CN111607608B - 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用 - Google Patents

基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基因工程高产ε‑聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，其构建步骤如下：步骤1，构建表达天冬氨酸激酶基因ask或二氢吡啶二羧酸合成酶基因dhdps质粒，所述基因ask或dhdps由pIMEP质粒上红霉素启动子ermE*控制；步骤2，表达ask或dhdps基因菌株的获得，即得基因工程高产ε‑聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌。经过实验证实，链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε‑聚赖氨酸的能力显著提高了17.2％‑25.8％，为ε‑聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

Description

基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用
技术领域
本发明属生物技术领域，尤其是一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用。
背景技术
ε-聚赖氨酸是目前发现的两种天然氨基酸同聚物之一(另一种是γ-聚谷氨酸)，自首株ε-聚赖氨酸产生菌发现后，经土壤筛选所得ε-聚赖氨酸产生菌均属于链霉菌属(Streptomyces)、链轮丝菌属(Streptoverticillum)、北里孢菌属(Kitasatospora)和香柱属
Figure BDA0002457656540000011
。ε-聚赖氨酸产生菌的分布主要局限于丝状细菌链霉菌科和麦角真菌。ε-聚赖氨酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及一些病毒均有抑制作用，热稳定性好，可直接加入食品一起加工。日本学者Shima和Sakai于20世纪80年代初首次将这种生物防腐剂应用于食品防腐。ε-聚赖氨酸还可作为一种食疗剂，抑制肠道中膳食脂肪的吸收，最终降低肥胖的几率。ε-聚赖氨酸也可用于防治牙周炎疾病，可抑制口腔细菌毒素的产生。除此之外，ε-聚赖氨酸可用于一次性擦布中药溶液的一种组成成分。ε-聚赖氨酸还可用作乳化剂，ε-聚赖氨酸与葡聚糖结合后所得结合物的乳化活性优于商业乳化剂。在水凝胶、生物芯片和生物电子的镀膜材料等方面也具有十分重要的用途。
正是由于ε-聚赖氨酸具有以上优良性质和广阔的市场前景，1989年日本智索股份有限公司(Chisso Corporation)首先利用微生物发酵技术工业化生产ε-聚赖氨酸。2001年，Kahar等提出采用两阶段pH控制策略来提升S.albulus S410菌株ε-聚赖氨酸的产量。随着ε-聚赖氨酸的需求量不断增大，国内外也有许多学者采用诱变育种等手段以期提高ε-聚赖氨酸的产量，Hiraki利用亚硝基胍对野生型菌株S.albulus No.346进行化学诱变，其中一株S.albulus 11011A高产突变株比出发菌株ε-聚赖氨酸产量高出约10倍。目前还未见到通过基因工程，尤其是通过过表达天冬氨酸激酶(aspartokinase)基因ask和二氢吡啶二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase)基因dhdps来提高ε-聚赖氨酸产量的报道。
通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的公开文献：
1、一种积累高丝氨酸的ε-聚赖氨酸的发酵方法(CN104004796A)，采用淀粉酶产色链霉菌CGMCCNo.3145作为生产菌株，在发酵0-48h，向发酵培养基中添加终浓度为2.5-5.0g/L的L-苏氨酸。涉及到的在发酵液中添加L-苏氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸不同于其他氨基酸的添加来提高ε-PL产量，而是通过抑制支路代谢改变代谢流分布来实现提高ε-PL产量的，是相同原料投入获得更高的产物浓度，副产物浓度降低，纯化简单。
2、一种稳定快速生产ε-聚赖氨酸的方法(CN110373439A)，是采用菌株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)，在含有适宜的碳源、氮源的培养基中进行发酵培养。本发明以孢子悬液直接接种，并以pH终点为转种指标，采用一步法降pH策略，进行ε-聚赖氨酸的稳定快速发酵生产，较常规工艺产量提高了80％-130％，周期缩短28％-45％。本发明改变了已有生产工艺步骤，从而简化了现有发酵生产方法，显著提高了ε-聚赖氨酸的生产强度，不仅缩短了发酵周期，节约了成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，另外，工艺简单易放大，易于实现产业化大规模生产。
通过对比，本发明与上述公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)，其构建步骤如下：
⑴提取大肠杆菌DH5α转化子中的重组质粒pIMEP-ASK或pIMEP-DHDPS，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有25ng/μL卡那霉素、50ng/μL安普霉素和25ng/μL氯霉素的LB平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；
⑵向长满淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)灰色孢子的贝纳特培养基平板上加入0.05mol/L、pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入2×孢子预萌发培养液，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子重悬于LB培养液中备用；
其中，每1L 2×孢子预萌发液培养基的组成为：
酵母粉10g，酪蛋白氨基酸10g，CaCl2浓度为0.01mol/L；
每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L；
⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的无血清培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆，得到基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌。
而且，所述重组质粒pIMEP-ASK为天冬氨酸激酶ask重组质粒pIMEP-ASK，该天冬氨酸激酶ask重组质粒pIMEP-ASK的构建步骤如下：
⑴目的片段基因的获得：根据ask基因设计引物序列ask-F/ask-R，在基因ask两端分别加入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在ask基因核苷酸序列的上游5’端添加8个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶XbaI的位点，在ask核苷酸序列的下游5’端添加9个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的ask基因；
所述引物ask-F/ask-R的序列为：
ask-F：SEQ No.3；
ask-R：SEQ No.4；
所述ask的序列为SEQ No.1；
⑵重组质粒pIMEP-ASK的构建步骤如下：
用XbaI和EcoRI双酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，将扩增的ask基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-ASK，化学法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子保存。
而且，所述重组质粒pIMEP-DHDPS为二氢吡啶二羧酸合成酶dhdps重组质粒pIMEP-DHDPS，该二氢吡啶二羧酸合成酶dhdps重组质粒pIMEP-DHDPS的构建步骤如下：
⑴目的片段基因的获得：根据dhdps基因设计引物序列dhdps-F/dhdps-R，在基因dhdps两端分别加入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在dhdps基因核苷酸序列的上游5’端添加8个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶XbaI的位点，在dhdps核苷酸序列的下游5’端添加9个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的dhdps基因；
所述引物dhdps-F/dhdps-R的序列为：
dhdps-F：SEQ No.5；
dhdps-R：SEQ No.6；
所述dhdps的序列为SEQ No.2；
⑵重组质粒pIMEP-DHDPS的构建步骤如下：
用XbaI和EcoRI双酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，将扩增的dhdps基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-DHDPS，化学法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选转化子保存。
而且，所述质粒pIMEP是在pSET152上加一个强启动子红霉素启动子，将红霉素启动子基因和质粒pSET152经XbaI单酶切后用T4连接酶连接而成。
而且，所述淀粉酶产色链霉菌TUST的名称为TUST1，分类名称为Streptomycesdiastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.3145，保藏日期：2009年6月29日，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌在提高ε-聚赖氨酸产量方面中的应用。
一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，所述方法通过构建过表达天冬氨酸激酶基因ask或二氢吡啶二羧酸合成酶基因dhdps质粒并整合到淀粉酶产色链霉菌TUST染色体中，获得基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌ASK或DHDPS，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的产量；
其中，所述天冬氨酸激酶基因ask的序列为SEQ No.1，二氢吡啶二羧酸合成酶基因dhdps的序列为SEQ No.2。
一种利用如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌提高ε-聚赖氨酸产量的方法。
而且，发酵生产方法为：
将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在28-37℃培养直至产生分生孢子；
然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在28-37℃，150-200rpm，培养30h，将培养好的种子按6-10％接种量转接到M3G培养基中进行发酵72h，即得ε-聚赖氨酸；
其中，每1LM3G培养基的组成为：(NH4)2SO410g，KH2PO41.36g，K2HPO40.8g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到900mL；
10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO4·7H2O和2ml 20×的MgSO4·7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min；
在使用M3G培养基时，每取900ml M3G，加入100mL10×的葡萄糖母液；
每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明在链霉菌中引入ε-聚赖氨酸前体合成基因，通过过表达ask或dhdps获得基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌ASK(Streptomyces diastatochromogenes ASK)或淀粉酶产色链霉菌DHDPS(Streptomyces diastatochromogenes DHDPS)，经过实验证实基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST生产ε-聚赖氨酸的能力分别提高了17.2％和25.8％，为ε-聚赖氨酸生产提供了优良菌种。
2、本发明涉及一种提高淀粉酶产色链霉菌ε-聚赖氨酸产量的方法，通过构建ask基因或dhdps基因的对应过表达质粒pIMEP-ASK或pIMEP-DHDPS,并将过表达质粒整合到链霉菌TUST染色体中，实现产量提高。
3、本发明通过过表达ask或dhdps基因可以增强二氨基庚二酸途径，增强L-赖氨酸的合成，为聚赖氨酸的合成提供了充足的前体物质。
附图说明
图1为本发明中质粒构建示意图；
图2为本发明中对目的基因表达质粒的EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切验证图；其中，泳道M：10kb marker；泳道1：pIMEP-ASK；泳道2：pIMEP-DHDPS；泳道M为2kb marker；
图3为本发明中初步筛选获得基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌阳性转化子提基因组，用质粒pIMEP上的安普霉素抗性基因aac(3)Ⅳ引物验证接合转移是否成功的验证图；其中，泳道M：2kb marker；泳道1-20：基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ASK和基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌DHDPS转化子扩增结果；泳道21-22:阴性对照出发菌株淀粉酶产色链霉菌TUST扩增结果；泳道23：阳性对照pIMEP质粒扩增结果；
图4为本发明中菌株在摇瓶发酵72h的聚赖氨酸产量图；其中，TUST为出发菌株淀粉酶产色链霉菌TUST，ASK为ask基因过表达ε-聚赖氨酸高产基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌ASK，DHDPS为dhdps基因过表达ε-聚赖氨酸高产基因工程菌株淀粉酶产色链霉菌DHDPS。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)，其构建步骤如下：
⑴提取大肠杆菌DH5α阳性转化子中的重组质粒pIMEP-ASK或pIMEP-DHDPS，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有25ng/μL卡那霉素、50ng/μL安普霉素和25ng/μL氯霉素的LB平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；
⑵向长满淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)灰色孢子的贝纳特培养基平板上加入0.05mol/L、pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入2×孢子预萌发培养液，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子重悬于LB培养液中备用；
其中，每1L 2×孢子预萌发液培养基的组成为：
酵母粉10g，酪蛋白氨基酸10g，CaCl2浓度为0.01mol/L；
每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L；
⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的无血清培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为25mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆，得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ASK或淀粉酶产色链霉菌DHDPS。
较优地，所述重组质粒pIMEP-ASK为天冬氨酸激酶ask重组质粒，该天冬氨酸激酶ask重组质粒pIMEP-ASK的构建步骤如下：
⑴目的片段基因的获得：根据ask基因设计引物序列ask-F/ask-R，在基因ask两端分别加入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在ask基因核苷酸序列的上游5’端添加8个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶XbaI的位点，在ask核苷酸序列的下游5’端添加9个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的ask基因；
所述引物ask-F/ask-R的序列为：
ask-F：SEQ No.3；
ask-R：SEQ No.4；
所述ask的序列为SEQ No.1；
⑵重组质粒pIMEP-ASK的构建步骤如下：
用XbaI和EcoRI双酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，将扩增的ask基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-ASK，化学法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子保存。
较优地，所述重组质粒pIMEP-DHDPS为二氢吡啶二羧酸合成酶dhdps重组质粒，该二氢吡啶二羧酸合成酶dhdps重组质粒pIMEP-DHDPS的构建步骤如下：
⑴目的片段基因的获得：根据dhdps基因设计引物序列dhdps-F/dhdps-R，在基因dhdps两端分别加入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在dhdps基因核苷酸序列的上游5’端添加8个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶XbaI的位点，在dhdps核苷酸序列的下游5’端添加9个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的dhdps基因；
所述引物dhdps-F/dhdps-R的序列为：
dhdps-F：SEQ No.5；
dhdps-R：SEQ No.6；
所述dhdps的序列为SEQ No.2；
⑵重组质粒pIMEP-DHDPS的构建步骤如下：
用XbaI和EcoRI双酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，将扩增的dhdps基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-DHDPS，化学法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子保存。
较优地，所述质粒pIMEP是在pSET152上加一个强启动子红霉素启动子，将红霉素启动子基因和质粒pSET152经XbaI单酶切后用T4连接酶连接而成。
较优地，所述淀粉酶产色链霉菌TUST的名称为TUST1，分类名称为Streptomycesdiastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.3145，保藏日期：2009年6月29日，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
如上所述的基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ASK或淀粉酶产色链霉菌DHDPS在提高ε-聚赖氨酸产量方面中的应用。
一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法，所述方法通过构建过表达天冬氨酸激酶基因ask或二氢吡啶二羧酸合成酶基因dhdps质粒并整合至淀粉酶产色链霉菌TUST的染色体中，获得基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ASK或淀粉酶产色链霉菌DHDPS，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的产量；
其中，所述天冬氨酸激酶基因ask的序列为SEQ No.1，二氢吡啶二羧酸合成酶基因dhdps的序列为SEQ No.2。
一种利用如上所述的基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ASK或淀粉酶产色链霉菌DHDPS提高ε-聚赖氨酸产量的方法。
较优地，发酵生产方法为：
将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在28-37℃培养直至产生分生孢子；
然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在28-37℃，150-200rpm，培养30h，将培养好的种子按6-10％接种量转接到M3G培养基中进行发酵72h，即得ε-聚赖氨酸；
其中，每1LM3G培养基的组成为：(NH4)2SO410g，KH2PO41.36g，K2HPO40.8g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到900mL；
10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO4·7H2O和2ml 20×的MgSO4·7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min；
在使用M3G培养基时，每取900ml M3G，加入100mL10×的葡萄糖母液；
每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH7.7，加水补充至1L。
本发明中所述的ask基因，是指天冬氨酸激酶基因，如SEQ No.1所示。
本发明中所述的dhdps基因，是指二氢吡啶二羧酸合成酶基因，如SEQ No.2所示。
本发明中构建方式可以包括以下两种方式的：
1)含有ask基因质粒的构建：PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST上的ask基因，具体步骤包括：设计ask基因的扩增引物ask-F/ask-R，在ask-F上加入XbaI的酶切位点，在ask-R上加入EcoRI酶切位点。将扩增到的ask基因片段插入到含有红霉素抗性基因强启动子基因ermE*的pIMEP质粒中，得到质粒pIMEP-ASK。
所述的引物ask-F/ask-R的序列如下
SEQ No.3ask-F：5’-GCTCTAGAGTGGGCCTTGTCGTGCAGAAGTACGG-3’横线处为XbaI酶切位点；
SEQ No.4ask-R：5’-CCGGAATTCTCATCGCCCGGTGCCGCCGATG-3’横线处为EcoRI酶切位点。
2)含有dhdps基因质粒的构建：PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST上的dhdps基因，具体步骤包括：设计dhdps基因的扩增引物dhdps-F/dhdps-R，在dhdps-F上加入EcoRI的酶切位点，在dhdps-R上加入XbaI酶切位点。将扩增到的dhdps基因片段插入到含有红霉素抗性基因强启动子基因ermE*的pIMEP质粒中，得到质粒pIMEP-DHDPS。
所述的引物dhdps-F/dhdps-R的序列如下
SEQ No.5dhdps-F：5’-GCTCTAGAATGGTTGATCGCACCCCCCTGGAGG-3’横线处为XbaI酶切位点；
SEQ No.6dhdps-R：5’-CCGGAATTC TCAGCCCAGGGCTGCCAGGTGC-3’横线处为EcoRI酶切位点。
步骤1)所述pIMEP质粒是含有红霉素抗性基因强启动子基因ermE*的链霉菌整合型载体，属于pSET152质粒的衍生质粒。
本发明中将重组质粒接合转移至链霉菌的步骤可以如下：
1)提取大肠杆菌DH5α阳性转化子中的重组质粒，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有卡那霉素(25ng/μL)、安普霉素(50ng/μL)和氯霉素(25ng/μL)的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有同样浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体3次除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；
2)在产孢较好的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenesTUST)贝纳特平板上加入0.05mol/L，pH为8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入等体积的2×预孢子萌发培养液，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子并重悬与LB培养基中备用；
其中，培养基配置方法如下：
2×孢子预萌发培养液(L)：酵母粉10g，酪蛋白氨基酸10g，CaCl2浓度为0.01mol/L。
贝纳特培养基(L)：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母浸粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L；
3)将步骤1)处理的大肠杆菌和步骤2)处理的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为25mg/mL的安普霉素的1mL无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌。
所述的SFM培养基成分可以为：2％琼脂糖，2％甘露醇，2％黄豆饼粉，pH 7.2-7.5。
本发明提供一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法和质粒，通过ask和dhdps分别在表达载体上表达，并将重组质粒整合至淀粉酶产色链霉菌TUST的染色体上进行高效表达，通过发酵实现提高ε-聚赖氨酸的发酵水平；
其中，所述ask的序列为SEQ No.1，dhdps的序列为SEQ No.2.
较优地，所述发酵的生产方法可以如下：
采用的菌株为过表达基因工程菌，将基因工程菌株接种在贝纳特培养基平板上，在28-37℃培养5-7d直至产生分生孢子；
然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在28-37℃，150-200rpm，培养30h，将培养好的种子液按6-10％转接到M3G培养基中摇瓶发酵72h；
所述M3G培养基成分：(NH4)2SO410g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO40.8g/L，酵母提取物5g/L，用用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL；
10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO4·7H2O和2ml 20×的MgSO4·7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min。
每使用900mLM3G培养基加入10mL10×的葡萄糖母液。
更为具体地，通过相关实施例来具体说明：
实施例1
一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌，构建步骤如下：
1)天冬氨酸激酶基因(ask)的获取：
以淀粉酶产色链霉菌基因组DNA为模板，利用引物ask-F/ask-R经PCR扩增ask全长，并在ask5’端加入XbaI酶切位点，在3’端加入EcoRI酶切位点。基因大小为1272bp。
其中：ask-F:5’-GCTCTAGAGTGGGCCTTGTCGTGCAGAAGTACGG-3’横线处为XbaI酶切位点，黑体为起始密码子；
ask-R：5’-CCGGAATTCTCATCGCCCGGTGCCGCCGATG-3’横线处为EcoRI酶切位点黑体为终止密码子。
PCR反应体系和条件：5×PrimeSTAR GXLBuffer 10μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，模板(20ng/ul)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，PrimeSTAR GXLDNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸90s，共循环30次，72℃延伸5min，16℃结束反应，得到目的基因ask。
2)过表达质粒pIMEP-ASK的构建：
将1)获得的ask片段和质粒pIMEP质粒经XbaI和EcoRI双酶切后进行连接，得到重组质粒pIMEP-ASK，构建图见图1。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中扩大培养，经XbaI和EcoRI双酶切验证，验证见图2，得到重组质粒pIMEP-ASK。
3)基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌ASK的获得：
质粒需要经过辅助质粒的帮助才能进入链霉菌内，具体步骤如下
a.将2)中得到的重组质粒pIMEP-ASK转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，涂布于含有卡那霉素(25ng/μL)、安普霉素(50ng/μL)和氯霉素(25ng/μL)的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有同样浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；
b.在产孢较好的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenesTUST)贝纳特平板上加入0.05mol/L，pH为8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入等体积的2×预孢子萌发培养液，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子并重悬与LB培养基中备用；
c.将步骤a处理的大肠杆菌和步骤b处理的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为25mg/mL的安普霉素的1mL无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆得到基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌。
实施例2
一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌，构建步骤如下：
1)二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dhdps)的获取：
以淀粉酶产色链霉菌基因组DNA为模板，利用引物dhdps-F/dhdps-R经PCR扩增dhdps全长，并在dhdps 5’端加入XbaI酶切位点，在3’端加入EcoRI酶切位点。基因大小为897bp。
其中：dhdps-F:5’-GGCTCTAGAATGGTTGATCGCACCCCCCTGGAGG-3’横线处为XbaI酶切位点，黑体为起始密码子；
dhdps-R：5’-CCGGAATTC TCAGCCCAGGGCTGCCAGGTGC-3’横线处为EcoRI酶切位点黑体为终止密码子。
PCR反应体系和条件：5×PrimeSTAR GXLBuffer 10μL，dNTP mixture(2.5mM)4μL，模板(20ng/ul)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，PrimeSTAR GXL DNAPolymerase 1μL，补超纯水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸60s，共循环30次，72℃延伸5min，16℃结束反应，得到目的基因dhdps。
2)过表达质粒pIMEP-DHDPS的构建：
将1)获得的dhdps片段和质粒pIMEP质粒经XbaI和EcoRI双酶切后进行连接，得到重组质粒pIMEP-DHDPS，构建图见图1。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中扩大培养，经XbaI和EcoRI双酶切验证，验证见图2，得到重组质粒pIMEP-DHDPS。
3)基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌DHDPS的获得：
质粒需要经过辅助质粒的帮助才能进入链霉菌内，具体步骤如下
a.将2)中得到的重组质粒pIMEP-DHDPS转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002，涂布于含有卡那霉素(25ng/μL)、安普霉素(50ng/μL)和氯霉素(25ng/μL)的抗性平板中，挑选阳性转化子于含有卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有同样浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；
b.在产孢较好的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenesTUST)贝纳特平板上加入0.05mol/L，pH为8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，将孢子悬液冷却至室温后加入等体积的2×预孢子萌发培养液，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集孢子并重悬与LB培养基中备用；
c.将步骤a处理的大肠杆菌和步骤b处理的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含浓度为25mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为25mg/mL的安普霉素的1mL无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆得到基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌。
实施例3
基因工程菌株的验证：
提取得到基因工程链霉菌的基因组DNA，设计验证引物aac-F/aac-R，以基因工程链霉菌的基因组DNA做模板扩增安普霉素抗性基因aac(3)IV。分别以原始菌株基因组DNA做为阴性对照，质粒pIMEP做为阳性对照，结果见图3。
其中，SEQ No.7aac-F：5’-GTGCAATACGAATGGCGAAAAG-3’
SEQ No.8aac-R：5’-TCAGCCAATCGACTGGCG-3’
PCR反应体系和条件：10X PCR Buffer 5μL，dNTPmixture(2.5mM)4μL，模板(20ng/ul)1μL，上、下游引物((10μM))各2μL，DMSO 2μL，TaKaRa Taq 1μL，补超纯水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸60s，共循环30次，72℃延伸5min，16℃结束反应。
实施例4
使用以上所述链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸产量的方法：
将链霉菌在贝纳特平板密集划线，在28-37℃培养5-7d直至产生孢子；然后，将-孢子接种至含有100mLM3G培养基的500mL三角瓶中，在28-37℃，150-200rpm发酵30h。以6-10％的接种量转移到新的100mL M3G培养基中发酵直72h，即得ε-聚赖氨酸。
其中，所述贝纳特培养基1L的组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L。
M3G培养基组分为：(NH4)2SO410g，KH2PO41.36g，K2HPO40.8g，酵母提取物5g，用氨水调节pH到7.2，用蒸馏水定容到900mL。
10×的葡萄糖母液：称取100g葡萄糖，加入2ml 500×ZnSO4·7H2O和2ml 20×的MgSO4·7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min。
每使用900mL的M3G培养基时加入10mL10×的葡萄糖母液。
摇瓶发酵72h后各菌株产量结果如图4，ask过表达菌株与原始菌株相比，产量提高了17.2％；dhdps过表达菌株与原始菌株相比，产量提高了25.8％。ask和dhdps过表达增强了二氨基庚二酸途径，使ε-聚赖氨酸产量提高。
本发明中使用到的相关基因序列可以如下：
1.SEQ No.1
天冬氨酸激酶基因ask序列
Figure BDA0002457656540000141
Figure BDA0002457656540000151
2、SEQ No.2
二氢吡啶二羧酸合成酶基因dhdps碱基序列
Figure BDA0002457656540000152
3、SEQ No.3
ask-F
gctctagagt gggccttgtc gtgcagaagt acgg                              34
4、SEQ No.4
ask-R
ccggaattct catcgcccgg tgccgccgat g                                 31
5、SEQ No.5
dhdps-F
gctctagaat ggttgatcgc acccccctgg agg                               33
6、SEQ No.6
dhdps-R
ccggaattct cagcccaggg ctgccaggtg c                                 31
7、SEQ No.7
aac-F
gtgcaatacg aatggcgaaa ag                                           22
8、SEQ No.8
aac-R
tcagccaatc gactggcg                                                18
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
                         序列表
<110>  天津科技大学
<120>  基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用
<160>  8
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  1272
<212>  DNA/RNA
<213>  天冬氨酸激酶基因ask序列(Unknown)
<400>  1
gtgggccttg tcgtgcagaa gtacggcggc tcatccgttg cggatgccga gggcatcaag 60
cgcgttgcca agcgaatcgt cgaggccaag aagaacggca accaggttgt cgtcgtggtc 120
tcggcgatgg gcgacacgac ggacgagctg atcgatctcg cgcaggaagt gtccccgatc 180
ccgtcgggac gcgagttcga catgctgctg accgccggag agcggatctc catggccctg 240
ctggcgatgg cgatcaaaaa cctcggccat gaggcgcagt ccttcaccgg tagccaggcc 300
ggtgtgatca ctgactccgt gcacaacaag gcacggatca tcgatgtcac gccgggccgc 360
atcaaggcgt ccctcgacga gggcaacatc gccatcgtcg ccggattcca gggcgtgtcc 420
caggacaaga aggacatcac gacgctcggg cgcggtggtt cggacaccac cgcggtggcg 480
ctcgccgccg ccctgaacgc cgatgtctgc gagatctaca ccgacgtcga cggcgtcttc 540
accgccgacc cgcgggtcgt gaagaaggcc cggaagatcg agtggatctc cttcgaggac 600
atgctggagc tggccagctc cggctccaag gtgctgctgc accgctgcgt cgagtacgca 660
cgccgttaca acatcccgat ccacgtccgc tcctccttct cggggctgca gggcacatgg 720
gtcagcaacg aaccgcaagg ggacaggccg atggaacagg cgatcatctc gggcgtcgca 780
cacgacacct ccgaggcgaa ggtcacggtc gtcggggtcc cggacaagcc gggcgaggcc 840
gcgcggatct tccgtgccat cgccgactcc gaggtcaaca tcgacatggt cgtccagaac 900
gtgtcggcgg cctccaccgg tctgacggac atctccttca cgctgccgaa ggccgagggc 960
cgcaaggccg tcgccgcgct ggagaagacc cgggccgcgg tcggcttcga ctcgctccgc 1020
tacgacgacc agatcgccaa gatctcgctg gtcggcgcgg gcatgaagac caaccccggc 1080
gtcaccgcga cgttcttcga ggcgctgtcg aacgcgggcg tgaacatcga gctcatctcg 1140
acctccgaga tccgcatctc ggtcgtcacc cgtgccgatg acgtcaacga ggccgtccag 1200
gcggtgcaca gcgccttcgg cctcgacagt gagaccgacg aagcagtcgt ctacggcggc 1260
accgggcgat ga                                                     1272
<210>  2
<211>  897
<212>  DNA/RNA
<213>  二氢吡啶二羧酸合成酶基因dhdps碱基序列(Unknown)
<400>  2
atggttgatc gcacccccct ggaggggatc cacgtaccgc tcgtcacgcc gttcgccgcc 60
gacgggcgga tcgccgagga ggccctggaa cggctcgcgc gcgggctgct cgacgcgggt 120
gccgcgggcc tggtcgccct cgggacgacc ggcgaacccg ccacgctgaa ggccgcggag 180
aagaccacgg tcgtcgaggt gtgcgcccgg gtctgccggg aacgccgggc gtcgctcctc 240
gtcggagccg ggagcaacgc cacgctggac agcgcggcgg ccctggccga actggcgcgg 300
tggcccgagg tcaccggcgc gctggtgccc gtcccctact tcacccggcc ctcgcccgac 360
ggagtcctgg cgcacttcgc cgagttggcg tccggcagcc cggtaccact ggtcgtctac 420
cacatcccct accgcaccgg caggtcgctc gacgggcaga ccctgcgaga gttggtgcgg 480
gtaccgggga tcgccggggt gaagtacgcg gccggcgcgg tcgaccgggc ggcggtggag 540
ctgctcggtg atctaccggc cggctgcgcg gtgttggcgg gggacgacgc cttcgcctca 600
ccgctgttgg cgctcggcgc ggcgggtgcc gtcctggcct cggcgaacct ggccccggca 660
ccgttcgtgg aattggccgc cgcctggcgc agcggggacg cccaccgggc acgagcgtgg 720
ggccacgccc tgtcaccgct gtcgacggca gtcttcgcgg agcccaaccc caccgtgatc 780
aaggcggtgt tgcacgccca gggccggatt cccacaccgg acgtgcggct gccgctgctg 840
cccgccggac ccgacgcggt gcacaccgcg ctcaagcacc tggcagccct gggctga    897
<210>  3
<211>  34
<212>  DNA/RNA
<213>  ask-F(Unknown)
<400>  3
gctctagagt gggccttgtc gtgcagaagt acgg                              34
<210>  4
<211>  31
<212>  DNA/RNA
<213>  ask-R(Unknown)
<400>  4
ccggaattct catcgcccgg tgccgccgat g                                 31
<210>  5
<211>  33
<212>  DNA/RNA
<213>  dhdps-F(Unknown)
<400>  5
gctctagaat ggttgatcgc acccccctgg agg                               33
<210>  6
<211>  31
<212>  DNA/RNA
<213>  dhdps-R(Unknown)
<400>  6
ccggaattct cagcccaggg ctgccaggtg c                                 31
<210>  7
<211>  22
<212>  DNA/RNA
<213>  aac-F(Unknown)
<400>  7
atggttgatc gcacccccct gg                                           22
<210>  8
<211>  18
<212>  DNA/RNA
<213>  aac-R(Unknown)
<400>  8
tcagcccagg gctgccag                                                18

Claims (2)

1.一种基因工程高产ɛ-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌（Streptomyces  diastatochromogenes），其特征在于：其构建步骤如下：
⑴提取大肠杆菌DH5α转化子中的重组质粒pIMEP-ASK或pIMEP-DHDPS，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有25ng/μL卡那霉素、50ng/μL安普霉素和25ng/μL氯霉素的LB平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37 ℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600=0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；
⑵向长满淀粉酶产色链霉菌TUST（Streptomyces diastatochromogenes TUST）灰色孢子的贝纳特培养基平板上加入0.05mol/L、pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30 ℃，180 r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50 ℃水浴热激10 min，将孢子悬液冷却至室温后加入2×孢子预萌发培养液，于37 ℃条件下震荡培养2-3 h使孢子萌发，5000 r/min 离心5 min收集孢子重悬于LB培养液中备用；
其中，每1L 2×孢子预萌发液培养基的组成为：
酵母粉10g，酪蛋白氨基酸10g，CaCl2浓度为0.01mol/L；
每1L贝纳特培养基的组成为：
葡萄糖 10 g，蛋白胨 2 g，酵母粉1 g，牛肉膏1 g，琼脂 15-20 g，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L；
⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5 mM MgCl2的无血清培养基上，30 ℃倒置培养14-18 h后，用含浓度为25 mg/mL的萘啶酮酸及含浓度为 25 mg/mL的安普霉素的无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性接合转移子单克隆，得到基因工程高产ɛ-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌；
所述重组质粒pIMEP-ASK为天冬氨酸激酶ask重组质粒pIMEP-ASK，该天冬氨酸激酶ask重组质粒pIMEP-ASK的构建步骤如下：
⑴目的片段基因的获得：根据ask基因设计引物序列ask-F/ask-R，在基因ask两端分别加入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在ask基因核苷酸序列的上游5’端添加8个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶XbaI的位点，在ask核苷酸序列的下游5’端添加9个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的ask基因；
所述引物ask-F/ask-R 的序列为：
ask-F：SEQ No.3；
ask-R：SEQ No.4；
所述ask的序列为SEQ No.1；
⑵重组质粒pIMEP-ASK的构建步骤如下：
用XbaI和EcoRI双酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，将扩增的ask基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-ASK，化学法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子保存；
所述重组质粒pIMEP- DHDPS为二氢吡啶二羧酸合成酶dhdps重组质粒pIMEP-DHDPS，该二氢吡啶二羧酸合成酶dhdps重组质粒pIMEP-DHDPS的构建步骤如下：
⑴目的片段基因的获得：根据dhdps基因设计引物序列dhdps-F/dhdps-R，在基因dhdps两端分别加入XbaI和EcoRI的酶切位点，其中在dhdps基因核苷酸序列的上游5’端添加8个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶XbaI的位点，在dhdps核苷酸序列的下游5’端添加9个核苷酸，形成保护碱基和限制性内切酶EcoRI的位点，PCR扩增淀粉酶产色链霉菌TUST中的dhdps基因；
所述引物dhdps-F/dhdps-R的序列为：
dhdps-F：SEQ No.5；
dhdps-R：SEQ No.6；
所述dhdps的序列为SEQ No.2；
⑵重组质粒pIMEP-DHDPS的构建步骤如下：
用XbaI和EcoRI双酶切整合有强启动子红霉素启动子ermE*的质粒pIMEP，将扩增的dhdps基因片段用XbaI和EcoRI双酶切后与双酶切后的pIMEP质粒进行连接，得到连接产物重组质粒pIMEP-DHDPS，化学法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子保存；
所述质粒pIMEP是在pSET152上加一个强启动子红霉素启动子，将红霉素启动子基因和质粒pSET152 经XbaI单酶切后用T4连接酶连接而成；
所述淀粉酶产色链霉菌TUST的名称为TUST1，分类名称为
Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No. 3145，保藏日期：2009年6 月29 日，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的基因工程高产ɛ-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌在提高ε-聚赖氨酸产量方面中的应用。
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