KR20220021436A - 고알칼리 조건에서 활성이 높은 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용한 카다베린 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고알칼리 조건에서 활성이 높은 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용한 카다베린 생산 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 신규 라이신 디카르복실라제를 활용하였을 때, pH 상승 변화에도 안정된 활성을 발휘하므로, 종래 문제가 되던 알칼리 환경에서의 라이신으로부터 카다베린으로의 전환 효율이 개선되며, 이를 통해 카다베린 생산 공정 개발 및 최적화에 광범위하게 적용될 수 있다.

Description

고알칼리 조건에서 활성이 높은 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용한 카다베린 생산 방법{Novel Lysine Decarboxylase with High Catalytic Efficiency in Alkaline Condition and Method for Producing Cadaverine Using the same}

본 발명은 고알칼리 조건에서 활성이 높은 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용한 카다베린 생산 방법에 관한 것이다.

라이신(lysine)은 식품 첨가제, 사료 배합에 주로 이용되며 전 세계적으로 그 수요가 연간 100만톤 이상이며, 미생물 기반 생산 공정들이 구축되고 실제 상업적인 생산이 이루어지고 있다.

카다베린(cadaverine)은 산업적으로 중요한 화합물로서, 폴리아마이드, 폴리우레탄, 킬레이트제, 첨가제 등 다양한 석유화학 제품에 활용되는 기반 물질이다. 이러한 석유 원료의 과도한 소비는 지구 온난화를 가속시키며, 이에 따라 환경 규제가 강화되면서 바이오-기반 경로를 통한 카다베린 생산에 대한 시장 요구가 커지고 있다. 특히, 재생 가능한 원료를 활용한 미생물 기반 카다베린 생산은 기존 석유화학 기반 폴리아미드 생산을 대체할 방안으로 각광받고 있어 미생물 기반 카다베린 생산에 대한 연구가 최근 떠오르고 있다.

미생물 기반 카다베린 생산 방법에는 크게 두 가지 전략이 적용될 수 있다. 글루코스와 같은 당류를 활용한 카다베린 생산, 생촉매 및 바이오트랜스포메이션을 활용한 라이신의 카다베린 직접 전환이 그것들이며 특히, 라이신의 직접 전환은 고농도 라이신 생산 공정이 확립되어 있기 때문에 훨씬 효율적일 수 있다. 더불어, 카다베린은 라이신보다 높은 경제적 가치를 가지고 있으며 최근 라이신이 생산 과잉 문제에 시달리는 점을 감안하면, 라이신을 카다베린으로 직접 전환하는 방법이 경제성 측면에서도 큰 이점을 가진다.

라이신 기반 카다베린 생산은 라이신 디카르복실라제(Lysine decarboxylase, LDC)에 의해 이루어질 수 있으며, 라이신 디카르복실라제는 대장균을 포함한 다양한 미생물 종에 존재한다. 특히, 대장균의 라이신 디카르복실라제 중 CadA는 높은 활성을 가지며 최근 그 구조 정보도 알려짐에 따라 카다베린 생산 공정 연구에 가장 많이 활용되는 효소다.

카다베린 생산을 위한 대장균 CadA 활용의 한계점 중 하나는 해당 효소가 알칼리 환경에서 낮은 활성을 갖는다는 점이다. 라이신의 카다베린 전환 과정에서는 강염기인 카다베린의 생산으로 인해 높은 알칼리 환경이 조성되는데, 낮은 알칼리 내성은 카다베린 전환 효율을 저해한다. 한편, 대장균의 또 다른 라이신 디카르복실라제인 LdcC는 CadA보다 상대적으로 낮은 효소 활성을 갖지만 알칼리 환경에서도 높은 내성을 갖는 것으로 알려져 있다.

이에, 상술한 바와 같이, 종래기술들에 의한 카다베린 생산은 그 생산 효율이 높지 않은 문제점이 있기 때문에, 고수율로 카다베린을 생산할 수 있는 균주 및 이에 의해 생산되는 알칼리 환경에서 높은 활성을 갖는 라이신 디카르복실라제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 고알칼리 조건에서도 높은 활성을 갖는 신규 라이신 디카르복실라제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 대장균의 라이신 디카르복실라제 2 종(CadA 및 LdcC)을 재조합하여 신규한 라이신 디카르복실라제를 제작하였고, 상기 신규한 라이신 디카르복실라제의 알칼리 환경에서의 카다베린 전환 효율을 측정했을 때, 야생형 CadA 및 LdcC와 비교하여 카다베린 전환 효율을 탁월하게 향상시킨 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 CadA 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 LdcC가 결합된, 라이신 디카르복실라아제를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는, 라이신 디카르복실라제 유전자를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 라이신 디카르복실라제 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된, 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는, 카다베린 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린의 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 CadA 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 LdcC가 융합된, 라이신 디카르복실라아제를 제공한다.

본 발명의 라이신 디카르복실라아제는, 서열번호 1의 야생형 라이신 디카르복실라제 CadA의 특정 위치의 아미노산 서열 부위에, 이에 상응하는, 다른 종류의 야생형 라이신 디카르복실라제 서열번호 2의 LdcC 펩타이드 단편을 삽입함으로써 CadA의 아미노산 서열 일부가 LdcC 펩타이드로 치환된 신규한 라이신 디카르복실라아제이며, 또한, 상술한 재조합에 따라 야생형 라이신 디카르복실라아제인 CadA 및 LdcC에 비해 pH 7 이상의 알칼리 조건에서 pH에 대한 안정성이 향상되어 활성이 증가된, 라이신 디카르복실라제 변이체인 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 라이신 디카르복실라아제는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 CadA의 121번째 내지 240번째 위치에 상응하는 아미노산 부위가, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 LdcC의 121번째 내지 240번째 위치에 상응하는 아미노산 부위(펩타이드 단편)로 상호치환된 것이며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 야생형에 비하여 활성이 증가된, 라이신 디카르복실라제를 언급하면서 사용되는 "라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase) 활성을 가지는 단백질" 또는 "라이신 디카르복실라제"는 라이신의 탈카르복실화 반응을 촉매함으로써 라이신을 탈탄산시켜 카다베린(cadaverine)과 이산화탄소를 생성할 수 있는 활성을 갖는 효소(단백질)을 의미하며, CadA* 1, 라이신 탈탄산화효소, 재조합 효소와 혼용된다.

본 명세서에서 "야생형 라이신 디카르복실라제"는 야생형 CadA 및 야생형 LDC 효소와 혼용되며, 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 의미할 수 있다.

상기 "활성"은 라이신의 카다베린으로의 전환능을 포함하여, 라이신 디카르복실라제 효소가 인비보, 인비트로에서 가지는 모든 능력을 의미한다.

본 발명에서는 본 발명의 대장균-유래 유전자 재조합에 의하여 야생형들에 비하여 pH 7 이상의 알칼리 조건에서 pH에 대한 안정성이 향상되어, 라이신 디카르복실라제의 카다베린 전환능이 현저히 증가함을 확인하였다.

본 명세서에서 상기 "안정성"은 저항성 또는 내성과 동일한 의미로 사용될 수 있다.

상기 대장균 유래의 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 서열 상동성이 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나 상기의 아미노산 서열에 한정되는 것은 아니며, 라이신 디카르복실라제 활성을 유지하는 한 가능한 아미노산 서열을 모두 포함할 수 있다.

즉, 상기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 98% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 라이신을 카다베린으로의 전환능을 갖는 단백질이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 서열의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

본 명세서에서 서열과 관련하여 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 쓰던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

한편, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 98% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 카다베린으로의 전환능을 갖는 단백질이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 서열의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는, 라이신 디카르복실라제 유전자를 제공한다. 예를 들어 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 위치 121 내지 240의 아미노산 부위가, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 위치 121 내지 240의 펩타이드 단편으로 삽입되어 치환된 단백질을 코딩하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 라이신 디카르복실라제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 라이신 디카르복실라제 유전자는 HCE 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 상기 벡터는 도 1b에 개시된 개열지도를 갖는다.

본 명세서에서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미할 수 있다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체로서 재조합 미생물을 제공한다.

예를 들어, 상기 재조합벡터는 숙주세포 내의 염색체로 삽임됨으로써 형질전환체에 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환체는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되어 형질전환된 미생물을 의미할 수 있다.

상기 발현벡터를 통해 염색체 내에 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 형질전환은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미할 수 있다.

형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다.

상기 형질전환체 또는 숙주(세포)는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 스트렙토마이시스 속 (Streptomyces sp.), 아카노박테리아 속 (Arcanobacterium sp.), 알칼리젠 속(Alcaligenes sp.) 등에 속하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 상기 형질전환된 미생물은 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 용어 "야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물" 이란, 천연 상태의 미생물 또는 모균주 대비 라이신의 생산능이 증가된 미생물을 의미하는데, 상기 라이신 생산능이 향상된 미생물은 모균주 대비 라이신 생산능이 향상된 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다.

상기 미생물이 상기 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환되기 위해, 본 발명의 라이신 디카르복실라제 유전자가 형질전환의 목적이 되는 미생물 내에 라이신 디카르복실라제 단백질 또는 유전자 발현단위로 포함될 수 있다. 상기 라이신 디카르복실라제의 유전자 발현단위는 벡터에 작동가능하게 연결되어 상기 미생물에 형질전환되어 포함되거나 상기 미생물의 염색체 내에 삽입되는 것 일 수 있다. 구체적으로, 상기 라이신 디카르복실라제 유전자가 개시코돈의 상류에 연결된 프로모터에 의해 과발현되도록 작동가능하게 연결되는 것일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "발현단위"는 프로모터와 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 단편을 의미하며, 이에 3'-UTR, 5'-UTR, poly A tail 등이 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명에서 용어 "발현단위"는 "발현카세트"와 혼용될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "작동가능하게 연결"이란 라이신 디카르복실라제를 암호화하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

이는 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 라이신 디카르복실라제 유전자와 작동가능하게 연결되어, 상기 라이신 디카르복실라제 유전자의 전사 활성을 조절할 수 있음을 의미하는 것이다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 상기 대장균 균주에서 유래된 라이신 디카르복실라제 유전자를 숙주세포, 구체적으로 에스케리키아 속 균주 미생물 내로 도입하여 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있도록 하는 전반적인 행위를 의미한다. 이때, 상기 라이신 디카르복실라제 유전자는 라이신 디카르복실라제를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로서 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 상기 유전자의 발현에 필요한 모든 요소(element)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사종결 신호, 리보좀 결합 부위 및 번역 종결 신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터의 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포로 도입되어, 숙주세포의 발현에 필요한 서열과 작동가능하게 연결되는 것일 수도 있다. 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 DNA를 도입하여 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현 벡터를 사용할 수 있다. 상기 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환의 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 그 예로, 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

일 구현예에서 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물이 본 발명의 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환됨으로써, 우수한 카다베린 생산능을 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체인 재조합 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는, 카다베린 생산용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 라이신을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 라이신 디카르복실라아제을 생산하는 재조합 미생물을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린의 생산방법을 제공한다.

상기 배양하는 단계는 라이신을 포함하는 배지에서 수행될 수 있으며, 상기 방법은 배양된 형질전환체 또는 그의 배양물로부터 카다베린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

즉, 상기 형질전환된 미생물을 배양한 배지에 라이신을 첨가함으로써 미생물 자체를 이용하여 라이신을 탈탄산시킴으로써 카다베린으로 전환시킬 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 카다베린 생산 방법은 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물이 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질이 발현되도록 형질전환된 카다베린 생산능을 가지는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지에서 카다베린을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질 및 상기 야생형에 비하여 향상된 라이신 생산능을 가지는 미생물은 각각 상술한 바와 같다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 탄소원은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 상기 예는 예시일 뿐 이에 한정되지 않는다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배지에 적절한 방식으로 첨가하여 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 라이신 디카르복실라제의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.

상기 카다베린을 회수하는 방법은, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 카다베린을 수집 또는 회수할 수 있다. 또한 이러한 회수 방법에는, 원심분리, 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배지를 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온 교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

또한 상기 카다베린의 생산 방법은 상기 미생물 또는 배지로부터 라이신 디카르복실라제를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 미생물 또는 배지로부터 라이신 디카르복실라제를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 미생물 또는 배지로부터 생산된 라이신 디카르복실라제를 수집 또는 회수할 수 있다. 또한 이러한 회수 방법에는, 원심분리, 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온 교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다. 또한 배지 중 미생물을 파괴하여 얻은 세포 분쇄액(cell lysate)로부터 라이신 디카르복실라제를 회수할 수 있다. 상기 세포 분쇄액은 당해 분야에 공지된 적절한 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들면 물리적인 분쇄기나, 적절한 상업적으로 입수가능한 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용할 수 있다. 이러한 세포 분쇄액로부터 원심분리 등 적절한 당해 분야에서 공지된 방법을 통해 라이신 디카르복실라제를 회수할 수 있다.

또한, 본 발명의 카다베린 생산방법은 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질 또는 상기 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물을 이용하여 라이신으로부터 카다베린으로 전환하는 단계; 및 상기 전환된 카다베린을 회수하는 단계를 포함하는 카다베린의 생산방법을 이용할 수도 있다.

상기 라이신을 카다베린으로 전환하는 단계는 신규 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하는 미생물로부터 추출하여 정제된 효소를 이용하여 라이신을 탈탄산시킴으로써 카다베린을 생산할 수 있다.

본 발명의 방법은 상술한 재조합 미생물을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따른 신규 라이신 디카르복실라제를 활용하였을 때, pH 상승 변화에도 안정된 활성을 발휘하므로, 종래 문제가 되던 알칼리 환경에서의 라이신으로부터 카다베린으로의 전환 효율이 개선되며, 이를 통해 카다베린 생산 공정 개발 및 최적화에 광범위하게 적용될 수 있다.

도 1a는 라이신으로부터의 카다베린 생산 과정을 개략적으로 보여주고, 도 1b는 본 발명의 벡터 맵을 보여준다.
도 2는 pH 조건에 따른 저농도의 본 발명의 신규한 라이신 디카르복실라제의 카다베린 전환 효율을 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 알칼리 조건 하에서 고농도의 본 발명의 신규한 라이신 디카르복실라제의 카다베린 전환 효율을 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 라이신 디카르복실라제들의 발현량을 비교한 결과를 보여준다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명의 라이신 디카르복실라제 생산 균주의 제작

대장균의 라이신 디카르복실라제들 중, CadA는 전반적으로 높은 효소 활성을 갖으나 알칼리 환경에서 그 활성이 크게 떨어지는 반면, LdcC는 효소 활성은 낮으나 알칼리 환경에서 상대적으로 높은 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

이에 착안하여, 본 발명자들은 카다베린 생산에 활용하기 위하여, 대장균의 라이신 디카르복실라제의 높은 활성을 가지면서, 동시에 고알칼리 환경에서 높은 안정성을 가질 수 있는 신규한 라이신 디카르복실라제를 획득하고자, 상기 2 종 효소의 아미노산 서열 및 구조를 분석하고 이들을 재조합(융합)하여 미생물에 도입시킴으로써, 고알칼리 환경에서 탁월한 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 재조합 단백질(효소)을 발현하도록 형질전환된 미생물을 제작하였다.

간략하게는, 당업계에 공지된 LdcC 또는 CadA의 프로모터 대신, 세포 내 조절에 영향받지 않고 상시 강하게 발현되는 HCE 프로모터를 이용하였고, LdcC 및 CadA 효소 자체의 특성을 고려하여, 효소 CDS 내 서열이 재조합되도록, 715 a.a로 구성된 CadA CDS 서열 중 각각 다른 위치의 120 a.a 길이의 아미노산 부위를, 120 a.a 길이의 LdcC 펩타이드 단편으로 치환시켰고(표 1), 발현 호스트로는 대장균 BL21(DE3) 균주를 활용하였다.

보다 구체적으로, 다음과 같다:

대장균 유래 라이신 디카르복실라제 유전자인 CadA 및 LdcC의 대장균으로의 도입 및 대장균에서의 발현을 위한 재조합 유전자의 클로닝을 진행하였다. 대장균 유래 야생형 라이신 디카르복실라제 CadA(Genbank numb. BAE78134.1) 및 LdcC(Genbank numb. BAA77861.2)에 대한 유전정보는 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/) 데이터 정보로부터 확보하였다.

또한, ColE1 replication origin, Kanamycin 저항성 유전자, HCE 프로모터를 포함하는 plasmid vector(도 1b)와 PCR을 통해 증폭시킨 E. coli-유래 LdcC, CadA 또는 각 유전자의 일부를 통상적으로 활용되는 Gibson assembly 방법을 활용하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.

그 결과, 대장균 유래 라이신 디카르복실라제 유전자 2 종(CadA 및 LdcC)을 재조합하여, 라이신 디카르복실라제 재조합 효소 3 종 CadA* 1 내지 3을 각각 발현하도록 형질전환시킨 대장균 균주 3 종(Escherichia coli CadA* 1, Escherichia coli CadA* 2 및 Escherichia coli CadA* 3)을 획득하였고, 상기 본 발명의 고알칼리 조건하에서 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물 균주들로부터 각각 생산된, 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질, 즉, 라이신 디카르복실라제 재조합 효소 3 종 각각을 CadA* 1 내지 3으로 명명하고, 이들의 아미노산 서열은 서열번호 3 내지 5(표 1)에 나타내었다.

아미노산 서열

MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQADGRYTVKVLKEESKK (서열번호 1; 야생형 CadA)

MNIIAIMGPHGVFYKDEPIKELESALVAQGFQIIWPQNSVDLLKFIEHNPRICGVIFDWDEYSLDLCSDINQLNEYLPLYAFINTHSTMDVSVQDMRMALWFFEYALGQAEDIAIRMRQYTDEYLDNITPPFTKALFTYVKERKYTFCTPGHMGGTAYQKSPVGCLFYDFFGGNTLKADVSISVTELGSLLDHTGPHLEAEEYIARTFGAEQSYIVTNGTSTSNKIVGMYAAPSGSTLLIDRNCHKSLAHLLMMNDVVPVWLKPTRNALGILGGIPRREFTRDSIEEKVAATTQAQWPVHAVITNSTYDGLLYNTDWIKQTLDVPSIHFDSAWVPYTHFHPIYQGKSGMSGERVAGKVIFETQSTHKMLAALSQASLIHIKGEYDEEAFNEAFMMHTTTSPSYPIVASVETAAAMLRGNPGKRLINRSVERALHFRKEVQRLREESDGWFFDIWQPPQVDEAECWPVAPGEQWHGFNDADADHMFLDPVKVTILTPGMDEQGNMSEEGIPAALVAKFLDERGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKAMGLLRGLTEFKRSYDLNLRIKNMLPDLYAEDPDFYRNMRIQDLAQGIHKLIRKHDLPGLMLRAFDTLPEMIMTPHQAWQRQIKGEVETIALEQLVGRVSANMILPYPPGVPLLMPGEMLTKESRTVLDFLLMLCSVGQHYPGFETDIHGAKQDEDGVYRVRVLKMAG (서열번호 2; 야생형 LdcC)

MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQT TDEYLDNITPPFTKALFTYVKERKYTFCTPGHMGGTAYQKSPVGCLFYDFFGGNTLKADVSISVTELGSLLDHTGPHLEAEEYIARTFGAEQSYIVTNGTSTSNKIVGMYAAPSGSTLLI DRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQADGRYTVKVLKEESKK* (서열번호 3; CadA* 1)

MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILI DRNCHKSLAHLLMMNDVVPVWLKPTRNALGILGGIPRREFTRDSIEEKVAATTQAQWPVHAVITNSTYDGLLYNTDWIKQTLDVPSIHFDSAWVPYTHFHPIYQGKSGMSGERVAGKVIF ETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQADGRYTVKVLKEESKK* (서열번호 4; CadA* 2)

MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIY ETQSTHKMLAALSQASLIHIKGEYDEEAFNEAFMMHTTTSPSYPIVASVETAAAMLRGNPGKRLINRSVERALHFRKEVQRLREESDGWFFDIWQPPQVDEAECWPVAPGEQWHGFNDAD NEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQADGRYTVKVLKEESKK* (서열번호 5; CadA* 3)

LdcC 펩타이드 단편이 삽입된 부위는 밑줄 친 굵은 글씨체로 표시된다.

실시예 2. 라이신 디카르복실라제의 선별

본 발명자들은, 상기 실시예 1에서 상술한 바와 같이 획득한, 라이신 디카르복실라제 CadA* 1 내지 3 중 탁월한 활성을 나타내는 라이신 디카르복실라제를 선별하기 위하여, 저농도(< 0.1 mg/ml of protein mixtures in cell lysate)의 CadA* 1 내지 3의 pH 조건(pH 5, 6, 7 및 8.4)에 따른 카다베린 전환 효율을 비교하여 활성을 확인하였다.

상세한 배양 및 발현 조건은 다음과 같다:

각 효소를 발현하는 균주들(Escherichia coli CadA* 1, Escherichia coli CadA* 2 및 Escherichia coli CadA* 3)을 고체 LB 아가 플레이트에 배양하여 개별 군집을 확보하였다. 이후, 개별 군집을 시험관 환경에서 37℃, 200 rpm으로 배양한 뒤 충분한 세포량이 획득되면, 250 mL 둥근 플라스크에 담긴 50 mL의 LB 배지에 초기 세포량을 OD600 기준 0.04로 맞춰 같은 조건에서 15시간 배양을 진행하여 발현을 진행하였다. 배양된 세포는 이후 다음과 같은 과정을 통해 카다베린 전환 활성을 비교하였다. 원심 분리를 통해 OD600 기준 4, 1 ml가 되게 배양 세포를 분리하였다. 이후, 초음파파쇄기(Ultrasonicator)를 포함한 다양한 방법을 통해 세포 파쇄액(Cell lysate)을 얻었다. 효소 활성 측정은 세포 파쇄액 20% (v/v), 200 g/L of lysine-HCl, 2 mM pyridoxal-5-phosphate의 조건에서 실시하였으며, 다양한 실험 조건에 따라 HCl을 첨가하여 pH를 조절하였다. 온도는 50℃, 반응 시간은 10분으로 진행하며, 반응 이후 효소 비활성화를 위해 98℃, 20분 이상 처리하였다. 얻어진 효소 전환액은 liquid-chromatography와 같은 분석 장비를 이용하여 카다베린 농도 및 효소 활성을 측정하여 비교하였다.

이때, 비교 대조군으로 야생형 라이신 디카르복실라제 효소인 CadA(서열번호 1) 및 LdcC(서열번호 2)를 이용하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, LdcC의 경우 높은 pH 조건에서 상대적으로 높은 효소 활성을 갖는 것을 확인할 수 있으며, CadA의 경우 대체로 높은 활성을 가지나 최적 활성 대비 pH 8.4 조건에서 20.7%의 활성 효율을 갖는 것을 확인하여 알칼리 조건에서 활성도가 크게 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.

반면, 본 발명의 신규한 라이신 디카르복실라제인 CadA* 1 및 CadA* 3은 각기 다른 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었는데, CadA* 1 효소의 경우 CadA와 유사한 수준의 최대 활성을 가지며, 특히, pH 8.4 조건에서 최적 활성 대비(pH 5.0 조건 기준) 37.1%의 활성으로 상대적으로 높은 알칼리 내성을 갖는 것을 확인할 수 있다. 또한, 해당 조건에서의 전환 효율은 CadA 효소 대비 85% 향상된 것을 확인할 수 있었다.

한편, CadA* 2의 경우 효소 활성을 보이지 않았으며, CadA* 3의 경우에는 상대적으로 낮은 효소 활성을 가지며 알칼리 환경에서의 효소 활성이 심하게 저해된 것이 확인되었다.

이에 따라, 상기 CadA* 1는 알칼리 조건에서도 안정적이고 높은 효소 활성을 발휘함으로써 라이신을 전환시켜 카다베린이 생성되는 것을 확인하였고, 이에 따라, CadA* 1을 선별하여 이하 실시예에 적용하였다.

실시예 3. 본 발명의 선별된 라이신 디카르복실라제의 고농도 조건에서의 카다베린 전환

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 선별된 라이신 디카르복실라제로서, 알칼리 조건하에서 높은 활성이 확인된 CadA* 1 효소의 응용 잠재성을 추가적으로 확인하기 위해, 고농도(= 0.5 mg/ml of protein mixtures in cell lysate)의 CadA* 1의 pH 8.4 조건 하 카다베린 전환 효율을 기존 대장균 LdcC, CadA와 비교하여 활성을 확인하였다.

이를 위해, 실시예 2의 실험 조건은 다음과 같이 일부 변경되었다. 세포 배양 이후 세포를 분리 획득하는 과정에서 OD600 기준 20, 1 ml의 배양 세포를 획득하였다. 해당 조건은 효소 농도를 기존 대비 5배 가량 향상시킨 조건이며, 나머지 배양 및 전환 효율 측정 실험 조건은 실시예 2와 동일하게 진행한다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, LdcC는 3.8 g/L의 카다베린, CadA는 15.1 g/L의 카다베린을 전환한 반면, 본 발명의 CadA* 1 효소는 29.8 g/L의 현저한 카다베린 전환 수준을 나타냈고, 이는 CadA와 대비하여 97.4% 높은 전환 효율에 해당한다.

한편, 본 발명자들은 해당 효소들의 발현이 카다베린 전환에 미치는 영향을 확인하고자 세포 파쇄액의 SDS-PAGE를 실시하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, LdcC, CadA, CadA* 1 효소에서 유의한 발현 증가는 확인되지 않았으며, 이는 효소의 발현 차이에 의한 효소 활성 기여가 상대적으로 적음을 의미한다.

종합적으로, 본 실시예를 통해서, 본 발명의 신규 재조합 라이신 디카르복실라제인 CadA* 1는, 기존 대장균 라이신 디카르복실라제에 비해, 상대적 pH 안정성이 높고, 이에 따라 현저히 높은 카다베린 전환 효율을 나타내는 것으로 입증되었으며, 이는 라이신 전환 반응에서 유리한 점으로 작용할 수 있으므로, 본 발명의 신규 라이신 디카르복실라제 CadA* 1는, 라이신을 생전환하여 카다베린을 상업적으로 생산하는 공정에 효율적으로 이용되어 생산 단가를 낮추는 효과를 달성할 수 있을 것으로 기대된다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Novel Lysine Decarboxylase with High Catalytic Efficiency in Alkaline Condition and Method for Producing Cadaverine Using the same <130> POSTECH1-89P-1 <150> KR 10-2020-0101682 <151> 2020-08-13 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 715 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys 130 135 140 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Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715 <210> 2 <211> 713 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln 20 25 30 Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His 35 40 45 Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu 50 55 60 Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met 85 90 95 Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile 115 120 125 Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu 165 170 175 Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe 195 200 205 Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp 245 250 255 Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys 275 280 285 Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu 340 345 350 Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met 355 360 365 Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr 370 375 380 Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu 405 410 415 Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala 420 425 430 Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp 465 470 475 480 Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala 500 505 510 Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu 565 570 575 Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg 595 600 605 Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp 610 615 620 Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu 625 630 635 640 Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val 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Gly Thr Ala Tyr Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu 165 170 175 Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe 195 200 205 Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg 275 280 285 Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715 <210> 4 <211> 715 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CadA* 2 <400> 4 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 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Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys 275 280 285 Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu 340 345 350 Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715 <210> 5 <211> 715 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CadA* 3 <400> 5 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met 165 170 175 Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe 195 200 205 Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg 275 280 285 Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met 355 360 365 Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr 370 375 380 Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu 405 410 415 Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala 420 425 430 Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715

Claims (12)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 CadA 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 LdcC가 융합된, 라이신 디카르복실라아제.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 라이신 디카르복실라아제는, 상기 야생형들에 비하여 pH 7 이상의 알칼리 조건에서 pH에 대한 안정성이 향상된 것을 특징으로 하는,
   라이신 디카르복실라아제.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 라이신 디카르복실라아제는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 CadA의 121번째 내지 240번째 위치에 상응하는 아미노산 부위가, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 LdcC의 121번째 내지 240번째 위치에 상응하는 아미노산 부위로 치환된 것을 특징으로 하는,
   라이신 디카르복실라아제.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 라이신 디카르복실라아제는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는,
   라이신 디카르복실라아제.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는,
   라이신 디카르복실라제 유전자.
   
6. 제5항의 라이신 디카르복실라제 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 라이신 디카르복실라제 유전자는 HCE 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는,
   재조합 벡터.
   
8. 제6항에 있어서,
   상기 벡터는 도 1b에 개시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는,
   재조합 벡터.
   
9. 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된, 재조합 미생물.
   
10. 제9항의 재조합 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는, 카다베린 생산용 조성물.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 라이신을 추가로 포함하는 것인, 카다베린 생산용 조성물.
    
12. 제9항의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 카다베린의 생산방법.

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