CN111471633A - 一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产ε‑聚赖氨酸的基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomyces diastatochromogenes CATF)并提高ε‑聚赖氨酸发酵水平的方法，所述高产基因工程菌株的构建步骤如下：步骤1，构建表达乙酰辅酶A乙酰转移酶CATF基因质粒，所述基因CATF序列片段由pIMEP质粒上红霉素启动子启动子erm^*控制；步骤2，表达catF基因菌株的获得，即高产ε‑聚赖氨酸的基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌CATF。经过实验证实，该链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε‑聚赖氨酸的能力显著提高了27.91％，为ε‑聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

Description

一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸 产量的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，尤其是一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF及提高ε-聚赖氨酸产量的方法。

背景技术

ε-聚赖氨酸是目前发现的两种天然氨基酸同聚物之一(另一种是γ-聚谷氨酸)，自首株ε-聚赖氨酸产生菌发现后，经土壤筛选所得ε-聚赖氨酸产生菌均属于链霉菌属(Streptomyces)、链轮丝菌属(Streptoverticillum)、北里孢菌属(Kitasatospora)和香柱属

。ε-聚赖氨酸产生菌的分布主要局限于丝状细菌链霉菌科和麦角真菌。ε-聚赖氨酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及一些病毒均有抑制作用，热稳定性好，可直接加入食品一起加工。日本学者Shima和Sakai于20世纪80年代初首次将这种生物防腐剂应用于食品防腐。ε-聚赖氨酸还可作为一种食疗剂，抑制肠道中膳食脂肪的吸收，最终降低肥胖的几率。ε-聚赖氨酸也可用于防治牙周炎疾病，可抑制口腔细菌毒素的产生。除此之外，ε-聚赖氨酸可用于一次性擦布中药溶液的一种组成成分。ε-聚赖氨酸还可用作乳化剂，ε-聚赖氨酸与葡聚糖结合后所得结合物的乳化活性优于商业乳化剂。在水凝胶、生物芯片和生物电子的镀膜材料等方面也具有十分重要的用途。

正是由于ε-聚赖氨酸具有以上优良性质和广阔的市场前景，1989年日本智索股份有限公司(Chisso Corporation)首先利用微生物发酵技术工业化生产ε-聚赖氨酸。2001年，Kahar等提出采用两阶段pH控制策略来提升S.albulus S410菌株ε-聚赖氨酸的产量。随着ε-聚赖氨酸的需求量不断增大，国内外也有许多学者采用诱变育种等手段以期提高ε-聚赖氨酸的产量，Hiraki利用亚硝基胍对野生型菌株S.albulus No.346进行化学诱变，其中一株S.albulus 11011A高产突变株比出发菌株ε-聚赖氨酸产量高出约10倍。目前还未见到通过基因工程，尤其是通过过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶(acetyl-CoAacetyltransferase)基因catF来提高ε-聚赖氨酸产量的报道。

通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的公开文献：

1、一种积累高丝氨酸的ε-聚赖氨酸的发酵方法(CN104004796A)，采用淀粉酶产色链霉菌CGMCCNo.3145作为生产菌株，在发酵0-48h，向发酵培养基中添加终浓度为2.5-5.0g/L的L-苏氨酸。涉及到的在发酵液中添加L-苏氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸不同于其他氨基酸的添加来提高ε-PL产量，而是通过抑制支路代谢改变代谢流分布来实现提高ε-PL产量的，是相同原料投入获得更高的产物浓度，副产物浓度降低，纯化简单。

2、一种稳定快速生产ε-聚赖氨酸的方法(CN110373439A)，是采用菌株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)，在含有适宜的碳源、氮源的培养基中进行发酵培养。本发明以孢子悬液直接接种，并以pH终点为转种指标，采用一步法降pH策略，进行ε-聚赖氨酸的稳定快速发酵生产，较常规工艺产量提高了80％-130％，周期缩短28％-45％。本发明改变了已有生产工艺步骤，从而简化了现有发酵生产方法，显著提高了ε-聚赖氨酸的生产强度，不仅缩短了发酵周期，节约了成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，另外，工艺简单易放大，易于实现产业化大规模生产。

通过对比，本发明与上述公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF及提高ε-聚赖氨酸产量的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomycesdiastatochromogenes CATF)，构建步骤如下：

⑴提取大肠杆菌JM109转化子中的重组质粒pIMEP-catF，首先将构建得到的重组质粒pIMEP-catF转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；

⑵向贝纳特培养基上产孢良好的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomycesdiastatochromogenes TUST)菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子备用；

其中，每1LM3G培养基组成为：

(NH₄)₂SO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 1.36g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水补充至1L；

每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L；

⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF。

而且，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF重组质粒pIMEP-catF的构建步骤如下：

⑴目的片段基因的获得：根据catF基因设计引物序列catF-FF/catF-RR，在基因catF两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在catF基因核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在catF核苷酸序列的下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的catF基因；

所述引物catF-FF/catF-RR的序列为：

catF-FF：SEQ No.2，即5’-tctagaatgtccgaggcgtacatcgt-3’，下划线序列为XbaI酶切位点；

catF-RR：SEQ No.3，即5’-gaattctcagagacgttcgatgatggtc-3’，下划线序列为EcoRI酶切位点；

所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的序列为SEQ No.1；

⑵重组质粒pIMEP-catF的构建步骤如下：

用XbaI和EcorI双酶切质粒pIMEP，将扩增的catF基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的质粒pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-catF，化学法转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选转化子保存。

而且，所述淀粉酶产色链霉菌TUST为保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.3145的菌株。

一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，所述方法通过构建过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF重组质粒pIMEP-catF，并将重组质粒pIMEP-catF转入淀粉酶产色链霉菌TUST中，获得基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平；

其中，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的序列为SEQ No.1。

而且，所述发酵的生产方如下：

采用的菌株为过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生分生孢子；

然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在30℃，180rpm，培养30h，将培养好的种子转接到M3G培养基中进行发酵；

其中，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。

本发明取得的优点和积极效果为：

1.本发明通过过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF获得基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomyces diastatochromogenes CATF)，经过实验证实，该链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε-聚赖氨酸的能力提高了27.91％，为ε-聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

2.本发明方法通过构建过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomyces diastatochromogenes CATF)来提高ε-聚赖氨酸发酵水平。

3.本发明通过过表达表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomyces diastatochromogenes CATF)发现脂肪酸途径对链霉菌生产ε-聚赖氨酸有重要影响。

附图说明

图1为本发明中以pIMEP为基础构建pIMEP-catF重组质粒的构建图；

图2为本发明中对基因表达质粒pIMEP-catF菌落的PCR验证图；其中，泳道M：5kbmarker；泳道1：catF基因全长验证；泳道2：菌落PCR扩增catF片段，筛选阳性转化子；

图3为本发明中初步筛选获得基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌CATF阳性转化子提基因组，用质粒pIMEP上引物验证结合转移是否成功的验证图；其中，泳道M：5kb marker；泳道1：验证CATF基因工程菌株中转入的catF基因；泳道2:对照TUST中无相应基因；

图4为本发明中菌株在24h、48h、72h的摇瓶发酵聚赖氨酸产量图；其中，TUST为出发菌株淀粉酶产色链霉菌TUST，CATF为基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌CATF菌株。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomycesdiastatochromogenes CATF)，构建步骤如下：

⑴提取大肠杆菌JM109转化子中的重组质粒pIMEP-catF，首先将构建得到的重组质粒pIMEP-catF转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；

⑵向贝纳特培养基上产孢良好的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomycesdiastatochromogenes TUST)菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子备用；

其中，每1LM3G培养基的组成为：

(NH₄)₂SO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 1.36g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，酵母提取物5g/L，用用氨水调节pH到7.2，加水定容至1L；

每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L；

⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF。

较优地，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF重组质粒pIMEP-catF的构建步骤如下：

⑴目的片段基因的获得：根据catF基因设计引物序列catF-FF/catF-RR，在基因catF两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在catF基因核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在catF核苷酸序列的下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的catF基因；

所述引物catF-FF/catF-RR的序列为：

catF-FF：SEQ No.2，即5’-tctagaatgtccgaggcgtacatcgt-3’，下划线序列为XbaI酶切位点；

catF-RR：SEQ No.3，即5’-gaattctcagagacgttcgatgatggtc-3’，下划线序列为EcoRI酶切位点；

所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的序列为SEQ No.1；

⑵重组质粒pIMEP-catF的构建步骤如下：

用XbaI和EcorI双酶切质粒pIMEP，将扩增的catF基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的质粒pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-catF，化学法转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选转化子保存。

较优地，所述淀粉酶产色链霉菌TUST为保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.3145的菌株。

一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，所述方法通过构建过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF重组质粒pIMEP-catF，并将重组质粒pIMEP-catF转入淀粉酶产色链霉菌TUST中，获得基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平；

其中，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的序列为SEQ No.1。

较优地，所述发酵的生产方如下：

采用的菌株为过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生分生孢子；

然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在30℃，180rpm，培养30h，将培养好的种子转接到M3G培养基中进行发酵；

其中，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。

更为具体地，通过相关实施例来具体说明：

实施例1

目的catF基因的获得：根据catF基因设计引物序列，在基因catF两端分别引入EcoRI和XbaI的酶切位点，其中在catF核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在catF核苷酸序列的下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，以提取的淀粉酶产色链霉菌TUST基因组DNA为模板，分别以序列表SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3为上下游引物，进行PCR反应，扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的catF基因，全长1158bp，见序列表SEQ ID No.1。

PCR反应体系：2×phanta max buffer 25μL，dNTP mixture(10mM)1μL，模板(20ng/ul)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，phanta max×Super-FidelityDNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，50-65℃退火15s，72℃延伸1min，共循环30次，72℃延伸5min，16℃结束反应，得到目的catF基因。

实施例2

含有catF基因的重组质粒pIMEP-catF的构建：

将PCR扩增的catF基因片段用XbaI和EcoRI双酶切，将带有红霉素启动子PermE*质粒pIMEP用XbaI和EcorI双酶切，再将catF基因片段连接到双酶切后pIMEP质粒的相应XbaI和EcoRI酶切位点，得到连接产物重组质粒pIMEP-catF。如图1所示。

实施例3

重组质粒pIMEP-catF的转化：

取连接产物重组质粒pIMEP-catF加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有安普霉素抗性的LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，结果如图2所示，重组质粒pIMEP-catF已成功转化到转化子中。

实施例4

基因工程菌株的获得：

利用结合转移的方法将质粒pIMEP-catF整合到淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)基因组中。

首先提取大肠杆菌JM109转化子中的pIMEP-catF重组质粒，将重组质粒按化学方法转化至辅助菌株大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，将转化子涂布于含有卡那霉素100μg/mL、安普霉素50μg/mL和氯霉素25μg/mL抗性的LB平板中，37℃倒置培养24h。挑选大肠杆菌阳性转化子单菌落于5mL LB(含有三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃恒温震荡过夜培养，之后按照1％的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同)，180r/min 37℃振荡培养至OD₆₀₀0.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40mL菌液，用新鲜的LB洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB中置于冰上备用,得到处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞。向淀粉酶产色链霉菌TUST孢子生长良好的平板上加入10mLpH 8.0的TES缓冲液，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mL M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子备用，得到萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子。

将处理过的大肠杆菌阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，对转化子进行观察。

实施例5

将筛选获得catF基因过表达菌株进行聚赖氨酸发酵培养基摇瓶发酵30h后，提取基因组，在pIMEP质粒XbaI、EcoRI酶切位点上下游各200bp左右处设计一对验证引物：上游引物pIMEP-F 5’-cgggcctcttcgctattac-3’(SEQ ID No.4)，下游引物pIMEP-R 5’-gaaatcttgaacatgcctaa cctc-3’(SEQ ID No.5)，经过PCR验证，catF基因已成功结合到TUST的基因组中，而对照TUST基因组中并未获得相应条带(如图3所示)。

实施例6

利用如上所述的淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomyces diastatochromogenesCATF)基因工程菌株发酵产生聚赖氨酸的方法，具体步骤如下：

将基因工程菌株接种在贝纳特培养平板上，在30℃培养7天左右直至产生孢子；然后，将孢子接种至含有100mLM3G培养基的500mL容量摇瓶中，在30℃，180rpm发酵30h。以6％的接种量转移到新的M3G培养基中发酵直至72h，即得ε-聚赖氨酸，产量可较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST提高30％；其中，所述贝纳特培养基1L的组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L。

M3G培养基组分为：(NH₄)₂SO₄ 10g，KH₂PO₄ 1.36g，K₂HPO₄ 0.8g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到1L。

10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO₄·7H₂O和2ml 20×的MgSO₄·7H₂O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min。

结果如图4所示，经过72小时的摇瓶发酵，发现原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST和基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomyces diastatochromogenes CATF)的ε-聚赖氨酸产量都随着时间进行不断增加，但是可以明显看出，在48小时和72小时基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomyces diastatochromogenes CATF)的ε-聚赖氨酸产量比原始菌株产量显著提高，尤其是在72小时比原始菌株TUST提高了27.91％。

实施例7

本发明涉及一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，通过构建过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF重组质粒，并将所述的重组质粒转入淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)TUST中，实现提高ε-聚赖氨酸发酵水平。

所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF序列，如SEQ ID No.1所示。

所述构建包括以下步骤：

(1)目的片段基因的获得：根据catF基因设计引物序列，在基因catF两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在catF基因核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在catF核苷酸序列的下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的catF基因，全长1158bp。

所述的引物catF-FF/catF-RR的序列为：

catF-FF(5’-tctagaatgtccgaggcgtacatcgt-3’下划线序列为XbaI酶切位点，黑体是是基因的起始核苷酸,SEQ ID No.2)

catF-RR(5’-gaattctcagagacgttcgatgatggtc-3’下划线序列为为EcoRI酶切位点，黑体是基因的终止核苷酸，SEQ ID No.3)

(2)含有catF基因的质粒pIMEP-catF的构建步骤如下：

用XbaI和EcorI双酶切质粒pIMEP，将catF基因片段插入到带有红霉素启动子的质粒pIMEP质粒的相应XbaI和EcoRI酶切位点。取连接产物加入到在冰浴中已融化的含有大肠杆菌JM109感受态细胞的离心管中，轻弹管壁，混匀，冰浴30min。42℃热激90s，然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下，向离心管中加入900μL LB培养基，吹打混匀后，37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min，移除900μL上清，用移液器将剩余液体吹打混匀，涂布到含有相应抗性的LB固体平板上。将LB平板37℃倒置培养过夜，至单菌落清晰可辨。

(3)基因工程菌株的获得：利用结合转移的方法将质粒pIMEP-catF整合到淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)基因组中。

首先将构建得到的重组质粒pIMEP-catF按化学的方法转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素100μg/mL、安普霉素50μg/mL和氯霉素25μg/mL抗性的LB平板中，37℃倒置培养24h。挑选阳性转化子单菌落于5mL LB(含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素，浓度与上一步相同)中，37℃恒温震荡过夜培养，之后按照1％的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50mL LB液体培养基中(抗生素种类、浓度与上一步相同)，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40mL菌液，用新鲜的LB洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素，重悬至1mL LB中置于冰上备用。向产孢效果较好的淀粉酶产色链霉菌TUST平板上加入pH 8.0的10mLTES缓冲液中，用无菌接种环刮下孢子，倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡2h，打断孢子链，然后用无菌脱脂棉过滤，除去菌丝。50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mLM3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子备用。

将处理过的阳性转化子大肠杆菌和萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上。30℃倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选结合子单克隆并进行发酵生产ε-聚赖氨酸。

本发明中使用到的相关基因序列可以如下：

1.Seq ID No.1

乙酰辅酶A乙酰转移酶catF基因

SEQ ID No.2

catF-FF

tctagaatgt ccgaggcgta catcg 25

SEQ ID No.3

catF-RR

gaattctcag agacgttcga tgatggtc 28

SEQ ID No.4

上游引物pIMEP-F

cgggcctctt cgctattac 19

SEQ ID No.5

下游引物pIMEP-R

gaaatcttga acatgcctaa cctc 24

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1158

<212> DNA

<213> 乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF(Unknown)

<400> 1

atgtccgagg cgtacatcgt cgatgccgtc cgcaccccgg tggggaagaa gggcggcgga 60

ctgtccggcg tccacccggc cgacctcggc gcgcacgtgc tgaccgcgct gatgggccgc 120

accgggatcg atccggccgc ggtcgaggac gtcgtcttcg gctgcctgga caccgtcggg 180

ccgcaggccg gggacatcgc ccgcacctgc tggctggccg ccgggctgcc ggaggaggta 240

cccggcgtca ccgtcgaccg gcagtgcggt tcctcgcagc aggccgtgca cttcgccgcg 300

cagggagtgc tctccggaac ccaggacctg gtcgtggccg gcggggtgca gaacatgtcg 360

cagatcccga tcgccttcgc cagccggcag gccgccgagc cgctgggcct cacccagggc 420

ccgtacgccg gttccgaagg ctggcgggcc cgctacgggg accagcccgt caaccagttc 480

cacggcgccg agctgatcgc caccaagtgg gacatctccc ggcaggacat ggaggagttc 540

gcgctccgct cgcaccagcg ggcggtccgg gccatcgacg agggccgctt cgaccgggaa 600

ctcgtcgcgt acggcgaggt caccaccgac gaggggccgc gccgcgcgac ctcgctggag 660

aagatggcgg ggttggcgcc ggtggtcgag ggcggtcggc tgaccgccgc ggtctcctcc 720

caggtgtccg acggggccgc ggcgatgctg ctggcctccg agcgggcggt ggccgagcac 780

gggctgaccc cgcgcgcccg gatccaccac ctctcggtcc gcggcgagga cccgatccgg 840

atgctgtccg cgccgatccc ggccaccgcg tacgcgctga agaaggccgg gatgacgatc 900

gacgacatcg acctggtcga gatcaacgag gcgttcgcgc cggtggtgct ggcctggctc 960

aaggagaccg gcgccgatcc cgagcgggtc aacgtcaacg gcggggccat cgccctcggc 1020

cacccgctgg gggcgaccgg cgttcggctg atgaccacgc tgctgaacga actggagcgc 1080

accggcggcc ggttcggcct ccagaccatg tgcgagggcg gcggccaggc caacgtgacc 1140

atcatcgaac gtctctga 1158

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> catF-FF(Unknown)

<400> 2

tctagaatgt ccgaggcgta catcg 25

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> catF-RR(Unknown)

<400> 3

gaattctcag agacgttcga tgatggtc 28

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 上游引物pIMEP-F(Unknown)

<400> 4

cgggcctctt cgctattac 19

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 下游引物pIMEP-R(Unknown)

<400> 5

gaaatcttga acatgcctaa cctc 24

Claims (5)

1.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF(Streptomycesdiastatochromogenes CATF)，其特征在于：构建步骤如下：

⑴提取大肠杆菌JM109转化子中的重组质粒pIMEP-catF，首先将构建得到的重组质粒pIMEP-catF转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；

⑵向贝纳特培养基上产孢良好的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomycesdiastatochromogenes TUST)菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子备用；

其中，每1LM3G培养基的组成为：

(NH₄)₂SO₄ 10 g/L，KH₂PO₄1.36 g/L，K₂HPO₄0.8 g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，用水定容到1L；

每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L；

⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF。

2.根据权利要求1所述的基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF，其特征在于：所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF重组质粒pIMEP-catF的构建步骤如下：

⑴目的片段基因的获得：根据catF基因设计引物序列catF-FF/catF-RR，在基因catF两端分别引入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在catF基因核苷酸序列的上游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶XbaI的位点，在catF核苷酸序列的下游5’端添加6个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的catF基因；

所述引物catF-FF/catF-RR的序列为：

catF-FF：SEQ No.2；

catF-RR：SEQ No.3；

所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的序列为SEQ No.1；

⑵重组质粒pIMEP-catF的构建步骤如下：

用XbaI和EcorI双酶切质粒pIMEP，将扩增的catF基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的质粒pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-catF，化学法转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选转化子保存。

3.根据权利要求2所述的基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF，其特征在于：所述淀粉酶产色链霉菌TUST为保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.3145的菌株。

4.一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于：所述方法通过构建过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF重组质粒pIMEP-catF，并将重组质粒pIMEP-catF转入淀粉酶产色链霉菌TUST中，获得基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌CATF，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平；

其中，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的序列为SEQ No.1。

5.根据权利要求4所述的提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于：所述发酵的生产方如下：

采用的菌株为过表达乙酰辅酶A乙酰转移酶基因catF的基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在30℃培养直至产生分生孢子；

然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在30℃，180rpm，培养30h，将培养好的种子转接到M3G培养基中进行发酵；

其中，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L。

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