KR102590534B1 - 하프니아 알베이 균주를 생촉매로 이용한 카다베린 생산방법 - Google Patents
하프니아 알베이 균주를 생촉매로 이용한 카다베린 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 라이신 존재 하에 배양한 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를, 생촉매로, 기질인 라이신(lysine)에 처리하여 효소반응을 유도하여 카다베린 (cadaverine)을 생산하는 방법에 관한 것으로, 고가의 조효소인 pyridoxal phosphate(PLP)의 사용없이도 효과적으로 라이신으로부터 카다베린을 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 이용하면, 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주의 라이신-카다베린 전환 생촉매능을 유의하게 향상시킬 수 있어, 카다베린의 생산 수율 및 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를 생촉매로 이용한 카다베린 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 라이신 존재 하에 배양한 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를, 생촉매로, 기질인 라이신(lysine)에 처리하여 효소반응을 유도하여 카다베린 (cadaverine)을 생산하는 방법에 관한 것이다.
전 세계 라이신 시장 규모는 2018년 기준으로 260만톤 정도이다. 그런데, 중국, 일본, 한국 기업들의 과다 경쟁으로 공급과잉 현상이 발생하여, 라이신의 새로운 수요처를 찾야야 하는 실정이다. 그 일환으로써 라이신을 기질로 사용하여 새로운 바이오 소재를 개발하고자 하는 연구가 진행되어 오고 있다.
한편, 포도당 또는 라이신으로부터 생물학적 대량생산이 가능한 카다베린은, 아디프산과 함께, 나일론 66의 주원료로 사용되는 1,6-hexanediamine을 대체할 수 있는 화합물로 주목받고 있는데, PA50, PA512 제조에 사용되고 있다. 카다베린은 1,6-hexanediamine과 비교하여 가격경쟁력을 확보함으로써 시장확대가 예상된다.
카다베린은 라이신 탈탄산효소 (Lysine decarboxylase)의 탈탄산 반응을 통해 라이신(Lysine)으로부터 생산이 가능하며, 라이신을 생산하는 미생물을 통한 직접 발효 생산법과 라이신을 기질로 사용하여 라이신 탈탄산효소를 도입한 전세포 촉매를 이용한 생산법으로 대량 생산이 가능하다.
직접 발효의 경우, 일 예로, 라이신 생산 균주인 코리네박테리움에 고효율 라이신 탈탄산효소를 도입하고, 프로모터 최적화, Lysine exporter 제거, N-acetyltransferase 제거 등의 균주 최적화를 기해, 카다베린 생산량을 증가시키는 방법이 알려져 있다.
전세포 촉매 반응의 경우, 일 예로, 라이신 탈탄산효소를 대장균에 도입하여 전세포 촉매를 개발하고 이를 이용한 반응이 알려져 있으며, 고농도 기질 저해를 완화시킨 free-base 라이신을 이용한 반응도 있다. 그 외, buffer free 반응 등 전세포 전환 공정 최적화를 통한 고농도 카다베린 생산 연구들이 진행 중이다. 다만, 카다베린의 고농도 생산, 분리·정제 효율성 향상, 스케일업의 용이성 등을 고려할 경우, 직접 발효 공정보다는 전세포 촉매 공정이 선호되며, 경제성이 높다.
그러나, 기존에 개발된 재조합 코리네박테리움, 대장균 균주를 이용한 전세포 촉매 공정의 경우, 고가의 조효소인 pyridoxal phosphate(PLP)을 반드시 첨가해주어야 하고, 고농도 라이신에 대한 저해 현상을 극복해야 하는 문제점이 있어, 이를 해결할 수 있는 다른 균주 기반의 카다베린 생물전환기술 개발 필요성이 대두되고 있다.
카다베린은 소수의 미생물에서만 발견되며, 생물학적으로는 라이신 탈탄산효소 (lysine decarboxylase, LDC, E.C.4.1.1.18)에 의한 라이신(lysine)의 탈탄산 반응을 통하여 카다베린이 생성된다. 카다베린을 생물공정으로 생산하기 위해서는 라이신의 탈탄산반응 (decarboxylation)을 촉매하는 라이신 탈탄산효소 (lysine decarboxylase, LDC)을 보유하고 있는 천연균주 또는 재조합 후보균주의 확보가 중요하다.
LDC를 보유한 균주는 대부분 그람음성균 및 그람양성균에 속하며, 일부는 pathogen으로 분류되고 있어서 산업용 카다베린 생산균주의 확보를 위해서는 안전 레벨(safety level) 1에 속한 안전미생물을 선별해야 하고, 이를 이용한 생물전환공정을 개발해야 한다.
본 발명자들은 라이신을 이용한 카다베린 생산 공정에 있어서, 종래 알려진 전세포 촉매 공정의 문제점으로 대두된 pyridoxal phosphate(PLP) 조효소 사용이 필요치 않고, 카다베린 생산 효율이 유의하게 개선된 전세포 촉매 공정을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 라이신이 첨가된 배지 상에서 전배양한 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를 생촉매로 이용하는 경우, PLP 조효소의 사용 없이도, 효과적으로 라이신을 카다베린으로 전환시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 라이신(lysine)을 포함하는 배양 배지에 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를 접종하여 배양하는 단계 (a); 및 상기 단계 (a)에서 배양된 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를, 생촉매로, 기질인 라이신(lysine)에 처리하여 효소반응을 유도하는 단계 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 카다베린(cadaverine) 생산방법을 제공한다.
본 발명의 카다베린(cadaverine) 생산방법에 있어서, 상기 단계 (a)의 배양 배지에 포함되는 라이신은, 바람직하게 배양 배지에 10~100 mM 농도로 포함되는 것이 좋다.
본 발명의 카다베린(cadaverine) 생산방법에 있어서, 상기 단계 (a)의 배양 배지는, 바람직하게 효모 추출물 및 펩톤을 포함하는 것이 좋다.
본 발명의 카다베린(cadaverine) 생산방법에 있어서, 상기 단계 (a)의 배양 배지는, 바람직하게 버퍼 성분으로 MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 추가로 포함하는 것이 좋다. 이때, 상기 단계 (a)의 배양 배지는, 바람직하게 pH 5.5~6.0인 것이 좋다.
본 발명의 카다베린(cadaverine) 생산방법에 있어서, 상기 단계 (a)에서 배양된 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 균주는, 바람직하게 라이신 탈탄산효소를 각각 암호화하는 LdcA 유전자와 CadB 유전자의 발현이 증가한 것일 수 있다.
본 발명의 카다베린(cadaverine) 생산방법에 있어서, 상기 단계 (b)의 효소반응은, 바람직하게 포타슘 포스페이트 (potassium phosphate)를 버퍼 성분으로 사용하여 수행하는 것이 좋다. 이때, 상기 버퍼 성분으로 사용되는 포타슘 포스페이트 용액은, 바람직하게 pH가 6~8이고, 포타슘 포스페이트의 농도가 20~50 mM인 것이 좋다.
본 발명의 카다베린 생산 방법을 이용하면, 고가의 조효소인 pyridoxal phosphate(PLP)의 사용없이도 효과적으로 라이신으로부터 카다베린을 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 이용하면, 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주의 라이신-카다베린 전환 생촉매능을 유의하게 향상시킬 수 있어, 카다베린의 생산 수율 및 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.
도 1은 YPD 배양 배지를 이용한 하프니아 알베이 균주의 배양 그래프를 나타낸다.
도 2는 전세포 효소 반응에 있어서, 포타슘 포스페이트 버퍼 농도, pH에 따른 반응 결과를 나타낸다.
도 3은 저농도 라이신(150 mM)에 대한, 하프니아 알베이 세포 농도에 따른 전세포 효소 반응 결과 그래프를 나타낸다.
도 4는 세포 농도에 따른 고농도 라이신(1.27 M)의 전세포 효소 반응 결과를 나타낸다.
도 5는 다양한 조건의 배지에서 배양한 세포를 이용한 전세포 효소 반응의 결과를 나타낸다.
도 6은 하프니아 알베이 균주의 gDNA의 LdcA와 CadA 모식도를 나타낸다.
도 7은 RT-PCR을 통한 LdcA와 CadA의 상대적 발현율 비교 결과를 나타낸다.
도 8은 서로 다른 배지에서 배양한 세포에 따른 전세포 효소 반응 결과를 나타낸다.
도 2는 전세포 효소 반응에 있어서, 포타슘 포스페이트 버퍼 농도, pH에 따른 반응 결과를 나타낸다.
도 3은 저농도 라이신(150 mM)에 대한, 하프니아 알베이 세포 농도에 따른 전세포 효소 반응 결과 그래프를 나타낸다.
도 4는 세포 농도에 따른 고농도 라이신(1.27 M)의 전세포 효소 반응 결과를 나타낸다.
도 5는 다양한 조건의 배지에서 배양한 세포를 이용한 전세포 효소 반응의 결과를 나타낸다.
도 6은 하프니아 알베이 균주의 gDNA의 LdcA와 CadA 모식도를 나타낸다.
도 7은 RT-PCR을 통한 LdcA와 CadA의 상대적 발현율 비교 결과를 나타낸다.
도 8은 서로 다른 배지에서 배양한 세포에 따른 전세포 효소 반응 결과를 나타낸다.
본 발명은 라이신(lysine)을 포함하는 배양 배지에 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를 접종하여 배양하는 단계 (a); 및 상기 단계 (a)에서 배양된 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를, 생촉매로, 기질인 라이신(lysine)에 처리하여 효소반응을 유도하는 단계 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 카다베린(cadaverine) 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 카다베린 생산방법을 각 단계별로 세분해서 상세히 설명하고자 한다.
<단계 (a): 생촉매로 사용할 하프니아 알베이 (
Hafnia alvei
) 균주 배양>
본 단계는 라이신(lysine)을 포함하는 배양 배지에 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 균주를 접종하여 배양하는 과정이다.
본 발명의 카다베린 생산 방법은 하프니아 알베이 균주가 발현하는 라이신 탈탄산효소(L-lysine decarboxylase, LDC)를 이용하여 기질인 라이신에 대해 탈카르복실화 반응(decarboxylation)을 일으킴으로써 수행된다.
본 발명자들은 기질인 라이신에 대해 생촉매로 하프니아 알베이 균주를 처리하기 위해, 하프니아 알베이 균주를 라이신을 포함하는 배양 배지 상에 배양한 후 처리하여 보았는데, 라이신을 포함하지 않는 배양 배지 상에 배양하여 처리하는 경우에 비해, 기질인 라이신의 소모량, 카다베린 생산량, 수율 및 반응속도 측면에서 현저히 상승된 결과를 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성한 것이다.
더욱이 본 발명은 고가의 조효소인 피리독살 포스페이트 (pyridoxal phosphate, PLP)을 첨가하지 않은 상태에서도 비교적 높은 수율 및 고생산성으로 카다베린을 생산할 수 있음을 확인하였는데, 이는 라이신이 첨가된 배지에서 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 균주를 배양했기 때문인 것으로 사료된다.
즉, 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 균주는 자체적으로 PLP를 생산하기는 하나, 그 양이 미미해서, 카데베린을 생산하기 위한 일반적인 환경에서는, 반응액(이 균주를 생촉매로 사용)에 별도로 PLP를 첨가해 주어야 한다.
하지만, 본 발명에서는, 특징적으로, 라이신이 첨가된 배지에서 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 균주를 배양하였는데, 이를 통해 균주 내 피리독살 포스페이트 (pyridoxal phosphate, PLP)의 발현양이 증가하였고, 이로 말미암아 별도로 PLP를 첨가하지 않고서도 고수율, 고생산성으로 카다베린을 생산할 수 있었던 것으로 추론하는 것이다.
본 발명에서 사용한“라이신”은 친수성이자 염기성으로 분류되는 아미노산의 일종으로서, 보다 구체적으로는 L-라이신을 의미한다. 본 발명의 하프니아 알베이 균주를 배양하기 위한 배양배지 상에 라이신 또는 라이신염의 형태로 첨가되어 사용될 수 있다. 또한, 기질로 사용되는 라이신 역시 반응액에 라이신 또는 라이신염의 형태로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단계 (a)의 라이신은 바람직하게 10~100 mM 농도로 포함될 수 있다. 상술한 농도 범위의 라이신을 포함하는 배양 배지 상에 하프니아 알베이 균주를 배양하여 수득하고, 이를 이용할 경우, 기질인 라이신을 카다베린으로 전환하는 전세포 효소 반응의 카다베린 생산량 및 생산 속도를 크게 증진시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명 단계 (a)의 배양 배지는 바람직하게 효모 추출물 및 펩톤을 포함한 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 배양 배지는 D-글루코오스를 추가적으로 포함하는 배양 배지일 수 있다. 구체적으로 예를 들자면, 상용화된 YPD 배지를 사용할 수 있다. 다만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명 단계 (a)의 배양 배지는 바람직하게 버퍼 성분으로 MES를 추가로 포함할 수 있다. MES는 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid의 일반 명칭이다. MES는 pH 범위가 5.5~6.5에서 유용하게 사용될 수 있는 양쪽이온 버퍼(zwitterionic buffer)이다. MES를 추가적으로 포함하는 배양배지에서 하프니아 알베이 균주를 배양하는 경우, 카다베린의 생산 수율의 증가를 도모할 수 있다. MES 버퍼는 대략 50~200 mM 농도로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명 단계 (a)의 배양 배지는 pH가 5.5~6.0인 것이 좋다. 배양 진행 중 pH가 변화하더라도 pH 조절제를 첨가해서 상기와 같은 pH 5.5~6.0 상태를 유지하는 것이 좋다. 이와 같은 약산성 조건에서 하프니아 알베이 균주를 배양하는 경우, 이를 이용하여 카다베린 생산량 및 생산 속도를 유의하게 증진시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단계 (a)에서 배양한 균주는 라이신 탈탄산효소(LDC)를 암호화하는 유전자의 발현이 증가된 상태이다. 즉, LDC를 암호화하는 유전자로 LdcA와 CadA의 발현이 증가된 상태인 것이다. 이와 같이 LdcA와 CadA의 발현이 증가한 본 발명의 균주를 사용할 경우, 카다베린 생산량 및 생산 속도가 증가하게 되는 것이다.
<단계 (b): 생촉매 효소반응을 통한 기질인 라이신(lysine)으로부터 카다베린 생산>
본 단계는 상기 단계 (a)에서 배양된 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 균주를, 생촉매로, 기질인 라이신(lysine)에 처리하여 효소반응을 유도하는 과정이다.
본 발명의 단계 (b)는 단계 (a)를 통해 배양된 하프니아 알베이 균주를 이용하여 기질인 라이신을 카다베린으로 전환시키는 전세포 효소 반응를 의미한다.
본 발명의 전세포 효소 반응의 경우, 종래 공지된 다양한 카다베린 생산 공정 조건을 토대로 실시될 수 있다. 다만, 바람직하게는 본 발명자들이 최적화한 생물전환 조건 하에서 실시할 수 있다.
단계 (b)의 기질인 라이신은, 목적에 따라, 저농도 및 고농도로 모두 바람직하게 선택하여 실시할 수 있으며, 구체적으로 예를 들자면, 1 M 이상의 고농도 조건의 시료를 전세포 효소 반응에 이용할 수 있다. 이때, 하프니아 알베이 균주는 OD600 40~90의 농도 범위 내에서 적절히 선택하여 처리할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단계 (b)는 포타슘 포스페이트를 버퍼 성분으로 사용한 버퍼 상에서 수행되는 것이 좋다. 포타슘 포스페이트는 바람직하게, 30~100 mM 농도 정도의 범위에서 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는 20~50 mM 농도 범위에서 사용하는 것이 좋다. 이때, pH 조건은 중성 조건에서 수행될 수 있으나, 바람직하게는 pH 6~8에서 수행하는 것이 좋다. 생물 전환을 위한 바람직한 온도 환경은 상온 이상의 온도일 수 있고, 보다 구체적으로 25~40℃에서 수행하는 것이 좋다. 다만, 반드시 이 조건에 제한되는 것은 아니다.
상술한 조건 하에서 본 발명의 생물 전환 공정이 수행될 수 있고, 기질인 라이신으로부터 높은 생산량, 고수율 및 고생산성으로 카다베린을 생산할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 본 발명의 방법에 의한 카다베린 생산
(1) 실험 재료 및 방법
1) 사용 균주 및 화합물
본 실험에는 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) ATCC9760를 사용하였고, American Type Culture Collection (http://www.atcc.org)에서 분양을 받았다. 라이신 원료로서 사용된 L-라이신염산염(lysine·HCl)은 씨제이제일제당(주)에서 제조하는 것으로서 99%이상의 순도를 갖는다. 나머지 시약들은 Sigma Aldrich 사에서 구매하여 사용하였다.
2) 유도체화 용액의 제조
삭제
하기 실험에서는 HPLC 분석을 위해 샘플 (반응 상등액)의 농도를 10 mM 이하로 희석시켰다. 희석을 위해 표 1의 조성으로 유도체화 용액을 제조하여 사용하였다. 이때 DEEMM(Diethyl Ethoxymethylenemalonate)은 메탄올에 용해시켰다.
| 재료 | 농도 (μl/sample) |
| Diethyl Ethoxymethylenemalonate(DEEMM) | 3 |
| Methanol | 100 |
| 50 mM sodium borate buffer (pH 9.0) | 300 |
| 3DW | 47 |
| 전체 | 450 |
3) 라이신과 카다베린 HPLC 분석 조건
다음 조건으로 라이신과 카다베린 HPLC 분석 조건을 수행하였다.
HPLC는 Agilent Technologies 1200 Series를 사용하였다. 컬럼(Column)으로서 C18 (Phenomenex, 4.6*250 mm, 5 μm 파티클 사이즈)을 사용하였다. 35℃ 온도 조건에서, UV 284 nm 디텍터를 이용하였고, A(Acetonitrile) 및 B(25 mM sodium acetate buffer (pH4.8))를 용리액(eluent)으로 이용하였다. 이동상의 플로우 레이트는 1 ml/min 이었다. 다음과 같은 용매 조성(A:B) 및 수행 시간으로 반응을 수행했다: 0-2 분 (20:80), 2-10 분 (25:75), 10-15 분 (70:30), 15-30 분 (20:80).
2. 실험 결과
(1) 하프니아 알베이 균주의 YPD 배지에서의 성장분석
하프니아 알베이 균주의 YPD 배지에서 성장 속도와 글루코스 소모 속도를 분석하기 위해 글루코스 20 g/l 농도인 YPD 배지에서 32시간 배양하여 OD 값, pH 값, 글루코스 농도 값을 분석하였다.
우선 표 2의 조성을 갖는 종균 배양 배지 20 ml에 균주 2%를 접종 후 30℃, 200 rpm에서 12시간 종균 배양하였다.
| 재료 | 농도 (g/l) |
| 글루코스 | 20 |
| 효모 추출물(yeast extract) | 10 |
| 펩톤 | 20 |
표 2의 조성을 갖는 본 배양 배지 100 ml에 균주를 OD600 0.1로 접종 후 30℃, 200 rpm에서 32시간 배양하였다. 4시간마다 OD, pH, 글루코스 농도값을 측정하였다.
실험 결과, 도 2에서와 같이 15시간 배양 후에 최대 OD600 18이 되었고, pH는 32시간 동안 6~8 사이 값으로 측정되었으며, 글루코스 20 g/l를 24시간 동안 전부 소모한 것을 확인하였다.
(2) 전세포 효소 반응에 사용되는 버퍼의 농도와 pH에 따른 카다베린 생산 변화
전세포 효소 반응에서 사용되는 포타슘 포스페이트 버퍼의 최적의 농도와 pH를 확인하기 위해 각 20 mM, 50 mM 농도에서 pH 6~8로 포타슘 포스페이트 버퍼를 제조하였고, 150 mM 라이신에서 카다베린으로의 전환률을 비교 분석하는 실험을 진행하였다.
실험을 위해, 우선 표 3의 조성인 20 ml YPD 종균 배양 배지에서 30℃, 200 rpm, 12시간 동안 균주를 배양한 후, OD600 0.1로 100 ml YPD 본 배양 배지에 접종하였다.
| 재료 | 농도(g/l) |
| 글루코스 | 20 |
| 효모 추출물(yeast extract) | 10 |
| 펩톤 | 20 |
30℃, 200 rpm, 18 시간 배양 후 배양액을 확보하였다. 확보한 배양액을 원심 분리 후, 세포를 회수 한 다음 50 mM 인산 칼륨 버퍼 (pH 5.6)으로 현탁하였다. 현탁한 세포를 다시 원심분리 후 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 최초 제조한 포타슘 포스페이트 버퍼로 세포를 재현탁 후 표 4의 조성인 전세포 효소 반응 용액에 넣어주었다.
| 세포 농도 | OD600 4.0 |
| 라이신 농도 | 150 mM |
| 포타슘 포스페이트 버퍼 | 20 mM (pH 6~8) 50 mM (pH 6~8) |
| 총 부피(total volume) | 20 ml |
35℃, 200 rpm 반응 후 4시간마다 1 ml씩 원심 분리 후 상등액을 확보하였다. 상등액 유도체화 후 HPLC 측정하였다. 그 결과는 표 5, 표 6 및 도 2에 나타내었다.
| 포타슘 포스페이트 버퍼 | 라이신 소비량 (mM) | 카다베린 생산량 (mM) | 수율 (mol/mol) | 생산속도 (mM/hr) |
| 20 mM pH 6 | 151 | 135 | 0.89 | 5.63 |
| 50 mM pH 6 | 140 | 124 | 0.89 | 5.17 |
| 20 mM pH 7 | 138 | 135 | 0.98 | 5.63 |
| 50 mM pH 7 | 153 | 148 | 0.97 | 6.17 |
| 20 mM pH 8 | 134 | 127 | 0.95 | 5.29 |
| 50 mM pH 8 | 137 | 106 | 0.77 | 4.41 |
| 포타슘 포스페이트 버퍼 | 라이신 소비량 (g/l) | 카다베린 생산량 (g/l) | 수율 (g/g) | 생산속도 (g/l·hr) |
| 20 mM pH6 | 22.0 | 13.8 | 0.63 | 0.58 |
| 50 mM pH6 | 20.4 | 12.7 | 0.62 | 0.53 |
| 20 mM pH7 | 20.1 | 13.8 | 0.69 | 0.58 |
| 50 mM pH7 | 22.4 | 15.1 | 0.67 | 0.63 |
| 20 mM pH8 | 19.5 | 13.0 | 0.67 | 0.54 |
| 50 mM pH8 | 20.0 | 10.8 | 0.54 | 0.45 |
50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼 pH 7에서 카다베린 생산량과 생산속도가 가장 높았다. 수율 역시 0.97 (mol/mol)로 높은 것을 확인하였다. 이에 따라 이어지는 전세포 효소 반응 용액의 버퍼는 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼 pH 7을 사용하였다.
(3) 전세포 효소 반응에서 세포의 농도에 따른 저농도 라이신의 전환량 변화
저농도의 라이신 150 mM을 첨가했을 때 전세포 효소 반응에 사용되는 최적의 세포 농도를 찾기 위해 효소 반응의 최종 부피 20 ml에서의 OD600 4.0~40이 되도록 세포를 넣어주었다.
실험을 위해 우선 표 7의 조성인 20 ml YPD 종균 배양 배지에서 30℃, 200 rpm, 12시간 동안 균주를 배양한 후 OD600 0.1로 100 ml YPD 본 배양 배지에 접종하였다.
| 재료 | 농도(g/l) |
| 글루코스 | 20 |
| 효모 추출물(yeast extract) | 10 |
| 펩톤 | 20 |
30℃, 200 rpm, 18시간 배양 후 배양액을 확보하였다. 확보한 배양액을 원심분리 후 세포를 회수한 다음 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼 (pH 5.6)로 세포를 현탁하였다. 현탁한 세포를 다시 원심분리 후 상등액을 제거하고, 세포를 회수하였다. 상기 제조한 포타슘 포스페이트 버퍼로 세포를 다양한 농도로 재현탁한 후 표 8의 조성인 전세포 효소 반응 용액에 넣어주었다.
| 세포 농도 | OD600 4.0~40 |
| 라이신 농도 | 150 mM |
| 포타슘 포스페이트 버퍼 | 50 mM, pH 7 |
| 총 부피 (total volume) | 20 ml |
35℃, 200 rpm 반응 후 4시간 마다 1 ml씩 원심분리 후 상등액을 확보하였다. 상등액을 유도체화 한 후 HPLC 측정하였다.
실험 결과, 도 3에서와 같이, 세포 농도가 OD600 4.0~10에서는 라이신을 전부 소모하지 못했지만, OD600 20~40에서는 16시간 만에 라이신을 전부 소모한 것을 볼 수 있었다. 또한, 표 9 및 표 10에서 보듯이, OD600 10에서 라이신 소비량과 카다베린 생산량이 가장 높은 것을 볼 수 있었지만, 수율은 OD600 20에서 가장 높았고, 생산속도는 OD600 30에서 가장 높은 것을 볼 수 있었다.
| 세포 농도 | 라이신 소비량 (mM) | 카다베린 생산량 (mM) | 수율 (mol/mol) | 생산속도 (mM/hr) |
| OD600 4.0 | 124 | 106 | 0.85 | 2.20 |
| OD600 10 | 142 | 118 | 0.83 | 4.07 |
| OD600 20 | 136 | 118 | 0.87 | 4.06 |
| OD600 30 | 131 | 110 | 0.84 | 6.84 |
| OD600 40 | 126 | 102 | 0.81 | 4.25 |
| 세포 농도 | 라이신 소비량 (g/l) | 카다베린 생산량 (g/l) | 수율 (g/g) | 생산속도 (g/l·hr) |
| OD6004.0 | 18.1 | 10.8 | 0.60 | 0.23 |
| OD60010 | 20.8 | 12.1 | 0.58 | 0.42 |
| OD60020 | 19.9 | 12.0 | 0.60 | 0.41 |
| OD60030 | 19.1 | 11.2 | 0.59 | 0.70 |
| OD60040 | 18.5 | 10.4 | 0.56 | 0.43 |
(4) 전세포 효소 반응에서 세포의 농도에 따른 고농도 라이신의 전환량 변화
고농도의 라이신 1.27 M을 첨가했을 때 전세포 효소 반응에 사용되는 최적의 세포 농도를 찾기 위해 효소 반응의 최종 부피 20 ml에서 OD600 40~90이 되도록 세포를 넣어주었다.
실험을 위해, 우선 표 11의 조성인 20 ml YPD 종균 배양 배지에서 30℃, 200 rpm, 12시간 배양한 후, 균주를 OD600 0.1로 100 ml YPD 본 배양 배지에 접종하였다.
| 재료 | 농도(g/l) |
| 글루코스 | 20 |
| 효모 추출물(yeast extract) | 10 |
| 펩톤 | 20 |
YPD 본 배양 배지 100 ml에서 30℃, 200 rpm, 18시간 배양 후 배양액을 확보하였다. 확보한 배양액을 원심분리 후 세포를 회수한 다음 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 5.6)로 세포를 현탁하였다. 현탁한 세포를 다시 원심분리 후 상등액을 제거하고, 세포를 회수하였다. 상기 제조한 포타슘 포스페이트 버퍼로 세포를 재현탁 후 표 8의 조성인 전세포 효소 반응 용액에 넣어주었다.
| 세포 농도 | OD600 40~90 |
| 라이신 농도 | 1.27 M |
| 포타?? 포스페이트 버퍼 | 50 mM, pH 7 |
| 총 부피 (total volume) | 20 ml |
35℃, 200 rpm 반응 후 4시간 마다 1 ml씩 원심분리 후 상등액을 확보하였다. 상등액을 유도체화 한 후 HPLC 측정하였다.
실험 결과, OD600 90에서 수율이 가장 높았지만, OD600 60에서 라이신 소비량이 1087±24.2 mM (159 g/l), 카다베린 생산량이 915±30.3 mM (93.5 g/l), 생산속도가 38.1 mM/hr로 각각 가장 높은 값을 보였다. 또한, 생산속도가 가장 빠른 구간인 0시간에서 17시간의 비생산성(specific productivity) 역시 0.83 mM/hr·OD로 가장 높은 값을 보였다(도 4, 표 13). 따라서 라이신 소비량, 카다베린 생산량, 생산속도, 비생산성(specific productivity)이 가장 높은 값을 가지는 OD600 60을 전세포 효소 반응에서 최적의 세포 농도로 결정하였다.
| 세포 농도 | 라이신 소비량 (mM) | 카다베린 생산량 (mM) | 수율 (mol/mol) | 생산속도 (mM/hr) | 0h~17h에서의 비 생산속도 (생산속도/OD) |
| OD600 40 | 671±10.0 (98g/L) | 543±16.6 (55.5g/L) | 0.81 | 12.2 | 0.58 |
| OD600 50 | 813±61.4 (119g/L) | 638±8.65 (65.2g/L) | 0.78 | 15.6 | 0.51 |
| OD600 60 | 1087±24.2 (159g/L) | 915±30.3 (93.5g/L) | 0.84 | 38.1 | 0.83 |
| OD600 70 | 836±33.2 (122g/L) | 745±45.0 (76.1g/L) | 0.89 | 18.2 | 0.29 |
| OD600 80 | 995±15.0 (145g/L) | 897±20.1 (91.7g/L) | 0.90 | 21.9 | 0.38 |
| OD600 90 | 966±47.4 (141g/L) | 926±117 (94.6g/L) | 0.96 | 38.6 | 0.48 |
(5) 라이신을 첨가한 배지에서 배양한 균주의 전세포 효소 반응에서의 카다베린 전환량 변화
기존 YPD 배지 10 ml에서 H.alvei 균주를 15시간 종균 배양 후 각기 다른 조성을 가지는 100 ml의 본 배양 배지(표 14)에서 30℃, 200 rpm로 18시간 배양 후 배양액을 확보하였다.
| Composition | |||||||
| YPD 20 | YPD 20 + Lysine 100mM | YDP 20 + Lysine 100mM (pH 5.8) | YDP + Lysine 100mM + MES (pH 5.8) | ||||
| Yeast extract | 10 g/L | Yeast extract | 10 g/L | Yeast extract | 10 g/L | Yeast extract | 10 g/L |
| Peptone | 20 g/L | Peptone | 20 g/L | Peptone | 20 g/L | ||
| Peptone | 20 g/L | Lysine | 100 mM | Lysine | 100 mM | Lysine | 100 mM |
| pH | X | pH | 5.8 | pH | 5.8 | ||
| buffer | X | buffer | 100 mM MES | ||||
확보한 배양액을 원심분리 후 세포를 회수한 다음 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 5.6)로 세포를 현탁하였다. 현탁한 세포를 다시 원심분리 후 상등액을 제거하고, 세포를 회수하였다.
그 후, 세포를 상기 포타슘 포스페이트 버퍼에 재현탁하고 라이신 1.27 M을 첨가한 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.0) 20 ml에 OD600 60이 되도록 첨가하였다(표 15). 그 후, 35℃, 200 rpm에서 반응 후 일정한 시간마다 1 ml씩 원심분리 후 상등액을 확보하고 상등액을 유도체화한 후에 HPLC로 분석하였다(도 5).
| 생물전환 조건 | |
| 균주 | H.alvei |
| 라이신 농도 | 1.27 M |
| 세포 농도 | OD600 60 |
| 버퍼 | 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼, pH 7 |
| 온도, rpm | 35℃, 200 rpm |
| 총 부피 (total volume) | 20 ml |
실험 결과, 기존 YPD 배지에서 배양한 세포를 이용하여 전세포 효소 반응을 수행할 경우보다, 100 mM 라이신을 첨가하고, pH 5.8로 조정한 배지에서 배양한 세포를 이용하여 전세포 효소 반응을 시킬 경우, 1.69배 높은 1032±87.1 mM (151 g/l)의 라이신 소비량과 1.49배 높은 831±23.4 mM(84.9 g/l)의 카다베린 생산량, 1.49배 높은 34.6의 생산속도를 보였다(도 5, 표 16).
| 배양배지 조성 | 라이신 소비량 (mM) | 카다베린 생산량 (mM) | 수율 (mol/mol) | 생산속도 (mM/hr) |
| YPD | 610±54.7 (89.2 g/l) | 557±19.7 (56.9 g/l) | 0.91 | 23.2 |
| Lysine 100 mM | 780±14.4 (114g/l) | 704±18.0 (71.9 g/l) | 0.90 | 29.3 |
| Lysine 100 mM (pH5.8) | 1032±87.1 (151g/l) | 831±23.4 (84.9 g/l) | 0.81 | 34.6 |
| Lysine + MES 버퍼 (pH5.8) | 876±58.8 (128 g/l) | 829±62.9 (84.7 g/l) | 0.95 | 34.5 |
(6) 배지 내 라이신 첨가에 따른 하프니아 알베이의 카다베린 탈탄소효소의 유전자 발현 규명
기존 YPD 배지에서 배양한 세포와 라이신 100 mM을 첨가하고, pH 5.8로 조정한 YPD 배지에서 배양한 세포의 gDNA에 있는 각기 다른 두 가지의 lysine decarboxylase 유전자 LdcA와 CadA의 상대적 발현율을 알아보고자 RT-PCR을 진행하였다(도 6).
기존 YPD 배지와 라이신 100 mM을 첨가하고 pH5.8로 조정한 YPD 배지에서 세포를 각각 9시간, 18시간 배양하고 원심분리 후 상등액을 제거하여 세포를 회수하였다. 그 후 박테리아 RNA 추출 키트(Bacterial RNA Extraction Kit)(Bioneer Co., Korea)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다.
그 후 합성된 cDNA 샘플 1 μl와 SYBR Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA) 10 μl, nuclease-free water 8 μl, 각각의 10 pmol/μl의 프라이머(표 17)를 0.5 μl씩 첨가 후 CFX Connect Real-Time PCR System (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 95℃, 30초의 변성(denaturation)과 61℃, 30초 어닐링(annealing), 72℃, 30초 연장(extension)을 50 횟수로 진행하였고, housekeeping control은 16s RNA 유전자로 수행하였다. 결과값은 2-ΔΔCT 방법으로 나타내었다 (Livak and Schmittgen, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method, Methods, Volume 25, Issue 4, December 2001, Pages 402-408).
그 결과, 두 가지의 라이신 탈탄산효소 유전자 LdcA와 CadB 모두 라이신을 첨가하고 pH 5.8로 조정한 배지에서 9시간, 18시간 배양할 경우 모두 더 높은 상대적 발현율을 보였다(도 7).
따라서, 라이신을 첨가하고 pH5.8로 조정한 배지에서 배양할 경우 더 많은 라이신 탈탄산효소의 발현율로 전세포 효소 반응 시 더 높은 카다베린 생산량을 보이는 것을 알 수 있었다.
| 명칭 | 설명 |
| LdcA_F_RT | catttcacccggcataaccaccgga |
| LdcA_R_RT | aacaccacaatctgccagacctgatgta |
| CadA_F_RT | agccatgccagctgtctttggaatcca |
| CAdA_R_RT | cgaaaccgctgctgcaatgatgaaagg |
| 16sRNA_F_RT | gtactttcagcgaggaggaaggcattgt |
| 16sRNA_R_RT | agttcccaagttaagctcggggatttca |
(7) 전세포 효소 반응에 사용할 세포의 배양 배지에 첨가한 라이신의 농도 최적화
앞 선 결과를 통해 라이신을 첨가하고, pH 5.8로 조정한 배지에서 배양할 경우 라이신 탈탄산효소의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 더 높은 라이신 탈탄산효소의 발현을 위해 배양 배지에 첨가할 최적의 라이신 농도를 결정하고자 하였다.
기존 YPD 배지에 HCl을 이용하여 pH 5.8로 조정하고, 라이신을 각각 10~150 mM 각각 참가한 배지(표 18)를 이용하여 균주를 배양하고, 30℃, 200 rpm에서 반응 후 일정한 시간마다 1 ml씩 원심분리 후 상등액을 확보하고 상등액을 유도체화 한 후에 HPLC로 분석하였다(도 8)
| 조성물 | |||||||
| Lysine 10 mM | Lysine 50 mM | Lysine 100 mM | Lysine 150 mM | ||||
| 효모 추출물 | 10 g/L | 효모 추출물 | 10 g/L | 효모 추출물 | 10 g/L | 효모 추출물 | 10 g/L |
| 펩톤 | 20 g/L | 펩톤 | 20 g/L | 펩톤 | 20 g/L | 펩톤 | 20 g/L |
| 라이신 | 10 mM | 라이신 | 50 mM | 라이신 | 100 mM | 라이신 | 150 mM |
| pH | 5.80 | pH | 5.80 | pH | 5.80 | pH | 5.80 |
실험 결과, 라이신 50 mM을 첨가한 배지에 배양한 세포를 이용하여 전세포 효소 반응시 라이신 소비량이 1041±71.9 mM(152 g/L), 카다베린 생산량이 943±71.9 mM(96.4 g/L), 생산 속도가 39.2 mM/hr로 가장 높은 값을 보였다(도 8, 표 19). 따라서 H. alvei의 배양 배지에 첨가할 최적의 라이신 농도는 50 mM로 결정하였다.
| 배양 배지에서의 라이신 농도 | 라이신 소비량 (mM) | 카다베린 생산량 (mM) | 수율 (mol/mol) | 생산속도 (mM/hr) |
| (F) Lysine 10 mM | 844±33.0 (123 g/l) | 674±70.5 (68.9 g/l) | 0.80 | 28.1 |
| (F) Lysine 50 mM | 1041±71.9 (152 g/l) | 943±71.9 (96.4 g/l) | 0.91 | 39.2 |
| (F) Lysine 100 mM | 783±77.1 (114 g/l) | 665±25.6 (67.9 g/l) | 0.85 | 27.7 |
| (F) Lysine 150 mM | 586±48.7 (85.7 g/l) | 584±4.93 (59.7 g/l) | 0.99 | 24.3 |
Claims (8)
- 라이신(lysine)을 10~100 mM 농도로 포함하는 배양 배지에 라이신 탈탄산효소를 각각 암호화하는 LdcA 및 CadB 유전자를 보유한 하프니아 알베이 (Hafnia alvei)를 배양하여, 상기 하프니아 알베이 (Hafnia alvei)의 LdcA 유전자와 CadB 유전자의 발현을 증가시키는 단계 (a); 및
상기 단계 (a)에서 배양되어 LdcA 유전자와 CadB 유전자의 발현이 증가된 하프니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주를 생촉매로, 기질인 라이신(lysine)에 처리하여 효소반응을 유도하는 단계 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 카다베린(cadaverine) 생산방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 배양 배지는,
효모 추출물 및 펩톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 카다베린 생산방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 배양 배지는,
버퍼 성분으로 MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 카다베린 생산방법.
- 제4항에 있어서,
상기 단계 (a)의 배양 배지는,
pH 5.5~6.0인 것을 특징으로 하는 카다베린 생산방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 효소반응은,
포타슘 포스페이트 (potassium phosphate)를 버퍼 성분으로 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 카다베린 생산방법.
- 제7항에 있어서,
상기 버퍼 성분으로 사용되는 포타슘 포스페이트 용액은,
pH가 6~8이고, 포타슘 포스페이트의 농도가 20~50 mM인 것을 특징으로 하는 카다베린 생산방법.
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-
2023
- 2023-03-28 KR KR1020230040558A patent/KR102590534B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 대한민국 특허공개번호 제10-2018-0029139호 (2018.03.20)에는 라이신 탈탄산 분해효소 (lysine decarboxylase, LDC)를 암호화하는 유전자를 보유하고 있는 미생물 균주를 생촉매(biocatalyst)로 사용하여 라이신(L-lysine) 또는 라이신 염산염(L-lysine monohydrochloride) 기질로부터 고농도의 카다베린(cadaverine)을 제조하는 방법이 기재되어 있다. |
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