CN117987340B - 一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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本发明涉及一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌及其构建方法和应用。本发明采用分子生物学手段，将骆驼刺泛菌（Pantoea alhagi）糖基转移酶palM基因过表达后构建获得高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌，palM基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌由于内源糖基转移酶基因palM过表达导致胞外多糖产量显著提高，与出发菌株相比，该菌株胞外多糖产量可达到29.25g/L，较出发菌株胞外多糖产量提高了38.36%，具有广阔的应用前景。

Description

一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
胞外多糖（EPS）是微生物分泌的细胞外生物大分子，近年来越来越受到关注。EPS单糖组成和键的多样性有助于结构的多样性，以及功能的多样性，如具备抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、免疫调节、乳化、增稠和胶凝等功能。此外，工业上稳定的发酵工艺生产EPS具有低成本、高产率、低污染等优势，极大增加了商业化的可能性，因而被广泛应用于食品、医药、农业、化妆品和饲料等行业中。植物根际促生菌（PGPR）骆驼刺泛菌Pantoea alhagiXK-11分泌的胞外多糖能够增强植物的抗逆性、改善土壤性质，同时具有流变学等特性，在农作物促生上具有优良效果。
目前对关于提高胞外多糖产量的研究主要集中在优化培养基的组成和发酵条件上，包括碳源优化、添加诱导剂和控制通气速率等措施。然而，这些方法具有有限的有效性以及高成本。随着现代基因工程技术的发展，通过基因工程的手段对微生物改良具有显著优势，因此构建高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌具有良好的经济效益和社会效。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌及其构建方法和应用。本发明通过改造骆驼刺泛菌获得，具体策略为过表达骆驼刺泛菌内源基因palM(编码糖基转移酶)以提高发酵过程中胞外多糖的产量。
具体地，本发明公开了一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌，所述工程菌以骆驼刺泛菌为出发菌株，过表达糖基转移酶palM基因后构建获得，palM基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
atgactgagtctacgcctttaatcagcgttgttattcccacctataatcgtgccgacatcattttaaaaaccctaaacagcgttttaaatcaaacctggcgtaacatcgaagtgttcgtggtggatgatgcttccacggataataccgctgaggtcatggcgggcgttaaggatgagcgcgtacattttattcagctggcgcaaaacagcagcggcacgcgtccgcgcaatgaaggaattgagcgcagcagcggtgagtttatcgccttgctcgattccgacgatgagtgggtgccagagaagctggaaaaacaactggcctatttacgccagcagccgggtaaaaaccgcgtttgcatgacggctaaatataataagcgtcctgagggcatgcacctgcgacggaataaagacctgaaaaaatattcctcgatcatggagttcctgctgctgggcaacgattttcaaaccagtacgctactgctggacgccgcgatagccaaacaaacgcagtttgatcctacgctgcgtaaacatcaggactgggattttgccctgcgcctgcaggagaggggagccagctttttttatctcgacctgccgctgaccatttatgacgattcggactctaccgcgcgtatttcttccgacggtaaacgcgataaatcgttaatctggctggagagtattaaaaagcgcgtacccagctatatctggttcggtttctacgcaaagattattgccgacagttatttgctctctaatgaaaaatcgaaaggcgtggctatctatttaaagctgctgctgtcgagaaaaattaaattcagccattttatggcgatgatgaatgaaagatttaaaaagttagccactattaccgcgaaacgttttgttccggggaagtga(SEQ ID NO.1)。
优选地，所述骆驼刺泛菌为骆驼刺泛菌Pantoea alhagiXK-11，其保藏编号为CGMCC NO.15526。所述菌株的详细信息公开于专利公布号为CN111808777A的专利文件中。
本发明进一步提出了上述骆驼刺泛菌工程菌的构建方法，步骤如下：
（1）以骆驼刺泛菌基因组为模版，PCR扩增palM目的基因片段；以pKT100质粒为模版，克隆pKT100载体框架，将获得的目的基因片段通过一步克隆法连接到pKT100载体上，并转入E.coli DH5α，涂布至含有卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，获得重组质粒pKT100-palM；
（2）将重组质粒pKT100-palM通过电转化转化至骆驼刺泛菌感受态细胞中，涂布至含有卡那霉素抗性的LB固体培养基中培养，优选地，37℃培养16h，挑取阳性克隆，获得palM基因过表达的骆驼刺泛菌工程菌。
优选地，步骤（2）中电转化条件为：电场强度1.8~2.5KV/cm，电击时间2~6msec。
本发明进一步提出了上述骆驼刺泛菌工程菌在发酵制备胞外多糖上的应用。
具体地，发酵制备胞外多糖包括如下步骤：
（1）种子液培养：将活化后的骆驼刺泛菌工程菌接种到LB液体培养基中过夜培养，优选地在37℃下过夜培养，获得发酵种子液；
（2）补料分批发酵：按2~10%（v/v）的接种量将培养好的种子液转接到发酵培养基中发酵，发酵周期为16~24h，在发酵8~12h后，通过流加补料工艺补充碳源继续发酵；
（3）胞外多糖制备：将发酵液于80~115℃加热20~30min进行降粘，趁热与1~3%珍珠岩混合均匀后通过板框过滤机过滤除去菌体，滤液冷却至室温后加入2~3倍体积的乙醇，收集絮状沉淀并干燥获得胞外多糖。
其中，所述发酵培养基包含碳源、氮源、无机盐，所述的碳源为蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘油中的一种或几种的组合，碳源浓度为10~30g/L；所述氮源为黄豆粉、蛋白胨、硫酸铵、玉米浆、鱼粉、豆粕粉中的任意一种或几种的组合，氮源浓度为5~10g/L；所述无机盐为NaCl、KCl、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MnSO4、MgSO4、CaCl2中的任意一种或几种的组合，无机盐总浓度为2.5~7.5g/L。
在一个具体的实施方式中，所述发酵培养基组成为：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾1g/L，pH=7.0。
优选地，发酵条件为：温度为28~32℃，pH为6.5~7.5，通气量为0.2~0.8vvm，搅拌转速为400~600rpm，罐压为0.01~0.03MPa。
优选地，步骤（2）中，补料总量为30~40g/L，补料流速为200~360ml/h；补料培养基中碳源浓度为100~300g/L。
糖基转移酶基因家族促进多糖的组装，糖基转移酶催化糖基从特定的活化供体连续转移到特定的受体分子，从而形成区域特异性和立体特异性的糖苷键，在多糖合成中具有发挥着重要作用。因此，通过构建内源糖基转移酶基因palM过表达，从而获得了高产胞外多糖的骆驼刺泛菌重组工程菌。
有益效果：本申请构建的工程菌由于内源糖基转移酶基因palM过表达导致胞外多糖产量显著提高，与出发菌株相比，该菌株胞外多糖产量可达到29.25g/L，较出发菌株产糖提高了38.36%，具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为实施例2中使用引物pKT100-CX-F和pKT100-CX-R能够扩增出的特异性基因条带。
具体实施方式
实施例1：骆驼刺泛菌工程菌的构建。
以骆驼刺泛菌Pantoea alhagi XK-11的基因组DNA为模板，获得目的基因片段，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
palM-F（SEQ ID NO.2）：AGCTAAGGAAGCTAAAACTAGTATGACTGAGTCTACGCC；
palM-R（SEQ ID NO.3）：TAAAACGACGGCCAGTGGATCCTCACTTCCCCGGAACA；
PCR扩增的反应体系如表1所示，总体系为50μL。
表1
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
以质粒pKT100为模板，PCR扩增扩增出pKT100载体框架，扩增引物的核苷酸序列如下：
pKT100-F（SEQ ID NO.4）：TTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCG
pKT100-R（SEQ ID NO.5）：ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGAC
PCR扩增的反应体系如表2所示，总体系为50μL。
表2
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
通过一步克隆法将获得的目的基因片段连接到pKT100载体上，一步克隆反应条件为37℃反应30min，4℃保存，反应体系如表3所示，总体系为20μL。
表3
将酶连后的重组质粒转化进DH5α细胞中，转化步骤如下：
a. 将感受态细胞DH5α至于冰上静置5min。
b. 取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，用移液枪混合均匀，冰上静置25min。
c. 42℃水浴热激60sec后，立即置于冰上冷却5min。
d. 加入900μL SOC培养基，37℃，200rpm摇菌1h。
e. 5000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养16h。
挑取骆驼刺泛菌（Pantoea alhagi）单菌落，在100ml种子培养基中培养至菌体浓度OD600为0.6~0.8，置于冰上冷却5mim，冷却后4,600rpm离心8min，用预冷的ddH2O洗涤菌体3次，最后1.2ml ddH2O重悬菌体，分装到12个无菌的1.5ml EP管中，制得感受态细胞。
使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的质粒提取试剂盒从DH5α中提取重组质粒，将10μL重组质粒与100μL制得的骆驼刺泛菌感受态细胞混合于遇冷的电极杯中，随后电击，电击转化条件为2.0KV，4msec，电击后立即加入900μL SOC培养基培养，37℃，200rpm摇菌1h。5,000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养16h。
挑选单菌落进行PCR验证，验证无误后即可得到糖基转移酶palM基因过表达后的工程菌。PCR验证引物的核苷酸序列如下：
pKT100-CX-F（SEQ ID NO.6）：ACGGAAGATCACTTCGCAGA
pKT100-CX-R（SEQ ID NO.7）：CATCAGCGCCATTCGCCATTC
实施例2：阳性重组菌的培养及鉴定。
挑取上述构建所得的阳性重组菌落，接种到含50μg/mL卡那霉素抗性的液体LB培养基中37℃过夜培养，培养完成后，以菌液为模板，pKT100-CX-F和pKT100-CX-R为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；
所述的PCR引物序列如下：
pKT100-CX-F（SEQ ID NO.6）：ACGGAAGATCACTTCGCAGA
pKT100-CX-R（SEQ ID NO.7）：CATCAGCGCCATTCGCCATTC
所述的PCR扩增体系为20μL，如表4所示。
表4
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，使用引物pKT100-CX-F和pKT100-CX-R能够扩增出一条特异性基因条带（图1），大小约为1300bp，与理论值1275bp接近，表明带有目的基因的重组质粒已成功转化到骆驼刺泛菌中，获得了palM基因过表达的骆驼刺泛菌工程菌。
实施例3：胞外多糖发酵测试。
分别以出发菌与重组工程菌作为菌种，按以下步骤发酵制备胞外多糖：（1）种子液培养：将活化后的菌株接种到LB液体培养基中37℃过夜培养，获得发酵种子液。
（2）补料分批发酵：按4%（v/v）的接种量将培养好的种子液转接到发酵培养基（蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾1g/L，pH=7.0）中，发酵条件：温度为30℃，pH为7.0，通气量为0.6vvm，搅拌转速为500rpm，罐压为0.02MPa，发酵周期为24h。发酵12h后，通过流加补料工艺补充碳源（蔗糖200g/L），补料总量为40g/L，补料流速为360ml/h。发酵结束后通过苯酚-硫酸法测定发酵液中的多糖含量。
（3）胞外多糖制备：将发酵液于115℃加热30min进行降粘，趁热与2%珍珠岩混合均匀后通过板框过滤机过滤除去菌体，滤液冷却至室温后加入2倍体积的乙醇，收集絮状沉淀并干燥获得胞外多糖。
在同等发酵条件下，出发菌株胞外多糖产量为21.14g/L，糖基转移酶palM基因过表达后的工程菌胞外多糖产量可达到29.25g/L，较出发菌株胞外多糖产量提高了38.36%。
本发明提供了一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌的构建思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (9)

1.一种高产胞外多糖的骆驼刺泛菌工程菌，其特征在于，所述工程菌以骆驼刺泛菌（Pantoea alhagi）XK-11为出发菌株，过表达糖基转移酶palM基因后构建获得，palM基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述骆驼刺泛菌（Pantoea alhagi）XK-11的保藏编号为CGMCC NO.15526。
2.权利要求1所述的骆驼刺泛菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
（1）以骆驼刺泛菌（Pantoea alhagi ）XK-11的基因组为模版，PCR扩增palM目的基因片段；以pKT100质粒为模版，克隆pKT100载体框架，将获得的目的基因片段通过一步克隆法连接到pKT100载体上，并转入E.coli DH5α，涂布至含有卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，获得重组质粒pKT100-palM；
（2）将重组质粒pKT100-palM通过电转化转化至骆驼刺泛菌感受态细胞中，涂布至含有卡那霉素抗性的LB固体培养基中培养，挑取阳性克隆，获得palM基因过表达的骆驼刺泛菌工程菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中电转化条件为：电场强度18~25KV/cm，电击时间2~6 msec。
4.权利要求1所述的骆驼刺泛菌工程菌在发酵制备胞外多糖上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵制备胞外多糖包括如下步骤：
（1）种子液培养：将活化后的骆驼刺泛菌工程菌接种到LB液体培养基中过夜培养，获得发酵种子液；
（2）补料分批发酵：按2~10%（v/v）的接种量将培养好的种子液转接到发酵培养基中发酵，发酵周期为16~24h，在发酵8~12h后，通过流加补料工艺补充碳源继续发酵；
（3）胞外多糖制备：发酵完成后将发酵液于80~115℃加热20~30min进行降粘，趁热与1~3%珍珠岩混合均匀后通过板框过滤机过滤除去菌体，滤液冷却至室温后加入2~3倍体积的乙醇，收集絮状沉淀并干燥获得胞外多糖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包含碳源、氮源、无机盐，所述的碳源为蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘油中的一种或几种的组合，碳源浓度为10~30g/L；所述氮源为黄豆粉、蛋白胨、硫酸铵、玉米浆、鱼粉、豆粕粉中的任意一种或几种的组合，氮源浓度为5~10g/L；所述无机盐为NaCl、KCl、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MnSO4、MgSO4、CaCl2中的任意一种或几种的组合，无机盐总浓度为2.5~7.5g/L。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾1g/L，pH=7.0。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵条件为：温度为28~32℃，pH为6.5~7.5，通气量为0.2~0.8vvm，搅拌转速为400~600rpm，罐压为0.01~0.03MPa。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，补料总量为30~40g/L，补料流速为200~360ml/h；补料培养基中碳源浓度为100~300g/L。
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