CN117737152A - 吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶在提高莫能菌素产量中的应用 - Google Patents
吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶在提高莫能菌素产量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶在提高莫能菌素产量中的应用。本发明发现吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶能够有效用于提高莫能菌素生产菌株的莫能菌素产量,提升莫能菌素产量的幅度为109%,说明改造出除了调控基因以外的外源基因也可起到增产作用,为有效提升莫能菌素产量、降低其生产成本提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,涉及吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶在提高莫能菌素产量中的应用。
背景技术
莫能菌素是由肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)产生的一类聚醚类的离子载体抗生素,广泛用于防治鸡、羔羊、犊牛、兔球虫病和促进反刍动物生长。莫能菌素具有控制瘤胃中挥发性脂肪酸比例,减少瘤胃中蛋白质的降解,降低饲料干物质消耗,改善营养物质利用率和提高动物能量利用率等作用。近些年,由于其在体外实验中对多种类型肿瘤细胞展现了良好的抑制活性,莫能菌素也被认为是潜在的抗肿瘤制剂。因此,如何高效生产莫能菌素的问题逐渐引起人们的重视。
目前对于如何通过基因改造提升莫能菌素产量的研究主要集中在调控基因的鉴定和改造上。如Lin等人发现过量表达全局碳代谢调控蛋白Crp对莫能菌素产量的提升幅度为31.5%(Lin,C.Y.et al.Regulatory Patterns of Crp on Monensin Biosynthesis inStreptomyces cinnamonensis.Microorganisms 8(2020).),Zhang等人发现过量表达全局调控因子DasR对莫能菌素产量的提升幅度为68.6%(Zhang,Y.et al.DasR positivelycontrols monensin production at two-level regulation in Streptomycescinnamonensis.Journal of industrial microbiology&biotechnology 43,1681-1692(2016).),Tang等人则鉴定出莫能菌素生物合成过程基因簇中的三个调控因子MonH,MonRI和MonRII,共同过表达这三个调控因子可带来莫能菌素74.3%的提升(Tang,Z.K.etal.Characterization ofthree pathway-specific regulators for high productionof monensin in Streptomyces cinnamonensis.Applied microbiology andbiotechnology 101,6083-6097(2017).)。
综上所述,目前关于如何改造调控基因以提升莫能菌素产量的研究已有报道,然而,目前改造的提升效果有限,此外,对于基因组内源或外源的其它类别基因是否仍可以影响及如何影响莫能菌素的合成,目前仍不清楚,因此,如何有效提高莫能菌素的产量,仍是莫能菌素研究领域亟需解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶在提高莫能菌素产量中的应用,以期为实提高莫能菌素产量提供新方法、新思路。
为达上述目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶在提高莫能菌素产量中的应用。
本发明中,发现吡咯喹啉醌能够促进莫能菌素生产菌株(如肉桂地链霉菌Streptomyces cinnamonensis等)生产莫能菌素,直接使用吡咯喹啉醌培养或在细胞内表达其合成前体和合成酶均能有效提高莫能菌素产量,莫能菌素产量的提升幅度可达109%。
本发明中,所述吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quineone,PQQ),是一种水溶性的有机化合物,分子式为C14H6N2O8。其结构由一个喹啉酮环和一个吡咯醌环构成。PQQ是一种酶辅因子,广泛存在于细菌中,用于部分氧化还原反应。PQQ的合成过程包括七个步骤,涉及4种Pqq酶(PqqB-E)和相应的前体分子(PqqA)。这个过程首先以PqqA(前体肽)和PqqE的互作为起点,然后经过一系列复杂的反应,包括环化、氧化、脱氨基和类酮肽键的形成,最终在PqqC酶的作用下形成PQQ。
优选地,所述合成前体包括前体肽PqqA,所述合成酶包括PqqB酶、PqqC酶、PqqD酶和PqqE酶。
第二方面,本发明提供一种生产莫能菌素的工程菌,所述工程菌表达前体肽PqqA、PqqB酶、PqqC酶、PqqD酶和PqqE酶;所述工程菌的出发菌株包括莫能菌素生产菌株。
优选地,所述莫能菌素生产菌株包括肉桂地链霉菌Streptomycescinnamonensis。
优选地,所述肉桂地链霉菌Streptomyces cinnamonensis包括Streptomycescinnamonensis ATCC15413。
优选地,所述前体肽PqqA的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
优选地,所述PqqB酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
优选地,所述PqqC酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
优选地,所述PqqD酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
优选地,所述PqqE酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
SEQ ID NO.1:
MNDTTPHTAPEATDRTRTDAGETAWQTPDYVVVETALEVTAYSLNAR。
SEQ ID NO.2:
MRVRVLGTAAGGGVPQWNCACPGCSGARAHPGWRRRHASLAVQAAEGRWYLVNATPDLGEQVEDCPELHPGPEPRRTPLAGVILTDAELDHTLGIARLREADGIEIVATAPVRHALLTGLHLGEVLTPYARLDWRPLGPEDRPLAEDSRLVVGAVPVSAKRPRYAAGLDAPGDDAPDDDAWVVALRLTDRTTGRTLLYAPALAAWPDAFQRAAESADHVIVDGTFWSDNEPLTSGFGSRTATAMGHLPIDGPDGTARRLAALHARTLYTHLNNTNPLNDPAAPQHTVLRELGVEVAADGMVIDL。
SEQ ID NO.3:
VSTPRTRLEERLRAVAQERYHDRHPFNVRMHAGELTPAELRRWILNRFHYQRHIPVKDALITAKLDTARLRRMWLRRIQDHDGAADGEGGIERWLRLGEAAGLDRDRLLSGAEVVPGVRLAVDGYVNFCRLRGPLEAVAASLTELSAPGIMLTRIDAFERYYPWIEREGLAYFRNRVDQGRRDSTEALDLVLTWARTPEDEDRAVAALAFKCDVLWSLLDAVEHADTKDGPGEG。
SEQ ID NO.4:
MTAADTPPAPDTSPAPETPPVPPAPAGWRPALAPAVSLRHDRVRDAELLVLPERVVVLRGSAARILRLCDGARDLDAIVAELTSRFPGAPVAEDVPAFLGRMRTEGWVR。
SEQ ID NO.5:
MTAAPRPWALLAELTHGCPLHCPYCSNPLELVRRSRELSTAEWTQVMRQAGEFGVVHTHLSGGEPLLRRDLAEIVTAAESAGIYTQLVTSGVGLDEARLAALIAAGLRSVQLSLQHADPAASDRIAGYRSFAAKERAAALVREAGLPLGINVVLHRDNLDALDAIVQRGLDWGADRIELANTQFYGWALRNRDALLPTRDQLARARETVERRRQRLGGTVDLVWVVPDYFDGVAKPCMGGWGAVSLTVAPDGTALPCPAAASLPDLDPPNVRDHTLEWIWDHSTAFNRYRGEEWMREPCRTCSRRTEDFGGCRCQAYALTGDAARTDPACALSPDHGVIRALTDAGHPAGVQAPARTGGYAYRKPGGG。
第三方面,本发明提供第一方面所述的生产莫能菌素的工程菌的构建方法,所述构建方法包括:
将所述前体肽PqqA、PqqB酶、PqqC酶、PqqD酶和PqqE酶的编码基因导入到莫能菌素生产菌株中。
优选地,所述前体肽PqqA的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
优选地,所述PqqB酶的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
优选地,所述PqqC酶的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
优选地,所述PqqD酶的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
优选地,所述PqqE酶的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。
SEQ ID NO.6:
atgaacgacaccacaccgcacacagctcccgaggcgacggaccggacccgtacggacgccggggaaaccgcctggcagacgcccgactacgtggtcgtggagaccgcgctggaggtcaccgcctactcgctgaacgcccgctga。
SEQ ID NO.7:
atgcgcgtgcgcgtgctcggcaccgcggcgggtggcggcgtaccccagtggaactgcgcgtgccccggatgctccggggcacgcgcccacccggggtggcgccgccgccatgcctcgctcgccgtccaggccgccgaaggccgctggtatctggtcaacgccacccccgacctcggcgaacaggtcgaggactgccccgagttgcaccccggacccgaaccgcgccggaccccgctggccggggtgatcctcaccgacgccgaactcgaccacaccctcggcatcgcccggctgcgcgaggcggacggcatcgagatcgtggccaccgccccggtccggcacgccctgctgaccggactccatctgggcgaggtcctcaccccgtacgcccggctggactggcgtcccctcggtcccgaggaccggccgctcgccgaggactcccgcctcgtcgtcggcgccgtccccgtctccgccaaacgcccccgctacgcggccggactcgacgccccgggcgacgacgccccggacgacgacgcctgggtggtcgccctgcggctgaccgaccgcaccaccggccgcaccctcctctacgcccccgcgctcgccgcctggcccgacgccttccagcgtgccgccgagagcgccgaccacgtcatcgtcgacggcacgttctggtccgacaacgagcccctcaccagcggcttcggctcgcgtaccgccaccgccatggggcatctgccgatcgacggaccggacggcacggcgcggcggctcgccgcactccatgcgcgcaccctgtacacccacctcaacaacaccaaccccctcaacgacccggccgcgccccagcacacggtgctgcgcgagctgggcgtcgaggtggccgccgacgggatggtgatcgacctgtga。
SEQ ID NO.8:
gtgagcaccccacggacacgtcttgaggagcggctgcgcgcggtcgcgcaggagcgctaccacgaccgccaccccttcaacgtacggatgcacgcgggcgagctcacccccgccgaactgcgccgctggatcctcaaccgcttccactaccagcgccacatccccgtcaaggacgcgctgatcaccgccaaactcgacaccgcacggctgcgccggatgtggctgcggcgtatccaggaccacgacggcgccgccgacggcgagggcggcatcgagcgatggctgcggctaggcgaggccgccggcctggaccgggaccggctgctgtccggcgccgaggtggtgcccggggtgcggctcgcggtcgacggctatgtcaacttctgccggttgcgcggcccgctggaagccgtcgccgcctcgctcaccgagctgtccgcgcccggcatcatgctcacccgtatcgacgccttcgagcggtactacccctggatcgagcgcgagggcctggcctacttccgcaaccgggtcgaccagggacgccgggacagcaccgaggcgctcgacctggtcctgacctgggcgcggacccccgaggacgaggaccgcgcggtggcggcgctcgccttcaaatgcgatgtgctgtggtcgctgctggacgcggtcgagcacgccgacaccaaggacggccccggggagggggcatga。
SEQ ID NO.9:
atgaccgccgccgacaccccgcccgccccggacacctcacccgccccggagaccccgcccgttccgcccgccccggccggatggcggcccgcgctggcccccgcggtgagcctgcgccacgaccgggtgcgtgacgccgagctgctggtgctgcccgagcgggtggtggtgctgcggggcagtgccgcgcggatcctgcggctctgcgacggcgcccgcgacctcgacgccatcgtggcggagctcacgagccgcttccccggcgcgcccgtggccgaggacgtgcccgccttcctcggccggatgcgtacggagggctgggtccgatga。
SEQ ID NO.10:
atgaccgccgcgccccgcccctgggccctgctcgccgagctcacccacggctgcccgctgcactgcccctactgctccaacccgctggagctggtccgccgctcgcgtgagctgtccaccgccgagtggacgcaggtgatgcgccaggccggggagttcggcgtggtgcacacccatctctccggcggggaaccgctgttgcgccgcgatctggccgagatcgtcaccgccgccgagtccgccgggatctacacccagctcgtcaccagcggtgtgggcctggacgaggcccggctggccgccctgatcgccgccgggctgcgcagtgtccagctctccctgcagcacgccgacccggccgcctccgaccggatcgccgggtaccgctcgttcgccgccaaggagcgggccgccgccctggtgcgcgaggccggtctgccgctcgggatcaatgtcgtcctgcaccgcgacaacctcgacgcgctcgacgccatcgtccagcgcggcctggactggggcgccgaccggatcgagctggccaacacccagttctacggctgggcgctgcgcaaccgcgacgccctgctgcccacccgcgaccagctcgcccgggcgcgggagacggtcgagcgccggcggcagcggctgggcggcaccgtcgacctggtgtgggtcgtgcccgactacttcgacggcgtcgccaagccctgcatgggcggctggggcgcggtctcgctgaccgtcgcgcccgacggcaccgcgctgccctgccccgccgccgcgagcctgccggacctggacccgcccaatgtgcgcgaccacaccctggagtggatctgggaccactccaccgccttcaaccgctaccggggcgaggagtggatgcgcgagccgtgccgcacctgctcccgccgcaccgaggacttcggcggctgccgctgccaggcgtacgccctgaccggcgacgccgcccgtaccgacccggcctgcgcgctctccccggaccacggcgtgatccgcgcgctgacggacgccgggcacccggccggagtacaggccccggcgcggaccggcggctatgcgtaccgcaagcccggaggagggtga。
可以理解,本发明中可以单独使用个编码基因,也可以以整体基因簇的形式使用吡咯喹啉醌合成基因,具体地,吡咯喹啉醌合成基因簇(shxm_1453-shxm_1457)可由Streptomyces hygroscopicus XM201中扩增出,核酸序列包括SEQ ID NO.11所示的序列。
SEQ ID NO.11:
atgaacgacaccacaccgcacacagctcccgaggcgacggaccggacccgtacggacgccggggaaaccgcctggcagacgcccgactacgtggtcgtggagaccgcgctggaggtcaccgcctactcgctgaacgcccgctgagctccccgccatgcgcgtgcgcgtgctcggcaccgcggcgggtggcggcgtaccccagtggaactgcgcgtgccccggatgctccggggcacgcgcccacccggggtggcgccgccgccatgcctcgctcgccgtccaggccgccgaaggccgctggtatctggtcaacgccacccccgacctcggcgaacaggtcgaggactgccccgagttgcaccccggacccgaaccgcgccggaccccgctggccggggtgatcctcaccgacgccgaactcgaccacaccctcggcatcgcccggctgcgcgaggcggacggcatcgagatcgtggccaccgccccggtccggcacgccctgctgaccggactccatctgggcgaggtcctcaccccgtacgcccggctggactggcgtcccctcggtcccgaggaccggccgctcgccgaggactcccgcctcgtcgtcggcgccgtccccgtctccgccaaacgcccccgctacgcggccggactcgacgccccgggcgacgacgccccggacgacgacgcctgggtggtcgccctgcggctgaccgaccgcaccaccggccgcaccctcctctacgcccccgcgctcgccgcctggcccgacgccttccagcgtgccgccgagagcgccgaccacgtcatcgtcgacggcacgttctggtccgacaacgagcccctcaccagcggcttcggctcgcgtaccgccaccgccatggggcatctgccgatcgacggaccggacggcacggcgcggcggctcgccgcactccatgcgcgcaccctgtacacccacctcaacaacaccaaccccctcaacgacccggccgcgccccagcacacggtgctgcgcgagctgggcgtcgaggtggccgccgacgggatggtgatcgacctgtgagcaccccacggacacgtcttgaggagcggctgcgcgcggtcgcgcaggagcgctaccacgaccgccaccccttcaacgtacggatgcacgcgggcgagctcacccccgccgaactgcgccgctggatcctcaaccgcttccactaccagcgccacatccccgtcaaggacgcgctgatcaccgccaaactcgacaccgcacggctgcgccggatgtggctgcggcgtatccaggaccacgacggcgccgccgacggcgagggcggcatcgagcgatggctgcggctaggcgaggccgccggcctggaccgggaccggctgctgtccggcgccgaggtggtgcccggggtgcggctcgcggtcgacggctatgtcaacttctgccggttgcgcggcccgctggaagccgtcgccgcctcgctcaccgagctgtccgcgcccggcatcatgctcacccgtatcgacgccttcgagcggtactacccctggatcgagcgcgagggcctggcctacttccgcaaccgggtcgaccagggacgccgggacagcaccgaggcgctcgacctggtcctgacctgggcgcggacccccgaggacgaggaccgcgcggtggcggcgctcgccttcaaatgcgatgtgctgtggtcgctgctggacgcggtcgagcacgccgacaccaaggacggccccggggagggggcatgaccgccgccgacaccccgcccgccccggacacctcacccgccccggagaccccgcccgttccgcccgccccggccggatggcggcccgcgctggcccccgcggtgagcctgcgccacgaccgggtgcgtgacgccgagctgctggtgctgcccgagcgggtggtggtgctgcggggcagtgccgcgcggatcctgcggctctgcgacggcgcccgcgacctcgacgccatcgtggcggagctcacgagccgcttccccggcgcgcccgtggccgaggacgtgcccgccttcctcggccggatgcgtacggagggctgggtccgatgaccgccgcgccccgcccctgggccctgctcgccgagctcacccacggctgcccgctgcactgcccctactgctccaacccgctggagctggtccgccgctcgcgtgagctgtccaccgccgagtggacgcaggtgatgcgccaggccggggagttcggcgtggtgcacacccatctctccggcggggaaccgctgttgcgccgcgatctggccgagatcgtcaccgccgccgagtccgccgggatctacacccagctcgtcaccagcggtgtgggcctggacgaggcccggctggccgccctgatcgccgccgggctgcgcagtgtccagctctccctgcagcacgccgacccggccgcctccgaccggatcgccgggtaccgctcgttcgccgccaaggagcgggccgccgccctggtgcgcgaggccggtctgccgctcgggatcaatgtcgtcctgcaccgcgacaacctcgacgcgctcgacgccatcgtccagcgcggcctggactggggcgccgaccggatcgagctggccaacacccagttctacggctgggcgctgcgcaaccgcgacgccctgctgcccacccgcgaccagctcgcccgggcgcgggagacggtcgagcgccggcggcagcggctgggcggcaccgtcgacctggtgtgggtcgtgcccgactacttcgacggcgtcgccaagccctgcatgggcggctggggcgcggtctcgctgaccgtcgcgcccgacggcaccgcgctgccctgccccgccgccgcgagcctgccggacctggacccgcccaatgtgcgcgaccacaccctggagtggatctgggaccactccaccgccttcaaccgctaccggggcgaggagtggatgcgcgagccgtgccgcacctgctcccgccgcaccgaggacttcggcggctgccgctgccaggcgtacgccctgaccggcgacgccgcccgtaccgacccggcctgcgcgctctccccggaccacggcgtgatccgcgcgctgacggacgccgggcacccggccggagtacaggccccggcgcggaccggcggctatgcgtaccgcaagcccggaggagggtga。
优选地,所述构建方法具体包括:
将所述前体肽PqqA、PqqB酶、PqqC酶、PqqD酶和PqqE酶的编码基因插入到表达载体中,得到重组载体,将所述重组载体导入到肉桂地链霉菌Streptomyces cinnamonensis中。
优选地,所述表达载体包括pLQ646载体,核酸序列如SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.12:
atctacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcgcagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgttgatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaatttatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgggctgcaggtcgactctagagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccgcgggatcctgttcacattcgaacggtctctgctttgacaacatgctgtgcggtgttgtaaagtcgtggccaggagaatacgacagcgtgcaggactgggggagttactagtatctgagttgaagaggtgacgtccatatgctctgatccattgcccctgccacctcactcgcctgcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggcaagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtggctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctgcggccgcatatcaattgatatgaattcgtaatcatgtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttggttcatgtgcagctccatcagcaaaaggggatgataagtttatcaccaccgactatttgcaacagtgccgttgatcgtgctatgatcgactgatgtcatcagcggtggagtgcaatgtcgtgcaatacgaatggcgaaaagccgagctcatcggtcagcttctcaaccttggggttacccccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggcccctcgaagatgggccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggagggacgctcgtcatgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtctctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccatccatttgcctttgcggcagcggggccacaggcagagcagatcatctctgatccattgcccctgccacctcactcgcctgcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggcaagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtggctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctttgctcggttgatccgctcccgcgacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccgttgatcttcctgcatccgccagaggcgggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggctgagctcatgagcggagaacgagatgacgttggaggggcaaggtcgcgctgattgctggggcaacacgtggagcggatcggggattgtctttcttcagctcgctgatgatatgctgacgctcaatgccgtttggcctccgactaacgaaaatcccgcatttggacggctgatccgattggcacggcggacggcgaatggcggagcagacgctcgtccgggggcaatgagatatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtatcgggccctggccagctagctagagtcgacctgcaggtccccggggatcggtcttgccttgctcgtcggtgatgtacttcaccagctccgcgaagtcgctcttcttgatggagcgcatggggacgtgcttggcaatcacgcgcaccccccggccgttttagcggctaaaaaagtcatggctctgccctcgggcggaccacgcccatcatgaccttgccaagctcgtcctgcttctcttcgatcttcgccagcagggcgaggatcgtggcatcaccgaaccgcgccgtgcgcgggtcgtcggtgagccagagtttcagcaggccgcccaggcggcccaggtcgccattgatgcgggccagctcgcggacgtgctcatagtccacgacgcccgtgattttgtagccctggccgacggccagcaggtaggccgacaggctcatgccggccgccgccgccttttcctcaatcgctcttcgttcgtctggaaggcagtacaccttgataggtgggctgcccttcctggttggcttggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccggctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaaggatggatataccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaagatccgtcgacctgcaggcatgcaagctctagcgattccagacgtcccgaaggcgtggcgcggcttccccgtgccggagcaatcgccctgggtgggttacacgacgcccctctatggcccgtactgacggacacaccgaagccccggcggcaaccctcagcggatgccccggggcttcacgttttcccaggtcagaagcggttttcgggagtagtgccccaactggggtaacctttgagttctctcagttgggggcgtagggtcgccgacatgacacaaggggttgtgaccggggtggacacgtacgcgggtgcttacgaccgtcagtcgcgcgagcgcgagagttcgagcgcagcaagcccagcgacacagcgtagcgccaacgaagacaaggcggccgaccttcagcgcgaagtcgagcgcgacgggggccggttcaggttcgtcgggcatttcagcgaagcgccgggcacgtcggcgttcgggacggcggagcgcccggagttcgaacgcatcctgaacgaatgccgcgccgggcggctcaacatgatcattgtctatgacgtgtcgcgcttctcgcgcctgaaggtcatggacgcgattccgattgtctcggaattgctcgccctgggcgtgacgattgtttccactcaggaaggcgtcttccggcagggaaacgtcatggacctgattcacctgattatgcggctcgacgcgtcgcacaaagaatcttcgctgaagtcggcgaagattctcgacacgaagaaccttcagcgcgaattgggcgggtacgtcggcgggaaggcgccttacggcttcgagcttgtttcggagacgaaggagatcacgcgcaacggccgaatggtcaatgtcgtcatcaacaagcttgcgcactcgaccactccccttaccggacccttcgagttcgagcccgacgtaatccggtggtggtggcgtgagatcaagacgcacaaacaccttcccttcaagccgggcagtcaagccgccattcacccgggcagcatcacggggctttgtaagcgcatggacgctgacgccgtgccgacccggggcgagacgattgggaagaagaccgcttcaagcgcctgggacccggcaaccgttatgcgaatccttcgggacccgcgtattgcgggcttcgccgctgaggtgatctacaagaagaagccggacggcacgccgaccacgaagattgagggttaccgcattcagcgcgacccgatcacgctccggccggtcgagcttgattgcggaccgatcatcgagcccgctgagtggtatgagcttcaggcgtggttggacggcagggggcgcggcaaggggctttcccgggggcaagccattctgtccgccatggacaagctgtactgcgagtgtggcgccgtcatgacttcgaagcgcggggaagaatcgatcaaggactcttaccgctgccgtcgccggaaggtggtcgacccgtccgcacctgggcagcacgaaggcacgtgcaacgtcagcatggcggcactcgacaagttcgttgcggaacgcatcttcaacaagatcaggcacgccgaaggcgacgaagagacgttggcgcttctgtgggaagccgcccgacgcttcggcaagctcactgaggcgcctgagaagagcggcgaacgggcgaaccttgttgcggagcgcgccgacgccctgaacgcccttgaagagctgtacgaagaccgcgcggcaggcgcgtacgacggacccgttggcaggaagcacttccggaagcaacaggcagcgctgacgctccggcagcaaggggcggaagagcggcttgccgaacttgaagccgccgaagccccgaagcttccccttgaccaatggttccccgaagacgccgacgctgacccgaccggccctaagtcgtggtgggggcgcgcgtcagtagacgacaagcgcgtgttcgtcgggctcttcgtagacaagatcgttgtcacgaagtcgactacgggcagggggcagggaacgcccatcgagaagcgcgcttcgatcacgtgggcgaagccgccgaccgacgacgacgaagacgacgcccaggacggcacggaagacgtagcggcgtagcgagacacccgggaagcctg。
第四方面,本发明提供一种生产莫能菌素的方法,所述方法包括:
在培养基中添加吡咯喹啉醌,培养莫能菌素生产菌株,收集细胞并进行产物纯化;或者,
培养第二方面所述的生产莫能菌素的工程菌,收集细胞并进行产物纯化。
优选地,所述莫能菌素生产菌株肉桂地链霉菌Streptomyces cinnamonensis。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明发现吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶能够有效用于提高莫能菌素生产菌株的莫能菌素产量,提升莫能菌素产量的幅度为109%,而目前改造调控基因Crp、DasR、MonH、MonRI和MonRII对莫能菌素的提升幅度分别为31.5%,68.6%和74.3%,说明改造出除了调控基因以外的外源基因也可起到增产作用,为有效提升莫能菌素产量、降低其生产成本提供新思路。
附图说明
图1为带有吡咯喹啉醌合成基因簇的表达载体图谱;
图2A为莫能菌素结构示意图;
图2B为莫能菌素质谱检测图;
图3为表达吡咯喹啉醌合成基因后莫能菌素的产量变化图;
图4为添加吡咯喹啉醌后莫能菌素的产量变化图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
吡咯喹啉醌合成基因簇片段克隆。
取1mL Streptomyces hygroscopicus XM201的菌株培养液,利用细菌基因组提取试剂盒(天根)抽取XM201的总基因组DNA。利用引物FP:TGAGTTGAAGAGGTGACGTCCATATGATGAACGACACCACACCGC,RP:AACAGCTATGACATGATTACGAATTCTCACCCTCCTCCGGGCTT。通过PhantaMax Super-Fidelity DNAPolymerase(诺唯赞)扩增带有吡咯喹啉醌及与pLQ646组装接头的片段,大小约为3.4kb。扩增体系如表1所示。
表1
试剂 | 体积/μL |
2×PCR Mix buffer | 25 |
dNTP | 1 |
DNA聚合酶 | 1 |
XM201基因组DNA | 1 |
FP | 2 |
RP | 2 |
50%DMSO | 5 |
无菌水 | 13 |
总计 | 50 |
PCR扩增条件为:95℃预变性10min;95℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸3.5min,30个循环;72℃延伸10min。通过琼脂糖凝胶电泳检测条带正确性。
实施例2
本实施例进行基因簇片段与载体pLQ646的Gibson组装。
利用NdeI和EcoRI酶切链霉菌表达载体pLQ646,并通过Gel ExtractionKit(Omega)分别回收线性化的pLQ646及带有吡咯喹啉醌的PCR片段。采用Gibson组装克隆试剂盒(NEB)组装载体和片段,带有吡咯喹啉醌合成基因簇的表达载体图谱如图1,其中1453-57为吡咯喹啉醌合成基因序列,通过Gibson组装连入pLQ646的NdeI、EcoRI位点。首先配置Gibson Assembly Master Mix。按照表2配制Gibson体系。
表2
试剂 | 体积/μL |
Gibson试剂 | 6 |
线性化的pLQ646 | 2 |
吡咯喹啉醌PCR片段 | 2 |
总计 | 10 |
将上述体系置于50℃反应50min,之后立即转移至冰上。
实施例3
本实施例进行Gibson组装产物转化及阳性克隆筛选
-80℃保存的E.coli DH5α感受态于冰上融化,每管加入10μL组装产物,在冰上继续放置10min。之后转移至42℃水浴热激90s。重新放置于冰上90s。每管加入500μL的LB培养基,放置于37℃摇床中恢复培养30min。之后涂布于加有安普霉素的LB固体培养基上,37℃倒置培养12h。
待长出单克隆后,挑取8个单克隆至添加有安普霉素的LB液体培养基中,37℃培养7h,后通过Vazyme,2×Rapid Taq Master Mix(诺唯赞),利用引物FP:GATTAAGTTGGGTAACGCCA,RP:GTTGTGTGGAATTGTGAGC,筛选可以扩增出3.5kb片段的阳性克隆。验证PCR体系的配制方法如表3所示。
表3
PCR扩增条件为:95℃预变性10min;95℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;72℃延伸10min。通过琼脂糖凝胶电泳检测条带正确性。
实施例4
本实施例进行重组载体转化入大肠杆菌接合转移菌株ET12567(pUZ8002)。
-80℃保存的E.coli ET12567(pUZ8002)感受态于冰上融化,每管加入5μL构建好的重组载体,在冰上继续放置10min。之后转移至42℃水浴热激90s。重新放置于冰上90s。每管加入500μL的LB培养基,放置于37℃摇床中恢复培养30min。之后涂布于加有安普霉素的LB固体培养基上,37℃倒置培养12h。
待长出单克隆后,挑取8个单克隆至添加有安普霉素的LB液体培养基中,37℃培养7h,后通过Vazyme,2×Rapid Taq Master Mix(诺唯赞),利用引物FP:GATTAAGTTGGGTAACGCCA,RP:GTTGTGTGGAATTGTGAGC,筛选可以扩增出3.5kb片段的阳性克隆。
实施例5
本实施例进行链霉菌-大肠杆菌属间接和转移。
在含有卡那霉素、氯霉素以及安普霉素的LB平板上活化含有重组质粒的E.coliET12567/pUZ8002,37℃过夜培养后,挑取单克隆到5mL的LB(含上述抗生素1:1,000)中,37℃培养,20h后离心收集菌体,LB洗两次,利用500μL的LB重悬。
将S.cinnamonensis ATCC15413的菌种涂布于固体SFM平板活化,30℃培养2天。挑取约1cm2带有菌丝体的琼脂块于10.3%的TSBY培养基中(3%胰蛋白胨大豆肉汤(TryptoneSoya Broth),0.5%酵提取物母(Yeast Extract),10.3%蔗糖(Sucrose))中,30℃培养17h。离心收集菌丝体,用无抗的LB洗两次,利用500μL的LB重悬。
将LB重悬的菌丝体与E.coli按照1:1充分混匀,均匀涂布于含10mM Mg2+的SFM平板,37℃倒置培养。12h后,用含有2mg萘啶酮酸和2mg安普霉素的无菌水覆盖。将平板吹干后,30℃倒置培养。
实施例6
本实施例筛选阳性克隆。
将接合子划线到含有萘啶酮酸、安普霉素的SFM平板上,待长出单克隆后,挑到加有安普霉素的TSBY培养基中进行培养。2天后使用该菌液、转入重组质粒的ET菌株作为正对照、野生型S.cinnamonensisATCC15413基因组作为负对照进行PCR验证。通过Vazyme,2×Rapid Taq Master Mix(诺唯赞),利用引物FP:GATTAAGTTGGGTAACGCCA,RP:GTTGTGTGGAATTGTGAGC,筛选可以扩增出3.5kb片段的阳性克隆。验证PCR体系的配制方法如表4所示。
表4
PCR扩增条件为:95℃预变性10min;95℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;72℃延伸10min。通过琼脂糖凝胶电泳检测条带正确性。
实施例7
本实施例进行莫能菌素发酵。
将转入重组载体的S.cinnamonensis ATCC15413菌株涂布于SFM固体培养基,30℃固体培养8天。以转入空载体的S.cinnamonensisATCC15413菌株作为对照。发酵时用无菌接种铲挖成熟斜面上的孢子,接种于装量为25mL/250mL的种子培养摇瓶中,置于30℃、220rpm旋转式摇床上培养48hr。然后接种10%到摇瓶发酵培养基中,装量仍为25mL/250mL,于30℃、220rpm培养10天。
其中,种子培养基的配方为(g/100mL):糊精2.0,低温黄豆粉1.5,酵母提取物0.25,葡萄糖0.5,用NaOH调pH 6.7~6.8,再加入CaCO30.1。
发酵培养基的配方为(g/100mL):豆油2.0,葡萄糖4.5,低温黄豆粉4,NaNO30.22,Na2SO40.22,Al2(SO4)30.007,硫酸亚铁0.01,氯化锰0.033,磷酸氢二钾0.0075,CaCO30.25,pH 6.7~6.8。
实施例8
本实施例进行莫能菌素发酵。
将野生型的S.cinnamonensisATCC15413菌株涂布于SFM固体培养基,30℃固体培养2天,发酵时切取约1cm2琼脂块接种于装量为1.5mL/孔的24孔深孔板中,置于30℃、800rpm旋转式摇床上培养48h。然后转接10%的种子液到装有发酵培养基的24孔深孔板中,装量为2.5mL/孔,于30℃、220rpm培养5天。在发酵第2天,加入终浓度为4nM的吡咯喹啉醌并继续发酵。
其中,种子培养基的配方为(g/100mL):糊精2.0,低温黄豆粉1.5,酵母提取物0.25,葡萄糖0.5,用NaOH调pH 6.7~6.8,再加入CaCO30.1。
发酵培养基的配方为(g/100mL):豆油2.0,葡萄糖4.5,低温黄豆粉4,NaNO30.22,Na2SO40.22,Al2(SO4)30.007,硫酸亚铁0.01,氯化锰0.033,磷酸氢二钾0.0075,CaCO30.25,pH 6.7~6.8。
实施例9
本实施例进行莫能菌素检测及定量。
实施例7、8发酵结束后,吸取100μL发酵产物,加入900μL甲醇,混匀后超声30min。12,000rpm离心1min后,上清用0.22μm的滤膜过滤。过滤之后,再用甲醇稀释10倍,即总共稀释100倍。
利用装有C18色谱柱的Agilent 6470三重四极杆液质联用系统分析处理后的发酵液。流动相为5%A(0.1%甲酸水)/95%B(乙腈)。流速0.3mL/min,10min/样品。质谱检测模式为MRM负模式,母/子离子对为669/637,莫能霉素化学结构如图2A所示,质谱检测图如图2B所示(示例展示实施例7结果)。
表达吡咯喹啉醌合成基因后莫能菌素的产量变化如图3所示,空载体对照为S.cinnamonensis转入未连有基因的骨架载体后所得菌株的发酵产量,吡咯喹啉醌合成基因为S.cinnamonensis转入吡咯喹啉醌合成基因表达元件后所得菌株的发酵产量,可见,在莫能菌素生产菌株中表达吡咯喹啉醌的合成前体和合成酶,能够有效提高莫能菌素的产量;野生型的S.cinnamonensisATCC15413菌添加吡咯喹啉醌发酵的莫能菌素产量结果如图4所示,可见,在莫能菌素生产菌株的培养基中添加吡咯喹啉醌进行发酵,能够有效提高莫能菌素的产量。
综上所述,本发明发现吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶能够有效用于提高莫能菌素生产菌株的莫能菌素产量,提升莫能菌素产量的幅度为109%,说明改造出除了调控基因以外的外源基因也可起到增产作用,为有效提升莫能菌素产量、降低其生产成本提供新思路。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.吡咯喹啉醌及其合成前体和合成酶在提高莫能菌素产量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述合成前体包括前体肽PqqA,所述合成酶包括PqqB酶、PqqC酶、PqqD酶和PqqE酶。
3.一种生产莫能菌素的工程菌,其特征在于,所述工程菌表达前体肽PqqA、PqqB酶、PqqC酶、PqqD酶和PqqE酶;
所述工程菌的出发菌株包括莫能菌素生产菌株。
4.根据权利要求3所述的生产莫能菌素的工程菌,其特征在于,所述莫能菌素生产菌株包括肉桂地链霉菌Streptomyces cinnamonensis;
优选地,所述肉桂地链霉菌Streptomyces cinnamonensis包括Streptomycescinnamonensis ATCC15413。
5.根据权利要求3或4所述的生产莫能菌素的工程菌,其特征在于,所述前体肽PqqA的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列;
优选地,所述PqqB酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列;
优选地,所述PqqC酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列;
优选地,所述PqqD酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列;
优选地,所述PqqE酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
6.权利要求3-5任一项所述的生产莫能菌素的工程菌的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括:
将所述前体肽PqqA、PqqB酶、PqqC酶、PqqD酶和PqqE酶的编码基因导入到莫能菌素生产菌株中。
7.根据权利要求6所述的生产莫能菌素的工程菌的构建方法,其特征在于,所述前体肽PqqA的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列;
优选地,所述PqqB酶的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列;
优选地,所述PqqC酶的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列;
优选地,所述PqqD酶的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列;
优选地,所述PqqE酶的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。
8.根据权利要求6或7所述的生产莫能菌素的工程菌的构建方法,其特征在于,所述构建方法具体包括:
将所述前体肽PqqA、PqqB酶、PqqC酶、PqqD酶和PqqE酶的编码基因插入到表达载体中,得到重组载体,将所述重组载体导入到肉桂地链霉菌Streptomyces cinnamonensis中。
9.一种生产莫能菌素的方法,其特征在于,所述方法包括:
在培养基中添加吡咯喹啉醌,培养莫能菌素生产菌株,收集细胞并进行产物纯化;或者,培养权利要求3-5任一项所述的生产莫能菌素的工程菌,收集细胞并进行产物纯化。
10.根据权利要求9所述的生产莫能菌素的方法,其特征在于,所述莫能菌素生产菌株肉桂地链霉菌Streptomyces cinnamonensis。
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