KR20180087540A - 피리독살 5-포스페이트에 대한 친화도가 향상된 라이신 디카르복실라제 변이효소 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법 - Google Patents
피리독살 5-포스페이트에 대한 친화도가 향상된 라이신 디카르복실라제 변이효소 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 야생형에 비하여 피리독살 5-포스페이트에 대한 친화도가 향상된 라이신 디카르복실라제 변이효소, 이를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 카다베린 생산용 형질전환체 또는 그의 배양물을 이용한 카다베린의 생산방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 야생형에 비하여 피리독살 5-포스페이트에 대한 친화도가 향상된 라이신 디카르복실라제 변이효소, 이를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 카다베린 생산용 형질전환체 또는 그의 배양물을 이용한 카다베린의 생산방법, 및 상기 효소 단백질의 결정체 제조방법에 관한 것이다.
카다베린(cadaverine) 은 폴리아마이드, 폴리우레탄, 킬레이트제, 첨가제 등 다양한 석유화학 제품에 활용되는 기반 물질이다. 석유 원료의 과도한 소비는 지구 온난화를 가속시키며, 이에 따라 환경 규제가 강화되면서 바이오-기반 경로를 통한 카다베린 생산에 대한 시장 요구가 커지고 있다.
바이오-기반의 카다베린은 라이신 디카르복실라제(LDC, Lysine decarboxylase)을 이용하여 생산된다. 그러나 라이신 디카르복실라제를 라이신에 반응시켜 카다베린을 생성하는 경우, 라이신의 탈탄산에 의해 이산화탄소가 발생하고, 1가의 양이온인 라이신으로부터 2가의 양이온인 카다베린이 생성됨으로 인해, 반응 중에 pH가 상승한다. 높은 pH에서 라이신 디카르복실라제의 활성이 급격히 감소하며, 이로 인해 카다베린의 생산량이 감소한다.
이를 해결하기 위하여, 높은 pH에서도 효소 활성을 유지하는 라이신 디카르복실라제를 개발하는 연구가 보고된바 있다(대한민국 공개특허 2016-0097691, 대한민국 공개특허 2016-0085602).
한편, 라이신 디카르복실라제 반응과정에 보조인자 피리독살 5-포스페이트 (pyridoxal 5-phosphate, PLP)를 지속적으로 공급하는 방법도 보고된바 있다(Kind S et al., Metabolic engineering 12: 341-351, 2010). 그러나 PLP 는 고가이므로, 이러한 비용을 감소시키고자 하는 시도가 다수 있어왔다. Ma W 외 (Engineering a pyridoxal 5'-phosphate supply for cadaverine production by using Escherichia coli whole-cell biocatalysis, Scientific reports 5, 2015)는 PLP 의 세포 내 수준을 향상시키기 위하여, 카다베린 생산 균주에 de novo PLP 생합성 경로를 도입하는 기술을 개시하고 있다.
본 발명의 주된 목적은 야생형 라이신 디카르복실라제의 2개 이상의 짝수의 잔기가 시스테인으로 치환되어 이루어지는, 야생형에 비하여 활성이 증가된 라이신 디카르복실라제 변이효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 변이효소를 코딩하는, 라이신 디카르복실라제 변이효소 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 위치 225 및 302의 아미노산이 시스테인으로 치환된 단백질을 코딩하는, 라이신 디카르복실라제 변이효소 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는, 카다베린 생산용 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 카세트를 포함하는, 카다베린 생산용 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체 또는 그의 배양물을 포함하는, 카다베린 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피리독살 5-포스페이트(pyridoxal 5-phosphate) 결합 부위를 가지는 효소 단백질에 이황화결합을 도입하는 단계를 포함하는, 피리독살 5-포스페이트에 대한 효소 단백질의 친화도를 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 PLP에 대한 친화도가 향상된 라이신 디카르복실라제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 야생형 라이신 디카르복실라제에 이황화결합을 도입할 경우 PLP에 대한 친화도가 향상될 뿐만 아니라, PLP가 거의 또는 아예 첨가되지 않은 환경에서도 효소 활성 및 카다베린 전환율이 크게 증가하며, pH 및 온도 저항성이 증가함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 야생형 라이신 디카르복실라제의 2n개의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되어 이루어지는, 야생형에 비하여 활성이 증가된 라이신 디카르복실라제 변이효소를 제공한다(n은 1 이상의 정수). 상기 "라이신 디카르복실라제"는 라이신의 탈카르복실화를 촉매하는 효소로, 본 명세서에서 LDC, 또는 라이신 탈탄산화효소와 혼용될 수 있다. 본 명세서에서 "야생형 라이신 디카르복실라제"는 LDCWT, 야생형 효소, 또는 재조합 효소와 혼용될 수 있다.
예를 들어, 상기 n이 1일 때, 상기 치환되는 2개의 아미노산 잔기 중 하나는, β-8 와 α-9 (220-231번째 잔기)를 연결하는 R-루프를 '닫힌' 형태 (closed conformation)로 유지할 수 있다면, 이에 제한되지 않으나, 야생형 라이신 디카르복실라제의 220 번째 내지 231 번째 아미노산 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
예를 들어, 상기 변이효소는 야생형 라이신 디카르복실라제의 225번째 아미노산 및 320번째 아미노산이 각각 시스테인으로 치환되어 이루어지는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변이효소는 야생형 라이신 디카르복실라제의 225번째 아미노산인 알라닌(Ala) 및 320번째 아미노산인 티로신(Tyr)이 각각 시스테인으로 치환되어 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명자들은 야생형 라이신 디카르복실라제 단백질의 결정체의 구조를 최초로 확인하였으며(표 3), 상기 단백질의 활성부위에 존재하는 3개의 루프(PS-, R-, AS-루프)가 다른 부분에 비하여 높은 유연성을 가지므로 PLP와의 친화도가 저해됨을 최초로 확인하였다. 특히, β-8 와 α-9 (220-231번째 잔기)를 연결하는 R-루프(regulatory loop)가 PLP와 라이신 디카르복실라제 단백질의 결합을 안정화시키는 루프(β-7과 α-8(178-187번째 잔기)을 연결하는 PS-루프)의 형태에 직접적으로 영향을 미치므로, 상기 R-루프를 닫힌 형태로 유지할 경우 라이신 디카르복실라제의 PLP에 대한 친화도를 유의하게 개선할 수 있음을 최초로 확인하였다.
예를 들어 상기 변이효소에서, 치환된 2개의 시스테인은 이황화결합을 형성할 수 있다. 이황화결합을 인공적으로 유도할 경우, 라이신 디카르복실라제 단백질의 구조 재설계가 일어나며, R-루프를 닫힌 형태로 유지되므로 단백질의 활성이 개선될 수 있다(도 7b).
상기 "활성"은 PLP에 대한 친화도, 기질에 대한 친화도, 라이신의 카다베린으로의 전환능을 포함하여, 라이신 디카르복실라제 효소가 인비보, 인트로에서 가지는 모든 능력을 의미한다. 본 발명자들은 이황화결합의 유도로 인하여 변이효소의 PLP 친화도와 카다베린 전환능이 현저히 증가함을 확인하였다(도 7c 내지 도 7h).
일 예로, 상기 야생형 라이신 디카르복실라제는 셀레노모나스 루미난티움(Selenomonas ruminantium)의 라이신 디카르복실라제, 비브리오 불리피쿠스(Vibrio vulnificus)의 라이신/오르니틴 디카르복실라제 (lysine/ornithine decarboxylase; VvL/ODC), 무스 무스쿨루스(Mus musculus)의 ODC (MmODC), 및 리파노소마 브루케이(Trypanosoma brucei)의 ODC (TbODC)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
비제한적인 예로, 상기 야생형 라이신 디카르복실라제는 서열번호 1, 및 서열번호 3 내지 서열번호 5로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 의미할 수 있다. 또한, 상기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 98% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 카다베린으로의 전환능을 갖는 단백질이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 서열의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 명세서에서 서열과 관련하여 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
일 예로, 상기 변이효소는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 98% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 카다베린으로의 전환능을 갖는 단백질이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 서열의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
일 예로, 상기 변이효소는 야생형에 비하여 온도 또는 pH에 대한 안정성이 향상된 것일 수 있다. 라이신 디카르복실라제의 탈탄산화 (decarboxylation) 반응 당 1개의 수소가 소모되므로 반응이 진행됨에 따라 pH가 증가되며, 이에 따라 시간이 지나면 반응성이 낮아진다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, PLP를 거의 또는 아예 첨가하지 않을 때에도 변이효소의 LDC 활성 및 카다베린 전환능이 매우 개선되었다. 이는 이황화결합으로 인한 구조 재설계에 의하여 PLP 결합 부위의 안정성이 증가되었기 때문으로 예상된다.
본 명세서에서 상기 "안정성"은 저항성 또는 내성과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 온도 또는 pH를 제외한 반응 조건이 동일할 때 상기 변이효소는 야생형 라이신 디카르복실라제에 비하여 보조인자인 PLP에 대한 친화도 또는 카다베린 전환능이 약 5배 내지 20배, 구체적으로 5배 내지 10배 증가하였다.
예를 들어, 상기 변이효소는 K d 값이 21μM인 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, UV/Vis 흡수 스펙트럼을 분석한 결과 변이효소의 K d 값은 21μM인 반면, 야생형 라이신 디카르복실라제의 K d 값은 72 μM으로 나타났다.
예를 들어, 상기 변이효소는 녹는점(T m)이 56.9 ℃인 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 변이효소의 T m 은 56.9 ℃로, 야생형 효소의 T m 은 52.27 ℃에 비해 높은 열안정성을 나타내었다.
일 예로, 상기 변이효소는 피리독살 5-포스페이트(pyridoxal 5-phosphate)의 첨가 없이 라이신을 카다베린으로 전환시키는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변이효소는 피리독살 5-포스페이트를 첨가하지 않을 때에도 라이신의 카다베린으로의 전환율이 20 내지 60%, 구체적으로 20 내지 40%으로 나타났다.
일 예로, 상기 변이효소는 피리독살 5-포스페이트(pyridoxal 5-phosphate)를 미량의 농도로 첨가하여 라이신을 카다베린으로 전환시키는 것일 수 있다. 상기 미량의 농도는 0.1 μM 내지 0.05mM, 구체적으로 0.1 μM 내지 0.02mM, 보다 구체적으로 0.1 μM 내지 0.01mM일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변이효소는 야생형 라이신 디카르복실라제에 비하여 PLP 농도를 1/20으로 감소시키더라도 유사한 수준의 카다베린 전환율을 나타내었다(도 7g).
일 예로, 상기 변이효소의 결정체는 공간군 P212121 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = 55.91 Å, b = 122.85 Å, c = 136.85 Å, 및 α = β = γ = 90.0°인 것일 수 있다.
한편, SrLDC의 apo-form I 결정체는 공간군 P43212 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = b = 105.97 Å, c = 73.634 Å, α = β = γ = 90.0°이며, SrLDC의 apo-form II 결정체는 공간군 C2 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = 146.45 Å, b = 70.794 Å, c = 88.061 Å, α = γ = 90.0°, β = 101.03°로, 상기 변이효소의 결정체와 명확히 구별된다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 변이효소를 코딩하는, 라이신 디카르복실라제 변이효소 유전자를 제공한다. 예를 들어 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 위치 225 및 302의 아미노산이 시스테인으로 치환된 단백질을 코딩하는 것일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는, 카다베린 생산용 카세트 또는 이를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
예를 들어, 상기 유전자는 카세트 또는 발현벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 포함된 것일 수 있다.
본 명세서에서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미할 수 있다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 카세트 또는 발현벡터를 포함하는, 카다베린 생산용 형질전환체를 제공한다.
예를 들어, 상기 카세트 또는 발현벡터는 숙주세포 내의 염색체로 삽임됨으로써 형질전환체에 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환체는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되어 형질전환된 미생물을 의미할 수 있다.
상기 카세트 또는 발현벡터를 통해 염색체 내에 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 형질전환은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미할 수 있다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다.
상기 형질전환체 또는 숙주(세포)는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 스트렙토마이시스 속 (Streptomyces sp.), 아카노박테리아 속 (Arcanobacterium sp.), 알칼리젠 속(Alcaligenes sp.) 등에 속하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체 또는 그의 배양물을 포함하는, 카다베린 생산용 조성물을 제공한다.
예를 들어, 상기 조성물은 라이신을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린의 생산방법을 제공한다.
예를 들어, 상기 배양하는 단계는 라이신을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
예를 들어, 상기 방법은 배양된 형질전환체 또는 그의 배양물로부터 카다베린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 배양하는 단계는 PLP를 0mM 내지 0.05mM, 구체적으로 0mM 내지 0.02mM, 보다 구체적으로 0mM 내지 0.01mM 처리하여 수행되는 것일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 PEG(polyethylene glycol), 시트르산나트륨(sodium citrate tribasic-citric acid), 및 염화마그네슘을 포함하는 저수조 용액과 서열번호 1의 라이신 디카르복실라제 단백질 용액을 혼합하는 단계를 포함하는, 서열번호 1의 라이신 디카르복실라제 단백질 결정체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 라이신 디카르복실라제 단백질의 결정체를 제조하기 위한 저수조 용액으로 PEG, 시트르산나트륨, 및 염화마그네슘을 사용할 경우 공간군 P43212 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = b = 105.97 Å, c = 73.634 Å, α = β = γ = 90.0° 인 apo-form I이 형성된다. 반면, 구연산나트륨, 카코딜산 나트륨(sodium cacodylate)을 저수조 용액으로 사용할 경우, 공간군 C2 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = 146.45 Å, b = 70.794 Å, c = 88.061 Å, α = γ = 90.0°, β = 101.03°인 apo-form II이 형성된다. 즉, 특정 저수조 용액을 사용할 경우에만 목적하는 결정체를 얻을 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 황산암모늄(ammonium sulfate), 카코딜산 나트륨, 및 염화나트륨을 포함하는 저수조 용액과 서열번호 6의 라이신 디카르복실라제 변이효소 단백질 용액을 혼합하는 단계를 포함하는, 서열번호 6의 라이신 디카르복실라제 변이효소 결정체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 야생형 효소의 결정체와 상이한 저수조 용액을 사용하여야 서열번호 6의 변이효소 결정체를 얻을 수 있다. 이 때 상기 변이효소 결정체는 공간군 P212121 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = 55.91 Å, b = 122.85 Å, c = 136.85 Å, α = β = γ = 90.0°인 결정체일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 PLP 결합 부위를 가지는 효소 단백질에 이황화결합을 도입하는 단계를 포함하는, PLP 에 대한 효소 단백질의 친화도를 향상시키는 방법을 제공한다.
예를 들어, 상기 PLP 결합 부위를 가지는 효소 단백질은 PLP 의존적 효소 단백질일 수 있다. 비제한적인 예로, 상기 효소 단백질은, 아스파테이트 아미노전이효소(aspartate amino-transferase), 트립토판 합성효소(tryptophan synthase), 알라닌 라세미화효소(alanine racemase), D-아미노산 아미노전이효소(D-amino acid aminotransferase), 글리코젠 인산화효소(glycogen phosphorylase), 및 라이신 디카르복실라제로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 이황화결합을 도입된 효소 단백질은 활성 부위가 '닫힌' 형태(conformation)로 유지되는 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, PLP를 보조인자 또는 조효소로 사용하는 대표적인 효소 단백질인 라이신 디카르복실라제 변이효소에 이황화결합을 도입할 경우 PLP 에 대한 효소 단백질의 친화도가 크게 향상되었다.
본 발명에 따른 변이효소는 PLP가 거의 또는 아예 첨가되지 않은 환경, 또는 높은 pH 또는/및 온도 환경에서도 카다베린을 높은 수율로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 피리독살 5-포스페이트에 대한 효소 단백질의 친화도를 향상시킬 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 SrLDC의 전체 구조를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 1a는 야생형 SrLDC, 비브리오 불리피쿠스(Vibrio vulnificus)의 라이신/오르니틴 디카르복실라제(lysine/ornithine decarboxylase; VvL/ODC, PDB code 2PLK), 무스 무스쿨루스(Mus musculus)의 ODC (MmODC, PDB code 7ODC), 및 리파노소마 브루케이(Trypanosoma brucei)의 ODC (TbODC, PDB code 1F3T)에서 동일 또는 높게 보존된 잔기를 표시한 도다. 도 1b는 SrLDC의 모노머(monomer) 구조를 나타낸 도이다. 도 1c는 SrLDC의 이량체(dimer) 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 SrLDC의 활성 부위(active site)를 나타낸 도이다. 구체적으로, (a)는 SrLDC의 apo-form과 PLP/카다베린과 결합한 SrLDC의 구조를 겹치게 놓은 도면이다. (b) 및 (c)는 3개의 다른 결정체에서 SrLDC의 b-factor를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 PLP 농도에 따른 SrLDC의 LDC 활성 및 카다베린 전환능을 나타낸 도이다.
도 4는 LDC의 유래 별 형태(conformation)를 나타낸 도이다. 구체적으로, (a)는 SrLDC, TbODC, MmODC, VvL/ODC 각각의 열린/닫힌 형태를 겹쳐 놓은 도이다. (b)는 TbODC의 열린/닫힌 형태, MmODC 의 열린/닫힌 형태, VvL/ODC의 열린/닫힌 형태를 나타낸 도이다. (e)는 SrLDC, TbODC, MmODC, VvL/ODC 각각의 PS-루프 상의 Ser182 잔기와 PLP의 포스페이트 모이어티 간의 수소결합 형태(빨간색 점선)를 나타낸 도이다.
도 5는 변이효소 SrLDCA225C / T302C 의 결정체 구조를 나타낸 도이다. 구체적으로, (a)는 변이효소의 이황화결합 위치의 전자 밀도 지도 (Electron density map)를 나타낸 도이고, (b)는 SrLDCA225C / T302C 와 닫힌 형태의 야생형 SrLDC의 구조를 겹쳐 나타낸 도이다. (c)는 변이효소의 b-factor를 나타낸 도이고, (d)는 변이효소의 안정된 AS-루프, PS-루프, R-루프를 나타낸 도이다.
도 6은 변이효소 SrLDCA225C / T302C 의 2개의 모노머를 겹쳐 나타낸 도이다.
도 7a는 변이효소 SrLDCA225C / T302C 와 SrLDCK2C / G227C 에 유도된 이황화결합의 위치를 나타낸 도이고, 도 7b는 닫힌 형태(우측)의 SrLDCA225C / T302C 와 열린 형태(좌측)의 SrLDCK2C/G227C 를 비교한 도이다.
도 7c 내지 도 7h는 변이효소와 야생형 SrLDC효소의 활성을 비교한 도이다. 구체적으로, 도 7c는 라이신에 보관한 정제된 각 효소를 나타낸 도이다. 도 7d는 각 효소의 UV/vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다. 도 7e는 각 효소의 주입 횟수(injection number)에 따른 등온 적정 열량 및 그에 따른 열역학 계수(K d)를 나타낸 도이다. 도 7f는 PLP 농도(concentration, mM)에 따른 각 효소의 활성을 나타낸 도이다. 도 7g는 PLP 농도(concentration, mM)에 따른 각 효소의 카다베린 전환률(cadavarine conversion, %)를 나타낸 도이다. 도 7h는 반응시간(reaction time, min)에 따른 각 효소의 카다베린 전환률을 나타낸 도이다.
도 8은 변이효소와 야생형 SrLDC효소의 열안정성을 비교한 도이다. 구체적으로, (a)는 pH에 따른 각 효소의 활성을 나타낸 도이고, (b)는 온도(℃)에 따른 각 효소의 녹는점 곡선을 나타낸 도이고, (c)는 37 ℃, (d)는 60 ℃에서의 보관 시간(incubation time; hour)에 따른 각 효소의 활성을 나타낸 도이다.
도 2는 SrLDC의 활성 부위(active site)를 나타낸 도이다. 구체적으로, (a)는 SrLDC의 apo-form과 PLP/카다베린과 결합한 SrLDC의 구조를 겹치게 놓은 도면이다. (b) 및 (c)는 3개의 다른 결정체에서 SrLDC의 b-factor를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 PLP 농도에 따른 SrLDC의 LDC 활성 및 카다베린 전환능을 나타낸 도이다.
도 4는 LDC의 유래 별 형태(conformation)를 나타낸 도이다. 구체적으로, (a)는 SrLDC, TbODC, MmODC, VvL/ODC 각각의 열린/닫힌 형태를 겹쳐 놓은 도이다. (b)는 TbODC의 열린/닫힌 형태, MmODC 의 열린/닫힌 형태, VvL/ODC의 열린/닫힌 형태를 나타낸 도이다. (e)는 SrLDC, TbODC, MmODC, VvL/ODC 각각의 PS-루프 상의 Ser182 잔기와 PLP의 포스페이트 모이어티 간의 수소결합 형태(빨간색 점선)를 나타낸 도이다.
도 5는 변이효소 SrLDCA225C / T302C 의 결정체 구조를 나타낸 도이다. 구체적으로, (a)는 변이효소의 이황화결합 위치의 전자 밀도 지도 (Electron density map)를 나타낸 도이고, (b)는 SrLDCA225C / T302C 와 닫힌 형태의 야생형 SrLDC의 구조를 겹쳐 나타낸 도이다. (c)는 변이효소의 b-factor를 나타낸 도이고, (d)는 변이효소의 안정된 AS-루프, PS-루프, R-루프를 나타낸 도이다.
도 6은 변이효소 SrLDCA225C / T302C 의 2개의 모노머를 겹쳐 나타낸 도이다.
도 7a는 변이효소 SrLDCA225C / T302C 와 SrLDCK2C / G227C 에 유도된 이황화결합의 위치를 나타낸 도이고, 도 7b는 닫힌 형태(우측)의 SrLDCA225C / T302C 와 열린 형태(좌측)의 SrLDCK2C/G227C 를 비교한 도이다.
도 7c 내지 도 7h는 변이효소와 야생형 SrLDC효소의 활성을 비교한 도이다. 구체적으로, 도 7c는 라이신에 보관한 정제된 각 효소를 나타낸 도이다. 도 7d는 각 효소의 UV/vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다. 도 7e는 각 효소의 주입 횟수(injection number)에 따른 등온 적정 열량 및 그에 따른 열역학 계수(K d)를 나타낸 도이다. 도 7f는 PLP 농도(concentration, mM)에 따른 각 효소의 활성을 나타낸 도이다. 도 7g는 PLP 농도(concentration, mM)에 따른 각 효소의 카다베린 전환률(cadavarine conversion, %)를 나타낸 도이다. 도 7h는 반응시간(reaction time, min)에 따른 각 효소의 카다베린 전환률을 나타낸 도이다.
도 8은 변이효소와 야생형 SrLDC효소의 열안정성을 비교한 도이다. 구체적으로, (a)는 pH에 따른 각 효소의 활성을 나타낸 도이고, (b)는 온도(℃)에 따른 각 효소의 녹는점 곡선을 나타낸 도이고, (c)는 37 ℃, (d)는 60 ℃에서의 보관 시간(incubation time; hour)에 따른 각 효소의 활성을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 야생형
라이신
디카르복실라제(
Sr
LDC)의
제조 및 정제
셀레노모나스 루미난티움(Selenomonas ruminantium)의 야생형 라이신 디카르복실라제(SrLDC, 아미노산 잔기 1-399)를 코딩하는 유전자를 셀레노모나스 루미난티움의 염색체 DNA로부터 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭시켰다.
| 프라이머 이름 | 서열 | 서열번호 |
| SrLDC_F | 5'-GCGCG CATATG AAAAACTTCCGTTTAAGCGAAAAAG -3' | 서열번호 7 |
| SrLDC_R | 5'-GCGCG CTCGAG GTGATGGTGATGGTGGTGAACTGCT -3' | 서열번호 8 |
증폭된 산물을 pET-22b(+) 벡터(Life Science Research)에 클로닝하여 6x히스-태그가 C 말단에 위치하도록 하였다. 상기 발현 벡터 pET-22b(+):Srldc 로 대장균 균주 BL21(DE3)-T1R을 형질전환시키고, 이를 100 μg/mL의 암피실린을 포함하는 LB배지 1L에서 OD600이 0.7에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 1.0mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thio-β-D-galactopyranoside)로 발현을 유도한 후, 18에서 20시간 추가로 배양하고, 4 ℃에서 4000 x g로 20분 원심분리하여 세포 펠렛을 회수하였다. 이후, 세포 펠렛을 버퍼 A (40mM Tris-HCl, pH 8.0)에 재현탁한 후, 초음파 처리하여 파쇄하였다. 세포 찌꺼기를 13,500 x g에서 30분간 원심분리하여 제거하고, 세포 용해물을 Ni-NTA agarose column(Qiagen)에 처리하였다. 이를 30mM의 이미다졸이 함유된 버퍼 A로 세척한 후, 컬럼에 붙어있는 단백질들은 버퍼 A에 들어있는 300mM 이미다졸로 용출시켰다. 최종적으로 미량의 오염물은, 버퍼 A로 평형화된 Superdex 200 prep-grade column(320mL, GE Healthcare)를 이용한 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 통하여 제거하였다. 모든 정제 실험들은 4℃에서 진행하였다.
상기 과정에 의해 정제된 단백질에 대한 SDS-PAGE 분석 결과, 44.0 kDa의 단일 폴리펩티드가 검출되었으며, 이는 SrLDC 단량체의 분자량에 대응되는 값이다. 상기 정제 단백질을 40mM Tris-HCl, pH 8.0을 이용하여 65mg/mL로 농축하여 실험에 사용하였다.
실시예
2. 변이효소의 제조 및 정제
Quick Change site-directed mutagenesis kit(stratagene)를 이용하여 부위-지정 돌연변이를 제조한 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 SrLDC의 변이 단백질을 제조 및 정제하였다. 돌연변이 제조 시 사용한 프라이머는 하기 표 2와 같다.
| 프라이머 이름 | 서열 | 서열번호 |
| SrLDCK2C_F | 5'-GGAGATATACATATGTGTAACTTCCGTTTAAGC -3' | 서열번호 9 |
| SrLDCK2C_R | 5'-GCTTAAACGGAAGTTACACATATGTATATCTCC -3' | 서열번호 10 |
| SrLDCG227C_F | 5'-GTTCCCGATGCTAAGTGTCTGAACGTTGACCTG -3' | 서열번호 11 |
| SrLDCG227C_R | 5'-CAGGTCAACGTTCAGACACTTAGCATCGGGAAC -3' | 서열번호 12 |
| SrLDCA225C_F | 5'-GCTTTCCGGTTCCCGATTGTAAGGGTCTGAACG -3' | 서열번호 13 |
| SrLDCA225C_R | 5'-CGTTCAGACCCTTACAATCGGGAACCGGAAAGC -3' | 서열번호 14 |
| SrLDCT302C_F | 5'-CATGTATGACCATTGGTGCTATCCGCTTCACTG -3' | 서열번호 15 |
| SrLDCT302C_R | 5'-CAGTGAAGCGGATAGCACCAATGGTCATACATG -3' | 서열번호 16 |
| SrLDCK143C_F | 5'-CAGTCAGAAACAATTGTGCATTAGTAGACTTG -3' | 서열번호 17 |
| SrLDCK143C_R | 5'-CAAGTCTACTAATGCACAATTGTTTCTGACTG -3' | 서열번호 18 |
| SrLDCL185C_F | 5'-GTTGGCAGCCAGTCCTGCTCCACAGCAGCGTATG -3' | 서열번호 19 |
| SrLDCL185C_R | 5'-CATACGCTGCTGTGGAGCAGGACTGGCTGCCAAC -3' | 서열번호 20 |
제조된 상기 변이효소 SrLDCA225C / T302C는 Ala225 및 Thr302 잔기를 시스테인으로 치환하여 이황화결합을 유도한 것이고, 변이효소 SrLDCK2C / G227C 는 Lys2 및 Gly227 잔기를 시스테인으로 치환하여 이황화결합을 유도한 것이다.
실시예
3. UV/
Vis
흡수 스펙트럼 분석
SrLDC 단백질에 공유 결합하는 PLP의 양을 측정하기 위하여, SrLDC 단백질의 300 nm 부터 500 nm까지의 UV/Vis 흡수 스펙트럼을 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 6.0)을 이용하여 SHIMADZU UV-VIS 분광기 UV-1800 으로 기록하였다. 45.42 μM을 SrLDC 단백질의 최종 농도로 하였다.
실시예
4. 등온 적정 열량측정법 (Isothermal titration calorimetry, ITC)을 통한 효소의 PLP 친화도 분석
SrLDC 단백질과 PLP 간의 결합력을 20 ℃에서 Nano ITC 모델 (TA Instruments) 을 이용하여 측정하였다: 먼저, 단백질 샘플 100 μM을 40 mM Tris, pH 8.0으로 준비하고, SrLDC 단백질과 PLP 의 적정을 위하여, 2.5 mM PLP 1.96 μl 를 25회 주입(injection)하였다. 주입하는 간격은 200초로 하였으며, ITC 반응 셀 내의 단백질 용액을 250rpm으로 저었다. 이 때 버퍼에 보조인자(PLP)를 희석할 때의 열(heat)과, 반응열 간의 온도차를 계산하였다. 주입 때마다 계산된 열량을 이용하여 종속 결합 모델에 맞추어 열역학 계수(K d, 결합 친화도)를 계산하였다.
실시예
5.
LDC
효소 활성 분석
5-1.
PLP
첨가 유무에 따른 효소 활성 분석
실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 SrLDC 단백질과 변이효소 단백질의 라이신 디카르복실라제 활성을 측정하기 위하여, 정제된 효소 단백질 56.78 μM을, 0.1 M 인산칼륨, pH 6.0, 50 μM L-라이신, 및 다양한 농도의 PLP를 포함하는 반응 혼합 용액 200 μl에 첨가하였다. 이후 90℃에서 5분간 상기 용액을 가열하여 LDC 반응을 종료시킨 후, 13,500 x g 에서 5분간 원심분리를 하였다. 남은 L-라이신을 라이신 옥시다제/페록시다제 (lysine oxidase/peroxidase) 법을 이용하여 검출하였다. 상기 라이신 옥시다제는 남은 L-라이신을 6-아미노-2-옥소헥사노에이트, NH3, 및 H2O2 로 전환하는 효소이며, 이 중 H2O2 는 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))를 이용하여 페록시다제에 의하여 제거된다. 구체적으로, 2x 라이신 옥시다제/페록시다제 (0.1 unit/ml lysine oxidase, 1 unit/ml peroxidase, 3.6 mM ABTS in 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0)을 LDC 반응 혼합액과 동일한 부피로 첨가하였다. 이 때 산화된 ABTS의 양을 흡광도 412nm에서 측정하였다.
5-2. pH에 따른 효소 활성 분석
한편, pH가 LDC 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, LDC 활성 분석을 pH 5 내지 10의 범위에서 진행하였다. 또한 열적 안정성을 확인하기 위하여, 각 효소를 미리 37℃ 또는 60℃에 보관하여 분석에 사용하였다. 모든 실험은 3번 반복 실험하였다.
5-3. 카다베린
전환능
분석
실시예 1에서 정제된 단백질 4.54 μM과, 0.5 M 인산 칼륨 완충액 (pH 6.0), 0.5 M L-라이신, 및 다양한 농도의 PLP를 포함하는 전환 혼합 용액 5 mL 을 37 ℃에서 30분간 보관하여 사용하는 것을 제외하고는 상기 실험예 2-1와 동일한 방법으로 카다베린의 전환능을 분석하였다. 샘플을 시간대 별로 회수하고, 남은 L-라이신의 양을 측정하여 카다베린 전환능을 관찰하였다.
실시예
6.
Sr
LDC의
녹는점(
T
m
) 측정
리간드와 표적 단백질의 결합은 단백질의 내열성을 변화시킨다. 이에, SrLDC 단백질의 열안정성을 확인하기 위하여, 제조업자의 매뉴얼을 참고하여 StepOnePlus Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific)에서 Protein thermal shift dye (Applied Biosystems)를 이용하여 녹는점 곡선을 측정하였다. 구체적으로, 1 μg의 단백질을 20 μl의 1x 단백질 열변성 염료와 혼합한 후, 25에서 90 ℃까지 온도를 올려가며 단백질 변성을 나타내는 신호 변화(녹는점)를 측정하였다. 녹는점은 1차 도함수 곡선으로부터 결정하였다.
실시예
7. 야생형
Sr
LDC
및 변이효소
Sr
LDC
A225C
/
T302C
의
결정체(crystal) 제조
7-1. 야생형
Sr
LDC
및 변이효소
Sr
LDC
A225C
/
T302C
의 결정화
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 정제한 단백질에 대한 결정화는, 상업적으로 이용가능한 키트인 sparse-matrix screen (Rigaku, Molecular Dimensions)을 이용하여 행잉-드롭 증기-확산법으로 20℃에서 진행하였다. 구체적으로, 1.0 μL의 단백질 용액 (65mg/mL in 40mM Tris-HCl, pH8.0)과 1.0 μL의 저수조(reservior) 용액을 혼합한 후, 이를 0.5mL의 저수조 용액에 대하여 평형화시켜 진행하였다.
SrLDC의 apo-form I 결정체를 여러 결정화 조건에서 제조하여 관찰한 결과, 28 % (w/v) PEG(polyethylene glycol) 400, 0.1 M sodium citrate tribasic-citric acid, pH 6.0, 및 0.2 M 염화마그네슘을 포함하는 저수조 용액을 20℃에서 사용할 경우 최적의 결정체가 도출되었다.
SrLDC의 apo-form II 결정체는 1.15 M 구연산나트륨, 0.1 M 카코딜산 나트륨(sodium cacodylate), pH 5.0을 포함하는 저수조 용액을 이용하여 결정화시켜 제조하였다.
한편, PLP/카다베린과 복합체를 이룬 SrLDC의 결정체는 50 % PEG 200, 0.1 M 구연산나트륨, pH 4.2, 0.2 M 염화나트륨을 포함하는 저수조 용액, 및 5 mM PLP(pyridoxal 5-phosphate)을 이용하여 제조하였다.
이후, 상기 결정체들을 각 30분씩 10 mM L-라이신에 담가 두었다.
한편, 변이효소 SrLDCA225C / T302C 는 1.4 M 황산암모늄(ammonium sulfate), 0.1 M 카코딜산 나트륨, pH 6.5, 및 0.2 M 염화나트륨을 포함하는 저수조 용액을 이용하여 결정화하였다.
7-2. 결정체의 구조 모델 정립(model building)
상기 실험예 7-1에서 제조한 결정체를 상기 용액 및 동결방지제 30 % (v/v) 글리세롤로 옮긴 후, 결정체보다 크기가 큰 루프로 꺼내어 액체 질소에 담궈 즉시 얼렸다.
천연 결정체의 X-레이 회절 데이터는 포항 가속기 실험실(Pohang Accelerator Laboratory; PAL, Pohang, Korea)의 7A 빔라인에서 Quantum 270 CCD detector (ADSC, USA)를 사용하여 수집하였다. SrLDC의 apo-form I 및 II 결정체는 각각 2.0 Å, 2.9 Å 해상도로 회절 데이터를 수집하였다. PLP/카다베린과 복합체를 이룬 SrLDC의 결정체와 변이효소 SrLDCA225C / T302C 결정체는 각각 2.5 Å, 1.8 Å 해상도로 회절 데이터를 수집하였다. 모든 데이터는 HKL2000 소프트웨어 패키지(Otwinowski & Minor, 1997)를 사용하여 데이터를 색인화하고, 통합시키고, 스케일화하였다.
그 결과, SrLDC의 apo-form I 결정체는 공간군 P43212 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = b = 105.97 Å, c = 73.634 Å, α = β = γ = 90.0° 으로 나타났다. 비대칭성 유닛 내의 SrLDC 1 분자에 있어 단백질 분자량 유닛 당 결정체 부피는 2.35 Å3 Da- 1 이었는데, 이는 용매 함량이 47.63 %임을 나타내는 것이다.
SrLDC의 apo-form II 결정체는 공간군 C2 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = 146.45 Å, b = 70.794 Å, c = 88.061 Å, α = γ = 90.0°, β = 101.03° 으로 나타났다. 비대칭성 유닛 내의 SrLDC 2 분자에 있어 단백질 분자량 유닛 당 결정체 부피는 2.54 Å3 Da- 1 이었는데, 이는 용매 함량이 51.68 %임을 나타내는 것이다.
PLP/카다베린과 복합체를 이룬 SrLDC의 결정체는 공간군 P6322 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = b = 111.73 Å, c = 112.97 Å, α = β = 90.0°, γ= 120.0° 으로 나타났다. 비대칭성 유닛 내의 1개 분자에 있어 단백질 분자량 유닛 당 결정체 부피는 2.31 Å3 Da- 1 이었는데, 이는 용매 함량이 46.83%임을 나타내는 것이다.
변이효소 SrLDCA225C / T302C 결정체는 공간군 P212121 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = 55.91 Å, b = 122.85 Å, c = 136.85 Å, α = β = γ = 90.0° 으로 나타났다. 비대칭성 유닛 내의 SrLDCA225C / T302C 2개 분자에 있어 단백질 분자량 유닛 당 결정체 부피는 2.67 Å3 Da- 1 이었는데, 이는 용매 함량이 53.95 % 임을 나타내는 것이다.
한편, 비브리오 불리피쿠스(Vibrio vulnificus) 유래의 L/ODC (lysine/ornithine decarboxylase) 구조를 서치 모델로 이용하고, MOLREP의 CCP4 버전에 의한 분자 치환법을 통하여 SrLDC의 apo-form I의 구조를 분석하였다. WinCoot 프로그램을 이용하여 수동으로 모델을 정립하고, CCP4 refmac5을 이용하여 조정하였다.
SrLDC의 apo-form II, PLP/카다베린과 복합체를 이룬 SrLDC, SrLDCA225C / T302C 변이효소의 구조는, 상기 조정된 SrLDC apo-form I의 구조를 이용하여, 분자 치환법에 의해 결정하였다. SrLDC apo-form I과 동일한 방법으로 모델을 정립, 조정하였다.
상기 4개 단백질 구조에 대한 데이터와 정제 통계 결과는 하기 표 3에 나타내었으며, Protein Data Bank 에 기탁하여 PDB 코드 5GJN, 5GJM, 5GJP, 5GJO 를 부여받았다.
실험예
1.
Sr
LDC
의 구조 분석
실시예 1에서 제조한 SrLDC의 구조를 분석한 결과, 도 1a에 나타난 것과 같이, 야생형 SrLDC는 비브리오 불리피쿠스(Vibrio vulnificus)의 라이신/오르니틴 디카르복실라제(lysine/ornithine decarboxylase; VvL/ODC, PDB code 2PLK), 무스 무스쿨루스(Mus musculus)의 ODC (MmODC, PDB code 7ODC), 및 리파노소마 브루케이(Trypanosoma brucei)의 ODC (TbODC, PDB code 1F3T)와 같은 오르니틴 디카르복실라제에서 보존되어 발현되는 전반적인 폴드가 유사하게 나타남을 알 수 있다. 상기 도면에서 AS-루프는 오렌지색, PS-루프는 청록색, R-루프는 마젠타색으로 표시하였다. PLP 결합에 관여하는 잔기는 빨간색 세모, 기질은 파란색 세모로 표시하였다. 이황화결합을 유도하기 위하여 시스테인에 의해 치환되는 잔기는 오렌지색 선으로 표시하였다.
도 1b에 나타난 것과 같이, SrLDC의 모노머 형태는 2개의 도메인(PLP-결합 '배리어 도메인'과 'sheet 도메인')으로 나누어진다. '배리어 도메인' (Leu27-Cys261)은 8개의 α-helix (α2 - α9; 빨강색으로 표시)와 8개의 평행한 β-strand (β2 - β9; 노랑색으로 표시) 가 교차패턴으로 되어 구성되어 있다. 8개의 α-helix는, 보조인자의 결합 부위로 작용하는 8개의 꼬여진 β-strand 코어를 감싸고 있다. 'Sheet 도메인' (Met1-Ser26, Gly262-Val393; 청록색으로 표시)은, 3개의 짧은 α-helix에 의하여 둘러싸인 7개의 꼬여진 역평행 β-sheet (β10 -β15)에 의해 형성되어 있다. 상기 도메인은 이량체화에 있어 주요 역할을 한다. 상기 도면에서 PLP는 살몬색(salmon), 카다베린은 노랑색으로 표시하였다(이하 동일).
도 1c에 나타난 것과 같이, SrLDC 동종이량체 (homodimer)는 1개 모노머의 배리어 도메인과 다른 1개 모노머의 sheet 도메인 간의 헤드-투-테일 접촉에 의해 형성된다. PISA 소프트웨어에 의해 계산해보면, 1개의 모노머에 있어 용매가 접근할 수 있는 인터페이스 중 2,474.4 Å 의 면적은 묻혀있고, 참여하는 잔기의 비율은 19.7 %에 불과하다. 동일한 2개의 활성 부위가 이량체 인터페이스에 놓여 있고, 2개의 활성 부위는 각 모노머의 잔기를 포함하고 있다. 상기 도면에서 색깔 표시는 도 1b와 동일하며, 다른 모노머의 배리어 도메인은 밝은 오렌지색, 다른 모노머의 sheet 도메인은 밝은 파란색으로 표시하였다.
실시예 7에서 PLP/카다베린과 복합체를 이룬 SrLDC의 구조를 관찰한 결과, 보조인자인 PLP와 결합 시 SrLDC의 형태 변화가 크게 나타남을 확인하였다.
구체적으로, 도 2의 (a)에 나타나듯이, PLP/카다베린과 복합체를 이룬 SrLDC과 SrLDC의 apo-form을 겹쳐서 보면, 두 구조가 거의 흡사한 것을 알 수 있다(평균제곱근편차(R.M.S.D.) 0.72 Å). 반면, 활성 부위의 경우 큰 구조차이를 나타내는데, PLP/카다베린과 복합체를 이룬 SrLDC 와 대비할 때, SrLDC의 apo-form에서는 β-7과 α-8 (Phe178-Thr187) 을 연결하는 루프가 PLP 결합 사이트와 5.0 Å 만큼 더 떨어져 있다. 이를 볼 때, 상기 루프의 His179 와 Ser182 잔기들과 PLP의 포스페이트 모이어트 간에 수소결합이 형성됨으로써 상기 루프가 PLP의 안정화에 크게 관여하는 것으로 보인다. 즉, 형태 변화가 일어날 경우 루프와 PLP의 포스페이트 모이어트 간에 수소결합이 방해되며, 이로 인해 SrLDC 단백질에 대한 PLP의 결합은 심각하게 저해될 수 있는 것이다. 따라서 상기 β-7과 α-8(Phe178-Thr187)을 연결하는 루프를 'PLP 안정화 루프 (PLP stabilization 루프)', 즉, PS-루프로 명명하기로 한다.
한편, β-8 와 α-9 (Phe220-Asp231)를 연결하는 루프 (이하 조절 루프(regulatory 루프), 즉, 'R-루프'이라 함)의 형태는 상기 PS-루프의 형태에 직접적으로 영향을 미친다. 구체적으로, PLP 결합 부위 근처에 위치하는 R-루프는 apo-form에 비해 PLP/카다베린 결합 SrLDC 구조('복합체 구조')에서 PLP 결합 부위로부터 12.2 Å 만큼 떨어져 있다. 이러한 구조적 차이는 SrLDC이 apo-form에서는 '열린' 형태로, 복합체 구조에서는 '닫힌' 형태로 존재함을 명확히 보여주는 것이다(도 2의 (c)). 각 구조에서의 루프의 안정화 모드도 상이하다. 복합체 구조의 경우 Phe220 주-사슬이 Gly257 및 Arg258 주-사슬과 "수(water)-관여" 수소결합을 형성하고, Ala225 주-사슬은 Thr302 주-사슬과 직접 수소결합을 형성하며, R-루프는 PS-루프와, Q183 곁-사슬과 Val222 주-사슬간의 수소결합에 의하여 상호작용을 한다. 반면, apo-form의 경우, R-루프가 N말단에 의해 안정화된다: Met1 및 Leu228의 주-사슬이 서로 수소결합을 형성하고, Pro223 및 Ala225 의 주-사슬이 Asn3의 주-사슬 및 곁-사슬과 수소결합을 형성한다.
또한, β-6 과 α-7 (Ile137-Gly153) 을 연결하는 루프 (이하 활성부위 루프(active site 루프), 즉, 'AS-루프'라 함)는 해당 효소 패밀리에서 크게 변동이 있는 루프로 알려져 있고, 활성 부위에 대한 기질의 접근을 조절하는 형태 변화를 수행하는 것으로 알려져 있다.
활성 부위에서 상기 3개의 루프 (PS-, R-, AS-루프)의 형태 변화로 인하여, 보조인자 PLP 및/또는 기질인 라이신의 결합에 따라 SrLDC 단백질이 '열린/닫힌' 형태 변화가 크게 일어난다.
한편, SrLDC 구조와 PLP/카다베린과 복합체를 이룬 SrLDC의 구조는 서로 다른 공간군에 속하며(상기 표 3), 이러한 결정체 구조의 차이가 단백질 일부분의 형태 변화에 영향을 미친다. 도 2의 (b)에 나타나듯이, SrLDC의 이량체에 있어서 각 모노머는 보조인자 또는 기질이 결합되어 있지 않더라도 활성 부위의 각 형태가 매우 상이한 것으로 나타났다. 이는 SrLDC의 열린/닫힌 형태가, 보조인자 PLP 및/또는 기질인 라이신의 결합보다는, 서로 다른 결정체 구조에 의해 주로 결정되는 것임을 시사하는 것이다.
한편, 도 2의 (c)에 나타나듯이, SrLDC의 3개의 루프 (PS-, R-, AS-루프)는 SrLDC의 다른 부분에 비하여 높은 유연성(flexibility)를 가지는 것으로 나타났다.
실험예
2. 야생형
Sr
LDC의
활성 분석
2-1.
PLP
첨가 유무에 따른 효소 활성 분석
실시예 5-1의 방법으로 효소 활성을 분석한 결과, 도 3a와 같이, 실시예 1에 따라 제조한 재조합 SrLDC 단백질은 PLP 첨가 없이는 반응 용액에 대하여 어떠한 반응을 일으키지 않았다. 반면, PLP 농도 0.1 mM 이상에서는 효소 활성이 최대로 나타났다. 이는 보조인자 PLP가 재조합 SrLDC 단백질의 정제과정에서 떨어져 나가므로, 재조합 단백질에서 PLP 공급 없이는 활성을 나타내지 않는다는 것을 시사하는 것이다.
또한, 도 3b과 같이, PLP 첨가 없이는 라이신의 카다베린으로의 전환 또한 관찰되지 않았다. 반면, PLP 농도 0.1 mM 이상에서는 라이신이 카다베린으로 거의 60% 정도 전환되었다. 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 효소 활성 부위의 큰 유연성 때문에 보조인자인 PLP와의 결합력이 극히 낮게 나타난다고 추측하였다.
2-2. L/
ODC
유래에 따른 활성 부위(active site)의 유연성 비교
구조적으로 동종인 효소들 간의 활성 부위 유연성을 비교하기 위하여 하기의 실험을 진행하였다. 먼저, VvL/ODC, MmODC, TbODC에 각각 PLP가 결합된 구조를 PLP와 결합된 SrLDC 단백질과 나란히 두고 비교한 결과, 전체 구조는 각각 1.2 Å, 1.4 Å, 1.4 Å 의 평균제곱근편차를 보이며 비슷하게 나타났다.
그러나, PS-루프 와 R-루프 는 단백질 마다 다소 다르게 나타났다(도 4의 (a)). MmL/ODC and TbODC 의 PS-루프는 SrLDC의 PS-루프와 비교할 때 PLP 결합 부위로부터 다소 떨어져 위치하였으며, 특히 MmODC 의 경우 ODC의 Ser200 잔기와 PLP의 포스페이트 모이어티 간의 "수(water)-관여" 수소결합이 나타난 반면, 다른 단백질의 경우 직접적인 수소결합이 나타났다(도 4의 (e)). 또한, MmO/LDC and TbODC 의 R-루프는 SrLDC의 열린/닫힌 형태의 중간 정도의 형태를 나타내고 있었다(도 4의 (a)). 한편, VvL/ODC는 다른 구조와 비교할 때 낮은 b-factor을 나타냈는데, 이러한 차이는 조밀한 결정체 구조에 따른 것으로 보인다.
실험예
3. 야생형
Sr
LDC와
변이효소
Sr
LDC
A225C
/
T302C
의
PLP
결합 부위의 안정성 비교
3-1. 구조 비교
상기 실험예 1-1의 결과를 볼 때, SrLDC는 PLP 결합을 위하여 '닫힌' 형태를 필요로 하는, 유연성 있는 활성 부위를 가지는 것으로 보인다. 이를 확인하기 위하여, 닫힌 형태를 유지함으로써 안정된 활성 부위를 가지는 변이효소를 제작하였다. 구체적으로, R-루프에 위치한 주-사슬인 Ala225와 Thr302 사이에 수소결합이 닫힌 형태에서 R-루프의 안정화에 기여함을 확인하고, Ala225와 Thr320 잔기들을 시스테인으로 치환함으로써 이황화결합을 유도하여 변이효소 SrLDCA225C / T302C 를 실시예 2의 방법으로 제작하였다.
도 5의 (a)는 실시예 2에서 제조한 변이효소 SrLDCA225C / T302C에서 예측한 것과 같이 A225C 잔기와 T302C 잔기 사이에 이황화결합이 형성된 것을 보여주는 도면이다. 이황화결합 부분의 Fo-Fc 지도는 3.0σ에서 등고선을 나타낸다. R-루프 부분은 밝은 파랑색으로, 변이된 잔기는 막대 모델로 나타내었다.
도 5의 (b)는 변이효소 SrLDCA225C / T302C 구조(AS-루프, PS-루프, R-루프 가 각각 녹색, 살몬색, 밝은-파랑색으로 표시됨)와 야생형 효소 SrLDCWT 구조(AS-루프, PS-루프, R-루프가 각각 오렌지색, 청록색, 마젠타색으로 표시됨)를 함께 놓고 비교하면, 변이효소의 PS-루프와 R-루프가 PLP가 결합하는 위치에서 '닫힌' 형태를 나타내며, PS-루프와 R-루프의 b-factor들이 SrLDCWT 에 비해 더 아래에 위치함을 알 수 있다(도 5의 (c)). 이는 인공적으로 유도한 이황화결합에 의해 루프 위치의 안정성이 유의하게 증가하였음을 나타내는 것이다. 또한 변이효소 SrLDCA225C / T302C는 AS-루프가 '닫힌' 형태이므로 기질 결합 위치의 형태에 기여하는 것으로 보인다(도 5의 (d)). 특히, AS-루프의 Val146 잔기는 기질 부근에 위치하며, 라이신 기질의 탄화수소 부분의 안정화에 관여하는 것으로 보인다. 이는 이황화결합이 기질 결합력 또한 향상시킴을 나타내는 것이다.
결국, 변이효소에 유도된 이황화결합은 R-루프의 안정화를 증가시켜, PS-루프의 안정성 또한 증가시키며, 결국 AS-루프의 안정성에 영향을 미친다.
한편, SrLDCA225C / T302C 이량체를 구성하는 2개의 모노머(각각 오렌지, 청록색으로 표시됨)를 함께 겹쳐 보면, 이들은 동일한 '닫힌' 형태를 나타내는 것을 알 수 있다(도 6). 이황화결합은 막대모델로 표시되었다. 이러한 결과는 변이효소에 유도된 이황화결합이 SrLDC의 활성 부위의 안정성을 증가시킴을 명확하게 보여주는 것이다.
한편, 상기 변이효소와 반대의 효과도 확인하기 위하여, 열린 형태의 변이효소를 제작하였다. 구체적으로 SrLDC의 열린 형태에서 R-루프가 N-말단과 상호작용함으로써 안정화되는 것을 확인하고, Lys2와 Gly227 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 이황화결합을 유도하여, 변이효소 SrLDCK2C / G227C를 실시예 2의 방법으로 제작하였다.
도 7a는 변이효소 SrLDCA225C / T302C 와 SrLDCK2C / G227C 에 유도된 이황화결합의 위치를 나타낸 것이다. 도 7b는 닫힌 형태(우측)의 SrLDCA225C / T302C 와 열린 형태(좌측)의 SrLDCK2C/G227C 를 비교한 것이다.
3-2. 효소활성 비교
실시예 1 및 실시예 2에서 제조, 정제하여 라이신에 담가둔 효소 1 mg/ml 를 촬영한 결과, 도 7c와 같이 변이효소 SrLDCA225C / T302C 는 선명한 노란색을 나타낸 반면, 변이효소 SrLDCA225C / T302C 는 밝은 노란색을 나타냈고, 야생형 SrLDC 은 투명하게 나타났다.
한편, 실시예 3에 따라 각 효소의 UV/Vis 흡수 스펙트럼을 분석한 결과, 도 7d와 같이, SrLDCA225C / T302C 는 327 nm 와 418 nm에서 흡수 피크가 나타났다. 이는 PLP에 결합한 효소에서 나타나는 특징적인 점이다. 반면, SrLDCWT 과 SrLDCK2C / G227C 에서는 이러한 스펙트럼이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 변이효소 SrLDCA225C / T302C 가 SrLDCWT 또는 SrLDCK2C / G227C 에 비하여 발현, 및 정제 과정 동안 효소 결합 부위에서 PLP와 더 많이 결합하였음을 나타내는 것이다.
한편, PLP와 효소의 친화도를 비교하기 위하여, 실시예 4의 방법에 따라 K d를 측정한 결과, 도 7e 와 같이, SrLDCWT 는 72 μM인 반면, SrLDCA225C / T302C 는 21μM로 나타났다. 이는 이황화결합의 유도로 인하여 변이효소 SrLDCA225C / T302C 의 PLP 친화도가 현저히 증가하였음을 나타낸다.
3-3.
PLP
농도에 따른 효소활성 비교
실시예 5-1의 방법으로 효소 활성을 분석한 결과, 도 7f 와 같이, 변이효소 SrLDCA225C/T302C 는 SrLDCWT 에 비해 2배 이상 높은 활성을 나타내었다. SrLDCK2C / G227C 는 0.2 mM PLP 첨가 시에도 SrLDCWT 활성의 50%에 불과한 활성을 보였다. 더욱 놀라운 것은, SrLDCA225C / T302C 는 PLP 첨가가 없는 환경에서도 0.2 mM PLP 첨가 시의 SrLDCWT 활성의 65%에 이르는 활성을 나타내었다. 나아가, SrLDCA225C / T302C 는 0.01 mM PLP를 첨가한 결과, 0.2 mM PLP 를 첨가한 SrLDCWT 에 이르는 활성을 나타내었다.
실시예 5-3의 방법으로 라이신으로부터 카다베린으로의 전환능을 분석한 경우에도 상기와 유사한 결과가 관찰되었다(도 7g). 0.2 mM PLP 첨가 시 변이효소 SrLDCA225C/T302C 는 거의 100%의 전환능을 나타낸 반면, 야생형 SrLDCWT 의 전환능은 60%에 불과한 것으로 나타났다. 가장 놀라운 결과는 PLP를 거의 또는 아예 첨가하지 않을 때 나타났다. PLP가 첨가되지 않았을 때도 변이효소 SrLDCA225C / T302C 는 25%의 라이신을 카다베린으로 전환한 반면, SrLDCWT 와 SrLDCK2C / G227C 에서는 이러한 카다베린 전환이 전혀 나타나지 않았다. 나아가, SrLDCA225C / T302C 에 0.02 mM PLP를 첨가한 결과, SrLDCWT 에 0.2 mM PLP 를 첨가한 때에 비해 전환율이 훨씬 높게 나타났다. 한편, 카다베린 전환능을 시간에 따라 측정하여 비교하면 그 차이가 보다 뚜렷하게 나타났다(도 7h).
이와 같이 PLP를 거의 또는 아예 첨가하지 않을 때에도 변이효소 SrLDCA225C/T302C 가 LDC 활성 및 카다베린 전환능이 매우 개선된 것은, 이황화결합으로 인한 구조 재설계에 의하여 PLP 결합 부위의 안정성이 증가 되었기 때문에 나타난 것으로 추측된다.
실험예
4. 야생형
Sr
LDC와
변이효소
Sr
LDC
A225C
/
T302C
의 pH, 온도 저항성 비교
4-1. pH 저항성 비교
LDC는 최적의 pH가 낮고 pH가 증가하면 활성이 감소하는 것으로 알려져 있는데, 이는 각 탈탄산화(decarboxylation) 반응 당 1개의 수소가 소모되어 반응이 진행됨에 따라 pH가 증가되며, 이에 따라 시간이 지나면 반응성이 낮아진다.
변이효소 SrLDCA225C / T302C 가 pH 증가에 대해 저항성을 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 5-2의 방법에 따라 pH에 따른 LDC 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 8의 (a)에 나타난 것과 같이, SrLDCA225C / T302C 와 SrLDCWT 는 모두 pH 6.0에서 가장 높은 활성을 나타내었고 pH 증가에 따라 활성이 점차 감소하였다. 그러나, 변이효소는 pH 전범위에서 높은 활성을 나타낼 뿐만 아니라, PLP 처리 농도를 20배로 감소시킨 경우에도 SrLDCWT 에 비해 우수한 LDC 활성을 나타내었다. 특히 pH 10에서는 0.01 mM PLP 를 첨가한 SrLDCA225C / T302C 의 LDC 활성이, 0.2 mM PLP 를 첨가한 SrLDCWT 의 활성에 비해 약 2배 높게 나타났으며, 시간 경과에도 높은 활성을 유지하였다.
4-2. 온도 저항성 비교
내부 이황화결합의 유도로 인하여 열안정성 또한 향상되었는지 확인하기 위하여, 실시예 6의 방법에 따라 녹는점(T m)을 측정하였다. 그 결과, 도 8의 (b)에 나타난 것과 같이, 변이효소 SrLDCA225C / T302C 의 T m 은 56.9 ℃로, SrLDCWT 의 T m 인 52.27 ℃에 비해 높은 열안정성을 나타내었다.
한편, 두 단백질을 37 ℃에 보관하고 활성을 관측한 결과, 도 8의 (c)에 나타난 것과 같이, SrLDCWT 의 활성은 4시간 만에 완전히 없어진 반면, 변이효소 SrLDCA225C/T302C 의 활성은 4시간 이후에도 높은 수준으로 유지되었다.
다음으로, 두 단백질은 60 ℃에 보관하고 활성을 관측한 결과, 도 8의 (d)에 나타난 것과 같이, SrLDCWT 의 활성은 급격하게 감소하여 3분만에 거의 소실된 반면, 변이효소 SrLDCA225C / T302C 은 보관한지 3분이 지난 후에도 여전히 활성을 나타내었다.
이러한 결과들은 이황화결합에 의한 구조 재설계가 안정성에만 영향을 끼치는 것이 아니라 효소의 열안정성에도 영향을 끼침을 나타내는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Lysine Decarboxylase mutant with an Enhanced Affinity for
Pyridoxal 5-Phosphate and a method for producing cadaverine using
the same
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<160> 20
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 393
<212> PRT
<213> Selenomonas ruminantium
<400> 1
Met Lys Asn Phe Arg Leu Ser Glu Lys Glu Val Lys Thr Leu Ala Lys
1 5 10 15
Arg Ile Pro Thr Pro Phe Leu Val Ala Ser Leu Asp Lys Val Glu Glu
20 25 30
Asn Tyr Gln Phe Met Arg Arg His Leu Pro Arg Ala Gly Val Phe Tyr
35 40 45
Ala Met Lys Ala Asn Pro Thr Pro Glu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Gly
50 55 60
Leu Gly Ser His Phe Asp Val Ala Ser Ala Gly Glu Met Glu Ile Leu
65 70 75 80
His Glu Leu Gly Val Asp Gly Ser Gln Met Ile Tyr Ala Asn Pro Val
85 90 95
Lys Asp Ala Arg Gly Leu Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Asn Val Arg Arg
100 105 110
Phe Thr Phe Asp Asp Pro Ser Glu Ile Asp Lys Met Ala Lys Ala Val
115 120 125
Pro Gly Ala Asp Val Leu Val Arg Ile Ala Val Arg Asn Asn Lys Ala
130 135 140
Leu Val Asp Leu Asn Thr Lys Phe Gly Ala Pro Val Glu Glu Ala Leu
145 150 155 160
Asp Leu Leu Lys Ala Ala Gln Asp Ala Gly Leu His Ala Met Gly Ile
165 170 175
Cys Phe His Val Gly Ser Gln Ser Leu Ser Thr Ala Ala Tyr Glu Glu
180 185 190
Ala Leu Leu Val Ala Arg Arg Leu Phe Asp Glu Ala Glu Glu Met Gly
195 200 205
Met His Leu Thr Asp Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Val Pro Asp
210 215 220
Ala Lys Gly Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Met Met Glu Ala Ile Asn
225 230 235 240
Lys Gln Ile Asp Arg Leu Phe Pro Asp Thr Ala Val Trp Thr Glu Pro
245 250 255
Gly Arg Tyr Met Cys Gly Thr Ala Val Asn Leu Val Thr Ser Val Ile
260 265 270
Gly Thr Lys Thr Arg Gly Glu Gln Pro Trp Tyr Ile Leu Asp Glu Gly
275 280 285
Ile Tyr Gly Cys Phe Ser Gly Ile Met Tyr Asp His Trp Thr Tyr Pro
290 295 300
Leu His Cys Phe Gly Lys Gly Asn Lys Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly
305 310 315 320
Pro Ser Cys Asp Gly Ile Asp Val Leu Tyr Arg Asp Phe Met Ala Pro
325 330 335
Glu Leu Lys Ile Gly Asp Lys Val Leu Val Thr Glu Met Gly Ser Tyr
340 345 350
Thr Ser Val Ser Ala Thr Arg Phe Asn Gly Phe Tyr Leu Ala Pro Thr
355 360 365
Ile Ile Phe Glu Asp Gln Pro Glu Tyr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asp
370 375 380
Asp Asp Val Lys Lys Lys Ala Ala Val
385 390
<210> 2
<211> 1182
<212> DNA
<213> Selenomonas ruminantium
<400> 2
atgaaaaatt tcagacttag cgaaaaagaa gtaaaaacgc ttgccaagcg tatcccgacg 60
ccctttttgg tggcttcact ggacaaggtt gaggaaaact accagtttat gcgccgtcat 120
ttgccgcggg cgggagtgtt ttatgccatg aaggcgaatc ctacgccaga aatactgtcc 180
ctgctggctg gccttggttc tcactttgat gtggcctctg ccggggagat ggagatcctc 240
catgaattgg gcgtagatgg ttcccagatg atatatgcca atccggtaaa ggatgcccgt 300
ggcctcaagg ctgcggctga ctacaatgtc cgccggttta ctttcgacga tccgtcggaa 360
atcgacaaga tggccaaggc tgtgccggga gccgatgtgc tggtgcgcat cgccgtgcgc 420
aacaacaaag ctttggtgga tctgaatacg aagtttggtg cgccggtgga agaagcgctg 480
gatcttttaa aggctgcgca ggatgctggc ctgcatgcca tggggatttg cttccatgtg 540
ggcagccagt ccctgtctac ggcggcttat gaggaagccc tgctggtggc tcgtaggctc 600
tttgatgagg cggaagaaat gggcatgcac ctgactgacc tcgacatcgg cggcggtttc 660
cctgttcccg atgccaaggg gctcaatgtg gatctggcgg ccatgatgga agccatcaac 720
aagcagatcg accgcctgtt cccggataca gctgtttgga cggaaccggg ccgttatatg 780
tgcggtacgg cggtgaacct cgtcacatcg gttatcggca cgaaaacccg tggtgagcag 840
ccttggtata tcttagatga aggcatctat ggctgcttct ccggcatcat gtatgaccac 900
tggacgtacc cgcttcattg cttcggcaag gggaataaga aaccttcgac tttcggcggc 960
cccagctgcg atggcatcga tgtgctctat cgcgacttca tggcaccgga gctcaagatc 1020
ggggacaagg tgctggtgac ggaaatgggt tcctatacca gcgtcagcgc tacgcgtttc 1080
aacggtttct acctggcgcc caccatcatc tttgaggacc agccggaata tgcagcccgt 1140
ctgacggaag atgatgatgt gaagaaaaag gcggctgtat aa 1182
<210> 3
<211> 399
<212> PRT
<213> Vibrio vulnificus
<400> 3
Met Ala His Ser His Pro Ile Phe Asp Ile Gln Ser Leu Thr Ser Pro
1 5 10 15
Ala Leu Ser Ala Glu Glu Ile Gln Val Ile Glu Thr Ser Val Glu Gln
20 25 30
Phe Gly Ala Pro Leu Leu Leu Leu Asp Cys Asp Val Ile Arg Gln Gln
35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Lys Asn Ala Leu Pro Asn Val Thr Leu His Tyr Ala
50 55 60
Leu Lys Pro Leu Pro His Pro Val Val Val Arg Thr Leu Leu Ala Glu
65 70 75 80
Gly Ala Ser Phe Asp Leu Ala Thr Thr Gly Glu Val Glu Leu Val Ala
85 90 95
Ser Glu Gly Val Pro Ala Glu Leu Thr Ile His Thr His Pro Ile Lys
100 105 110
Arg Asp Ala Asp Ile Arg Asp Ala Leu Ala Tyr Gly Cys Asn Val Phe
115 120 125
Val Val Asp Asn Leu Asn Glu Leu Glu Lys Phe Lys Ala Tyr Arg Asp
130 135 140
Glu Val Glu Leu Leu Val Arg Leu Ser Phe Arg Asn Ser Glu Ala Phe
145 150 155 160
Ala Asp Leu Ser Lys Lys Phe Gly Cys Ser Pro Glu Gln Ala Leu Val
165 170 175
Ile Ile Glu Thr Ala Lys Glu Trp Asn Ile Arg Ile Lys Gly Leu Ser
180 185 190
Phe His Val Gly Ser Gln Thr Thr Asn Pro Asn Lys Tyr Val Glu Ala
195 200 205
Ile His Thr Cys Arg Asn Val Met Glu Gln Val Val Glu Arg Gly Leu
210 215 220
Pro Ala Leu Ser Thr Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Val Asn Tyr
225 230 235 240
Thr Gln Gln Val Met Pro Ile Asp Gln Phe Cys Val Pro Ile Asn Glu
245 250 255
Ala Leu Ser Leu Leu Pro Glu Thr Val His Val Leu Ala Glu Pro Gly
260 265 270
Arg Phe Ile Cys Ala Pro Ala Val Thr Ser Val Ala Ser Val Met Gly
275 280 285
Gln Ala Glu Arg Glu Gly Gln Ile Trp Tyr Tyr Leu Asp Asp Gly Ile
290 295 300
Tyr Gly Ser Phe Ser Gly Leu Met Phe Asp Asp Ala Arg Tyr Pro Leu
305 310 315 320
Thr Thr Ile Lys Gln Gly Gly Glu Leu Ile Pro Ser Val Leu Ser Gly
325 330 335
Pro Thr Cys Asp Ser Val Asp Val Ile Ala Glu Asn Ile Leu Leu Pro
340 345 350
Lys Leu Asn Asn Gly Asp Leu Val Ile Gly Arg Thr Met Gly Ala Tyr
355 360 365
Thr Ser Ala Thr Ala Thr Asp Phe Asn Phe Phe Lys Arg Ala Gln Thr
370 375 380
Ile Ala Leu Asn Glu Phe Val Ala Gly Ser Glu Arg Met Ile Gly
385 390 395
<210> 4
<211> 461
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Met Ser Ser Phe Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys His Ile Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gly Phe Thr Ala Lys Asp Ile Leu Asp Gln Lys Ile Asn Glu Val Ser
20 25 30
Ser Ser Asp Asp Lys Asp Ala Phe Tyr Val Ala Asp Leu Gly Asp Ile
35 40 45
Leu Lys Lys His Leu Arg Trp Leu Lys Ala Leu Pro Arg Val Thr Pro
50 55 60
Phe Tyr Ala Val Lys Cys Asn Asp Ser Arg Ala Ile Val Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ala Ala Ile Gly Thr Gly Phe Asp Cys Ala Ser Lys Thr Glu Ile Gln
85 90 95
Leu Val Gln Gly Leu Gly Val Pro Ala Glu Arg Val Ile Tyr Ala Asn
100 105 110
Pro Cys Lys Gln Val Ser Gln Ile Lys Tyr Ala Ala Ser Asn Gly Val
115 120 125
Gln Met Met Thr Phe Asp Ser Glu Ile Glu Leu Met Lys Val Ala Arg
130 135 140
Ala His Pro Lys Ala Lys Leu Val Leu Arg Ile Ala Thr Asp Asp Ser
145 150 155 160
Lys Ala Val Cys Arg Leu Ser Val Lys Phe Gly Ala Thr Leu Lys Thr
165 170 175
Ser Arg Leu Leu Leu Glu Arg Ala Lys Glu Leu Asn Ile Asp Val Ile
180 185 190
Gly Val Ser Phe His Val Gly Ser Gly Cys Thr Asp Pro Glu Thr Phe
195 200 205
Val Gln Ala Val Ser Asp Ala Arg Cys Val Phe Asp Met Ala Thr Glu
210 215 220
Val Gly Phe Ser Met His Leu Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Gly
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Lys Leu Lys Phe Glu Glu Ile Thr Ser Val Ile Asn
245 250 255
Pro Ala Leu Asp Lys Tyr Phe Pro Ser Asp Ser Gly Val Arg Ile Ile
260 265 270
Ala Glu Pro Gly Arg Tyr Tyr Val Ala Ser Ala Phe Thr Leu Ala Val
275 280 285
Asn Ile Ile Ala Lys Lys Thr Val Trp Lys Glu Gln Pro Gly Ser Asp
290 295 300
Asp Glu Asp Glu Ser Asn Glu Gln Thr Phe Met Tyr Tyr Val Asn Asp
305 310 315 320
Gly Val Tyr Gly Ser Phe Asn Cys Ile Leu Tyr Asp His Ala His Val
325 330 335
Lys Ala Leu Leu Gln Lys Arg Pro Lys Pro Asp Glu Lys Tyr Tyr Ser
340 345 350
Ser Ser Ile Trp Gly Pro Thr Cys Asp Gly Leu Asp Arg Ile Val Glu
355 360 365
Arg Cys Asn Leu Pro Glu Met His Val Gly Asp Trp Met Leu Phe Glu
370 375 380
Asn Met Gly Ala Tyr Thr Val Ala Ala Ala Ser Thr Phe Asn Gly Phe
385 390 395 400
Gln Arg Pro Asn Ile Tyr Tyr Val Met Ser Arg Pro Met Trp Gln Leu
405 410 415
Met Lys Gln Ile Gln Ser His Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln
420 425 430
Asp Asp Gly Thr Leu Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp
435 440 445
Arg His Pro Ala Ala Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val
450 455 460
<210> 5
<211> 423
<212> PRT
<213> Trypanosoma brucei
<400> 5
Met Asp Ile Val Val Asn Asp Asp Leu Ser Cys Arg Phe Leu Glu Gly
1 5 10 15
Phe Asn Thr Arg Asp Ala Leu Cys Lys Lys Ile Ser Met Asn Thr Cys
20 25 30
Asp Glu Gly Asp Pro Phe Phe Val Ala Asp Leu Gly Asp Ile Val Arg
35 40 45
Lys His Glu Thr Trp Lys Lys Cys Leu Pro Arg Val Thr Pro Phe Tyr
50 55 60
Ala Val Lys Cys Asn Asp Asp Trp Arg Val Leu Gly Thr Leu Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gly Thr Gly Phe Asp Cys Ala Ser Asn Thr Glu Ile Gln Arg Val
85 90 95
Arg Gly Ile Gly Val Pro Pro Glu Lys Ile Ile Tyr Ala Asn Pro Cys
100 105 110
Lys Gln Ile Ser His Ile Arg Tyr Ala Arg Asp Ser Gly Val Asp Val
115 120 125
Met Thr Phe Asp Cys Val Asp Glu Leu Glu Lys Val Ala Lys Thr His
130 135 140
Pro Lys Ala Lys Met Val Leu Arg Ile Ser Thr Asp Asp Ser Leu Ala
145 150 155 160
Arg Cys Arg Leu Ser Val Lys Phe Gly Ala Lys Val Glu Asp Cys Arg
165 170 175
Phe Ile Leu Glu Gln Ala Lys Lys Leu Asn Ile Asp Val Thr Gly Val
180 185 190
Ser Phe His Val Gly Ser Gly Ser Thr Asp Ala Ser Thr Phe Ala Gln
195 200 205
Ala Ile Ser Asp Ser Arg Phe Val Phe Asp Met Gly Thr Glu Leu Gly
210 215 220
Phe Asn Met His Ile Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Gly Thr Arg
225 230 235 240
Asp Ala Pro Leu Lys Phe Glu Glu Ile Ala Gly Val Ile Asn Asn Ala
245 250 255
Leu Glu Lys His Phe Pro Pro Asp Leu Lys Leu Thr Ile Val Ala Glu
260 265 270
Pro Gly Arg Tyr Tyr Val Ala Ser Ala Phe Thr Leu Ala Val Asn Val
275 280 285
Ile Ala Lys Lys Val Thr Pro Gly Val Gln Thr Asp Val Gly Ala His
290 295 300
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305 310 315 320
Tyr Gly Ser Phe Asn Cys Ile Leu Tyr Asp His Ala Val Val Arg Pro
325 330 335
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340 345 350
Val Trp Gly Pro Thr Cys Asp Gly Leu Asp Gln Ile Val Glu Arg Tyr
355 360 365
Tyr Leu Pro Glu Met Gln Val Gly Glu Trp Leu Leu Phe Glu Asp Met
370 375 380
Gly Ala Tyr Thr Val Val Gly Thr Ser Ser Phe Asn Gly Phe Gln Ser
385 390 395 400
Pro Thr Ile Tyr Tyr Val Val Ser Gly Leu Pro Asp His Val Val Arg
405 410 415
Glu Leu Lys Ser Gln Lys Ser
420
<210> 6
<211> 393
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lysine Decarboxylase mutant
<400> 6
Met Lys Asn Phe Arg Leu Ser Glu Lys Glu Val Lys Thr Leu Ala Lys
1 5 10 15
Arg Ile Pro Thr Pro Phe Leu Val Ala Ser Leu Asp Lys Val Glu Glu
20 25 30
Asn Tyr Gln Phe Met Arg Arg His Leu Pro Arg Ala Gly Val Phe Tyr
35 40 45
Ala Met Lys Ala Asn Pro Thr Pro Glu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Gly
50 55 60
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65 70 75 80
His Glu Leu Gly Val Asp Gly Ser Gln Met Ile Tyr Ala Asn Pro Val
85 90 95
Lys Asp Ala Arg Gly Leu Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Asn Val Arg Arg
100 105 110
Phe Thr Phe Asp Asp Pro Ser Glu Ile Asp Lys Met Ala Lys Ala Val
115 120 125
Pro Gly Ala Asp Val Leu Val Arg Ile Ala Val Arg Asn Asn Lys Ala
130 135 140
Leu Val Asp Leu Asn Thr Lys Phe Gly Ala Pro Val Glu Glu Ala Leu
145 150 155 160
Asp Leu Leu Lys Ala Ala Gln Asp Ala Gly Leu His Ala Met Gly Ile
165 170 175
Cys Phe His Val Gly Ser Gln Ser Leu Ser Thr Ala Ala Tyr Glu Glu
180 185 190
Ala Leu Leu Val Ala Arg Arg Leu Phe Asp Glu Ala Glu Glu Met Gly
195 200 205
Met His Leu Thr Asp Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Val Pro Asp
210 215 220
Cys Lys Gly Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Met Met Glu Ala Ile Asn
225 230 235 240
Lys Gln Ile Asp Arg Leu Phe Pro Asp Thr Ala Val Trp Thr Glu Pro
245 250 255
Gly Arg Tyr Met Cys Gly Thr Ala Val Asn Leu Val Thr Ser Val Ile
260 265 270
Gly Thr Lys Thr Arg Gly Glu Gln Pro Trp Tyr Ile Leu Asp Glu Gly
275 280 285
Ile Tyr Gly Cys Phe Ser Gly Ile Met Tyr Asp His Trp Cys Tyr Pro
290 295 300
Leu His Cys Phe Gly Lys Gly Asn Lys Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly
305 310 315 320
Pro Ser Cys Asp Gly Ile Asp Val Leu Tyr Arg Asp Phe Met Ala Pro
325 330 335
Glu Leu Lys Ile Gly Asp Lys Val Leu Val Thr Glu Met Gly Ser Tyr
340 345 350
Thr Ser Val Ser Ala Thr Arg Phe Asn Gly Phe Tyr Leu Ala Pro Thr
355 360 365
Ile Ile Phe Glu Asp Gln Pro Glu Tyr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asp
370 375 380
Asp Asp Val Lys Lys Lys Ala Ala Val
385 390
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC_F primer
<400> 7
gcgcgcatat gaaaaacttc cgtttaagcg aaaaag 36
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC_R primer
<400> 8
gcgcgctcga ggtgatggtg atggtggtga actgct 36
<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC(K2C)_F primer
<400> 9
ggagatatac atatgtgtaa cttccgttta agc 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC(K2C)_R primer
<400> 10
gcttaaacgg aagttacaca tatgtatatc tcc 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 11
gttcccgatg ctaagtgtct gaacgttgac ctg 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC(G227C)_R primer
<400> 12
caggtcaacg ttcagacact tagcatcggg aac 33
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC(A225C)_F primer
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gctttccggt tcccgattgt aagggtctga acg 33
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 14
cgttcagacc cttacaatcg ggaaccggaa agc 33
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 15
catgtatgac cattggtgct atccgcttca ctg 33
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 16
cagtgaagcg gatagcacca atggtcatac atg 33
<210> 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC(K143C)_F primer
<400> 17
cagtcagaaa caattgtgca ttagtagact tg 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC(K143C)_R primer
<400> 18
caagtctact aatgcacaat tgtttctgac tg 32
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC(L185C)_F primer
<400> 19
gttggcagcc agtcctgctc cacagcagcg tatg 34
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SrLDC(L185C)_R primer
<400> 20
catacgctgc tgtggagcag gactggctgc caac 34
Claims (21)
- 야생형 라이신 디카르복실라제의 225번째 아미노산 및 320번째 아미노산이 각각 시스테인으로 치환되어 이루어지는, 야생형에 비하여 활성이 증가된 라이신 디카르복실라제 변이효소.
- 제1항에 있어서,
상기 변이효소는 치환된 2개의 시스테인이 이황화결합을 형성한 것인, 변이효소.
- 제1항에 있어서,
상기 야생형 라이신 디카르복실라제는 서열번호 1, 및 서열번호 3 내지 서열번호 5로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 변이효소.
- 제1항에 있어서,
상기 변이효소는 야생형에 비하여 온도 또는 pH에 대한 안정성이 향상된 것인, 변이효소.
- 제1항에 있어서,
상기 변이효소는 피리독살 5-포스페이트(pyridoxal 5-phosphate)의 첨가 없이 라이신을 카다베린으로 전환시키는 것인, 변이효소.
- 제1항에 있어서,
상기 변이효소는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 변이효소.
- 제1항에 있어서,
상기 변이효소는 하기 (a) 내지 (c)의 특성 중 어느 하나 이상을 나타내는 것인, 변이효소:
(a) K d = 21μM;
(b) 피리독살 5-포스페이트를 첨가하지 않을 때 카다베린으로의 전환율이 20 내지 60%; 및
(c) 녹는점(T m) = 56.9℃.
- 제1항에 있어서,
상기 변이효소의 결정체는 공간군 P212121 에 속하고, 단위 셀 파라미터는 a = 55.91 Å, b = 122.85 Å, c = 136.85 Å, 및 α = β = γ = 90.0°인 것인, 변이효소.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이효소를 코딩하는, 라이신 디카르복실라제 변이효소 유전자.
- 서열번호 1의 아미노산 서열에서 위치 225 및 302의 아미노산이 시스테인으로 치환된 단백질을 코딩하는, 라이신 디카르복실라제 변이효소 유전자.
- 제9항의 유전자를 포함하는, 카다베린 생산용 카세트.
- 제11항의 카세트를 포함하는, 카다베린 생산용 형질전환체.
- 제12항의 형질전환체 또는 그의 배양물을 포함하는, 카다베린 생산용 조성물.
- 제13항에 있어서,
상기 조성물은 라이신을 추가로 포함하는 것인, 카다베린 생산용 조성물.
- 제12항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린의 생산방법.
- 제15항에 있어서,
상기 배양하는 단계는 라이신을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 카다베린의 생산방법.
- 제15항에 있어서,
상기 방법은 배양된 형질전환체 또는 그의 배양물로부터 카다베린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 카다베린의 생산방법.
- PEG(polyethylene glycol), 시트르산나트륨(sodium citrate tribasic-citric acid), 및 염화마그네슘을 포함하는 저수조 용액과 서열번호 1의 라이신 디카르복실라제 단백질 용액을 혼합하는 단계를 포함하는, 서열번호 1의 라이신 디카르복실라제 단백질 결정체의 제조방법.
- 황산암모늄(ammonium sulfate), 카코딜산 나트륨, 및 염화나트륨을 포함하는 저수조 용액과 서열번호 6의 라이신 디카르복실라제 변이효소 단백질 용액을 혼합하는 단계를 포함하는, 서열번호 6의 라이신 디카르복실라제 변이효소 결정체의 제조방법.
- 피리독살 5-포스페이트(pyridoxal 5-phosphate) 결합 부위를 가지는 효소 단백질에 이황화결합을 도입하는 단계를 포함하는, 피리독살 5-포스페이트에 대한 효소 단백질의 친화도를 향상시키는 방법.
- 제20항에 있어서,
상기 피리독살 5-포스페이트 결합 부위를 가지는 단백질은, 아스파테이트 아미노전이효소(aspartate amino-transferase), 트립토판 합성효소(tryptophan synthase), 알라닌 라세미화효소(alanine racemase), D-아미노산 아미노전이효소(D-amino acid aminotransferase), 글리코젠 인산화효소(glycogen phosphorylase), 및 라이신 디카르복실라제로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 방법.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR102590534B1 (ko) * | 2023-03-28 | 2023-10-16 | 국민대학교산학협력단 | 하프니아 알베이 균주를 생촉매로 이용한 카다베린 생산방법 |
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-
2017
- 2017-01-24 KR KR1020170011275A patent/KR101919220B1/ko active IP Right Grant
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