CN110438144B - 一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法 - Google Patents

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Abstract

一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，它涉及产絮菌领域。本发明的目的是为了解决目前微生物絮凝剂研发与应用的局限性，从基因水平提高产絮菌F2的产絮能力，克服产量低的瓶颈问题。本发明利用exoY基因构建了过表达重组载体pBB‑exoY，将该重组载体导入野生产絮菌F2中，获得重组产絮菌株F2‑exoY‑O。与对照菌株相比，重组菌株可以产生大量多糖型微生物絮凝剂，且在发酵培养结束时，重组菌株的有效成分含量提高了1～1.5倍。本发明应用于生物产絮领域。

Description

一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法
技术领域
本发明涉及产絮菌领域，具体涉及一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法。
背景技术
微生物絮凝剂是微生物发酵产生的高分子聚合物，主要有效成分为多糖、蛋白质、纤维素、核酸等生物高分子化合物，弥补传统絮凝剂易产生二次污染、不易自然降解等缺点的新型绿色水处理剂，在环境生物技术领域得到了广泛关注。目前，国内外关于微生物絮凝剂合成路径及调控机理的研究还处于初探阶段，因而无法从根本上解决野生菌株产絮产絮能力差、产量低的瓶颈问题。微生物絮凝剂发展需求和强大的组学技术手段引领着微生物絮凝剂的研究正逐渐由胞外深入到胞内，由宏观扩展到微观。微生物絮凝剂合成基因、合成途径及其调控机制的研究已成为微生物絮凝剂研究领域的热点问题之一。各种组学技术的飞跃性发展，为揭示微生物合成途径和调控机制解析提供了强有力的技术手段。但目前，从基因水平提高产絮菌株的产絮能力的相关报道较少。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前微生物絮凝剂研发与应用的局限性，无法从基因水平提高产絮菌株F2的产絮能力的问题，并克服产量低的瓶颈问题，而提供了一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法。
本发明的一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，具体方法为：
一、提取产絮菌株F2中带有启动子序列的exoY基因；
二、将exoY基因重组到广宿主表达载体pBBR1-MCS2中，获得含有exoY基因的重组表达载体pBB-exoY；
三、将重组表达载体pBB-exoY导入野生产絮菌F2中，获得exoY基因过表达的重组产絮菌株F2-exoY-O，从而完成所述的强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法；所述的带有启动子序列的exoY基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明所述的产絮菌F2为Agrobacterium tumefaciens F2是从国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得的，保藏编号为CGMCC 10131。
本发明包含以下有益效果：
本发明基于过表达菌体内编码糖基转移酶的基因会导致胞外多糖产量提升的研究，对多种多糖合成相关编码基因进行表达水平调控，包括exoA、exoC、exoF、exoQ、exoY等，结果表明，exoY基因过表达的重组菌株产絮能力提高最为明显，从而提高了产絮菌F2的产絮能力。本发明首次报道exoY基因过表达可以使产絮菌F2中多糖型微生物絮凝剂产量提高。综上，本发明采用基因工程手段，构建基因工程菌，提高絮凝剂产量，为解决产量低的瓶颈问题，推进微生物絮凝剂的工业应用奠定基础。
采用本发明的方法构建的重组产絮菌株F2-exoY-O的多糖型微生物絮凝剂产量提高。与对照组相比，exoY基因过表达的重组产絮菌株，其多糖型微生物絮凝剂有效成分含量提高了1～1.5倍。说明本发明经过基因工程方法所得的产絮重组菌株可以高效合成多糖型微生物絮凝剂。
附图说明
图1重组表达载体pBB-exoY结构图；
图2重组产絮菌株的多糖型微生物絮凝剂产量图；其中，A为野生菌株产量图，B为重组菌株产量图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，具体方法为：
一、提取产絮菌株F2中带有启动子序列的exoY基因；
二、将exoY基因重组到广宿主表达载体pBBR1-MCS2中，获得含有exoY基因的重组表达载体pBB-exoY；
三、将重组表达载体pBB-exoY导入野生产絮菌F2中，获得exoY基因过表达的重组产絮菌株F2-exoY-O，从而完成所述的强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法；所述的带有启动子序列的exoY基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：提取产絮菌株F2中的exoY基因所需的引物序列为：
exoY-F：AGCCCGGGGGATCCACTAGTTTCTTTTTTATGCAACCGTTAAT；
exoY-R：TATAGGGCGAATTGGAGCTCTCAGTAGCTTCCGCGTGACAG。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：将exoY基因插入到广宿主表达载体pBBR1-MCS2的两个同源序列AGCCCGGGGGATCCACTAGT和GAGCTCCAATTCGCCCTATA之间，获得含exoY基因的重组表达载体pBB-exoY。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：通过三亲接合法将重组表达载体pBB-exoY导入野生产絮菌F2中。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：提取产絮菌株F2中的exoY基因涉及的PCR扩增的反应体系为50μl，由下列成分组成：
Figure BDA0002172844140000031
PCR扩增条件：预变性94℃2min；94℃30s，56～60℃15s，72℃1min，30个循环；4.0℃∞。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：用
Figure BDA0002172844140000034
MaxDNA Polymerase试剂盒提取产絮菌株F2中的exoY基因。其它与具体实施方式一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1
重组表达载体pBB-exoY的构建。以产絮菌F2基因组为模板，构建重组表达载体，经PCR扩增及测序后，获得重组表达载体pBB-exoY。根据NCBI查询野生产絮菌F2的基因组序列，PCR扩增exoY基因核苷酸序列，以同源序列为基础将目标基因连接到载体上，采用
Figure BDA0002172844140000032
II One Step Cloning Kit，连接体系20μL：
Figure BDA0002172844140000033
37℃水浴30min后，立刻放在冰上，无菌环境中将其全部转移至大肠杆菌感受态细胞中，菌液涂布37℃过夜培养。
30℃培养野生产絮菌F2，37℃培养大肠杆菌，经三亲接合法在野生产絮菌中导入重组表达载体pBB-exoY，培养1～5d后，经平板涂布，30℃培养，获得单菌落。挑取单菌落纯培养后进行验证，获得产絮重组菌株。
接种纯化后的产絮重组菌株F2-exoY-O至发酵培养基，经30℃培养获得种子液。取种子液接种到发酵培养基获得发酵液，离心收集发酵上清液，采用醇沉法提取微生物絮凝剂，并采用苯酚硫酸法测定多糖成分含量以分析多糖型微生物絮凝剂产量变化。结果如图1所示。由图1可知，与对照菌株(将载体pBBR1-MCS2导入野生产絮菌F2获得对照菌株，进行发酵培养，并采用上述相同的提取微生物絮凝剂和测定方法)相比，exoY基因过表达的重组产絮菌株，其多糖型微生物絮凝剂有效成分含量提高了1～1.5倍。
序列表
<110> 哈尔滨工业大学
<120>一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法
<160> 3
<210> 1
<211>881
<212> DNA
<213>产絮菌（Agrobacterium tumefaciens）。
<400> 1
ttctttttta tgcaaccgtt aatattgccc ggacgttgat cggccgctca cgcaagaaat 60
cgcatagacg gtcataggca atgtgcctta caaaaaatcc attagcatca aattcagaac 120
acagacttgt tatctccttt agacggaaag acgcgcctcc gggcaccgac caatcgcaaa 180
acataaatgg agttctctct atgaagtccg cgacccaatc ggctgaacag acactcagca 240
gctccgaaga cttcgatgtc agttttccta tcgggggcat cgcaaaacgt agcttcgata 300
tgacatcggc tgcacttgcg ctgctcatat tcagcccgct tttcctgttg atcgccgcgc 360
tggtgaaatt ttccgaccct ggcccgatct tctacggcca ccggcgtgtg ggacataatg 420
gccgctattt ccattgcctg aaattcagga cgatggcgat gaatggcgac gagatgttgc 480
gccaatatct tgccgccaat ccggaagccg ccgaggaatg gcgtgctacc cgcaagctca 540
agaacgatcc gcgtgttacg gccgttggcg ccgtgctgcg caagctctcc cttgatgaac 600
tgccgcagct cctcaatatc atccgcggcg aaatgagcgt ggttggcccg cgcccggtcg 660
tcgatgaaga gctgagctac tacgaaagcg ctgccgctta ttatctcagc acccgtccgg 720
gcctgaccgg cctgtggcag atcagcggcc gtaacgacgt ctcctacaaa acccgcgtgg 780
ccttcgacac gcaatatgtg cagaactggt cgatgcgaca ggatgtcttc atcatcgtca 840
agaccattcc agccgtgtgc ctgtcacgcg gaagctactg a 881
<210> 2
<211>43
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> exoY-F引物。
<400> 2
AGCCCGGGGGATCCACTAGTTTCTTTTTTATGCAACCGTTAAT 43
<210> 3
<211>41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> exoY-R引物。
<400> 3
TATAGGGCGAATTGGAGCTCTCAGTAGCTTCCGCGTGACAG 41

Claims (6)

1.一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，其特征在于具体方法为：
一、提取产絮菌株F2中带有启动子序列的exoY基因；
二、将exoY基因重组到广宿主表达载体pBBR1-MCS2中，获得含有exoY基因的重组表达载体pBB-exoY；
三、将重组表达载体pBB-exoY导入野生产絮菌F2中，获得exoY基因过表达的重组产絮菌株F2-exoY-O，从而完成所述的强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法；所述的带有启动子序列的exoY基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，其特征在于提取产絮菌株F2中的exoY基因所需的引物序列为：
exoY-F：AGCCCGGGGGATCCACTAGTTTCTTTTTTATGCAACCGTTAAT；
exoY-R：TATAGGGCGAATTGGAGCTCTCAGTAGCTTCCGCGTGACAG。
3.根据权利要求1所述的一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，其特征在于将exoY基因插入到广宿主表达载体pBBR1-MCS2的两个同源序列AGCCCGGGGGATCCACTAGT和GAGCTCCAATTCGCCCTATA之间，获得含exoY基因的重组表达载体pBB-exoY。
4.根据权利要求1所述的一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，其特征在于通过三亲接合法将重组表达载体pBB-exoY导入野生产絮菌F2中。
5.根据权利要求1所述的一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，其特征在于提取产絮菌株F2中的exoY基因涉及的PCR扩增的反应体系为50μl，由下列成分组成：
Figure FDA0002172844130000011
PCR扩增条件：预变性94℃2min；94℃30s，56～60℃15s，72℃1min，30个循环；4.0℃∞。
6.根据权利要求1或2所述的一种强化表达exoY基因提高产絮菌F2絮凝剂产量方法，其特征在于用
Figure FDA0002172844130000012
Max DNA Polymerase试剂盒提取产絮菌株F2中的exoY基因。
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