CN112980862A - 一种高纯度微环dna的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度微环DNA的制备方法，微环制备包括携带目的基因的亲本质粒和一种专门生产微环的大肠杆菌ZYCY10P3S2T感受态细胞。将构建成功的亲本质粒转入大肠杆菌ZYCY10P3S2T感受态细胞中，30度过夜培养，然后通过阿拉伯糖诱导表达得到微环DNA，但由于微环DNA中会有亲本质粒的残留，导致微环DNA的纯度降低，影响转染表达效果。本发明提供了一种用特异性限制性内切酶线性化亲本质粒，再用T5核酸外切酶去除线性化亲本质粒的方法，达到彻底去除亲本质粒的目的，从而获得高纯度的微环DNA，提高转染和表达的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高纯度微环DNA的制备方法。
背景技术
在基因治疗过程中，一个将目的基因转移至细胞内表达的基因载体非常重要。目前用于基因治疗的载体可分为2种，病毒载体和非病毒载体。病毒载体转化效率虽然高，但存在将病毒基因整合到宿主基因组等安全隐患。传统质粒载体相比较于病毒载体转染效率低，传统质粒含有细菌复制所需要的复制子和抗性基因等，这些序列在质粒复制过程中是必要的，但在基因治疗中可能引起免疫原性反应，微环DNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种不含抗性基因和复制子的小环，从而提高了转染效率，使临床应用更加安全。此外，与传统质粒DNA相比微环DNA的空间拓扑结构更加稳定，免疫后在机体可以维持更高的超螺旋结构，具有更高的表达效率。
携带目的基因的亲本质粒包含重组酶识别位点，然后通过阿拉伯糖诱导大肠杆菌ZYCY10P3S2T表达重组酶phiC31和Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶，phiC31介导亲本质粒attB和attP重组，亲本质粒会被切割成2部分，一部分为微环DNA，另一部分含有Sce-Ⅰ识别位点的骨架DNA，骨架DNA被Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶剪切成线性DNA，从而被DNA酶消化。然后通过无内毒素质粒抽提的方法获得微环DNA。由于微环DNA在体内诱导不完全，会导致少量亲本质粒残留影响细胞转染效率。为了解决这一问题，本发明提供一种利用T5核酸外切酶去除亲本质粒的方法，从而获得高纯度的微环DNA，解决了亲本质粒残留的问题，从而获得高纯度的微环DNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度微环DNA的制备方法。
办发明要解决的技术问题：
本发明提供一种利用T5核酸外切酶去除亲本质粒的方法，从而获得高纯度的微环DNA，解决了亲本质粒残留的问题，从而获得高纯度的微环DNA。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种高纯度微环DNA的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：构建生产微环DNA的亲本质粒；
步骤S2：将亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T感受态细胞；
步骤S3：利用阿拉伯糖诱导表达得到微环DNA；
步骤S4：利用限制性内切酶线性化亲本质粒，T5外切酶来消化线性化的亲本质粒，利用异丙醇沉淀的方法得到高纯度的微环DNA。
进一步，步骤S1的具体步骤如下：
步骤S11：构建含有微环DNA序列的质粒puc57-mc；
步骤S12：以pmc-simple为空载体，利用BsbⅠ进行酶切，使用柱回收来纯化酶切后的载体，以puc57-mc为模板扩增微环DNA序列，首位引物序列分别添加pmc-sipmle载体BsbⅠ酶切位点左右的同源臂，通过同源重组的方法构建亲本质粒，最后通过酶切和Sanger法测序验证亲本质粒构建正确。
进一步，步骤S2的具体步骤如下：
步骤S21：将步骤S12构建的亲本质粒取1ng加入ZYCY10P3S2T感受态细胞中，混匀，在冰浴条件下保温10min；
步骤S22：将步骤S21得到的感受态细胞，在温度为42℃的条件下，水浴热激90min后，置于冰上冷却5min；
步骤S23：加入600μL LB培养基，在温度为37℃，转速为220rpm的条件下，培养40min，得到菌液；
步骤S24：取步骤S23制得的菌液100μL涂平板，在温度为37℃的条件下，过夜培养，得到单克隆抗体。
进一步，步骤S3的具体步骤如下：
步骤S31：将挑取步骤S24制得的单克隆于含有4mL的LB卡纳抗性的单管中，在温度为30℃，转速为200rpm的条件下，进行摇菌培养6-7h，得到种子液；
步骤S32：向含有100mL/1L的TB培养基中加入100μL种子液，在转速为220rpm,温度为30℃的条件下，过夜培养得到菌液；
步骤S33：取2mL步骤S32制得的菌液测定OD值、pH值和小抽酶切验证，若4＜OD＜6，加入100mL LB培养液和200μL质量分数10％的阿拉伯糖，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下，进行诱导5-5.5h，若6＜OD，加入200mL LB培养液和400μL质量分数10％的阿拉伯糖，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下，进行诱导5-5.5h，完成诱导后再加入750μL浓度10M的NAOH调制ph值；
步骤S34：利用无内毒素大抽质粒抽提试剂盒进行微环DNA的抽提，得到微环DNA。
进一步，步骤S4的具体步骤如下：
步骤S41：将步骤S34得到的微环DNA进行纯化，用内切酶NdeⅠ处理2h，反应体系如下：50μL buffer、4μL NdeⅠ，500ng微环DNA，补水至500μL。
步骤S42：向步骤S41处理后微环DNA中加入50μL 4-buffer和6μL T5外切酶，在温度为37℃的条件下，过夜处理后，用异丙醇沉淀法得到纯化后的微环DNA。
本发明的有益效果：改进了现有微环生产流程，目前亲本质粒残留问题，采用了选取亲本骨架上的限制性内切酶NdeⅠ线性化亲本质粒，然后利用T5外切酶去消耗线性化亲本质粒得到高纯度的微环DNA。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的高纯度微环DNA制备的流程图；
图2为本发明的pmc-simple图谱；
图3为本发明的亲本质粒图谱；
图4为本发明的微环DNA图谱；
图5为本发明的未纯化的微环DNA电泳图，泳道1为微环DNA，泳道2为EcoRV单切，泳道M为Marker；
图6为本发明的纯化后的微环DNA电泳图，泳道1为微环DNA，泳道2为EcoRV单切，泳道M为Marker。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种高纯度微环DNA的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：构建生产微环DNA的亲本质粒；
步骤S11：构建含有微环DNA序列的质粒puc57-mc；
步骤S12：以pmc-simple为空载体，利用BsbⅠ进行酶切，使用柱回收来纯化酶切后的载体，pmc-simple图谱见图2，以puc57-mc为模板扩增微环DNA序列，首位引物序列分别添加pmc-sipmle载体BsbⅠ酶切位点左右的同源臂，通过同源重组的方法构建亲本质粒，最后通过酶切和Sanger法测序验证亲本质粒构建正确，亲本质粒图谱见图3；
步骤S2：将亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T感受态细胞；
步骤S21：将步骤S12构建的亲本质粒取1ng加入ZYCY10P3S2T感受态细胞中，混匀，在冰浴条件下保温10min；
步骤S22：将步骤S21得到的感受态细胞，在温度为42℃的条件下，水浴热激90min后，置于冰上冷却5min；
步骤S23：加入600μL LB培养基，在温度为37℃，转速为220rpm的条件下，培养40min，得到菌液；
步骤S24：取步骤S23制得的菌液100μL涂平板，在温度为37℃的条件下，过夜培养，得到单克隆抗体。
步骤S3：利用阿拉伯糖诱导表达得到微环DNA；
步骤S31：将挑取步骤S24制得的单克隆于含有4mL的LB卡纳抗性的单管中，在温度为30℃，转速为200rpm的条件下，进行摇菌培养6-7h，得到种子液；
步骤S32：向含有100mL/1L的TB培养基中加入100μL种子液，在转速为220rpm,温度为30℃的条件下，过夜培养得到菌液；
步骤S33：取2mL步骤S32制得的菌液测定OD值、pH值和小抽酶切验证，若4＜OD＜6，加入100mL LB培养液和200μL质量分数10％的阿拉伯糖，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下，进行诱导5-5.5h，若6＜OD，加入200mL LB培养液和400μL质量分数10％的阿拉伯糖，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下，进行诱导5-5.5h，完成诱导后再加入750μL浓度10M的NAOH调制ph值；
步骤S34：利用无内毒素大抽质粒抽提试剂盒进行微环DNA的抽提，得到微环DNA,微环DNA图谱见图4，用EcoRV单切微环DNA，亲本质粒大小在9.8k，微环DNA大小在5.7k，凝胶电泳图见图5，从电泳图中可以看到有少量的亲本质粒残留；
步骤S4：利用限制性内切酶线性化亲本质粒，T5外切酶来消化线性化的亲本质粒，利用异丙醇沉淀的方法得到高纯度的微环DNA；
步骤S41：将步骤S34得到的微环DNA进行纯化，用内切酶NdeⅠ处理2h，反应体系如下：50μL buffer、4μL NdeⅠ，500ng微环DNA，补水至500μL。
步骤S42：向步骤S41处理后微环DNA中加入50μL 4-buffer和6μL T5外切酶，在温度为37℃的条件下，过夜处理后，用异丙醇沉淀法得到纯化后的微环DNA，用EcoRV单切微环DNA，亲本质粒大小在9.8k，微环DNA大小在5.7k，凝胶电泳图见图6，从电泳图中可以看到少量的亲本质粒残留被消化完全。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种高纯度微环DNA的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S1：构建生产微环DNA的亲本质粒；
步骤S2：将亲本质粒转化大肠杆菌ZYCY10P3S2T感受态细胞；
步骤S3：利用阿拉伯糖诱导表达得到微环DNA；
步骤S4：利用限制性内切酶线性化亲本质粒，T5外切酶来消化线性化的亲本质粒，利用异丙醇沉淀的方法得到高纯度的微环DNA。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度微环DNA的制备方法，其特征在于：步骤S1的具体步骤如下：
步骤S11：构建含有微环DNA序列的质粒puc57-mc；
步骤S12：以pmc-simple为空载体，利用BsbⅠ进行酶切，使用柱回收来纯化酶切后的载体，以puc57-mc为模板扩增微环DNA序列，首位引物序列分别添加pmc-sipmle载体BsbⅠ酶切位点左右的同源臂，通过同源重组的方法构建亲本质粒，最后通过酶切和Sanger法测序验证亲本质粒构建正确。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度微环DNA的制备方法，其特征在于：步骤S2的具体步骤如下：
步骤S21：将步骤S12构建的亲本质粒取1ng加入ZYCY10P3S2T感受态细胞中，混匀，在冰浴条件下保温10min；
步骤S22：将步骤S21得到的感受态细胞，在温度为42℃的条件下，水浴热激90min后，置于冰上冷却5min；
步骤S23：加入600μL LB培养基，在温度为37℃，转速为220rpm的条件下，培养40min，得到菌液；
步骤S24：取步骤S23制得的菌液100μL涂平板，在温度为37℃的条件下，过夜培养，得到单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度微环DNA的制备方法，其特征在于：步骤S3的具体步骤如下：
步骤S31：将挑取步骤S24制得的单克隆于含有4mL的LB卡纳抗性的单管中，在温度为30℃，转速为200rpm的条件下，进行摇菌培养6-7h，得到种子液；
步骤S32：向含有100mL/1L的TB培养基中加入100μL种子液，在转速为220rpm,温度为30℃的条件下，过夜培养得到菌液；
步骤S33：取2mL步骤S32制得的菌液测定OD值、pH值和小抽酶切验证，若4＜OD＜6，加入100mL LB培养液和200μL质量分数10％的阿拉伯糖，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下，进行诱导5-5.5h，若6＜OD，加入200mL LB培养液和400μL质量分数10％的阿拉伯糖，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下，进行诱导5-5.5h，完成诱导后再加入750μL浓度10M的NAOH调制ph值；
步骤S34：利用无内毒素大抽质粒抽提试剂盒进行微环DNA的抽提，得到微环DNA。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度微环DNA的制备方法，其特征在于：步骤S4的具体步骤如下：
步骤S41：将步骤S34得到的微环DNA进行纯化，用内切酶NdeⅠ处理2h，反应体系如下：50μL buffer、4μL NdeⅠ，500ng微环DNA，补水至500μL。
步骤S42：向步骤S41处理后微环DNA中加入50μL 4-buffer和6μL T5外切酶，在温度为37℃的条件下，过夜处理后，用异丙醇沉淀法得到纯化后的微环DNA。
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2021
- 2021-02-25 CN CN202110213887.2A patent/CN112980862A/zh active Pending
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