MXPA01011766A - 1,3-propanodiol deshidrogenasa mutante. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la 1,3- propanodiol deshidrogenasa mutante y a un novedoso microorganismo que es capaz de crecer en concentraciones de al menos 105 g/l de 1, 3-propanodiol, niveles normalmente toxicos para los microorganismos tipo silvestre. La presente invencion proporciona tambien vectores de expresion y celulas hospedadoras que contienen la 1,3-propanodiol deshidrogenasa mutante, asi como a metodos para producir 1,3-propanodiol, que comprenden el uso de celulas que contienen la 1,3- propanodiol deshidrogenasa mutante.

Description

1,3-PROPANODIOL DESHIDROGENASA MUTANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a 1,3-propanodiol deshidrogenasa mutante que tiene una afinidad (Km) por el 1, 3-propanodiol, alterada. La presente invención proporciona la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la forma mutante de la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa. La presente invención proporciona también vectores de expresión y células hospedadoras que contienen 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El 1, 3-propanodiol es un monómero que tiene potencial utilidad en la producción de fibras poliéster y en la fabricación de poliuretanos y compuestos cíclicos. La producción de 1, 3-propanodiol ha sido descrita en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,686,276 expedida el 11 de noviembre de 1997 y en la WO 98/21341. Una ruta representativa para la producción de 1,3-propanodiol a partir de glucosa, puede conseguirse mediante la siguiente serie de pasos. La glucosa es convertida, en una serie de pasos, por enzimas de la ruta glicolitica, en REF.: 134062 dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y en 3-fosfogliceraldehido (3-PG) . El glicerol se forma luego, ya sea por hidrólisis del DHAP en dihidroxiacetona (DHA) seguido de la reducción, o por la reducción del DHAP en glicerol 3-fosfato (G3P) seguido de la hidrólisis. El paso de hidrólisis puede ser catalizado por cualquier número de fosfatasas celulares que son conocidas por ser especificas o no especificas con respecto a sus substratos o la actividad puede introducirse en el hospedador por recombinación. El paso de reducción puede ser catalizado por una enzima del hospedador enlazada a NAD+ (o NADP+) o la actividad puede ser introducida al hospedador por recombinación. Es notorio que el reguión de dha contiene una glicerol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.6) que cataliza la reacción reversible de la Ecuación 3.

Glicerol ® 3-HP + H20 (Ecuación 1) 3-HP + NADH + H+ ® 1, 3-propanodiol + NAD+ (Ecuación 2) Glicerol + NAD+ ® DHA + NADH + H+ (Ecuación 3) El glicerol se convierte en 1, 3-propanodiol a través del intermediario 3-hidroxipropionaldehido (3-HP) como se describió con detalle anteriormente. El 3-HP intermediario se produce a partir del glicerol (Ecuación 1) mediante una enzima deshidratasa que puede ser codificada por el hospedador o que puede ser introducida al hospedador por recombinación. Esta deshidratasa puede ser la gliceroldeshidratasa (E.C.4.2.1.30) , la dioldeshidratasa (E.C.4.2.1.28) , o cualquier otra enzima capaz de catalizar esta transformación. La glicerol deshidratasa es codificada por el reguión de dha . El 1, 3-propanodiol se produce a partir del 3-HP (Ecuación 2) por una enzima del hospedador enlazada a NAD+- (o NADP+) o la actividad puede introducirse al hospedador por recombinación. Esta reacción final en la producción del 1, 3-propanodiol puede ser catalizada por la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.202) u otras alcohol deshidrogenasas. En la Klebsiella pneumoniae y la Citroi_>acter freundii , los genes que codifican las actividades funcionalmente enlazadas de la glicerol deshidratasa ( dhaB) , 1, 3-propanodiol oxidoreductasa { dha T) , de la glicerol deshidrogenasa [ dhaD) y de la dihidroxiacetona cinasa ( dhaK) están comprendidos por el reguión de la dha . Los regulones de la dha de la Ci trobacter y Klebsiella han sido expresados en Escherichia coli y se ha demostrado que convierten el glicerol en 1, 3-propanodiol . Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa, que han sido descritas en la técnica, incluyendo la de Klebsiella pneumoniae # de acceso GenBank: U30903 (Williard, 1994, "Investigation of the Klebsiella pneumoniae 1, 3-propanediol pathway: Characterization and expression of glycerol dehydratase and 1, 3-propanediol oxidoreductasa" Thesis Chemical Engineering, University of Wisconsin-Madison) ; Citrobacter freundii # de acceso GenBank U09771 (Daniel, R. et al., 1995, Purification of 1 , 3-propanediol dehydrogenase from Citrobacter freundii: cloning, sequencing, and overexpression of the corresponding gene in Escherichia coli. J. Bacteriol. 177:2151-2156); y Clostridium pasteurianum # de acceso GenBank AF006034 (Luers, F. et al., 1997, Glycerol conversión to 1, 3-pro?anediol by Clostridium pasteurianum: cloning and expression of the gene encoding 1, 3-propanediol dehydrogenase. FEMS Microbiol, Lett. 154:337-345).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al descubrimiento de una forma mutante de la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa (PDD) aislada de un derivado de la E. blattae, capaz de crecer en la presencia de al menos 105 g/1 de 1, 3-propanodiol, niveles normalmente tóxicos para la E. blattae tipo silvestre. Por lo tanto la presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la forma mutante de la PDD esta asociada con la resistencia de la E. blattae a niveles normalmente tóxicos de 1,3-propanodiol. La presente invención se basa también, en parte, en el descubrimiento de que esta PDD mutante tiene una Km por el 1, 3-propanodiol y por la NAD, alterada. Por consiguiente, la presente invención proporciona una PDD mutante que tiene una Km por el 1,3-propanodiol, que está incrementada respecto a la Km de la PDD tipo silvestre, por el 1, 3-propanodiol . En una modalidad, la Km de la PDD mutante es aproximadamente 3 veces la Km de la PDD tipo silvestre, por el 1,3-propanodiol. En otra modalidad, la PDD mutante tiene una Km de aproximadamente 80 mM por el 1, 3-propanodiol. En una modalidad adicional, La PDD mutante puede obtenerse a partir de la E. blattae # de acceso ATCC, PTA-92. Todavía en otra modalidad de la presente invención, la PDD mutante comprende una mutación que corresponde al residuo de Hisl05 a Leu en la PDD de la E. blatte, como se muestra en la Figura 3. En una modalidad adicional, la PDD mutante comprende el aminoácido mostrado en la SEC ID NO: 2 y esta codificada por el ácido nucleico que tiene la secuencia como la que se muestra en la SEC ID NO:l. La presente invención proporciona también vectores de expresión y células hospedadoras que comprenden el ácido nucleico aislado que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID NO:l. En una modalidad la célula hospedadora incluye la Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella , Aerobacter, Lactobacillus , Aspergillus , Saccharomyces , Schizosaccharomyces , Zygosaccharomyces, Pichia , Kluyveromyces , Candida , Hansenula , Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia , Salmonella , Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas . En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a métodos para producir 1,3-propanodiol, que comprenden el uso de un microorganismo que contiene PDD mutante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID NO:l) para la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa (PDD) mutante. La Figura 2 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 2) para la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa (PDD) mutante. La Figura 3 proporciona una alineación de aminoácidos de PDD de varios microorganismos. Eb_GEBT representa la PDD mutante de E. blattae depositada en ATCC, Eb_429T y Eb_907T son E. blattae tipo silvestre (Número de acceso ATCC, 33429) ; Kpn es Klebsiella pneumoniae (# de acceso GenBank U30903) ; Cfu es Citrobacter freundii (# de acceso GenBank U09771) y Cpast es Clostridium pasteurianum (# de acceso GenBank AF006034) .

DESCRIPCIÓN DE LOS DEPÓSITOS DE MICROORGANISMOS REALIZADOS SEGÚN EL TRATADO DE BUDAPEST Los solicitantes han realizado los siguientes depósitos biológicos según los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimiento de Patente: DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Los términos "1, 3-propanodiol deshidrogenasa" «D PDnnD"' (conocida también en la técnica como "oxidoreductasa") se refiere al (a los) polipéptido (s) responsable (s) de una actividad enzimática que es capaz de catalizar la reducción del 3-hidroxipropionaldehido en 1,3-propanodiol. La 1, 3-propanodiol deshidrogenasa incluye, por ejemplo, el polipéptido codificado por el gen de dha T. La presente invención abarca la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa de cualquier fuente, incluyendo, aunque no limitada a la E.blatte, K.pneumoniae, C. freundii, C.pasteurianum. Como se usan en la presente, el término "mutante" o "mutación" se refiere a cualquier cambio genético que ocurra en el ácido nucleico de un microorganismo y que pueda o no reflejar un cambio fenotipico en el microorganismo. Una mutación puede comprender un cambio, deleción o inserción en un solo par de bases; una mutación puede comprender un cambio, deleción o inserción en un gran número de pares de bases; una mutación puede comprender también un cambio en una región grande de ADN, tal como a través de duplicación o inversión. La secuencia de aminoácidos de una 1.3-propanodiol deshidrogenasa mutante, puede derivarse a partir de una 1, 3-propanodiol deshidrogenasa precursora, mediante la sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa natural. En la técnica se han descrito métodos para modificar genes (por ejemplo, a través de la mutagénesis de oligonucleótidos dirigida al sitio) . La frase "correspondiente a" tal como se usa en la presente, se refiere a la relación de aminoácidos entre 1, 3-propanodiol deshidrogenasas como se ejemplifica en la Figura 3. Los residuos específicos analizados en la presente se refieren a un número del residuo de aminoácido que hace referencia al número asignado a la PDD GEB de E. blatte mostrado en la Figura 3. La mutación de His a Leu se muestra en el residuo 105 en la Figura 3. La Figura 3 ilustra que las 1, 3-propanodiol deshidrogenasas de una variedad de fuentes microbianas pueden alinearse usando el algoritmo CLUSTALW. La invención no esta limitada a la mutación de la PDD de E. blattae mostrada en las Figuras 1 y 2, o de E. blattae depositada en la ATCC y que tiene el número de acceso PTA-92 sino que comprende todas las PDD que contienen residuos de aminoácidos en las posiciones que son equivalentes al residuo identificado particular en la E. blattae. Un residuo es equivalente si, o es homólogo (es decir, su posición corresponde ya sea a la estructura primaria o terciaria) o análogo a un residuo especifico o porción de ese residuo en la PDD de E. blattae (es decir, que tiene una capacidad funcional igual o similar para combinarse, reaccionar o interactuar quimica o estructuralmente) . A fin de establecer homología con la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una PDD se compara directamente con la secuencia primaria de la PDD de la E. blattae (mostrada en la Figura 2) y particularmente con un conjunto de residuos conocidos por ser invariantes para todas las PDD para las cuales se conocen las secuencias (ver, por ejemplo, la Figura 3) . La presente invención abarca el cambio de residuos equivalentes en todas las fuentes de 1, 3-propanodiol deshidrogenasa siempre y cuando la forma mutante sea capaz de alterar la Km de la actividad por el 1, 3-propanodiol. En una modalidad preferida la Km de la forma mutante se incrementa para el 1, 3-propanodiol. La secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO:l se obtuvo a través de técnicas PCR. Esas técnicas se caracterizan a menudo por un error inadvertido en la secuencia, generado por PCR. Por lo tanto, la presente invención abarca también la 1,3-propanodiol deshidrogenasa de la E. blattae que tiene el número de acceso ATCC, PTA-92 y mutaciones correspondientes en otras fuentes microbianas de las 1, 3-propanodiol deshidrogenasas. El término "Km" se refiere a la afinidad de la enzima por el substrato. Una Km alta refleja una afinidad baja; una Km baja refleja una afinidad alta. Los términos "substrato de carbono" y "fuente de carbono" se refieren a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por los organismos hospedadores de la presente invención y particularmente las fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de un carbono, o mezclas de los mismos. Los términos "célula hospedadora" u "organismo hospedador" se refieren a un microorganismo capaz de recibir genes extraños o heterólogos, y de expresar esos genes para producir un producto genético activo. Como se usa en la presente, "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, y fragmentos o porciones de los mismos, y al ADN o ARN de origen genómico o sintético, que puede ser de doble hebra o de una sola hebra, ya sea que represente la hebra de sentido o antisentido. Los términos "nativo" y "tipo silvestre" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza, con sus propias secuencias regulatorias . Como se usa en la presente "aminoácido" se refiere a secuencias de péptidos o proteínas, o porciones de las mismas . El término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción en producto genético de un gen que codifique para la secuencia del producto genético. Los términos "plásmido", "vector", y "cassette" se refieren a un elemento cromosómico adicional que a menudo porta genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y usualmente en la forma de moléculas circulares de ADN de doble hebra. Esos elementos pueden ser secuencias que se repliquen autónomamente, secuencias integradoras del genoma, secuencias de fagos o nucleótidos, ADN o ARN, lineal o circular, de una sola hebra o de doble hebra, derivados de cualquier fuente, en los que cierto número de secuencias de nucleótidos han sido unidas o recombinadas en una estructura única que es capaz de introducir un fragmento promotor y la secuencia de ADN para un producto genético seleccionado junto con la secuencia no traducida 3' apropiada, a una célula. "Cassette de Transformación" se refiere a un vector especifico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que facilitan la transformación de un célula hospedadora particular. "Cassette de Expresión" se refiere a un vector especifico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que permiten la expresión mejorada de ese gen en un hospedador extraño. Los términos "aislado" o "purificado" como se usan en la presente, se refieren a un ácido nucleico o aminoácido que se retira de al menos un componente con el cual se encuentra asociado naturalmente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la 1,3-propanodiol deshidrogenasa (PDD) mutante, caracterizada por tener una Km por el 1, 3-propanodiol, incrementada. 1. Secuencias de PDD La secuencia de polinucleótidos como se muestra en la SEC ID N0:1 codifica la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa (SEC ID NO: 2) que tiene la mutación de His a Leu en el residuo 105 como se muestra en la Figura 3. Como lo comprenderá el experimentado en la técnica, debido a la degeneración del código genético, una variedad de polinucleótidos puede codificar la SEC ID NO: 2. La presente invención comprende todos esos polinucleótidos. La presente invención comprende el ácido nucleico que codifica la PDD que comprende una mutación que corresponde al residuo His 105 a Leu de E. blatte, como se muestra en la Figura 3. La secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos para la PDD de la K. pneumoniae se proporciona en el número de acceso GenBank U30903; la PDD de la C. freundii se proporciona en el número de acceso GenBank U09771; para la PDD de la C. pasteurianum se proporciona en el número de acceso GenBank AF00034. La presente invención comprende también la PDD mutante que se puede obtener de la E. blattae que tiene el número de acceso ATCC, PTA-92. Los métodos para obtener los genes deseados de un genoma microbiano son comunes y bien conocidos en la técnica de la biología molecular. Por ejemplo, si la secuencia del gen es conocida, se pueden crear bibliotecas genómicas apropiadas, mediante la digestión de endonucleasa de restricción y pueden clasificarse sistemáticamente con sondas complementarias para la secuencia de genes deseada.

Una vez que se aisla la secuencia, el ADN puede amplificarse usando métodos estándares de amplificación dirigida al cebador, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,683,202) para obtener cantidades de ADN apropiadas para la transformación, usando vectores apropiados. Alternativamente, métodos del uso de vectores cósmidos, para la transformación de hospedadores bacterianos apropiados, se encuentran bien descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbon, NY (1989). Métodos para hacer mutaciones en genes de la PDD, son conocidos por los experimentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio, procedimientos descritos en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4760025 expedida el 26 de Julio de 1988. Vectores y Cassettes de Expresión La presente invención proporciona una variedad de vectores y cassettes de transformasción y expresión apropiados para la clonación, transformación y expresión de PDD mutante asi como de otras proteínas asociadas con la producción de 1, 3-propanodiol en una célula hospedadora apropiada. Los vectores apropiados serán aquellos que sean compatibles con la bacteria empleada. Los vectores apropiados se pueden derivar, por ejemplo, de una bacteria, un virus (tal como el bacteriófago T7 o un fago derivado M-13) , un cósmido, una levadura o una planta. Los protocolos para obtener y usar esos vectores son conocidos por los experimentados en la técnica. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual - volúmenes 1,2,3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) ) . Tipicamente el vector o cassette contiene secuencias que dirigen la transcripción y traducción del gen relevante, un marcador seleccionable, y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica. Los vectores apropiados comprenden una región 5' del gen que contiene los controles del inicio de la transcripción y una región 3' del fragmento de ADN que controla la terminación de la transcripción. Lo más preferido es cuando ambas regiones de control son derivadas de genes homólogos con la célula hospedadora transformada, aunque se comprenderá que esas regiones de control no necesitan ser derivadas de los genes nativos en la especie especifica seleccionada como un hospedador para producción. Las regiones de control de la iniciación o promotores, que son útiles para conducir la expresión de la PDD en la célula hospedadora deseada, son numerosos y familiares para los experimentados en la técnica. Virtualmente cualquier promotor capaz de conducir estos genes es apropiado para la presente invención, incluyendo, aunque no limitados a, CYC1, HIS3, GALl, GALIO, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRPl, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para la expresión' en Saccharomyces) ; AOXl (útil para la expresión en Pichia) ; y lac, trp, IPL, IPR, T7, tac y tre (útil para la expresión en E. coli) . Las regiones para el control de la terminación se pueden derivar también de varios genes nativos para los hospedadores preferidos. Opcionalmente un sitio de terminación puede no ser necesario, sin embargo lo más preferido es que se incluya. Para la expresión efectiva de las enzimas de la presente, el ADN que codifica las enzimas esta enlazado funcionalmente a través de codones de iniciación, a las regiones de control de la expresión, seleccionadas, de manera tal que la expresión de por resultado la formación del ARN mensajero apropiado.

Transformación de hospedadores apropiados y expresión de la PDD Una vez que están construidos los cassettes apropiados, estos se usan para transformar las células hospedadoras apropiadas. La introducción del cassette que contiene la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante, ya sea en forma separada o conjunta con otras proteínas necesarias para la producción de 1, 3-propanodiol, en la célula hospedadora, puede conseguirse a través de procedimientos conocidos, tales como la transformación (por ejemplo usando células permeabilizadas por calcio, electroporación) o por transfección usando un virus fago recombinante (Sambrook et al. , supra. ) . Células Hospedadoras Las células hospedadoras apropiadas para la producción recombinante de 1, 3-propanodiol pueden ser, ya sea procarióticas o eucarióticas y estarán limitadas únicamente por la capacidad de la célula hospedadora para expresar enzimas activas. Los hospedadores preferidos serán aquellos tipicamente útiles para la producción de glicerol o 1, 3-propanodiol, tales como la Ci trobacter, EnteroJbacter, Clostridium, Klebsiella , Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces , Schizosaccharomyces , Zygosaccharomyces, Pichia , Kluyveromyces, Candida , Hansenula , Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter , Escherichia , Salmonella , Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas . Las más preferidas en la presente invención son la E. Coli, la especie Klebsiella y la especie Saccharomyces .

Medios y Substratos de Carbono: Los medios de fermentación en la presente invención deben contener substratos de carbono apropiados. Los substratos apropiados pueden incluir, aunque no están limitados a, monosacáridos tales como la glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como la lactosa o sucrosa, polisacáridos tales como el almidón o la celulosa, o mezclas de los mismos, y mezclas no purificadas de productos alimenticios renovables tales como producto permeado de suero de queso, licor de maiz, melazas de remolacha de azúcar, y malta de cebada. Adicionalmente el substrato de carbono puede ser también substratos de un carbono tal como el dióxido de carbono o metanol, para los cuales se ha demostrado la conversión metabólica en intermediarios bioquímicos claves. Los substratos de carbono preferidos son los monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y substratos de un carbono. Los más preferidos son los azúcares tales como la glucosa, fructosa, sucrosa y substratos de un solo carbono tales como el metanol y dióxido de carbono. La más preferida es la glucosa. Además de una fuente de carbono apropiada, los medios de fermentación deben contener minerales apropiados, sales, cofactores, soluciones reguladoras y otros componentes, conocidos por los experimentados en la técnica, apropiados para el crecimiento de los cultivos y promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción de glicerol. Se ofrece particular atención a la sales de Co(II) y/o vitamina Bi2 o precursores de la misma.

Condiciones de cultivo: Tipicamente, las células se cultivan a 30° en medios apropiados. Los medios de cultivo preferidos en la presente invención son los medios comunes preparados comercialmente tales como el caldo Luria Bertani (LB) , el caldo de Dextrosa Sabouraud (SD) o el caldo de Extracto de Malta de Levadura (YM) . Otros medios de cultivo definidos o sintéticos pueden usarse también y el medio apropiado para el cultivo del microorganismo particular será conocido por alguien de experiencia en la técnica de la microbiología o de la ciencia de las fermentaciones. El uso de agentes conocidos para modular la represión de catabolitos, directa o indirectamente, por ejemplo el 2 ' : 3' -monofosfato de adenosina cíclico o el 2 ' : 5' -monofosfato de adenosina cíclico, pueden incorporarse también en los medios de reacción. Similarmente, el uso de agentes conocidos por modular las actividades enzimáticas (por ejemplo, sulfitos, bisulfitos y álcalis), que conduce a la intensificación de la producción de glicerol, puede usarse junto con manipulaciones genéticas o como una alternativa a las mismas. Los intervalos de pH apropiados, para la fermentación, se encuentran entre un pH de 5.0 a pH de 9.0, en donde se prefiere un pH de 6.0 a un pH de 8.0 como el intervalo para la condición inicial. Las reacciones se pueden llevar a cabo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, en donde se prefieren las condiciones anaeróbicas o microaeróbicas. La manera y método para llevar a cabo la presente invención pueden ser comprendidos de forma más completa por los experimentados en la técnica, haciendo referencia a los siguientes ejemplos, ejemplos que no pretenden de manera alguna limitar el alcance de la presente invención o de las reivindicaciones enfocadas a la misma.

Ejemplos El Ejemplo 1 Describe los cambios cinéticos asociados con la PDD mutante mostrada en la SEC ID NO: 2.

Materiales y Métodos Cepas-La E. blattae tipo silvestre, ATCC 33429, comprende el Número de acceso ATCC de la PDD, PTA-92.

Cultivo- Las células se cultivaron en un medio complejo a 30 °C, usando 500 ml en un frasco Fernbach de 2800 ml con agitación a 225 rpm durante 20 horas. El medio consiste de KH2P04, 5.4 g/L; (NH4)2S04, 1.2 g/L; MgS07H20, 0.4 g/L; extracto de levadura, 2.0 g/L; triptona, 2.0 g/L; y glicerol, 9.2 g/L en agua de la llave. El pH se ajustó a 7.1 con KOH, antes de la introducción al autoclave (Honda, et al., J. Bacteriol, 143:1458-1465).

Preparación de los extractos-Las células se recolectaron por centrifugación, con cuidado, para evitar condiciones anaeróbicas. Las masas pelotiformes se volvieron a suspender en tricina 100 mM, pH 8.2, que contenia 50 mM de KCl y 1 mM de DTT. Las células se rompieron mediante el paso a través de una celda de presión French. Los extractos crudos se clarificaron por centrifugación a 20K X g durante 20 minutos, seguido por 100 K X g durante 1 hora, para producir la fracción del sobrenadante a alta velocidad (HSS) .

Ensayos-el ensayo para la PDD se llevó a cabo como se describe en Johnson, E.A. et al., 1987, J. Bacteriol. 169:2050-2054.

Purificación parcial de la PDD- El HSS se separó en una columna Poros 20HQ, 16 X 100. Las soluciones reguladoras fueron A, HEPES 50 mM, pH 7.4 que contenia 100 µM de MnCl y B, una solución reguladora que contenia 500 mM de KCl. La columna se cargó y se desarrolló a razón de 10 ml/min. El gradiente fue un lavado con 10 volúmenes de columna (CV) , un gradiente lineal hasta 70% de B en 10 CV, y 1 CV hasta 100% de B. La actividad se detectó en las primeras fracciones del gradiente. Las fracciones de la columna, recolectadas, de la cepa 33429, se usaron tal como se recolectaron, para los ensayos, después de la adición de DTT lmM adicional. Las fracciones activas de la cepa GEB031 se recolectaron y concentraron en una membrana PM30 y se usaron como se concentraron después de la adición de DTT 1 mM adicional.

Cinética de la PDD-Los resultados se presentan abajo, Ejemplo 2: Clonación y secuenciación de los genes de la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa ( dha T) de la E. blattae. Los genes de la dha T se amplificaron por PCR a partir del ADN genómico de la E. blattae, como ADN de plantilla, usando cebadores sintéticos (cebador 1 y cebador 2) en base a la secuencia de dha T de la K. pneumoniae e incorporando un sitio Xbal en el extremo 5' y un sitio BamHl en el extremo 3' . El producto se subclonó en pCR- Blunt II-TOPO (Invitrogen) . Las clonaciones de la dha T se secuenciaron después con técnicas estándares. Los resultados de la secuenciación de ADN se proporcionan en la SEC ID NO:l y en la SEC ID NO: 2.

Cebador 1 5' TCTGATACGGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT3' Cebador 2 5' GCGCCGTCTAGAATTATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTG3' Como comprenderá fácilmente el experimentado en la técnica, la secuencia de ácidos nucleicos, generada a través de métodos PCR puede contener errores inadvertidos. La presente invención abarca también ácido nucleico que codifique la PDD que pueda obtenerse de la E. blattae que tiene el número de acceso ATCC, PTA-92. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo patentes, solicitudes de patente, secuencias y publicaciones, se incorporan en la presente, en su totalidad, como referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica de la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante, caracterizada porque tiene una afinidad (Km) incrementada por el 1, 3-propanodiol, respecto a la Km que tiene la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa tipo silvestre por el 1, 3-propanodiol . 2. La 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la Km incrementada es aproximadamente tres veces la Km del tipo silvestre.
3. 3. La 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una Km de aproximadamente 80 mM por el 1,3-propanodiol.
4. 4. La 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se puede obtener de la E. blattae que tiene el número de acceso ATCC, PTA-92.
5. 5. La 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene una mutación que corresponde al residuo His 105 a Leu en la E. blatte como se muestra en la Figura 3.
6. 6. La 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido tiene la secuencia como se muestra en la SEC ID NO:2.
7. 7. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID NO: 2.
8. 8. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID NO:l.
9. 9. Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 7.
10. 10. Una célula hospedadora caracterizada porque contiene el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 9.
11. 11. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque incluye la Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella , Aerobacter, Lactobacillus , Aspergillus, Saccharomyces , Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces , Pichia , Kluyveromyces, Candida , Hansenula , Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia , Salmonella , Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas .
12. 12. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la 1,3-propanodiol deshidrogenasa mutante contiene una mutación que corresponde al residuo His 105 a Leu en la E. blatte mostrada en la Figura 3.
13. 13. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la 1,3-propanodiol deshidrogenasa mutante tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 2.
14. 14. Un método para producir 1, 3-propanodiol en un microorganismo, caracterizado porque comprende los pasos de: i. obtener un microorganismo que contenga una 1, 3-propanodiol deshidrogenasa (PDD) mutante, que tenga una Km incrementada por el 1, 3-propanodiol con respecto a la PDD tipo silvestre correspondiente, el microorganismo contiene al menos un gen capaz de expresar una actividad de la deshidratasa, e, ii. poner en contacto el microorganismo con un substrato de carbono.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante contiene una mutación que corresponde al residuo His 105 a Leu en la E. Blatte mostrada en la Figura 3.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el 1, 3-propanodiol mutante contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N0:2.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la 1, 3-propanodiol deshidrogenasa mutante puede obtenerse a partir de la E. blattae que tiene el número de acceso ATCC, PTA-92.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo incluye la Ci trobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella , Aerobacter, Lactobacillus , Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces , Zygosaccharomyces , Pichia , Kluyveromyces , Candida , Hansenula , Debaryomyces , Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia , Salmonella , Bacillus , Streptomyces y Pseudomonas .
19. 19. Un microorganismo aislado, caracterizado porque tiene el número de acceso ATCC, PTA-92.