CN101423850A

CN101423850A - 以新的代谢途径方式由可再生的原材料通过发酵获得丙酮

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Publication number: CN101423850A
Application number: CNA2008101739195A
Authority: CN
Inventors: S·弗塞克; S·沙弗; W·弗赖塔格; F·G·施米特; M·奥尔谢尔; G·格伦德; W·施米特; H·J·巴尔; R·-J·费希尔; A·梅
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2007-11-02
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2028-10-31
Also published as: EP2181195B1; US20100261237A1; EP2181195A2; JP5473927B2; CN101423850B; JP2011502493A; DE102007052463A1; WO2009056423A2; ES2470618T3; US8986961B2; WO2009056423A3

Abstract

本发明涉及以新的代谢途径方式由可再生的原材料通过发酵获得丙酮。本发明涉及由乙酰辅酶A起始制备丙酮的方法，该方法包括：步骤A，由乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A；步骤B，由乙酰乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酸和辅酶A；以及，步骤C，由乙酰乙酸脱羧产生丙酮和CO₂，其特征在于，在步骤B中，辅酶A不转移到受体分子中。此外，出人意料地，步骤B由酰基辅酶A硫酯酶、酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶类催化。本发明涉及一种全新的代谢途径，这是因为迄今为止没有报道过任何微生物酶在不同时发生辅酶A向受体分子转移的情况下酶水解乙酰乙酰辅酶A。

Description

以新的代谢途径方式由可再生的原材料通过发酵获得丙酮

技术领域

本发明涉及用于生产丙酮的、新的酶学生物合成途径，其不同于传统的发酵方法之处在于不与乙醇和丁醇的形成相偶联，还涉及用于该目的的酶和核酸。

背景技术

梭菌(Clostridium)中的ABE法

传统的ABE发酵方法，即利用微生物生产丙酮、丁醇和乙醇，在世界范围内早已成为第二大生物技术方法，仅次于利用酵母发酵生产乙醇的方法。商业化的ABE发酵于1916年始于英国，尤其是ChaimWeizmann发现了丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)具有形成溶剂丙酮、丁醇和乙醇的能力。这一方法在西方世界应用至十九世纪五十年代末，在南美甚至一直应用到1981年。

放弃这一方法的两个基本原因在于：首先，丙酮和丁醇的化学合成日益流行，其次发酵底物的价格日益攀升。由于糖蜜被用作牲畜的饲料添加剂，使其价格大幅提高。

石油化学产品前体成本的增长，以及微生物途径工程领域的新技术的可能性，提供了研发高性能菌株和用于生产丙酮等溶剂的工业发酵方法的新选择。

传统的ABE发酵基于丙酮丁醇棱菌和拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌均为革兰氏阳性，在严格的厌氧条件下生长。这些微生物能够转化单糖，二糖和多糖，用于发酵的主要的底物是糖蜜和淀粉。

上述利用丙酮丁醇梭菌的发酵方法分为两个阶段。第一阶段中，生物量的形成与乙酸、丁酸以及痕量的乙醇的形成并行(“酸化形成阶段(acidogene phase)”)。在第二阶段中，即所谓的“溶剂形成阶段(solventogene phase)”，所述的酸用于形成发酵产物丙酮、丁醇和乙醇(ABE)。野生型的丙酮丁醇梭菌中，产物丙酮、丁醇和乙醇以大约3:6:1的比例形成。这一产物比率根据所选择的培养条件(例如pH或营养素的供给)或所应用的底物可产生很大的变化。

已基本上纯化了溶剂丙酮、丁醇和乙醇的生物合成中的酶，并且对其进行了生化表征(参见图1；Duerre，P.，and Bahl，H.1996.Microbialproduction of acetone/butanol/isopropanol.In：Biotechnology，vol.6，2nded.M.Roehr，(ed.)，VCHVerlagsgesellschaft mbH，Weinheim，Germany.p.229-268.Duerre，P.1998.New insights and novel developments inclostridi alacetone/butanol/isopropanol fermentation.Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648.)。丙酮丁醇梭菌的基因组序列也是可以获得的(Noelling，J.，Breton，G.，Omelchenko，M.V.& 16 other authors(2001).Genome sequence and comparative analysis of the solventproducingbacterium Clostridium acetobutylicum.J Bacteriol 183，4823-4838.)。

近年来，研究出了大量的可以实现靶定的途径工程的遗传工具。目前，可以获得三个不同的、稳定获得的复制子(pIM13，pCBU2和pAM1；Lee et al.(1992).Vector construction，transformation，and geneamplification in Clostridium acetobutylicum ATCC 824.Ann.N.Y.Acad.Sci.665：39-51；Minton et al.(1993).Clostridial cloning vectors.In：Theclostridia and biotechnology(D.R.Woods；editor).Butterworth-Heinemann.Stoneham，USA.pages119-150)以及抗红霉素和抗甲砜氯霉素的两个抗生素抗性标记(Green and Bennett(1998).Genetic manipulation of acid and solvent formation in Clostridiumacetobutylicum ATCC 824.Biotechnol.Bioeng.58：215-21.)。

另一方面，诸如插入失活或者基因缺失之类的方法还不能常规地进行，即使是基于反义技术的基因表达抑制在此类生物中也存在效力方面的差异，且尚未完全实现(Desai and Papoutsakis(1999).AntisenseRNA strategies for metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum.Appl.Environ.Microbiol.65：936-45；Tummala et al.(2003).AntisenseRNA downregulation of coenzyme A transferase combined withalcohol-aldehy dedehydroge naseoverexpression leads to predominantlyalcohologenic Clostridium acetobutylicum fermentations.J.Bacteriol.185：3644-53.)。许多公开出版物描述了所谓“溶剂形成的”和“酸形成的”生物合成途径代谢工程。基因buk(丁酸激酶)或pta(磷酸转乙酰酶)的失活导致丁酸和乙酸浓度大幅下降(Green et al.(1996).Geneticmanipulation of acid formation pathways by gene inactivation inClostridium acetobutylicum ATCC 824.Microbiology.142：2079-86.；Harris et al.(2000).Characterization of recombinant strains of theClostridium acetobutylicum butyrate kinase inactivation mutant：need fornew phenomenological models for solventogenesis and butanol inhibition？Biotechnol.Bioeng.67：1-11.)。不过，这些突变株形成丁酸和乙酸，这是因为乙酸激酶和磷酸转丁酰酶替代了失活的丁酸激酶和磷酸转乙酰酶。可能是作为对丙酮酸积累的应答，两菌株均形成高浓度的乳酸，而在野生型丙酮丁醇梭菌中没有乳酸积累。乙醛/乙醇脱氢酶adhE/aad的失活导致丁醇形成被严重破坏，但与此同时丁酸浓度增加。当adhE/aad基因在这一突变体中的质粒上表达时，可以重建野生型中的正常丁酸和丁醇浓度。有趣的是，在AdhE/aad突变株或带有adhE/aad互补的菌株中均不能检测到丙酮的形成。这一现象基于极性作用(polaren effekten)，其对位于adhE/aad下游的两个基因起作用。这两个基因编码对于丙酮合成所必需的、辅酶A转移酶的两个亚基(Green，E.M，and Bennett，G.N.1996.Inactivation of an aldehyde/alcoholdehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824.Appl.Biochem.Biotechnol.57/58：213-221)。这是第一个被描述的、通过丙酮丁醇梭菌中的途径工程可使丙酮与丁酸形成彼此解偶联的实例。

这一现象得到其他出版物的证实。在这些工作中所研究的微生物菌株由于缺乏192kb的大质粒(Megaplasmid)pSOL1丧失了形成丙酮和丁醇的能力。用于丙酮丁醇形成的基因大多位于该质粒上，这些基因中的一些也用于乙醇的合成(Cornillot，E.，Nair，R.，Papoutsakis，E.T.，and Soucaille，P.1997.The genes for butanol and acetone formationin Clostridium acetobutylicum ATCC 824reside on a large plasmid whoseloss leads to degeneration of the strain.J.Bacteriol.179：5442-5447)。这些退化菌株只能形成野生型菌株所形成的乙醇量的一半。这些衍生自丙酮丁醇梭菌ATCC824的菌株被称作M5(经化学诱变产生)和DG1(由野生型的多次培养(mehrfache Kultivierung)获得。这些菌株作为质粒受体，所述的质粒包含有辅酶A转移酶亚基A和B(ctfA和ctfB)的蛋白质编码序列，以及乙酰乙酸脱羧酶基因(adc)，或丁醛/丁醇脱氢酶基因(adhE/aad)。所得的菌株只产生丙酮或丁醇(Mermelstein et al.(1993).Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824for increased solvent production by enhancement of acetone formationenzyme activities using a synthetic operon.Biotech.Bioeng.42：1053-1060.；Nair，R.V.，and Papoutsakis，E.T.1994.Expression ofplasmid-encoded aad in Clostridium acetobutylicum M5 restores vigorousbutanol production.J.Bacteriol.176：5843-5846；Cornillot，E.，Nair，R.，Papoutsakis，E.T.，and Soucaille，P.1997.The genesfor and acetoneformation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824reside on a largeplasimd whose loss leads to degeneration of the strain.J.Bacteriol.179：5442-5447)。所测定的各溶剂的滴度总是低于野生型中的丙酮和丁醇浓度，并且乙酸和丁酸可积累至总浓度达240mM。通过带有adhE/aad基因的质粒可以使乙醇形成恢复至野生型水平。

图2描述了梭菌中丙酮合成的经典代谢途径。该途径由乙酰-辅酶A起始，是一种在所有微生物中形成的中心代谢(zentralenMetaboliten)，无关乎是哪种碳源代谢或建立了哪种代谢途径。所需的酶为：-酮硫解酶，乙酰-辅酶A/丁酰-辅酶A转移酶的两个亚基以及乙酰乙酸脱羧酶。

可以显示出在大肠杆菌中异源表达这些由乙酰-辅酶A(乙酰乙酸脱羧酶，乙酰-辅酶A/丁酰-辅酶A转移酶和硫解酶，起始催化丙酮形成的、来自丙酮丁醇梭菌的酶导致在所述微生物中形成约150mM的丙酮，尽管也以不利的方式形成了大量的乙酸盐(50mM)(Bermejo L.L.，N.E.Welker，E.T.Papoutsakis.1998.Expression of Clostridiumacetobutylicum ATCC 824 Genes in Escherichia coli for acetoneProduction and Acetate Detoxification.Appl.Env.Microbiol.64：1079-1085)。上述情况的另外一个不利的方面在于丙酮只能在需氧条件下产生，这是因为在大肠杆菌中，由葡萄糖到乙酰-辅酶A的代谢中所产生的氧化还原等价物(Redoxequivalente)不能在厌氧条件下被再氧化。在该方法中，通过催化所述反应的酶使从乙酰乙酰基脱离的辅酶A再次转移到受体分子。

酰基辅酶A-切割酶

水解酰基辅酶A的酶可以是，例如酰基辅酶A硫酯酶或酰基辅酶A硫激酶。通过酰基辅酶A硫酯酶或酰基辅酶A合成酶/酰基辅酶A硫激酶水解酰基辅酶A的主要区别在于利用激酶的情况下产生ATP或GTP，这是因为与ATP的水解的G₀’值(-31.8kJ)相比，乙酰乙酰辅酶A水解具有更高的G₀’值(-44kJ)。

乙酰乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.11)

该酶催化乙酰乙酰辅酶A水解为乙酰乙酸和辅酶A，且不同时将辅酶A分子转移到如羧酸之类的受体分子。

酰基辅酶A硫酯酶(EC 3.1.2.18)

来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白YbgC是一种特异于短链分子并接受丁酰-辅酶A和-羟基丁酸-辅酶A作为底物的酰基辅酶A硫酯酶(EC 3.1.2.18)。相应于上述底物的Km值分别为24mM和20mM(Zhuang et al.(2002).The YbgC protein encoded bythe ybgC gene of the tol-pal gene cluster of Haemophilus influenzaecatalyzes acyl-coenzyme A thioester hydrolysis.FEBS Lett.516：161-3.)。

也描述了枯草芽孢杆菌中的、具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列以及SEQ ID No.2所示的相应cDNA序列的硫酯酶II(TEII_srf)，其与用于合成抗生表面活性肽(Antibiotikums Surfactin)的非核糖体肽合成酶相关(Schwarzer D.，H.D.Mootz，U.Linne，M.A.Marahiel.2002.Regeneration of misprimed nonribosomal peptide synthetases by type IIthioesterases.PNAS 99：14083-14088)。

酰基辅酶A合成酶/酰基辅酶A硫激酶(伴随AMP合成；EC 6.2.1.2，伴随GDP合成；EC 6.2.1.10))

这两种酶的生理功能是涉及酰基辅酶A合成，但已知也有这些酶催化形成ATP的、反向水解反应的实例，例如，三羧酸循环中的琥珀酰-辅酶A硫激酶。目前还没有实例表明，上述的酶类可以在体外或体内水解乙酰乙酰辅酶A形成乙酰乙酸但不形成辅酶A。

针对来自苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的AcsA2已描述了由酰基辅酶A合成酶降解多羟基烷烃类伴随AMP形成(Aneja et al.(2002).Identification of an acetoacetyl coenzyme A synthetase-dependentpathway for utilization of L-(+)-3-hydroxybutyrate in Sinorhizobiummeliloti.J.Bacteriol.184：1571-7.)。

利用来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的进一步纯化的酶可以检测特异于短链分子的酰基辅酶A合成酶/酰基辅酶A硫激酶(伴随AMP形成；EC 6.2.1.2)。该酶接受丁酰-辅酶A和-羟基丁酰-辅酶A和2-酮基丁酸作为底物，其分别具有很低的Km值10，25和25μM(Shimizu et al.(1981).Butyryl-CoA synthetase of Pseudomonasaeruginosa-purification and characterization.Biochem.Biophys.Res.Commun.103：1231-7.)。

由此本发明的目的在于提供一种新的、简化的、由乙酰-辅酶A起始合成丙酮的途径。

发明内容

本发明涉及重组酶技术的辅助下的、改良的丙酮生产：由乙酰-辅酶A起始，由乙酰乙酰辅酶A产生乙酰乙酸，接下来再转化成丙酮和CO₂。

由此，本发明涉及权利要求1所述的生产丙酮的方法；涉及权利要求18所述的酶的用途，所述的酶使得本发明的方法中的步骤B得以实施；还涉及权利要求17所述的核酸序列，以及如权利要求19所述的核酸序列的用途，所述的核酸序列的翻译产物能够催化本发明的方法。

本发明的方法的有益之处在于，所述的丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶被一种能以单体形式发挥作用的酶替代，所述的丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶由两个亚基组成、在常规的系统中将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸。

由此，本发明进一步的有益之处在于，在给定的系统中的丙酮产量高于利用已知的丁酸-乙酰乙酸辅酶A转移酶所产生的丙酮的量。再一有益之处在于，在所述生产方法中乙酸盐与丙酮的比率向有利于丙酮的方向偏移。

本发明的方法的又一有益之处在于，事实上，丙酮合成不与丁醇和乙醇合成相偶联，由此在施用时所产生的醇类副产物不对生产微生物产生毒害。这可使培养基中的产物浓度更高，由此提高时空产量。

以与丁醇和乙醇不相偶联地生产丙酮的另一有益之处在于成为一种简化的发酵工艺，简化了产品的分离与加工，这是因为该工艺不再需要将丙酮与醇类副产物相分离。与传统的ABE发酵中的产品分离相比，本发明的工艺的能量消耗较小。本发明的方法的又一有益之处在于其可在多种已详细表征了的微生物中进行，在好氧以及厌氧条件下均能良好地培养所述的微生物，并已知对其施以多种遗传操作以提供进一步改良的可能性。总之，由发酵可再生的原材料有效地制备丙酮进一步对环境友好、资源节约型工业化学品生产作出贡献。

具体实施方式

本发明的制备丙酮的方法以及所述的多肽和核酸在实施本发明的方法中的用途通过下述示例方式进行描述，本发明并不限于下述示例性的实施方案。本发明的说明书中所引用的文献意在将其所公开的全部内容纳入本发明。多肽指具有任意链长的。因此，其还包括任何蛋白质、酶，特别是乙酰乙酸辅酶A水解酶，酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶。“自发转化”指一种产生能量的化学反应。“在严格条件下”杂交指试验条件，例如在Northern印迹技术中在50-70℃，优选60-65℃下的洗涤溶液的应用，譬如应用含0.1％SDS的0.1x SSC缓冲液(2Ox SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)洗脱非特异性杂交的cDNA探针和寡核苷酸。在该条件下，只有那些高度互补的核酸能够保持彼此间的结合。设定严格条件是本领域技术人员已知的，并描述于例如Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。

本发明包括由乙酰-辅酶A制备丙酮的方法，该方法包括下述步骤：A由乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A；B：由乙酰乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酸和辅酶A；和C.由乙酰乙酸脱羧产生丙酮和CO₂，其特征在于在步骤B中，辅酶A不转移到受体分子中。

可以在本发明的步骤A中应用β-酮硫解酶来将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A。优选使用来自梭菌属菌种，即梭菌属的微生物的β-酮硫解酶，特别优选来自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌的。步骤A中的酶促转化优选由具有酮硫解酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列与SEQ ID No.16的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一。

在本发明的方法的步骤C中，可以应用乙酰乙酸脱羧酶将乙酰乙酰辅酶A酶促转化为丙酮和CO₂。优选使用来自梭菌属菌种，即梭菌属的微生物的乙酰乙酸脱羧酶，特别优选来自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌的。步骤C中的酶促转化优选由具有乙酰乙酸脱羧酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列与SEQ ID No.18的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一。在本发明的方法的进一步优选的实施方案中，步骤C的转化是自发进行的。

本发明的丙酮生产方法的区别特征在于，在步骤B中辅酶A不转移到受体分子之中。这可通过应用具有乙酰乙酰辅酶A水解酶活性的酶来实现。令人惊讶的是也可以通过迄今为止未知具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性的酶来实现这一目的，例如，选自酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶的酶。因此，在本发明的方法的优选实施方案中，步骤B中的酶促转化可由乙酰乙酸辅酶A水解酶，酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶催化进行。

在本发明的方法优选实施方案中，步骤B中的酶促转化可以应用具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列与SEQ ID No.1的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一。在本发明的方法优选实施方案中，步骤B中的酶促转化可以应用具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列与SEQ IDNo.3的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一。在本发明的方法优选实施方案中，步骤B中的酶促转化可以应用具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列与SEQ ID No.5的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一。

本发明的方法优选地通过微生物实施。其它用于该方法的微生物可以是本身即具有合成丙酮的能力的微生物，也可以是通过遗传途径工程赋予其丙酮形成能力的微生物。这可以通过提高细胞浓度或酶的活性来实现，所述的酶催化由乙酰-辅酶A起始的、不依赖于乙酸盐的丙酮合成。

本发明的方法优选地在经遗传修饰的微生物中实施。可能的例子来自下述的属，即选自：梭菌属(Clostridium)，发酵单胞菌属(Zymomonas)，埃希氏菌属(Escherichia)，沙门氏菌属(Salmonella)，红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，肠球菌属(Enterococcus)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，节杆菌属(Arthrobacter)，棒杆菌属(Corynebacterium)，短杆菌属(Brevibacterium)，毕赤氏酵母属(Pichia)，假丝酵母属(Candida)，汉逊氏酵母属(Hansenula)和糖酵母属(Saccharomyces)。上述属中的种的例子有：大肠杆菌(Escherichia coli)，真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)，红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)，鹑鸡肠球菌(Enterococcvs gallinarium)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

优选选自下述的生物，即：大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，梭菌属菌种(Clostridium spec.)，醋酸梭菌(Clostridium aceticum)，伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，酿酒酵母属的种(Saccharomyces spec.)，酿酒酵母和巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)，特别优选地，将“大肠杆菌pUC19ayt”，参见实施例5和6，用于本发明的方法。

本领域技术人员已知可以利用遗传重组技术制备重组的微生物。一般而言，可以通过常规的转化或转染技术将带有外源基因的载体插入到细胞中。适用的方法可参见Sambrook et al.(Molecular Cloning：ALaboratory Manual.2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。所使用的微生物可以是通过诱变和筛选，通过重组DNA技术和通过上述两种方法的组合产生的菌株。可以应用，利用如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或紫外光的经典体内诱变方法进行诱变。也可以利用体外诱变方法进行诱变，例如利用羫胺进行处理(Miller，J.H.：A Short Coursein Bacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbook for Escherichiacoli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，1992)或应用诱变寡核苷酸进行处理(T.A.Brown：Gentechnologie für Einsteiger，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1993)或应用Newton和Graham所著手册中描述的聚合酶链式反应(PCR)(PCR，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1994)进行处理。

有关产生突变的进一步的指导可参考现有技术以及已知的遗传及分子生物学教科书，例如Knippers著(“Molekulare Genetik”，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)，Winnacker著(“Geneund Klone”，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann著(“Allgemeine Genetik”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

应用体外方法时，可以由自野生型菌株中分离的总DNA通过聚合酶链式反应扩增现有技术中所描述的基因，并根据需要将其克隆到合适的质粒载体中，接下来将所述DNA应用于诱变方法中。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA序列的有关指导，本领域技术人员可以参考，特别是Gait所著的手册：寡核苷酸合成实用方法(OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach IRL Press，Oxford，UK，1984)以及Newton和Graham所著的：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)。类似地，也可以应用体外诱变方法，例如Sambrook等所著的公知手册中所描述的(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，USA，1989)。相应的方法也可通过所谓“试剂盒”的形式通过商业途径实施，例如“QuikChange Site-DirectedMutagenesis Kit”，参见Papworth等(Strategies 9(3)，3-4(1996))以及由Stratagene(La Jolla，USA)所提供的那些。

本发明也涉及包含用于本发明的多核苷酸的载体，特别是质粒，以及如果需要，在所述细菌中的适当复制。由此，本发明也涉及用上述载体转化的重组微生物。在此方面中涉及的多核苷酸受控于一个或多个启动子的作用。在此方面，术语“增强(

)”指提高微生物中的、由相应的DNA编码的一种或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度，例如通过增加基因、ORF，至少1个拷贝的，拷贝数，将强启动子功能性连接于所述基因，或者利用编码具有高活性的所述酶或蛋白质的基因、等位基因或ORF，如果需要，将上述方法组合。大肠杆菌中的强启动子的例子为lac，tac和trp。开放阅读框(ORF)指在现有技术中未被赋予功能的、编码或可以编码蛋白质、多肽或核糖核苷酸的核苷酸序列节段。在被赋予功能后，所述核苷酸序列的相关节段通常被称作基因。等位基因通常指所给定的基因的经改变的形式。由于核苷酸序列不同以使它们的形式相区别。

基因产物通常指由核苷酸序列，即ORF，基因或等位基因所编码的蛋白质，或所编码的核糖核酸。相应蛋白质的活性或浓度通常通过上述的增强方法提高，特别是过表达基于野生型蛋白质的活性或浓度、或未进行所述蛋白质或酶的重组的微生物或亲株中的蛋白质活性或浓度，至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，最高达1000％或2000％。非重组微生物或亲株指对其实施本发明的增强或过表达的微生物。基因或基因构建体可存在于具有不同拷贝数的质粒上，也可以整合并扩增于染色体上。作为实现相关基因过表达的另一种方式可以改变培养基的组成或培养方式。

本发明还涉及一种方法，其中，经遗传修饰的微生物表达编码上述蛋白编码酶的核酸，其可用于步骤A-C。

本发明的方法的特征在于，所述的微生物至少包含：

核酸a，其至少编码下述一个多肽，所述多肽

具有酮硫解酶活性且具有与SEQ ID No.16的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一的氨基酸序列，

核酸b，其至少编码下述一个多肽，所述多肽

是乙酰乙酸辅酶A水解酶，酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶，

或具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性且具有与SEQ ID No.1的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一的氨基酸序列，

或具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性且具有与SEQ ID No.3的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一的氨基酸序列，

或具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性且具有与SEQ ID No.5的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一的氨基酸序列，

以及核酸序列c，其至少编码下述的一个多肽，所述多肽

具有乙酰乙酸脱羧酶活性且具有与SEQ ID No.18的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96，97，98，99或100％同一的氨基酸序列，

所应用的核酸a，b和c保证所述多肽在所述微生物中的表达。

优选用于本方面的核酸a选自：

aa 序列17或其互补链所描述的DNA序列，

bb 与aa中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

cc 在无遗传密码简并的情况下，与aa和bb中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。

优选使用的核酸c选自：

dd 序列19或其互补链所描述的DNA序列，

ee 与dd中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

ff 在无遗传密码简并的情况下，与aa和bb中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。

优选使用的核酸b选自：

gg 序列2或其互补链所描述的DNA序列，

hh 与gg中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

ii 在无遗传密码简并的情况下，与gg和hh中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。

或更优选地选自：

jj 序列4或其互补链所描述的DNA序列，

kk 与jj中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

ll 在无遗传密码简并的情况下，与jj和kk中所定义的DNA序列杂交的DNA序列，

或特别优选地选自：

mm 序列6或其互补链所描述的DNA序列，

nn 与mm中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

oo 在无遗传密码简并的情况下，与mm和nn中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。

在本发明的方法的优选实施方案中，所述的核酸a，b和c位于可是全部三个基因的产物表达的核苷酸链上。

特别优选地，所述的核酸a，b和c位于一条核苷酸链上，且后者选自：

具有如SEQ ID No.7所示的核酸序列的质粒pSKatt，

具有如SEQ ID No.8所示的核酸序列的质粒pKSatt，

具有如SEQ ID No.9所示的核酸序列的质粒pUC19att，

具有如SEQ ID No.10所示的核酸序列的质粒pUC18att，

和

具有如SEQ ID No.11所示的核酸序列的质粒pUC19ayt。

本发明由此涉及具有如SEQ ID No.7所示的核酸序列的质粒pSKatt，具有如SEQ ID No.8所示的核酸序列的质粒pKSatt，具有如SEQ ID No.9所示的核酸序列的质粒pUC19att，具有如SEQ ID No.10所示的核酸序列的质粒pUC18att，和具有如SEQ ID No.11所示的核酸序列的质粒pUC19ayt。

本发明还涉及酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶在将乙酰乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酸和辅酶A中的用途。鉴于大多数酶的高底物特异性，这些酶均接受乙酰乙酸辅酶A作为底物，对本领域技术人员而言出乎意料且无法预知的。

具有酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶活性的多肽在将乙酰乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酸和辅酶A中的用途是优选的，所述的多肽为：

乙酰乙酰辅酶A水解酶，酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶，

或者

具有与SEQ ID No.1的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列，或

具有与SEQ ID No.3的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列，或

具有与SEQ ID No.5的氨基酸序列至少90％，优选至少95％，更优选96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列。

本发明还涉及选自gg到oo的至少一个核酸b在利用其基因产物将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸和辅酶A中的用途。

下述实施例，通过不将本发明限定到所述实施例的实施方案的示例性方式对本发明进行详细描述，本发明的应用范围由全部的说明书、权利要求书来体现。

图1：丙酮，丁醇和乙醇的生物合成

图2：丙酮的生物合成

图3：TEII_srf在大肠杆菌M15中的表达

图4：由大肠杆菌中纯化TEII_srf

图5：为确定TEII_srf对底物乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的Km值的ALineweaver-Burk图

图6：AACS在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

图7：由大肠杆菌中纯化AACS

图8：YbgC的表达和纯化

图9：连续向质粒pSK中克隆基因adc，teIIsrf和thlA的示意图。

图10：制备pUC19构建体

图11：在带有不同表达载体的大肠杆菌HB101的5ml培养物中形成丙酮和乙酸盐

图12：在带有pUC19ayt(YbgC)和pUC19act(对照CtfA/B)的大肠杆菌HB101的100ml培养物中形成丙酮和乙酸盐。

实施例

实施例1：来自枯草芽孢杆菌的硫酯酶II(TEII_srf)

该酶与用于在枯草芽孢杆菌ATCC 21332中形成表面活性肽(肽抗生素)的非核糖体肽合成酶相关。Schwarzer等能将相应的基因克隆到介导靶蛋白与C末端His标记物(pTEIIsrf)相融合的质粒pQE60中并纯化所述蛋白质(28kDa)(Schwarzer D.，H.D.Mootz，U.Linne，M.A.Marahiel.2002.Regeneration of misprimed nonribosomal peptidesythetases by type II thioesterases.PNAS 99：14083-14088)。在接下来的研究中证明了该蛋白以乙酰-辅酶A和丙酰-辅酶A为底物的水解活性。

带有SEQ ID NO.13的质粒pTEIIsrf的制备如Schwarzer D，Mootz HD，Linne U，Marahiel MA所述(Regeneration of misprimednonribosomal peptide sythetases by type II thioesterases.Proc Natl AcadSci U S A.2002 Oct 29；99(22)：14083-8)。

在LB_Amp培养基中于30℃、150转/分钟条件下培养的大肠杆菌M15中表达所述蛋白，在光密度(OD_600nm)0.6-0.8用1mM IPTG诱导。2小时后收集所述培养物。在培养过程中采集的样品证实了蛋白质的成功表达。图3显示的是Coomassie染色后的12％SDS聚丙烯酰胺凝胶，所述凝胶中的每一泳道中添加了15μl粗提物；1：诱导前，2：诱导后1小时，3：诱导后2小时。

利用确定游离SH基团的DTNB试验[5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)]确定待分析的活性要求将蛋白质进行纯化。这依赖于在Ni²⁺-NTA琼脂糖和递增的咪唑梯度上进行的金属螯合亲和层析的方式，通过TEII_srf的融合His标记物在FPLC的协助下完成。

为实现该目的，开始，收获所述细胞(5000xg，15min，4℃)，将其悬浮于3ml/g鲜重的细胞裂解缓冲液(50mM HEPES，300mMNaCI，pH7.8)中，需要时储存于-20℃。通过超声处理(SonicatorBandelin Sonopuls，Bandelin Berlin)裂解细胞，离心(30000xg，30min，4℃)收集粗提物。在FPLC系统(Pharmacia Biotech GmbH)中进行纯化。将3.5ml粗提物上样于根据制造商的说明制备并平衡(50mM HEPES，300mM NaCl，30mM咪唑，pH7)的Ni²⁺-NTA琼脂糖柱(QiagenSuperflow，床体积5ml)。随后用50ml的平衡缓冲液洗柱。用50ml(30-300mM咪唑于50mM HEPES，300ml的NaCl中，pH7)线性梯度咪唑洗脱。

图4上部示出依照下述程序在Ni²⁺-NTA琼脂糖(Qiagen Superflow，床体积5ml)上的FPLC洗脱图谱：洗0-50ml，用30-300mM咪唑(线性梯度)洗脱50-100ml，级分大小各1ml；图4下部示出Coomassie染色的12％SDS-PAGE凝胶，其上，洗脱级分23-31，每种情况下，每一泳道上样1μg蛋白。

将所述级分合并用于活性测定。所用的底物为乙酰乙酰辅酶A，以及用于比较的乙酰-辅酶A。在所述的DTNB试验中，辅酶A末端已通过向乙酰乙酸或乙酸盐的酶促转化游离出来的巯基与DTNB反应，形成可通过光度测定法在412nm检测到的显色产物。

测定了下述的kM值：乙酰-辅酶A为2×10^-4mol.l^-1(0.2mM)，乙酰乙酰辅酶A为7.7×10^-4mol.l^-1(0.77mM)。由此，TEII_srf对乙酰-辅酶A显示出更高的底物亲合性。图5显示用于确定TEII_srf对底物乙酰-辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的Km值的Lineweaver-Burk图。

实施例2：来自苜蓿中华根瘤菌的乙酰乙酰辅酶A合成酶(AACS)

具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列以及SEQ ID No.4所示的相应cDNA序列的、来自苜蓿中华根瘤菌的乙酰乙酰辅酶A合成酶(AACS)催化伴随ATP消耗的、由乙酰乙酸和辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A和AMP。但在本发明的框架下，所关注的是其逆反应。

如Aneja，P.，R.Dziak，G.-Q.Cai，T.C.Charles.2002.Identificationof an Acetoacetyl Coenzyme A synthetase-Dependent Pathway forUtilization of L-(+)-3-hydroxybutyrate in Sinorhizobium meliloti.J.Bacteriol.184：1571-1577所述将相应基因acsA2克隆到表达载体pET30Xa/LIC中。通过此种方式获得的质粒“pRD112”介导靶蛋白N末端与His标记物融合，籍此利于在Ni²⁺-NTA琼脂糖上由亲和层析进行纯化。

所述的蛋白的表达在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中于37℃下180转/分钟条件下进行。在光密度(OD_600nm)0.5-0.6下，用1mM IPTG诱导培养物，然后继续培养3小时。由生长过程中采集的样品证明了所述蛋白质(约72kDa)的成功表达。

图6显示出Coomassie染色后的7.5％SDS-PAGE凝胶；所述凝胶中的每一泳道中添加了15μl粗提物(快速细胞裂解物)；1：诱导前，2：诱导后1小时，3：诱导后2小时。

利用类似于TEII_srf的方式，通过Ni²⁺-NTA琼脂糖和20-250mM的咪唑(图.7A)梯度上金属螯合亲和层析进行纯化。其间出现了两个峰(1和2)，检测了所述级分的蛋白质含量。接下来利用7.5％SDS-PA凝胶分析表明，特别是对于第一个峰，在约55kDa处出现一个另外的带。由于这条带在第二个峰中很弱或者说并不存在，将这一峰的级分合并用于活性测定。用于DTNB试验的底物还是乙酰乙酰辅酶A以及作为比较的乙酰-辅酶A。Km值的确定给出了以乙酰-辅酶A作为底物的7×10^-4mol.l^-1(0.7mM)。另一方面，所测定的针对乙酰乙酰辅酶A的值不足以确定Km。但由于该酶与乙酰乙酰辅酶A的特异活性仅为0.0038μmol·min^-1.mg^-1，来自苜蓿中华根瘤菌的AACS以及与梭菌属的基因一起克隆的相应基因均没有继续应用。图7显示来自大肠杆菌的AACS的纯化，上部示出依照下述程序在Ni²⁺-NTA琼脂糖(QiagenSuperflow，床体积5ml)上的FPLC洗脱图谱：洗0-100ml，用20-250mM咪唑(线性梯度)洗脱100-150ml级分大小各1ml；图7下部示出经银染的7.5％ SDS-PAGE凝胶，其上，由峰1和峰2选择的洗脱级分，每种情况下，每一泳道上样1μg蛋白。CE：粗提物，FT：流通(Durchlauf；flow-through)。

实施例3：来自流感嗜血杆菌的酰基辅酶A硫酯酶YbgC

具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列以及SEQ ID No.6所示的相应cDNA序列的、来自流感嗜血杆菌的YbgC蛋白表现出与来自大肠杆菌的相应蛋白质的相似性，后者作为胞浆蛋白属于所谓的Tol-Pal系统。其广泛存在于革兰氏阴性细菌中。其对于维持细胞壁的完整性是重要的，并且可能具有转运底物通过周质的功能。YbgC在流感嗜血杆菌中的功能以及其与Tol-Pal系统的功能之间的任何联系迄今并未被公开。但是，Zhuang等(2002)描述了该蛋白的催化功能以及硫酯酶活性分析的相关研究。此种情况下可以显示出YbgC水解短链脂肪族酰基辅酶A酯类，例如丙酰基-辅酶A和丁酰基-辅酶A(Km值11-24mM)(Zhuang Z.，F.Song，B.M.Martin，D.Dunaway-Mariano.2002.The YbgCprotein encoded by the ybgC gene of the tol-pal gene cluster ofHaemophilus infuenzae catalyzes acyl-coenzyme A thioester hydrolysis.FEBS Lett.516：161-163)。

在这方面的范围内，体外检测与乙酰-辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的活性同样依赖于蛋白的纯化。由基因组DNA开始，将所述基因克隆到不同的表达系统，来自NEB(Frankfurt a.M.)的系统IMPACT^TM(InteinMediated Purification with an Affinity Chitin-binding-Tag)。其有益之处在于该方法可以简单地以天然的形式，即，无标记物，纯化重组蛋白质。

将ybgc克隆到载体pTYB1(NEB Frankfurt a.M.)中，以便于由大肠杆菌表达并接下来纯化所述的酰基辅酶A硫酯酶YbgC。

利用引物ybgcTYB1Ndefw(ATA TAC ATA TGT TGG ATA ATGGCT TTT C)和ybgcTYB1Xhorev(TCC GAA CTC GAG TTT TAA GTGATG)通过PCR由基因组DNA扩增ybgc基因。此情况下，引物介导在所述扩增片段的5’端掺入NdeI切割位点，在3’端掺入XhoI切割位点。所述的Taq Mastermix(Qiagen，Hilden)根据制造商的说明在下述条件下应用：

获得了所期望的、大小约为430bp的片段。根据制造商的说明(pJet_ybgcTYB，410bp)，将其首先亚克隆到pJET载体(Fermentas，St.Leon-Rot)。接下来利用内切核酸酶NdeI和XhoI再将ybgc片段从该质粒上切割下，并通过凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab BiotechnologieGmbH，Erlangen，根据制造商的说明进行)。类似地，将载体pTYB1(7477bp)用NdeI和XhoI切割(7439bp)，然后利用快速连接试剂盒(FermentasGmbH，St.Leon-Rot)根据制造商的建议将其与经切割并凝胶洗提的ybgc片段连接。用10μl连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，分离质粒DNA。利用限制性酶切(NdeI/XhoI)分析检测所分离的质粒并测序(Agowa GmbH，Berlin)。所得质粒称作pTYBybgc(SEQ IDNo.15)，并于进一步转化大肠杆菌BL21 DE3。

在37℃、LB_Amp培养基中培养的大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，直至于OD_600nm～0.5时用0.5mM IPTG诱导，此后，所述培养物在20℃、150转/分钟条件下继续培养6小时。异源表达的融合蛋白(约70kDa)与壳多糖结合。通过添加DTT引起构象变化并使靶蛋白(约15kDa)切割出来，所述靶蛋白接下来可被洗脱出来。图8示出SDS-PAGE凝胶。上部显示用于分析YbgC的表达的SDS-PAGE。其是Coomassie染色后的10-20％梯度SDS-PA凝胶。所述凝胶中的每一泳道中上样15μl粗提物(快速细胞裂解物)；1：诱导前，2，3：诱导后6小时。下部示出在壳多糖柱上，经银染的10-20％梯度SDS-PAGE凝胶中YbgC的纯化过程。每一泳道上样2μg蛋白。CE：粗提物，FT：流通(flow-through)，W：洗涤级分，洗脱：含蛋白的洗脱级分(级分大小：各1ml)。

如洗脱级分所显示的，除了所期望的15kDa蛋白质之外，还有融合蛋白条带以及切割下来的内含肽结构域的条带，其可用于在DTNB试验中进行体外活性检测。尽管用于确定Km的测定方法不同(数据未示出)，但可以确定对乙酰-辅酶A作为底物的Km为5.3×10^-4mol·l^-1(0.53mM)，对乙酰乙酰辅酶A作为底物的Km为1.4×10^-4mol·l^-1(0.14mM)。由此，可以通过直接地比较确定针对乙酰乙酰辅酶A的酶的底物亲和性实际上提高了。这些结果利于将YbgC用于进一步的克隆试验。

实施例4：用于构建表达载体的克隆策略

为了在大肠杆菌中生产丙酮，将合适的酰基辅酶A硫酯酶、或酰基辅酶A合成酶/酰基辅酶A硫激酶基因与来自丙酮丁醇梭菌的thlA基因(基因产物具有SEQ ID No.16所示的氨基酸序列以及相应的cDNA序列SEQ ID No.17，硫解酶A)以及adc(基因产物具有SEQ IDNo.18所示的氨基酸序列以及相应的cDNA序列SEQ ID No.19，乙酰乙酸脱羧酶)一起克隆。为了实现该目的首先选出质粒pSK和pKS。它们是克隆载体，其主要区别在于多克隆位点(MCS)的方向不同。所述的MCS均位于编码-半乳糖苷酶N-末端片段的lacZ’基因序列内部，由此可以通过蓝-白筛选选择重组质粒。在这一方面所涉及的试验中，优先在可诱导的lac启动子的控制下表达所克隆的基因。提供载体pSK用于此目的。此外，还制备了整合到质粒pKS中所产生的变体，在此情况下所述的基因在来自丙酮丁醇梭菌的组成型硫解酶启动子的控制下表达。

依次将各基因克隆到载体中。为实现该目的，首先设计用于扩增所述基因的寡核苷酸，向其中引入合适的切割位点，然后进行聚合酶链式反应。扩增出全部的片段，并如上所述克隆到所述载体中。制备策略以及应用pSK时所使用的限制性切割位点如图9所示。利用质粒pKS的制备方法与上述类似。

克隆步骤详述如下：

将基因adc，teII，thlA克隆到质粒pKS中：

目的是将基因adc(来自丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脱羧酶)，teII_srf(来自枯草芽孢杆菌的硫酯酶II)和thlA(来自丙酮丁醇梭菌的硫解酶)一起克隆到载体中，接下来在大肠杆菌中表达它们。利用引物AdcXhofwneu(CAT GCT CGA GAC GCG TTA CGT ATC)和AdcAparevneu(GAT GGG GCC CTG AAT TCT ATT ACT TAAG)通过PCR方法由质粒pDrive_adc(SEQ ID No.20)扩增所述的乙酰乙酸脱羧酶基因adc。此情况下，引物介导在所述扩增片段的5’端掺入XhoI切割位点，在3’端掺入ApaI切割位点。根据制造商的说明应用聚合酶GoTaq(Promega GmbH，Mannheim)以及4mM MgCl₂在下述条件下进行：

获得了预期大小约800bp的片段。通过凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab Biotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)，然后进行切割，类似于质粒pKS，用限制性内切核酸酶XhoI和ApaI(788bp)，将载体脱磷酸(Antarctic磷酸酶，New England Biolabs GmbH，Frankfurt a.M.，按照制造商的说明进行)。然后将经此种方式处理的所述载体与片段用T4连接酶连接(New England Biolabs GmbH，Frankfurta.M.)，按照制造商的说明进行。用10μl的连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。对于每一混合物，100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞转移到预冷的1.5ml反应容器中，各加入10μl的连接混合物，小心混合，将所述混合物在冰上培养30分钟。随后于42℃下热激90秒，将所述细胞再次置于冰上2min，各加入0.5ml预温的LB培养基。将所述混合物在37℃下轻柔地振荡培养60min。各100-300μl混合物铺于LB-氨苄青霉素培养基，于37℃下培养过夜。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，如下所述分离所述质粒DNA：应用无柱纯化(Qiagen，Hilden)的“Qiagen mini-kit”的经修饰的步骤，依照Birnboim和Doly(Birnboim，H.C.，J.Doly.1979.A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmidDNA.Nucleic Acids Res.7：1513-1523)快速分离质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切(ApaI/XhoI)分析检测，然后将阳性克隆测序(Agowa GmbH，Berlin)。该质粒称作pKSadc并用于后续的克隆步骤。

利用引物TeIISalfw(CAA TTG TCG ACG GAT AAC AAT TTC ACACAG A)和TeIIXhorev(CTA TCA ACT CGA GTC CAA GCT CAG CTAATT AA)，通过PCR由质粒pTEIIsrf扩增硫酯酶II基因teII_srf。此情况下，引物介导在所述扩增片段的5’端掺入SalI切割位点，在3’端掺入XhoI切割位点。根据制造商的说明应用协同聚合酶(synergypolymerase)(GeneCraft GmbH，Lüdinghausen)在下述条件下进行：

获得了大小约为850bp的预期片段。通过凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab Biotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)，而后，类似于质粒pKSadc，用限制性内切核酸酶SalI和XhoI切割(831bp)，将载体脱磷酸(虾碱性磷酸酶SAP，Fermentas GmbH，St.Leon-Rot，按照制造商的说明进行)。然后将经此种方式处理的所述载体与片段用快速连接试剂盒连接，按照制造商的说明进行(Fermentas GmbH，St.Leon-Rot)。用10μl的连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。将各100-300μl的混合物铺于LB-氨苄青霉素培养基并于37℃下培养过夜。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，并分离所述的质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(XhoI/SalI)，将阳性克隆测序(Agowa GmbH，Berlin)。所述质粒称作pKSadcte用于后续的克隆步骤。

通过PCR由来自丙酮丁醇梭菌的基因组DNA扩增硫解酶基因thlA，包括硫解酶启动子。

由丙酮丁醇梭菌分离染色体DNA：

原则上根据Bertram(Bertram，J.1989.Entwicklung eines Systemszum DNA-Transfer and zur Transposon-Mutagenese für Clostridiumacetobutylicum.Dissertation，

)由丙酮丁醇梭菌分离染色体DNA。为了这一目的，细胞在2×YTG培养基中厌氧生长，并在OD600收集约1.2。通过离心(5min，5000×g，4℃)使所述细胞沉降。用10ml的1×TAE缓冲液(添加10％[w/v]蔗糖)将所述细胞沉淀物洗三次，并于-20℃下储存。如下所述由通过此种方式处理的90ml细胞悬液中获得DNA：

1.用3.8ml含蔗糖的1×TAE悬浮所述沉淀(Pellet)

2.添加1ml的溶菌酶-RNA酶溶液

3.培养：30min，37℃

4.添加500μl的0.5M EDTA(pH8.0)，40μl的tris-HCl(pH8.0)，30μl的SDS(10％[w/v])

5.培养：10min，37℃

6.添加200μl的蛋白酶K溶液

7.培养：2h，37℃

8.添加1.4ml的5M高氯酸钠

9.添加7.3ml置于冰上的氯仿-异戊醇(24：1[v/v])

10.离心：10min，5000×g，4℃

11.去除上层，水相

12.重复步骤9.-11.两次

13.加入1vol.的异丙醇由水相中沉淀DNA

14.培养：5min，RT

15.离心：20min，16000×g，4℃

16.在RT下干燥所述沉淀最长2h

17.在2ml的TE缓冲液中悬浮所述沉淀

18.添加200μl的蛋白酶K溶液

19.培养：过夜，37℃

20.用双蒸水使体积增加到4ml

21.添加600μl的3M Na乙酸盐(pH5.2)

22.氯仿-异戊醇抽提三次(参见步骤9.-11.)

23.加入1vol.的异丙醇沉淀DNA

24.培养：5min，RT

25.离心：20min，16000×g，4℃

26.用96％(v/v)乙醇(特纯的，冰冷的)洗沉淀两次

27.在RT下干燥所述沉淀最长2h

28.在200μl的TE缓冲液中悬浮所述沉淀

用于PCR的引物PthlAXmafw(CAT GAT TTC CCG GGG GTTAGC ATA TG)和PthlASalrev(CAG AGT TAT TTT TAA GTC GAC TTTCTA GCA C)介导在所述扩增片段的5’端掺入XmaI切割位点，在3’端掺入SalI切割位点。根据制造商的说明应用Taq Mastermix(Qiagen，Hilden)在下述条件下进行：

获得了大小约为1400bp的预期片段。首先将其亚克隆到pJET载体(Fermentas，St.Leon-Rot)中，按照制造商的说明进行(pJet_PthlA)。接下来用限制性内切核酸酶XhoI和Cfr9I再由所述质粒中切出thlA片段(1397bp)并通过凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab BiotechnologieGmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。所述质粒pKSadcte用XhoI和Cfr9I进行类似地处理并脱磷酸(虾碱性磷酸酶SAP，FermentasGmbH，St.Leon-Rot，按照制造商的说明进行)。然后将经此种方式处理的所述载体与片段用快速连接试剂盒连接，按照制造商的说明进行(Fermentas GmbH，St.Leon-Rot)。用10μl的连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，并分离所述的质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(SalI/Cfr19I)，将阳性克隆测序(Agowa GmbH，Berlin)。

具有SEQ ID No.8的质粒称作pKSatt并用于进一步转化不同的大肠杆菌菌株，接下来用其研究丙酮的形成。

将基因adc，teII_srf，thlA克隆到质粒pSK中：

为了将这三个基因克隆到载体pSK中，首先用限制酶ApaI和SalI将已存在于pKS中的adc-teII_srf片段切除(1625bp)并经凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab Biotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)并将其连接到同样经切割并且去磷酸的pSK载体(SAP，Fermentas GmbH，St.Leon-Rot，按照制造商的说明进行)。应用快速连接试剂盒(New England Biolabs GmbH，Frankfurt a.M.)，按照制造商的说明进行，以实现这一目的。接下来使所得克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长进行检测，并分离质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(ApaI/SalI)。通过此种方式获得的质粒称作pSKadcte，并进一步在后续的克隆步骤中使用。

利用引物ThlAXmafw(GTC GAC CCG GGT CAA AAT TTA GGAG)和ThlASalrev(GCT TGT CGA ATT CAG ATC AGA G)，通过PCR由质粒pDrive_line thl(SEQ ID No.21)扩增硫解酶基因thlA。此种情况下，所述引物介导在所述扩增片段的5’端掺入XmaI切割位点，在3’端掺入SalI切割位点。根据制造商的说明应用Taq Mastermix(Qiagen，Hilden)在下述条件下进行：

获得了预期大小约为1250bp的片段。将其首先亚克隆到pJET载体(Fermentas，St.Leon-Rot)，按照制造商的说明进行)(pJet_thlA)中。接下来用限制性内切核酸酶XhoI和Cfr9I再由所述质粒中切出thlA片段(1243bp)并通过凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab BiotechnologieGmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。所述质粒pSKadcte同样用XhoI和Cfr9I进行处理并脱磷酸(虾碱性磷酸酶SAP，FermentasGmbH，St.Leon-Rot，按照制造商的说明进行)。然后将所述载体与经此种方式处理的片段用快速连接试剂盒连接，按照制造商的说明进行(New England Biolabs GmbH，Frankfurt a.M.)。用10μl的连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，并分离所述的质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(SalI/Cfr19I)，将阳性克隆测序(AgowaGmbH，Berlin)。

具有SEQ ID No.7的质粒称作pSKatt并用于进一步转化不同的大肠杆菌菌株。

可以基于具有SEQ ID No.14(pUCadc_ctfA/B_thlA；参见图10)、且其中已克隆了梭菌基因adc，ctfA/B和thlA的pUC18构建体，在载体pUC19中生成附加的变体，在pUC19中基因盒在lac启动子控制下表达。也可以将基因ctfA/B特异切割出来，在向所述片段引入适当的切割位点后插入基因teII_srf和ybgC(图9)。在pUC18构建体中，还将原有的thlA片段去除，由thlA片段替代，其还包含位于“上游”的thl启动子序列。

图10显示pUC19构建体的生成；图的上部示出将基因盒adc/ctfAB/thlA克隆到质粒pUC19的过程；图的下部示出由质粒pUC19act克隆teII_srf和ybgC的过程。

所述的克隆过程详述如下：

质粒pUC19act的构建

作为该构建基础的是质粒pUCadc_ctfA/B_thlA，其具有代表克隆到载体pUC18中的梭菌基因——乙酰乙酸脱羧酶(adc)，辅酶A转移酶(ctfA/B)和硫解酶(thlA)基因，的SEQ ID No.14。所述的基因是以与lacZ基因相反的方向克隆的。对于可在lac启动子控制下转录的基因，再次将adc_ctfA/B_thlA片段(3311bp)用限制性内切核酸酶SalI和EcoRI切割下来，连接到已用相同的酶进行切割的载体pUC19中(快速连接试剂盒，按照制造商的说明进行；Fermentas GmbH，St.Leon-Rot)。用10μl的连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，并分离所述的质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(SalI/EcoRI)。这一具有SEQ ID No.12的质粒被称作pUC19act并用于进一步转化不同的大肠杆菌菌株，接下来用其研究丙酮的形成。该包含用于丙酮生成的梭菌基因的构建体还可以用于与其他构建体进行比较。

质粒pUC18att的构建

作为该构建基础的是质粒pUCadc_ctfA/B_thlA，其具有代表克隆到载体pUC18中的梭菌基因——乙酰乙酸脱羧酶(adc)，辅酶A转移酶(ctfA/B)和硫解酶(thlA)基因，的SEQ ID No.14。

利用引物TeIIpUCBamfw(CAA TTG GGA TCC GAT AAC AATTTC ACA CAG)和TeIIpUCAccrev(GAG ATC TGG TAC CCG GTT AAATGA TCG GA)通过PCR由质粒pTEIIsrf扩增硫酯酶II基因teII_srf。此种情况下，所述的引物介导在所述扩增片段的5’端掺入BamHI切割位点，在3’端掺入Acc65I切割位点。根据制造商的说明应用协同聚合酶(GeneCraftGmbH，Lüdinghausen)在下述条件下进行：

获得了大小约为800bp的预期片段。首先将其亚克隆到pJET载体(Fermentas，St.Leon-Rot)，按照制造商的说明进行(pJet_teIIpUC)。用限制性内切核酸酶BamHI和Acc65I再将所述的teII_srf片段从该质粒上切割下来(776bp)并进行凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlabBiotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。载体pUCadc_ctfA/B_thlA也同样用限制酶BamHI和Acc65I处理以提取ctfA/B片段(1331bp)。将混合物在琼脂糖凝胶中分离，将包含剩余载体的带(4633bp)用凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab BiotechnologieGmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。然后将所述载体和所述片段用快速连接试剂盒，按照制造商的说明进行(Fermentas GmbH，St.Leon-Rot)连接。用10μl的连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，并分离所述的质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(BamHI/Acc65I)。所得的质粒pUC18att_sub进一步用于克隆带有硫解酶启动子的thlA片段。

通过PCR由丙酮丁醇梭菌的基因组DNA扩增包括硫解酶基因启动子的硫解酶基因thlA。利用PCR的引物PthlApUCSalfw(CAT GATTTG TCG ACG GTT AGC ATA TG)和PthlApUCBamrev(CAG AGT TATTTT TAA GGA TCC TTT CTA GC)介导在所述扩增片段的5’端掺入SalI切割位点，在3’端掺入BamHI切割位点。根据制造商的说明应用Taq Mastermix(Qiagen，Hilden)并添加2.5mM MgSO₄在下述条件下进行：

获得了大小约为1400bp的预期片段。首先将其亚克隆到pJET载体(Fermentas，St.Leon-Rot)，按照制造商的说明进行(pJet_PthlApUC)。接着用限制性内切核酸酶SalI和BamHI将thlA片段再从该质粒上切割下来(1397bp)并进行凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlabBiotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。用SalI和BamHI将硫解酶片段(无启动子，1217bp)从先前构建的质粒pUC18att_sub上切割下来，剩余的载体(4192bp)经凝胶洗提，在将包含启动子的硫解酶片段(1397bp)连入(快速连接试剂盒，按照制造商的说明进行；Fermentas GmbH，St.Leon-Rot)。用10μl的连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，并分离所述的质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(SalI/BamHI)并测序(Agowa GmbH，Berlin)。所述质粒称作pUC18att(SEQ ID No.10)并用于进一步转化不同的大肠杆菌菌株，接下来用其研究丙酮的形成。

质粒pUC19att的构建

作为该构建基础的是质粒pUC19act，其代表克隆到载体pUC19中的梭菌基因——乙酰乙酸脱羧酶(adc)，辅酶A转移酶(ctfA/B)和硫解酶(thlA)基因。

用限制酶BamHI和Acc65I将teII_srf片段由pJet_teIIpUC切出(776bp)并进行凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab Biotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。用相同的限制酶切割载体pUC19act以提取ctfA/B片段。在琼脂糖中分离后，包含剩余载体的带(4633bp)经凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlab Biotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。而后将载体片段与teIIpUC片段相连。为此，应用快速连接试剂盒(New England Biolabs GmbH，Frankfurt a.M.)，按照制造商的说明进行。转化如上所述进行。为了检测所得的克隆，使其接下来在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，并分离质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(BamHI/Acc65I)。通过上述方式所得的质粒称作pUC19att(SEQ ID No.9)并用于进一步转化不同的大肠杆菌菌株，接下来用其研究丙酮的形成。

质粒pUC19ayt的构建

作为该构建的基础的是质粒pUC19att。

利用引物ybgcpUCBamfw(CTC TAG AAG GAT CCT GTT TAACTT TAA G)和ybgcpUCAccrev(ATT GGG TAC CTC ATT GCA TACTCC G)通过PCR由基因组DNA扩增来自流感嗜血杆菌的酰基辅酶A硫酯酶YbgC的基因ybgc。此种情况下，所述的引物介导在所述扩增片段的5’端掺入BamHI切割位点，在3’端掺入Acc65I切割位点。根据制造商的说明应用Taq Mastermix(Qiagen，Hilden)在下述条件下进行：

获得了预期大小约为490bp的片段。首先将其亚克隆到pJET载体(Fermentas，St.Leon-Rot)，按照制造商的说明进行(pJet_ybgcpUC)。然后，用限制性内切核酸酶BamHI和Acc65I将ybgc片段再从该质粒上切割下来(465Bp)并进行凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlabBiotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。

同样地，用限制酶BamHI和Acc65I对载体pUC19att进行处理以提取teII_srf片段(468bp)。所述混合物在琼脂糖凝胶中分离，并将包含剩余载体的条带(4633bp)通过凝胶洗提(凝胶提取试剂盒；peqlabBiotechnologie GmbH，Erlangen，按照制造商的说明进行)。然后将所述的载体与所述片段用快速连接试剂盒，按照制造商的说明进行(Fermentas GmbH，St.Leon-Rot)连接。用10μl的连接混合物转化100μl的CaCl₂-感受态大肠杆菌XL1-B细胞。所得的克隆在LB-氨苄青霉素液体培养基中生长，并分离所述的质粒DNA。所分离的质粒通过限制性酶切分析检测(BamHI/Acc65I)并测序(Agowa GmbH，Berlin)。所得的质粒称作pUC19ayt(SEQ ID No.11)并用于进一步转化不同的大肠杆菌菌株，接下来用其研究丙酮的形成。

本发明的质粒构建体总结于表1。

表1：质粒构建体

质粒大小bp 插入物启动子

pSKatt 5771 teII _srf (adc，thlA) lac

pKSatt 5925 teII _srf (adc，thlA) thl

pUC19att 5409 teII _srf (adc，thlA) lac

pUC18att 5589 teII _srf (adc，thlA) thl

pUC19ayt 5101 ybgC(adc，thlA) lac

pUC19act 5964 ctfA/B(adc，thlA) lac

实施例5：大肠杆菌中形成丙酮

在大肠杆菌克隆菌株HB101中利用所得的全部质粒变体(参见表1)研究丙酮的形成。所述的分析以5ml的规模在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中进行，进行分析之前先经过：从合适的预培养物接种并于37℃、200转/分钟条件下进行培养的过程。利用光度计测定光密度(600nm)为约0.5-0.6时，通过添加1mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导所述克隆基因的表达，诱导3-4小时后加入葡萄糖(20g/l)。受硫解酶启动子控制的变体未被诱导，这是因为假设发生了组成型表达。在约48小时的过程中，于特定的时间点进行采样，通过气相色谱确定无细胞的培养基上清中的丙酮和乙酸盐浓度。在诱导后4小时或者与诱导同时，可任选地另外添加不同剂量(在10-40g/l的范围)的葡萄糖。

检测到大肠杆菌HB101中的全部质粒变体均产生显著量的丙酮。图11示例性的显示单独的变体相对于形成的丙酮和乙酸盐的量的生长曲线。

关于最高丙酮浓度的小结如表2所示。

图11显示在每种情况下，所选定的时间点的光密度(600nm)与丙酮和乙酸盐浓度(mM)。黑色的箭头表示在各情况下添加IPTG(1mM)的时间，绿色的箭头代表添加葡萄糖(20g/l)。

表2：5ml培养物中单独的质粒变体的最高丙酮浓度概要

质粒插入物启动子最高丙酮浓度菌株培养基

pSKatt teII _srf (adc，thlA) lac 34mM(2.0g/l，HB101，LB _Amp )

pKSatt teII _srf (adc，thlA) thl 36mM(2.1g/l，HB101，LB _Amp )

pUC19att teII _srf (adc，thlA) lac 30mM(1.7g/l，HB101，LB _Amp )

pUC18att teII _srf (adc，thlA) thl 35mM(2.0g/l，HB101，LB _Amp )

pUC19ayt ybgC(adc，thlA) lac 60mM(3.5g/l，HB101，LB _Amp )

pUC19act ctfA/B(adc，thlA) lac 46mM(2.7g/l，HB101，LB _Amp )

实施例6：比较涉及由流感嗜血杆菌克隆的ybgC基因的丙酮途径与仅由梭菌基因组成的丙酮途径

接下来的试验试图在100ml变体pUC19ayt的培养物(LB_Amp)中再现所得的结果，pUC19act为对照(37℃，200转/分钟)。用相应的1ml预培养物接种主培养物，用1mM IPTG在OD_600nm为0.5时进行诱导。与前述试验不同的是，在第一次添加葡萄糖后的18小时重复添加葡萄糖(20g/l)。此外，在各采样时间点平行地确定培养物中的的葡萄糖含量，以确定葡萄糖的消耗。通过如Bergmeyer(1970)所述的光-酶试验确定葡萄糖，其中葡萄糖在己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以及所添加的ATP和NADP⁺的作用下，葡萄糖分两步转化成6-磷酸葡萄糖和NADPH(Bergmeyer，H.U.(主编)：Methods of Enzymatic Analysis，2nd Edition，Verlag Chemie，Weinheim-Deerfield Beach-Basel1970)。在此情况下所形成的NAPDH的量与存在的葡萄糖的量成正比，可利用光度计测定340nm波长下的吸光度变化来确定。所述结果如图12A和12B所示。显然，在培养物A(大肠杆菌HB101 pUC19ayt)在进行第二次添加时已经被完全消耗掉了。

然而，重新添加葡萄糖没有如所希望的那样使丙酮的量进一步增加，也没有被消耗，因为显然没有检测到下降。由于光密度没有进一步的增加，因此假定此时的生长受到其他因素的限制。最高形成67mM(3.9g/l)的丙酮。含有对照质粒pUC19act的培养物B在相同的条件下进行试验，得到类似的结果。在进行第二次添加时，葡萄糖还没有被完全消耗掉，但是同样地，也没有因重新添加葡萄糖使所形成的丙酮的量相应增加。最高形成20mM(1.2g/l)的丙酮。与仅包含梭菌基因的对照培养物相比，具有来自流感嗜血杆菌的克隆基因ybgC基因在这些条件下可产生三倍于对照培养物的丙酮。

图12显示每一情况下，在所选择的时间点的光密度(600nm)，丙酮和乙酸盐的浓度(mM)以及葡萄糖含量(g/l)。黑色的箭头表示添加IPTG(1mM)的时间，绿色的箭头表示添加葡萄糖(20g/l)的时间；上部：E.coli HB101 pUC19ayt，下部：E.coli HB101 pUC19act(对照)。

序列表

<110>Evonik Degussa GmbH

<120>利用可再生原材料由新的代谢途径通过通过发酵生产丙酮

<130>200700792

<160>21

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>246

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>1

<210>2

<211>741

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>2

<210>3

<211>650

<212>PRT

<213>苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)

<400>3

<210>4

<211>1953

<212>DNA

<213>苜蓿中华根瘤菌

<400>4

<210>5

<211>136

<212>PRT

<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)

<400>5

<210>6

<211>411

<212>DNA

<213>流感嗜血杆菌

<400>6

<210>7

<211>5765

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>7

<210>8

<211>5919

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>8

<210>9

<211>5409

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>9

<210>10

<211>5589

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>10

<210>11

<211>5098

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>11

<210>12

<211>5964

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>12

<210>13

<211>4151

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>13

<210>14

<211>5964

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>14

<210>15

<211>7849

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>15

<210>16

<211>392

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>16

<210>17

<211>1179

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>17

<210>18

<211>244

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>18

<210>19

<211>735

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>19

<210>20

<211>4616

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>20

<210>21

<211>5098

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>21

Claims

1.由乙酰辅酶A起始制备丙酮的方法，该方法包括下述步骤：

A.由乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A；

B.由乙酰乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酸和辅酶A

C.由乙酰乙酸脱羧产生丙酮和CO₂

其特征在于

在步骤B中，辅酶A不转移到受体分子中。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤A中的酶促转化是由具有酮硫解酶活性、且具有与SEQ IDNo.16的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的多肽催化的。

3.如权利要求1或2中至少一项所述的方法，其特征在于，

步骤C中的转化是由具有乙酰乙酸脱羧酶活性、且具有与SEQID No.18的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的多肽催化的。

4.如权利要求1-3中至少一项所述的方法，其特征在于，

步骤C中的所述转化是自发发生的。

5.如权利要求1-4中至少一项所述的方法，其特征在于，

步骤B中的酶促转化是由乙酰乙酸辅酶A-水解酶，酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶催化的。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，

步骤B中的酶促转化是由具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性、且具有与SEQ ID No.1的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的多肽催化的。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，

步骤B中的酶促转化是由具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性、且具有与SEQ ID No.3的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的多肽催化的。

8.如权利要求1-5中至少一项所述的方法，其特征在于，

步骤B中的酶促转化是由具有乙酰乙酸辅酶A水解酶活性、且具有与SEQ ID No.5的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的多肽催化的。

9.如权利要求1-8中至少一项所述的方法，其特征在于，所述方法是通过微生物进行的。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

所述的微生物至少包含：

a 核酸，其编码权利要求2中所述的至少一个多肽，和

b 核酸，其编码权利要求5-8中所述的至少一个多肽，和

c 核酸，其编码权利要求3中所述的至少一个多肽，

使用核酸a，b和c以保证所述多肽在所述微生物中表达。

11.权利要求10所述的方法，其特征在于，

所述核酸a选自：

aa 序列17或其互补链所描述的DNA序列，

bb 与aa中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

cc 在无遗传密码简并的情况下，可与aa和bb中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。

12.如权利要求10或11中至少一项所述的方法，其特征在于，所述的核酸c选自：

dd 序列19或其互补链所描述的DNA序列，

ee 与dd中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

ff 在无遗传密码简并的情况下，与dd和ee中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。

13.如权利要求10-12中至少一项所述的方法，其特征在于，所述的核酸b选自：

gg 序列2或其互补链所描述的DNA序列，

hh 与gg中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

14.如权利要求10-12中至少一项所述的方法，其特征在于，所述的核酸b选自：

jj 序列4或其互补链所描述的DNA序列，

kk 与jj中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

ll 在无遗传密码简并的情况下，与jj和kk中所定义的DNA序列杂交的DNA序列。

15.如权利要求10-12中至少一项所述的方法，其特征在于，所述的核酸b选自：

mm 序列6或其互补链所描述的DNA序列，

nn 与mm中所述的DNA序列在严格条件下杂交的DNA序列，

16.如权利要求10-15中至少一项所述的方法，其中，核酸a，b和c位于一条核苷酸链上，且其后者选自：

具有如SEQ ID No.7所示的核酸序列的质粒pSKatt，

具有如SEQ ID No.8所示的核酸序列的质粒pKSatt，

具有如SEQ ID No.9所示的核酸序列的质粒pUC19att，

具有如SEQ ID No.10所示的核酸序列的质粒pUC18att，

和

具有如SEQ ID No.11所示的核酸序列的质粒pUC19ayt。

17.核酸，其选自：

具有如SEQ ID No.7所示的核酸序列的质粒pSKatt，

具有如SEQ ID No.8所示的核酸序列的质粒pKSatt，

具有如SEQ ID No.9所示的核酸序列的质粒pUC19att，

具有如SEQ ID No.10所示的核酸序列的质粒pUC18att，

和

具有如SEQ ID No.11所示的核酸序列的质粒pUC19ayt。

18.具有酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶活性的多肽在将乙酰乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酸和辅酶A中的用途，其特征在于，所述的多肽是

乙酰乙酸辅酶A水解酶，酰基辅酶A硫酯酶，酰基辅酶A合成酶或酰基辅酶A硫激酶，

或者

具有与SEQ ID No.1的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，或

具有与SEQ ID No.3的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，或

具有与SEQ ID No.5的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。

19.选自gg到oo的至少一个核酸b在利用其基因产物将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸和辅酶A中的用途。