CN104232676B - 一种获得微环dna的亲本质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用。该亲本质粒是在出发载体pEGFP‑N1‑attB质粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表达盒构建而成，所述attR片段插入出发载体限制性内切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位点之间，所述attL片段插入出发载体的限制性内切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位点之间，所述ΦC31整合酶基因表达盒插入出发载体的限制性内切酶AflⅢ的酶切位点。利用该亲本质粒能够快速、高效、经济地获得用于稳定整合的微环DNA，后续的转基因操作方法简单易行，具有重要的生物学意义及实际应用价值。

Description

一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用。

背景技术

微环DNA载体（Minicircle DNA Vector）是一种超螺旋的DNA分子，它是亲本质粒（Parental Plasmid,PP）发生位点特异性重组的产物。在重组酶的作用下，亲本质粒转变为两个环状DNA，一个含有大量的细菌骨架序列，称为微质粒（Miniplasmid,MP）；另一个则是仅含有目的基因的真核表达框架，即微环DNA（Minicircle,MC）。与传统质粒载体相比，微环DNA作为载体具有安全性好、携带的目的基因表达水平高、转基因表达持续时间长等优点（Darquet AM,Cameron B,Wils P,et al.A new DNA vehicle for nonviral genedelivery:supercoiled minicircle.Gene Ther,1997,4:1341-1319.Chen ZY,He CY,Ehrhardt A,et al.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result inpersistent and high-level transgene expression in vivo.Mol Ther,2003,8:495-500.Bigger BW,Tolmachov O,Collombet JM,et al.An araC-controlled bacterial creexpression system to produce DNA minicircle vectors for nuclear andmitochondrial gene therapy.J Biol Chem,2001,276:23018-23027.）。

已有报道利用LR克隆酶(Invitrogen,Cat.No.11791-020)成功获得微环DNA载体（Tasic B,Hippenmeyer S,Wang C,et al.Site-specific integrase-mediatedtransgenesis in mice via pronuclear injection.Pro Natl Acad Sci U S A,2011,108(19):7902-7907）。上述报道方法为：构建亲本质粒时连入attL和attR片段，在体外LR克隆酶的作用下attL和attR片段发生重组，生成微质粒和微环DNA，微质粒在限制性内切酶作用下被破坏，最后通过切胶回收获得微环DNA，然而该方法存在如下缺点：1、LR克隆酶价格昂贵，200μl体系用量大，成本较高；2、微环DNA经过胶回收纯化得到，损失大，获得量少；3、步骤繁琐，LR反应后还要进行限制性酶切将微载体破坏，造成后续微环DNA纯化回收的困难。因此很有必要对如何高效、快速、经济地利用LR克隆酶获得微环DNA载体的方法进行研究。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前利用LR克隆酶获得微环DNA的步骤较繁琐以及微环DNA获得量较低的缺陷，提供一种获得微环DNA的亲本质粒及其转基因的方法和应用，利用本发明所述的亲本质粒可以高效、快速、经济地得到微环DNA，并且高效、快速地获得转基因细胞株。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述亲本质粒是在真核表达载体pEGFP-N1-attB质粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表达盒构建而成，其中所述attR片段插入pEGFP-N1-attB质粒的限制性内切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位点之间，所述attL片段插入pEGFP-N1-attB质粒的限制性内切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位点之间，所述ΦC31整合酶基因表达盒插入pEGFP-N1-attB质粒的限制性内切酶AflⅢ的酶切位点。

其中所述表达盒为本领域常规表达盒，所述表达盒较佳地包括合适的转录调节序列，以及转录终止信号，还包括有助于实现表达或实现表达所需的其他因子，如表达增强子元件。其中所述ΦC31整合酶基因表达盒较佳地为链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因表达盒，所述表达盒或其他外源基因表达盒在亲本质粒的位置为任何位置，只要不影响该亲本质粒的其他功能以及外源基因的表达即可。

其中所述转录调节序列是指调节与其连接的核酸序列转录的具有调控功能的核酸序列。当转录调节序列控制并调节核酸序列的转录和/或翻译时，所述转录调节序列“可操作地连接”于所述核酸序列。转录调节序列，或表达控制序列较佳地包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点、转录终止子、位于蛋白编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号以及终止密码子。

其中所述“转录调节序列”是指核酸序列，其功能是控制一个或多个编码序列的转录，并且对于编码序列的转录起始位点的转录方向而言位于其上游，并且在结构上由DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列决定，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的作用是直接或间接调节由启动子转录的任何其他核酸序列，包括衰减子、增强子或者沉默子。其中所述启动子较佳地包括组成型启动子，诱导型启动子和/或组织特异性启动子。其中所述组成型启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。诱导型启动子是受到生理或发育调节的启动子，例如通过应用化学诱导剂进行调节的启动子。组织特异性启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。本发明所述ΦC31整合酶基因表达盒中的启动子为常规启动子，较佳地为真核启动子，更佳地为PGK启动子；其中所述外源基因表达盒中的启动子为常规启动子，较佳地为真核启动子，更佳地为CMV启动子。

其中所述ΦC31整合酶基因为常规的ΦC31整合酶基因，所述ΦC31整合酶基因较佳地为小鼠密码子优化的ΦC31整合酶基因（Raymond CS and Soriano P.High-efficiency FLP and PhiC31site-specific recombination in mammalian cells.PLoSone,2007,2:e162.）或者链霉菌噬菌体ΦC31整合酶。其中所述attL片段与attR片段为本领域常规核酸序列，所述attR片段和attL片段较佳地是指λ噬菌体的attP位点和细菌基因组中attB位点发生定点重组后产生的核酸序列。所述attL片段与attR片段的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成序列即得。

本发明所述attR片段的制备方法较佳地为：利用attR-up引物和attR-down引物，以attR单链序列和attRrc单链序列为模板，进行PCR反应即得。

其中所述attR-up引物的序列较佳地如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述引物含有SpeⅠ限制性酶切位点；其中所述attR-down的序列较佳地如序列表中SEQ ID NO:2所示，该引物含有DraⅢ限制性酶切位点。其中所述引物的制备方法为常规制备方法，较佳地为人工全序列合成。

其中所述attR单链序列为本领域常规序列，所述attR单链序列较佳地为序列表中SEQ ID NO:3所示（125bp）；所述attRrc单链序列为本领域常规序列，所述attRrc单链序列较佳地为序列表中SEQ ID NO:4所示（125bp）。本发明所述attR单链序列和attRrc序列的制备方法为常规制备方法，较佳地为人工全序列合成。

其中所述的PCR反应为本领域常规的PCR反应。所述PCR反应的体系较佳地为：模板attR单链和attRrc单链各5ng，引物attR-up和attR-down（10μM）各1μl，ExTaq酶（5U/μl）0.25μl，10×ExTaq Buffer5μl，dNTP（2.5mM）4μl，加ddH₂O至50μl。

其中所述PCR的程序较佳地为：（1）94℃变性30s；（2）55℃复性30s，（3）72℃延伸30s，步骤（1）～（3）循环26次；（4）72℃，延伸2min。

其中所述attL片段为常规，所述attL片段的制备方法较佳地为：将attL单链和attLrc单链各稀释成100～150μM的溶液，将溶液等摩尔混合，放置在100℃沸水的烧杯中自然冷却到20～40℃即得。

其中所述attL单链序列较佳地为序列表中SEQ ID NO:5所示(107bp，5’端含AflⅢ限制性酶切粘末端)；其中所述attLrc单链较佳地为序列表中SEQ ID NO:6所示(105bp，5’端含AseI限制性酶切粘末端)。其中所述attL单链和attLrc单链的制备方法为常规制备方法，较佳地为人工合成全序列即得。

其中所述获得微环DNA的亲本质粒以出发载体为基础进行构建，所述出发载体为本领域常规载体，较佳地为真核表达载体，更佳地为pEGFP-N1-attB质粒。

其中所述的出发载体较佳地还包括荧光蛋白，所述荧光蛋白为常规荧光蛋白，较佳地为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白，本发明所述出发载体包含的荧光蛋白更佳地为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。

本发明所述亲本质粒的构建方法为常规构建方法，所述构建方法较佳地为：首先在pEGFP-N1-attB质粒的限制性内切酶SpeⅠ和DraⅢ位点中插入attR序列构建pEGFP-N1-attB-attR载体；其次在pEGFP-N1-attB-attR载体的限制性内切酶AflⅢ和AseⅠ位点中插入attL序列，构建pEGFP-N1-attB-attR-attL载体；最后将所得pEGFP-N1-attB-attR-attL利用限制性内切酶AflⅢ酶切后获得线性化pEGFP-N1-attB-attR-attL质粒，将所得线性化质粒补平后去磷酸化，与线性化ΦC31整合酶基因表达盒连接，即得pEGFP-N1-attB-attR-attL-ΦC31亲本质粒。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种包含如上所述的亲本质粒的重组表达转化体。

其中所述重组表达转化体是指含有本发明所述亲本质粒的转化细胞。其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述亲本质粒pEGFP-N1-attB-attR-attL-ΦC31转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使所述转亲本质粒稳定地自行复制，且其所携带的外源基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠埃希氏菌(E.coli)，更佳地为大肠埃希氏菌DH5α或大肠埃希氏菌TOP10。将前述亲本质粒转化至E.coli DH5α中，即可得本发明优选的重组表达转化体。所述转化方法为本领域常规转化方法，其较佳地包括化学转化法、热激法或电转法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：一种转基因方法，其中所述转基因方法包括以下步骤：

（1）在如上述获得微环DNA的亲本质粒的多克隆位点中插入外源基因；

（2）将步骤（1）所得的获得微环DNA的亲本质粒中加入LR克隆酶进行LR重组反应，得到包含微环DNA和表达ΦC31整合酶的微质粒的LR重组体系，所述LR重组反应的条件为：20～30℃，反应3～14小时；

（3）利用所得LR重组体系转染宿主细胞。

步骤（1）为在如上所述获得微环DNA的亲本质粒的多克隆位点中插入外源基因。其中所述插入外源基因的方法为本领域常规方法，较佳地为通过在上述获得微环DNA的亲本质粒的多克隆位点中选择适当的内切酶位点进行克隆插入外源基因即得插入外源基因的亲本质粒。

步骤（2）为：将步骤（1）所得的获得微环DNA的亲本质粒中加入LR克隆酶进行LR重组反应，得到包含微环DNA和表达ΦC31整合酶的微质粒的LR重组体系，所述LR重组反应的条件为：20～30℃，反应3～14小时。

其中所述LR克隆酶为常规LR克隆酶，是指能够催化LR重组反应的LR克隆酶。所述LR重组反应为常规LR重组反应，即attL序列和attR序列之间发生重组反应。其中所述LR克隆酶的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。

其中所述LR重组反应的温度更佳地为25℃，LR重组反应的反应时间更佳地为4小时。

其中所述LR重组体系中微环DNA和表达ΦC31整合酶的质粒的摩尔比为1:1，共转染真核细胞时，在所述LR重组体系中可添加表达ΦC31整合酶的质粒，使共转染体系中微环DNA与表达ΦC31整合酶的质粒的摩尔比较佳地为1:1～1:100，更佳地为1:5。

其中所述转染宿主细胞较佳地为真核细胞，更佳地为贴壁生长的真核细胞，优选地为具有假attP位点的真核细胞。所述真核细胞较佳地包括来自于人、小鼠、大鼠、果蝇、兔、羊和牛的真核细胞，更佳地包括：HeLa细胞，牛耳皮肤成纤维细胞和羊耳皮肤成纤维细胞。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：如上所述的亲本质粒在制备转基因载体中的应用。

本发明所述获得微环DNA的亲本质粒能够广泛应用于转基因技术和基因治疗领域。所述应用较佳地为将所述获得微环DNA的亲本质粒经LR重组反应后所得的微环DNA作为转基因载体将外来基因导入宿主细胞的基因组中。

其中所述转基因技术是指将具有潜在应用价值的基因通过一定方式导入培养的细胞中，使有应用价值的蛋白高效表达的一种生物工程技术，更佳地为利用本发明所述获得微环DNA的亲本质粒携带具有潜在应用价值的基因通过一定方式导入宿主细胞，从而达到获得有应用价值的蛋白的目的。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五为：如上所述的亲本质粒在制备基因治疗药物中的应用。

其中所述基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的一种生物医学新技术，更佳地为利用本发明所述获得微环DNA的亲本质粒通过LR重组反应所得的微环DNA载体，该微环DNA载体不含细菌骨架序列，安全性较高。微环DNA能够将其携带的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入宿主细胞以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：利用本发明提供的获得微环DNA的亲本质粒经LR重组反应后，该LR重组体系中的微环DNA载体对靶细胞进行转基因操作时具有较高的转基因效率，外源基因的转染率和整合效率均大幅提高，表达量也增加。利用该亲本质粒获得的微环DNA载体进行转基因操作无需太多昂贵的LR克隆酶，仅使用少量LR克隆酶即可；所得LR重组体系无需纯化，可直接用于转基因操作，操作方法简单易行。利用本发明提供的获得微环DNA的亲本质粒能够快速、高效、经济地获得用于稳定整合外源基因的微环DNA，具有重要的生物学意义及实际的应用价值。

附图说明

图1为pEGFP-N1-attB-attR-attL-ΦC31亲本质粒的构建策略图。

图2为pEGFP-N1-attB-attR-attL-ΦC31亲本质粒的LR重组反应示意图。通过将该亲本质粒进行LR重组反应即得到微环DNA和表达ΦC31整合酶的微质粒。

图3为attR双链PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道1为PCR产物，泳道2为100bp marker。

图4为PvuⅡ酶切含有ΦC31整合酶基因的pPGKPhiC31obpA质粒琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道1为1Kb marker，泳道2为酶切产物。

图5为EcoRⅠ限制性酶切pEGFP-N1-attB-attR-attL-ΦC31亲本质粒琼脂糖凝胶电泳图谱。其中1-13泳道分别为：2k15，2k14，2k12，2k11，2k10，2k8，1Kb marker，2k7，2k6，2k5，2k3，2k2和2k1。

图6为EcoRⅠ限制性酶切LR重组反应体系琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道1为LR重组反应体系，泳道2为1Kb marker。

图7为微环DNA载体转染率测定结果图。其中1为微环DNA载体转染HeLa细胞，2为pEGFP-N1-attB质粒载体转染HeLa细胞。

图8为微环DNA载体整合率测定结果图。其中1为微环DNA载体转染HeLa细胞，2为pEGFP-N1-attB质粒载体转染HeLa细胞。

图9为ΦC31整合酶载体分别与微环DNA载体（以“MC”表示）或pEGFP-N1-attB质粒载体（以“C”表示）转染HeLa细胞所得细胞克隆的基因组中EGFP部分片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中1-13泳道分别为：水，2k8（亲本质粒，阳性对照），100bp marker，MC1，MC2，MC3，MC4，MC5，C1，C2，C3，C4和C5。

图10为ΦC31整合酶载体分别与微环DNA载体（以“MC”表示）或pEGFP-N1-attB质粒载体（以“C”表示）转染HeLa细胞所得细胞克隆基因组中attB部分片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中1-13泳道分别为：水，2k8（亲本质粒，其中attB位点完整，作为PCR反应的阳性对照），100bp marker，MC1，MC2，MC3，MC4，MC5，C1，C2，C3，C4和C5。

图11为ΦC31整合酶载体分别与微环DNA载体（以MC表示）或pEGFP-N1-attB质粒载体（以C表示）转染HeLa细胞所得细胞克隆基因组中LR重组部分片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中1-8泳道分别为：MC1，MC2，MC3，MC4，MC5，LR重组体系（PCR反应的阳性对照），100bp marker和C1（其中不含LR位点，为阴性对照）。

图12为ΦC31整合酶载体分别与微环DNA载体或pEGFP-N1-attB质粒载体共转染HeLa细胞所获细胞克隆中目的基因EGFP表达量的流式细胞仪测定结果图。其中1为微环DNA载体整合HeLa细胞克隆的平均荧光强度，2为pEGFP-N1-attB质粒整合HeLa细胞克隆的平均荧光强度。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。所述室温为20～40℃。

以下实施例中，所用到的含有目的基因绿色荧光蛋白（EGFP）和attB位点的质粒pEGFP-N1-attB及含有目的基因TPO的质粒pP1A3-hTPO由上海医学遗传研究所提供。其中，质粒pEGFP-N1-attB的构建方法请参考专利号为ZL200510111476.3的中国发明专利，pP1A3-hTPO的构建参考宁云山等的方法（宁云山等，TPO内含子Ⅴ可显著增强人血小板生成素基因在乳腺细胞中的表达，中国生物化学与分子生物学报，2007，23(07):537-541）。含链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因的质粒pPGKPhiC31obpA购于Addgene（Addgene Plasmid#13795）。

使用的HeLa细胞购自中科院生化细胞所。LR克隆酶购自Invitrogen公司（Cat.No.11791-020）。引物及attL和attR各自两条单链都合成于Invitrogen公司。PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自QIAGEN公司。

蛋白酶K购自Invitrogen公司；DMSO购自Sigma-Aldrich公司；Tris饱和酚购自上海沓玛生物科技有限公司；氯仿为无锡市东风化工厂出品；异戊醇为上海试剂一厂生产；醋酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇由常熟市杨园化工有限公司生产。

以下实施例中，如非特别说明，所用试剂均购自NEB公司。

实施例1亲本质粒载体的构建

本发明所述pEGFP-N1-attB-attR-attL-ΦC31质粒的构建策略如图1所示，在pEGFP-N1-attB质粒上依次连入attR序列，attL序列和ΦC31整合酶基因。

1、连入attR片段

引物设计：attR-up(含有SpeI限制性酶切位点)，其序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

attR-down(含有DraⅢ限制性酶切位点)，其序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

PCR扩增获得attR双链片段。

attR和attRrc单链由Invitrogen公司合成。

attR序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:3所示（125bp）；

attRrc序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:4所示（125bp）。

PCR反应体系（50μl）：模板attR和attRrc单链各5ng，引物attR-up和attR-down（10μM）各1μl，ExTaq酶（5U/μl）0.25μl，10×ExTaq Buffer5μl，dNTP（2.5mM）4μl，加ddH₂O至50μl。

PCR反应程序：（1）94℃变性30s；（2）55℃复性30s，（3）72℃延伸30s，步骤（1）～（3）循环26次；（4）72℃，延伸2min。

将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。经过PCR后得到了目的条带双链attR（144bp）。

将扩增获得的双链attR和pEGFP-N1-attB质粒分别进行SpeⅠ和DraⅢ双酶切，酶切条件均为：37℃，酶切2小时。酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化后再进行连接。连接产物转化感受态细胞，挑单克隆。利用上述PCR方法验证质粒中连接上attR片段后，送博尚生物技术有限公司测序，序列完全正确。确认pEGFP-N1-attB质粒已连接上attR片段。

2、连入attL片段

Invitrogen公司合成获得attL的两条单链：

attL(107bp，5’端含AflⅢ限制性酶切粘末端)，其序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

attLrc(105bp，5’端含AseⅠ限制性酶切粘末端)，其序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

将所得attL和attLrc单链各稀释成浓度为100μM的溶液，将所得溶液等摩尔混合，放置在100℃沸水的烧杯中自然冷却到20～40℃，即可获得双链attL序列，所得attL序列摩尔浓度为50μM，质量浓度为1734.6ng/μl，将其浓度稀释成17.35ng/μl。

将pEGFP-N1-attB-attR质粒用AflⅢ和AseⅠ双酶切，酶切条件为37℃，水浴加热2小时。酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化，测浓度为82.7ng/μl，再进行连接。

连接体系(20μl)为：10×T4DNA Ligase Buffer2μl，双链attL(17.35ng/μl)3.1μl，pEGFP-N1-attB-attR载体(82.7ng/μl)2.4μl，T4Ligase1μl，加ddH₂O至20μl。反应条件：在16℃PCR仪器中过夜反应。

连接产物转化感受态细胞，挑单克隆，送博尚生物技术有限公司测序，序列完全正确，确认pEGFP-N1-attB-attR质粒已连接上attL片段。

3、连入ΦC31整合酶基因

PvuⅡ酶切含有ΦC31整合酶基因的pPGKPhiC31obpA质粒，目的片段为2.9Kb。酶切体系为：DNA（pPGKPhiC31obpA质粒）24μg、PvuⅡ酶（20U/μl）8μl、10×buffer8μl、加ddH₂O至80μl。酶切条件为37℃，水浴加热2小时。

纯化酶切产物：胶回收试剂盒纯化PvuⅡ酶切产物。回收结果：产物浓度52.1ng/μl，产物体积40μl。酶切的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示。Pvu Ⅱ酶可切出2907bp、187bp、2514bp三条带（图中有一条约550bp非特异性酶切产生的条带），将2.9Kb条带切下回收。

AflⅢ酶切pEGFP-N1-attB-attR-attL质粒，目的片段4.4Kb。酶切体系为：DNA（pEGFP-N1-attB-attR-attL质粒）10μg、酶（5U/μl）12μl、10×buffer12μl、100×BSA1.2μl、加ddH₂O至120μl，酶切条件为37℃，水浴加热2小时。

PCR纯化试剂盒回收AflⅢ酶切产物，即线性化的pEGFP-N1-attB-attR-attL质粒。回收结果：产物浓度213.8ng/μl，产物体积35μl。

补平线性化的pEGFP-N1-attB-attR-attL质粒，补平体系：10×buffer5μl、0.1%BSA5μl、dNTP（2.5mM）5μl、DNA33.5μl、T4DNA聚合酶2μl。

补平反应步骤为：

a.将所述4个组分（10×buffer5μl、0.1%BSA5μl、dNTP（2.5mM）5μl、DNA（pEGFP-N1-attB-attR-attL质粒）33.5μl）混匀，70℃10min预变性，移入37℃水浴中降温。

b.加入T4DNA聚合酶，混匀，37℃水浴15min。

c.用振荡器剧烈震荡使酶失活。利用PCR纯化试剂盒回收补平产物，回收结果：产物浓度为120.1ng/μl，产物体积为50μl。

将所得纯化的补平产物去磷酸化，去磷酸化反应体系：DNA43.5μl、CIP（牛小肠碱性磷酸酶）2μl、10×buffer35μl，反应条件：37℃水浴1h。利用PCR纯化试剂盒回收去磷酸化产物，回收结果：产物浓度115.7ng/μl，产物体积30μl。

连接体系：回收酶切所得片段16μl、去磷酸化pEGFP-N1-attB-attR-attL载体1μl、10×buffer2μl、连接酶1μl，PCR仪中16℃过夜。

在卡那霉素抗性平板上得到16个克隆（编号2k1～2k16），抽提质粒后选取大小合适的质粒进行EcoRⅠ限制性酶切，检测ΦC31整合酶基因是否正确插入pEGFP-N1-attB-attR-attL质粒载体。

用EcoRⅠ限制性酶切所得质粒，酶切条件为37℃，水浴加热2小时。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。若所得片段正确插入载体，则能切出1.2Kb和6.1Kb的条带，从图5中可知第6泳道编号为2k8的质粒酶切结果正确，送博尚生物技术有限公司测序。测序结果显示ΦC31整合酶基因无突变正确插入载体，成功获得pEGFP-N1-attB-attR-attL-ΦC31质粒。

实施例2LR重组反应

反应体系（10μl）为以下组分：DNA(实施例1制备所得2k8质粒)200ng、10×TEbuffer1μl、LR克隆酶（LR clonase）2μl、加ddH₂O至10μl。也可在质粒抽提时用1×TEbuffer溶解质粒（2k8），此时反应体系（10μl）为：DNA(2k8质粒)200ng、LR克隆酶（LRclonase）2μl、补加1×TE buffer至10μl。

反应条件：PCR仪中25℃保温处理3h～14h，该质粒的LR克隆反应过程如图2所示。

用EcoRⅠ限制性酶切LR反应体系。若pEGFP-N1-attB-attR-attL-ΦC31质粒发生LR重组反应，则能切出2.1Kb(微环DNA)和5.2Kb的（微质粒）两条带，若为原始亲本质粒则能切出1.2Kb和6.1Kb的两条带。酶切体系为：EcoRⅠ酶1μl、10×buffer2μl、LR反应体系10μl、ddH₂O至20μl，反应条件：37℃水浴2h。

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。从电泳图可看出5.2Kb的条带亮度明显高于6.1Kb的条带，而1.2Kb条带太弱几乎看不到，说明大部分亲本质粒都发生了LR重组反应。

实施例3转染HeLa细胞

用GenJet^TMPlus DNA In Vitro Tranfection Reagent转染试剂（SignaGenLaboratories，Cat.No.SL100499）转染实施例2所得的LR反应体系到12孔板中的HeLa细胞。

转染步骤：

（1）用750μl无血清DMEM（GIBCO，Cat.No.11995-073）为Hela细胞换液。

（2）准备两个1.5ml EP管，分别标记为A管和B管。若为实验组，则A管中依次加入无血清DMEM38μl，LR重组反应体系10μl，pPGKPhiC31obpA质粒（200ng/μl）3μl，吹打3～4下混匀。若为对照组，则A管中依次加入无血清DMEM38μl，pEGFP-N1-attB质粒(100ng/μl)1.39μl，pPGKPhiC31obpA质粒（200ng/μl）3.72μl，吹打3～4下混匀。实验组与对照组的B管相同，都分别依次加入无血清DMEM38μl，转染试剂4μl，吹打3～4下混匀。

（3）将B管混合液加到A管中，吹打3～4下混匀。

（4）将混合液室温放置20min(小于30min即可)。

（5）将所得混合液均匀滴加入12孔板中。

（6）将12孔板放入培养箱中，于37℃，5%CO₂（体积比）条件下培养24h后换液，可测转染率。

转染体系如表1所示：

表1转染细胞的质粒体系

目的质粒	质量	pPGKPhiC31obpA质粒添加量	转染试剂
				微环DNA载体	56.4ng	600ng(LR重组体系中另有143.6ng)	4μl
pEGFP-N1-attB质粒	139.4ng	743.6ng	4μl

如表1中所示，微环DNA载体与ΦC31整合酶质粒的摩尔比，以及对照pEGFP-N1-attB质粒与ΦC31整合酶质粒的摩尔比均为1：5。其中，将微环DNA载体反应体系中添加ΦC31整合酶至所述摩尔比。表中所列微环DNA载体质量的数值（56.4ng及143.6ng）是通过总反应中亲本质粒的质量及其所生成的两个质粒的分子量大小推算出来的，非实测值。

转染24h后，计数12孔板中的HeLa细胞约为1×10⁶个。用流式细胞仪对7×10⁵个细胞做转染率的测定，其转染率测定结果如表2和图7所示：

表2细胞转染率

从上述结果可知，本发明所述的微环DNA载体的相对转染率是对照组的3倍，同时说明LR重组体系可不经过纯化处理，直接转染真核细胞，大大减少了昂贵的LR克隆酶的使用量，简化了实验步骤，使微环DNA载体的应用更经济快捷。

实施例4外源基因整合率的测定

在转染24h后，铺10个10cm平板，每平板细胞数为1×10⁴，两周后计算整合率，即计算发绿色荧光的细胞克隆数/（总细胞数×转染率），选取10个平板的整合率求平均值，整合率数据如表3和图8所示：

表3整合率结果

	绿色荧光克隆数	整合率
			微环DNA载体	31.90±3.93个	1.33%±0.16%
pEGFP-N1-attB质粒	5.90±1.52个	0.74%±0.19%

从上述结果可知，本发明所述微环DNA载体的整合率是对照组的1.8倍（P<0.001）。

实施例5获得目的细胞克隆并验证

将发绿色荧光的克隆部位用胰酶消化到一个6孔板或12孔板里，待其长满后，通过极限稀释的方法在96孔板中培养（稀释度平均1个细胞/孔），挑出仅发绿色荧光的单克隆目的细胞再进行培养进行后续实验。获得目的细胞克隆的基因组DNA，具体步骤如下：

（1）向细胞沉淀中加入400μl细胞裂解液，剧烈震荡混匀后加入2μl的蛋白酶K（20ng/μl），混匀，37℃水浴消化过夜。

（2）细胞充分消化后，加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，4℃离心机13,000rpm离心10min。

（3）吸取上清至1.5ml EP管中，加入等体积氯仿：异戊醇混合液（氯仿：异戊醇是24:1），充分混匀，震荡，4℃离心机13,000rpm离心10min。

（4）吸取上清至1.5ml EP管中，加入1/10体积的醋酸钠（浓度为3M）和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后在-20℃静置1h，4℃离心机13,000rpm离心10min。

（5）弃上清，加1ml75%乙醇，洗涤1～2次，4℃离心机13,000rpm离心6min。

（6）弃上清，室温放置30min，加无菌水溶解。

利用PCR方法确认ΦC31整合酶介导的微环DNA定点整合的目的克隆。具体步骤如下：

验证定点整合。由于ΦC31整合酶催化attB位点和attP位点或假attP位点重组时attB位点将从核心TTG处断开，因此，可在attB核心TTG两侧设计引物检测定点整合是否发生。而微环DNA上的EGFP序列的存在可确认微环DNA的整合。利用下列引物分别扩增EGFP及attB部分片段，其中EGFP部分片段扩增产物长度为585bp，attB部分片段为549bp（若成功发生定点整合则无扩增产物）。

扩增EGFP部分片段上游引物1，如序列表中SEQ ID NO:7所示；

扩增EGFP部分片段下游引物2：如序列表中SEQ ID NO:8所示；

扩增attB部分片段上游引物1：如序列表中SEQ ID NO:9所示；

扩增attB部分片段下游引物2：如序列表中SEQ ID NO:10所示。

扩增EGFP部分片段的PCR反应体系和PCR反应程序与扩增attB部分片段的PCR反应体系和PCR反应程序相同，转染微环DNA载体获得的克隆用MC表示，转染pEGFP-N1-attB质粒载体获得的克隆用C表示，模板分别为：MC1，MC2，MC3，MC4，MC5，C1，C2，C3，C4，C5和2k8（阳性对照）。

PCR反应体系（25μl）为：模板DNA样品50ng，所述上游引物1和下游引物2（10μM）各1μl，ExTaq酶（5U/μl）0.25μl，10×ExTaq Buffer2.5μl，dNTP（2.5mM）2μl，加ddH₂O至25μl。

PCR反应程序：（1）94℃预变性10min；（2）94℃变性1min，（3）54℃复性1min；（4）72℃延伸50s；步骤（2）～（4）循环30次；（5）72℃，延伸10min。

PCR所得产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图9及图10所示，结果显示微环DNA载体转染HeLa细胞（用MC表示）以及pEGFP-N1-attB质粒载体转染HeLa细胞（用C表示）所得克隆中的目的基因均发生了定点整合。

微环DNA载体的鉴定。由于LR克隆酶催化亲本质粒发生重组后形成微环DNA和微质粒的反应效率并非100%，因此，直接转染重组体系产物有可能导致未重组的亲本质粒以位点特异性方式重组入基因组。此时，可通过检测attL位点和attR位点之间是否发生重组来验证亲本质粒的存在。在形成微环DNA的attL和attR序列两端分别设计合适的引物，若亲本质粒未发生重组，则该PCR产物不能扩增，设计的引物序列如下：

LR重组片段上游引物MC-R：如序列表中SEQ ID NO:11所示；

LR重组片段下游引物MC-L：如序列表中SEQ ID NO:12所示。

扩LR重组部分片段，转染微环DNA载体获得的克隆用MC表示，转染pEGFP-N1-attB质粒载体获得的克隆用C表示，模板有MC1，MC2，MC3，MC4，MC5，LR重组反应产物（阳性对照）和C1（阴性对照）。

PCR反应体系（25μl）为：模板DNA样品50ng，上游引物MC-R和下游引物MC-L（10μM）各1μl，ExTaq酶（5U/μl）0.25μl，10×ExTaq Buffer2.5μl，dNTP（2.5mM）2μl，加ddH₂O至25μl。

PCR反应程序：（1）94℃预变性10min；（2）94℃变性1min，（3）56℃复性1min；（4）72℃延伸50s；步骤（2）～（4）循环30次；（5）72℃，延伸10min。

以LR重组体系做阳性对照，PCR产物片段大小为120bp，琼脂糖凝胶电泳结果如图11所示。结果显示微环DNA载体转染HeLa细胞（用MC表示）克隆扩出120bp条带，测序结果显示上述PCR产物与LR重组体系扩出的条带序列完全吻合，而对照组pEGFP-N1-attB质粒载体转染HeLa细胞克隆（用C表示，不含LR位点）没有扩增出该片段，因此实验组细胞克隆确定为微环DNA载体转染获得，而亲本质粒整合的细胞克隆未检测到，再次表明本发明提供的微环DNA在整合发生时具有较大的优势。同时，测序结果确定了LR重组位置为：在attL序列的80bp处和attR序列的5bp处发生重组。

实施例6外源基因的表达检测

用流式细胞仪分别检测上述共转染ΦC31整合酶质粒和微环DNA载体或pEGFP-N1-attB质粒的单克隆HeLa细胞的荧光强度（反映EGFP表达量），其结果见图12。结果显示转染微环DNA载体的HeLa细胞的平均荧光强度明显高于转染pEGFP-N1-attB质粒的HeLa细胞的平均荧光强度(P<0.001)，说明微环DNA载体可以有效提高目的基因的表达量。

为了更充分说明这一点，将实施例1构建所得亲本质粒中的EGFP基因替换为hTPO（人血小板生成素）基因，转染牛耳皮肤成纤维细胞，测hTPO基因表达量。方法如下：用限制性内切酶BamHI和NotI双酶切实施例1制备所得的亲本质粒2k8，T4DNA聚合酶补平粘性末端后使载体自连，去除EGFP基因。经测序正确后再用NheⅠ酶切该载体，用于连接hTPO基因。同时用限制性内切酶SpeⅠ酶切pP1A3-hTPO质粒（上海医学遗传研究所提供），酶切产生1759bp，1388bp和9181bp三条带，其中1388bp条带为含有hTPO的目的条带，因限制性内切酶SpeⅠ与NheⅠ互为同尾酶，可利用T4连接酶将该目的片段连入亲本质粒的多克隆位点NheⅠ中，获得含有目的基因hTPO的亲本质粒载体。将该亲本质粒载体经过实施例2所述LR重组后获得含有目的基因hTPO的微环DNA载体，转染牛耳皮肤成纤维细胞，从整体水平上检测目的基因hTPO的表达。经qRT-PCR检测RNA水平的表达，及ELISA检测目的蛋白的表达，与对照组转染未经重组反应的亲本质粒的牛耳皮肤成纤维细胞的hTPO表达量比较，发现利用微环DNA为载体的实验组中，目的基因hTPO在宿主细胞中得到了更高的表达。因此，运用本发明所述亲本质粒制备的微环DNA除具有转染率高、定点整合率高、安全性高等优点外，还具有使目的基因高效表达的特点，该载体在基因工程领域具有广阔的应用前景。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述亲本质粒是在真核表达载体pEGFP-N1-attB质粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表达盒构建而成，其中所述attR片段插入pEGFP-N1-attB质粒的限制性内切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位点之间，所述attL片段插入pEGFP-N1-attB质粒的限制性内切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位点之间，所述ΦC31整合酶基因表达盒插入pEGFP-N1-attB质粒的限制性内切酶AflⅢ的酶切位点。

2.如权利要求1所述获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述attR片段为λ噬菌体attR片段，所述attL片段为λ噬菌体attL片段。

3.如权利要求1所述获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述ΦC31整合酶基因表达盒中的启动子片段为PGK启动子片段。

4.一种包含如权利要求1～3任一项所述获得微环DNA的亲本质粒的重组表达转化体。

5.一种转基因方法，其特征在于，所述转基因方法包括以下步骤：

（1）在权利要求1～3任一项所述获得微环DNA的亲本质粒的多克隆位点中插入外源基因；

（2）将步骤（1）所得的获得微环DNA的亲本质粒中加入LR克隆酶进行LR重组反应，得到包含微环DNA和表达ΦC31整合酶的微质粒的LR重组体系，所述LR重组反应的条件为：20～30℃，反应3～14小时；

（3）利用所得LR重组体系转染宿主细胞。

6.如权利要求5所述的转基因方法，其特征在于，步骤（2）所述LR重组体系中微环DNA与表达ΦC31整合酶的质粒的摩尔比为1:1～1:100。

7.如权利要求5所述的转基因方法，其特征在于，步骤（3）所述宿主细胞为真核细胞。

8.如权利要求1～3任一项所述获得微环DNA的亲本质粒在制备转基因载体中的应用。

9.如权利要求1～3任一项所述获得微环DNA的亲本质粒在制备基因治疗药物中的应用。