JP5473927B2 - 新規代謝経路による再生可能な原料からの発酵によるアセトン生産 - Google Patents
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Description
本発明の対象は、エタノールとブタノールの形成を分ける通常の発酵方法とは異なるアセトンを製造するための酵素による新規生合成法、ならびに本明細書で使用される酵素と核酸である。
クロストリジウムにおけるABE−法
従来のABE発酵法、すなわち、アセトン、ブタノール及びエタノールの微生物による製造は、酵母を用いるエタノール発酵に続き長い間世界で2番目に大きなバイオテクノロジープロセスであった。商業的なABE発酵は、英国で1916年に始まり、特にハイム・ヴァイツマンが溶剤であるアセトン、ブタノール及びエタノールを産生するクロストリジウム・アセトブチリカムの性能を発見した。このプロセスは、50年代後半まで主要な世界で用いられたが、南アフリカでは1981年まで用いられていた。
アシル−CoAを加水分解できる酵素は、例えば、アシル−CoA−チオエステラーゼ又はアシル−CoA−チオキナーゼであることができる。アシル−CoAの加水分解との主な違いは、アシル−CoA−チオエステラーゼ又はアシル−CoA−合成酵素/アセチル−CoA−チオキナーゼにより、キナーゼの場合にATPもしくはGTPが形成されることである。それというのも、アセトアセチル−CoAの加水分解はATP(−31.8kJ)の加水分解と比べて−44kJの高いΔGo’値を有するからである。
この酵素は、アセトアセチル−CoAからアセトアセテートとコエンザイムAへの加水分解を触媒するが、CoA−分子は同時に、例えばカルボン酸のような受容体分子に転用されない。
インフルエンザ菌由来のタンパク質YbgCは、短鎖分子に特異的なアシル−CoA−チオエステラーゼ(EC 3.1.2.18)であり、これはブチリル−CoAとβ−ヒドロキシブチラート−CoAを基質として受容する。これらの基質のKm値は24mMもしくは20mMである(Zhuang et al. (2002)、アシル‐コエンザイムAチオエステルの加水分解を触媒する、インフルエンザ菌のtol-pal遺伝子クラスターのybgC遺伝子によりコードされたYbgCタンパク質、FEBS Lett. 516:161-3)。
本明細書で記載された発明は、組換え酵素技法により改善されたアセトンの生産を扱う:アセチル−CoAから出発し、アセトアセチル−CoAを介してアセトアセテートが生じ、これは引き続きアセトンとCO2に変換される。
A:アセチル−CoAを酵素反応させてアセトアセチル−CoAにし、
B:アセトアセチル−CoAを酵素反応させてアセトアセテートとCoAにし、
C:アセトアセテートを脱カルボキシル化してアセトンとCO2にする
を有する、アセチル−コエンザイムAから出発するアセトンを製造する方法を内容とし、前記方法は方法工程BでコエンザイムAが受容体分子に転用されないことを特徴する。
(ケトチオラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列 配列番号16と少なくとも90%まで、有利には少なくとも95%、有利には96%、97%、98%、99%又は100%まで同一であるアミノ酸配列を有する)
少なくとも1つのポリペプチドのタンパク質をコードする核酸b
(アセトアセテート−CoA−加水分解酵素、アシル−CoA−チオエステラーゼ、アシル−CoA−合成酵素又はアシル−CoA−チオキナーゼであるか、又はアセトアセテート−CoA−加水分解酵素活性を有し、かつアミノ酸配列 配列番号1と少なくとも90%まで、有利には少なくとも95%、有利には96%、97%、98%、99%又は100%まで同一であるアミノ酸配列を有するか、又は
アセトアセテート−CoA−加水分解酵素活性を有し、かつアミノ酸配列 配列番号3と少なくとも90%まで、有利には少なくとも95%、有利には96%、97%、98%、99%又は100%まで同一であるアミノ酸配列を有する、又は
アセトアセテート−CoA−加水分解酵素活性を有し、かつアミノ酸配列 配列番号5と少なくとも90%まで、有利には少なくとも95%、有利には96%、97%、98%、99%又は100%まで同一であるアミノ酸配列を有する)及び
少なくとも1つのポリペプチドのタンパク質をコードする核酸c
(アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列 配列番号18と少なくとも90%まで、有利には少なくとも95%、有利には96%、97%、98%、99%又は100%まで同一であるアミノ酸配列を有する)
を有することに特徴付けられ、その際、核酸a、b及びcは微生物中でポリペプチドの発現を保証するために使用される。
aa 配列17に記載されたDNA配列又はその相補鎖、
bb ストリンジェントな条件下に、aaに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、
cc 遺伝子コードの縮重なく、aaとbbで定義したDNA配列にハイブリダイズするDNA配列
から選択される核酸aを使用するのが有利である。
dd 配列19に記載されたDNA配列又はその相補鎖、
ee ストリンジェントな条件下に、ddに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、
ff 遺伝子コードの縮重なく、ddとeeに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列
から選択されるものを使用するのが有利である。
gg 配列2に記載されたDNA配列又はその相補鎖、
hh ストリンジェントな条件下に、ggに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、
ii 遺伝子コードの縮重なく、ggとhhに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列
から選択されるものを使用するのが有利であり、又は更に有利には次のもの:
jj 配列4に記載されたDNA配列又はその相補鎖、
kk ストリンジェントな条件下に、jjに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、
ll 遺伝子コードの縮重なく、jjとkkに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列
から選択されるものを使用するのが有利であり、又は特に有利には次のもの:
mm 配列6に記載されたDNA配列又はその相補鎖、
nn ストリンジェントな条件下に、mmに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、
oo 遺伝子コードの縮重なく、mmとnnに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列
から選択されるものを使用するのが有利である。
配列番号7による核酸配列を有するプラスミドpSKatt、
配列番号8による核酸配列を有するプラスミドpKSatt、
配列番号9による核酸配列を有するプラスミドpUC19att、
配列番号10による核酸配列を有するプラスミドpUC18att、
配列番号11による核酸配列を有するプラスミドpUC19ayt
を有する群から選択されるのが特に有利である。
アミノ酸配列 配列番号3と少なくとも90%まで、有利には少なくとも95%まで、更に有利には96%、97%、98%、99%又は100%まで同一であるアミノ酸配列を有する、又は
アミノ酸配列 配列番号5と少なくとも90%まで、有利には少なくとも95%まで、更に有利には96%、97%、98%、99%又は100%まで同一であるアミノ酸配列を有する。
例1:枯草菌由来のチオエステラーゼII(TEIIsrf)
この酵素を、枯草菌ATCC 21332内で非リボソーム型ペプチド−合成酵素と一緒に混合しサーファクチン(ペプチド−抗生物質)を形成した。Schwarzer等は、C末端にHis-Tagを有する目的タンパク質との融合を媒介するプラスミドpQE60内で相応の遺伝子をクローン化(pTEIIsrf)し、かつこのタンパク質(28kDa)を精製することができた(Schwarzer D., H. D. Mootz, U. Linne, M. A. Marahiel. 2002、II型チオエステラーゼによるミスプライムされた非リボソーム型ペプチド合成酵素の再生、PNAS 99: 14083-14088頁)。引き続く検査では、このタンパク質には基質としてのアセチル−CoAとプロピオニル−CoAで加水分解活性が検出された。
アミノ酸配列 配列番号3を有するアセトアセチル−CoA−合成酵素(AACS)と、シノルヒゾビウム・メリロティ由来の相応のcDNA−配列 配列番号4は、ATPを消費しながらアセトアセテートとコエンザイムAの反応を触媒してアセトアセチル−CoAとAMPにする。しかし本発明の範囲内では逆の反応に関心があった。
アミノ酸配列 配列番号5及び相応するcDNA−配列 配列番号6を有するインフルエンザ菌由来のYbgCタンパク質は、E. Coli由来の相応のタンパク質と類似性があった。これは細胞質タンパク質として、いわゆるTol-Pal−系に属する。これはグラム陰性細菌内で広く伝播し、細胞壁の完全性を保持するために重要であり、かつ場合によっては物質を周辺細胞質を介して輸送する際の機能を有する。それに対して、インフルエンザ菌内でのYbgCの機能ならびにTol-Pal−系の機能との可能性として有り得る関係は、これまでに発表されていない。しかしZhuang等の刊行物(2002)には、このタンパク質の触媒機能の試験及びチオエステラーゼ活性の分析が記載されている。この場合に、例えばプロピオニル−CoAとブチリル−CoA(Km値11〜24mM)のような単鎖脂肪族アシル−CoA−エステルのYbgCによる加水分解が示されている(Zhuang Z., F. Song, B. M. Martin, D. Dunaway-Mariano. 2002.インフルエンザ菌のtol-pol-遺伝子クラスターのybgC遺伝子にコードされたYbgCタンパク質は、アシル−コエンザイムAチオエステルの加水分解を触媒する、FEBS Lett. 516:161-163)。この目的の範囲内でアセチル−CoAとアセトアセチル−CoAの活性をin-vitro検出するには、新たなタンパク質の精製が前提となる。ゲノムDNAから出発して、他の発現系、すなわちNEB社(フランクフルト・アン・メイン)のIMPACTTM(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding-Tag)系で遺伝子をクローン化した。その利点は、前記方法がその本来の形で、すなわちタグ無しで組換えタンパク質の簡単な精製を可能にすることにある。
E.Coli内でアセトンを生産するために、C.アセトブチリカム由来の遺伝子thlA(配列番号16のアミノ酸配列及び相応のcDNA−配列 配列番号17を有する遺伝子産物、チオラーゼA)及びadc(配列番号18のアミノ酸配列及び相応のcDNA−配列 配列番号19を有する遺伝子産物、アセトアセテート−デカルボキシラーゼ)と一緒に、適切なアシル−CoA−チオエステラーゼ又はアシル−CoA−合成酵素/アシル−CoA−チオキナーゼ遺伝子のクローン化を行った。このために、まずプラスミドpSKとpKSを選択した。これは実質的にマルチクローニングサイト(MCS)の方向とは異なるクローン化ベクターである。MCSは、それぞれ存在するlacZ’−遺伝子配列の内部にあり、これはβ−ガラクトシダーゼのN−末端断片をコードし、かつ組換えプラスミドのブルー・ホワイト−スクリーニングを可能にする。プロジェクトの範囲内での検査では、誘発可能なlac−プロモーターの制御下にクローン化遺伝子を発現することが重要である。このために、ベクターpsKを用意した。更に、プラスミドpKS内に挿入することにより、変異体が産生される。その際、該遺伝子は、C.アセトブチリカム由来の構築的なチオラーゼ−プロモータの制御下に実験するのがよい。
プラスミドpKS内での遺伝子adc、teII、thIAのクローン化:
遺伝子adc(クロストリジウム・アセトブチリカム由来のアセトアセテート−デカルボキシラーゼ)、teIIsrf(枯草菌由来のチオエステラーゼII)及び
thIA(C.アセトブチリカム由来のチオラーゼ)を1つのベクターと一緒にクローン化し、かつ引き続きE.Coli中で発現させることが目的であった。
C.アセトブチリカムからの染色体DNAの単離は、原則的にバートラム(Bertram)により行った(Bertram, J. 1989、クロストリジウム・アセトブチリカムのDNAトランスファー及びトランスポゾン突然変異誘発系の開発、学位論文、ゲッティンゲン大学)。
1.サッカロース含有1×TAE3.8ml中にペレットを懸濁
2.リゾザイム−RNase溶液1mlを添加
3.インキュベーション:30分、37℃
4.0.5M EDTA(pH 8.0)500μlを添加、40μlTris-HCl(pH 8.0)、30μl SDS(10%[w/v])
5.インキュベーション:10分、37℃
6.タンパク質分解酵素K溶液200μlを添加
7.インキュベーション:2時間、37℃
8.5M過塩素酸ナトリウム1.4mlを添加
9.氷にクロロホルム−イソアミルアルコール(24:1[v/v])7.3mlを添加
10.遠心分離:10分、5000×g、4℃
11.上の水相を除去
12.工程9〜11の2回目の繰り返し
13.1体積イソプロパノールの添加により水相からDNAの沈殿
14.インキュベーション:5分、室温
15.遠心分離:20分、16000×g、4℃
16.室温でペレットを乾燥、最大2時間
17.TE−緩衝液2ml中でペレットの懸濁
18.タンパク質分解酵素K−溶液200μlを添加
19.インキュベーション:37℃で一晩
20.A. dest.で4mlまで体積を増やす
21.3M酢酸ナトリウム600μlを添加(pH 5.2)
22.クロロホルム−イソアミルアルコールで3回抽出(工程9〜11参照)
23.1体積イソプロパノールの添加によりDNA沈殿
24.インキュベーション:5分、室温
25.遠心分離:20分、16000×g、4℃
26.96%(v/v)エタノールでペレットを2回洗浄(純粋な氷冷)
27.室温でペレットを乾燥、最大2時間
28.TE200μl中、ペレットを懸濁。
3つの遺伝子をベクターpSK中でクローン化するために、まず既にpKS中に存在するadc−teIIsrf−断片を制限により、ApaIとSalIで切り取り(1625Bp)、かつゲル溶出し(ゲル抽出キット; peqlab Biotechnologie GmbH, 製造者の指示に従って獲得)、かつ同様に切断し、かつ脱燐したpSK−ベクター(SAP, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, 製造者の指示に従って)中でライゲーションした。このために、クイックライゲーションキット(New England Biolabs GmbH、フランクフルト・アム・マイン)を製造者の指示に従って使用した。引き続き、得られたクローンを調べるために、これをLB−アンピシリン−液体培地中で育て、かつプラスミド−DNAを単離した。単離したプラスミドを制限分析(ApaI/SalI)を用いて検査した。このように得られたプラスミドをpSKadcteでマークし、かつ以下のクローン化工程で更に使用した。
プラスミドpUC19actの構築
この基礎は配列番号14を有するプラスミドpUCadc_ctfA/B_thlAであり、これはアセトアセテート−デカルボキシラーゼ(adc)、CoA−トランスフェラーゼ(ctfA/B)及びチオラーゼ(thlA)のためのクロストリジウム遺伝子をベクターpUC18中でクローン化したものである。該遺伝子は、lacZ−遺伝子に対して反対方向でクローン化された。従って、遺伝子はlac−プロモーターの制御下に転写可能であり、adc_ctfA/B_thlA断片(3311Bp)を再び制限エンドヌクレアーゼSalIとEcoRIで切り取り、かつ同じ酵素で切断しておいたベクターpUC19内でライゲーションした(製造者の指示に従って、レピッドライゲーションキット;Fermentas GmbH, St. Leon-Rot)。ライゲーション反応物10μl毎に、100μlのCaCl2−コンピテントE. ColiXL1-B−細胞を形質転換に使用した。引き続き得られたクローンをLB−アンピシリン−液体培地中で育て、かつプラスミド−DNAを単離した。単離したプラスミドを制限分析(SalI/EcoRI)により検査した。配列番号12を有するプラスミドをpUC19atcでマークし、かつ以後、種々のE.Coli菌株における形質転換に使用し、これを後でアセトンの形成について検査した。この場合に、アセトンを形成するクロストリジウム遺伝子を含んでいる構築物を、残りの構築物との比較として使用した。
この基礎は配列番号14を有するプラスミドpUCadc_ctfA/B_thlAであり、これはアセトアセテート−デカルボキシラーゼ(adc)、CoA−トランスフェラーゼ(ctfA/B)及びチオラーゼ(thlA)のためのクロストリジウム遺伝子をベクターpUC18中でクローン化したものである。
この基礎はプラスミドpUC19actであり、これはアセトアセテート−デカルボキシラーゼ(adc)、CoA−トランスフェラーゼ(ctfA/B)及びチオラーゼ(thlA)のためのクロストリジウム遺伝子をベクターpUC19中でクローン化したものである。
このためにプラスミドpUC19attを形成した。
プラスミド 大きさ(Bp) インサート プロモーター
pSKatt 5771 teIIsrf(adc, thlA) lac
pKSatt 5925 teIIsrf(adc, thlA) thl
pUC19att 5409 teIIsrf(adc, thlA) lac
pUC18att 5589 teIIsrf(adc, thlA) thl
pUC19ayt 5101 ybgC(adc, thlA) lac
pUC19act 5964 ctfA/B(adc, thlA) lac
得られた全てのプラスミド変異体(表1参照)をE.Coli−クローン菌株HB101においてアセトン形成について検査した。分析は、相応の予備培養から移植し、かつ37℃、200rpmでインキュベートした後に、アンピシリン含有LB−培地(100μg/ml)中、5ml基準で行った。光学濃度(600nm)は光分析により観察し、かつ約0.5〜0.6の値の時に、1mM IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)の添加によりクローン化遺伝子の発現を誘発し、3〜4時間後にグルコース(20g/l)を添加した。チオラーゼ−プロモーターを制御した変異体では何も誘発を行わなかった。それというのも、構造的な発現が行われたからである。
プラスミド インサート プロモーター 最大アセトン濃度、菌株、培地
pSKatt teIIsrf(adc, thlA) lac 34mM(2.0 g/l,HB101,LBAmp)
pKSatt teIIsrf(adc, thlA) thl 36 mM(2.1 g/l,HB101,LBAmp)
pUC19att teIIsrf(adc, thlA) lac 30 mM(1.7 g/l,HB101,LBAmp)
pUC18att teIIsrf(adc, thlA) thl 35 mM(2.0 g/l,HB101,LBAmp)
pUC19ayt ybgCsrf(adc, thlA) lac 60 mM(3.5 g/l,HB101,LBAmp)
pUC19act ctfA/Bsrf(adc, thlA) lac 46 mM(2.7 g/l,HB101,LBAmp)
引き続く実験では、変異体pUC19aytとpUC19actをコントロールとして有する100ml-培地(LBAmp)でも得られた結果を再現して検査した(37℃、200rpm)。主要培地を相応の前培養1mlで接種し、かつ0.5のOD600nmの時に1mM IPTGで誘発した。これまでの検査とは異なり、グルコース(20g/l)の添加を1番目の添加の18時間後に繰り返した。付加的に、プローブを取り出す各時点と平行して、培養のグルコース含有量の測定を行い、グルコースの消費を算出できるようにした。グルコースの測定は、Bergmeyer(1970年)による光学−酵素試験により行った。その際、酵素ヘキソキナーゼとグルコース−6−ホスフェート−脱水素酵素により、ATPとNADP+を添加しながら、2工程でグルコースの6−ホスホ−グルコネートとNADPHへの反応が行われた(Bergmeyer, H. U. (編集長):Methods of Enzymatic Analysis、第二版、Verlag Chemie, Weinheim Deerfield Beach-Basel 1970)。この場合に、NADPHの形成量は存在するグルコース量に比例し、かつ340nmの波長で吸光度の変化により光学的に決定することができた。この結果は、図12Aと12Bに示されている。培養A(E. Coli HB101 pUC19ayt)中のグルコースは、2番目の添加の時点までに既に完全に消費されていることが分かる。
Claims (8)
- 次の方法工程:
A:アセチル−CoAを酵素反応させてアセトアセチル−CoAにする工程であって、該反応が、ケトチオラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列番号16と少なくとも90%まで同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドにより触媒される工程、
B:アセトアセチル−CoAを酵素反応させてアセトアセテートとCoAにする工程であって、該反応が、アセトアセテート−CoA−加水分解酵素、アシル−CoA−チオエステラーゼ、アシル−CoA−合成酵素又はアシル−CoA−チオキナーゼにより触媒される工程、
C:アセトアセテートを脱カルボキシル化してアセトンとCO2にする工程であって、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列番号18と少なくとも90%まで同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドにより触媒される工程、
を有するアセチル−コエンザイムAから出発するアセトンの製法であって、
方法工程BではコエンザイムAが受容体分子に転用されず、
方法工程Bでの酵素反応は、アセトアセテート−CoA−加水分解酵素活性を有し、かつアミノ酸配列番号5と少なくとも90%まで同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドにより触媒されるものである
ことを特徴とする、アセトンの製法。 - 方法工程Cでの反応は自発的に行われる、請求項1に記載の方法。
- 微生物により実施される、請求項1又は2に記載の方法。
- 微生物は、少なくとも次のもの:
a 方法工程A)における反応を触媒する少なくとも1つのポリペプチドのタンパク質をコードする核酸、及び
b アセトアセテート−CoA−加水分解酵素活性を有し、かつアミノ酸配列番号5と少なくとも90%まで同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドのタンパク質をコードする核酸、及び
c 方法工程C)における反応を触媒する少なくとも1つのポリペプチドのタンパク質をコードする核酸
を含み、その際、核酸a、b及びcは微生物中でのポリペプチドの発現を保証するために使用される、請求項3に記載の方法。 - 核酸aは、次のもの:
aa 配列番号17に記載されたDNA配列又はその相補鎖、
bb ストリンジェントな条件下に、aaに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、
から選択される、請求項4に記載の方法。 - 核酸cは、次のもの:
dd 配列番号19に記載されたDNA配列又はその相補鎖、
ee ストリンジェントな条件下に、ddに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、
から選択される、請求項4又は5に記載の方法。 - 核酸bは、次のもの:
mm 配列番号6に記載されたDNA配列又はその相補鎖、
nn ストリンジェントな条件下に、mmに記載されたDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、
から選択される、請求項4から6までのいずれか1項に記載の方法。 - 核酸a、b及びcは、1つのヌクレオチド鎖上にあり、かつこれは次のもの:
配列番号7による核酸配列を有するプラスミドpSKatt、
配列番号8による核酸配列を有するプラスミドpKSatt、
配列番号9による核酸配列を有するプラスミドpUC19att、
配列番号10による核酸配列を有するプラスミドpUC18att、
配列番号11による核酸配列を有するプラスミドpUC19ayt
を含む群から選択される、請求項4から7までのいずれか1項に記載の方法。
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