CN116622657B

CN116622657B - 一种1，3-丙二醇氧化还原酶突变体及含其融合蛋白与应用

Info

Publication number: CN116622657B
Application number: CN202310870566.9A
Authority: CN
Inventors: 张炽坚; 何廷刚; 艾勇; 张金桂; 曾安平
Original assignee: Hua An Tang Biotech Group Co ltd
Current assignee: Hua An Tang Biotech Group Co ltd
Priority date: 2023-07-17
Filing date: 2023-07-17
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2043-07-17
Also published as: CN116622657A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种1，3‑丙二醇氧化还原酶突变体及含其融合蛋白与应用。本发明提供了一种1，3‑丙二醇氧化还原酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种包含所述突变体的融合蛋白。所述突变体和/或融合蛋白与野生型蛋白相比，热稳定性较佳，比酶活约为野生型蛋白的3倍，催化效率约为野生型蛋白的4.7倍，在生物合成1，3‑丙二醇中应用前景广阔，工业价值较高。

Description

一种1，3-丙二醇氧化还原酶突变体及含其融合蛋白与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种1，3-丙二醇氧化还原酶突变体及含其融合蛋白与应用。

背景技术

在生物柴油生产过程中伴随着大量副产物粗甘油的产生，全球约有67%的粗甘油来源于生物柴油工业生产。粗甘油中含有大量残留的甲醇、盐、催化剂、甘油酯和游离脂肪酸等杂质，在未经预处理的情况下，其工业应用价值低。因此，如何绿色高效地综合利用这些粗甘油是面临的难题。近些年来，科研人员考虑将其转化为高附加值产品，例如1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、丁醇等。

1，3-丙二醇（1，3-PDO）是一种重要的大宗化合物，广泛应用于化妆品、医药、溶剂、有机合成等领域，是合成聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）、聚氨酯、聚醚以及杂环化合物的单体，尤其作为生产PTT的前体受到广泛关注。目前，1，3-PDO工业生产主要有化学合成法和生物法两种。传统的化学合成法均具有成本高、产率低等缺点。中国专利申请201910071254.5公开了一种甘油溶液高效氢解制备1，3-丙二醇的方法，催化剂由WO_x/M_yO_z复合氧化物载体负载铂、钌双金属合金活性组分构成，M_yO_z为氧化物Al₂O₃、SiO₂、TiO₂、ZrO₂中的一种；WO_x/M_yO_z载体中，WO_x质量分数为5-50%，M_yO_z质量分数为50-95%。Pt的含量占载体质量的0.1-10%，Ru的含量占载体质量的0.1-10%。

与化学合成法相比，生物法反应条件更温和，原材料来源更广泛，而且对环境污染小。目前生物法主要以甘油为底物，采用相应的微生物发酵，将甘油转化为1，3-PDO。中国专利申请201310688092.2公开了一株高产1，3-丙二醇的微生物，具体公开了分离的微生物、生产PDO的方法及系统，该分离的微生物为克雷伯肺炎杆菌，于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7824，保藏名称为ACR30。中国专利申请201410693426.X公开了一种重组大肠杆菌菌株，以及所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，和使用该重组大肠杆菌菌株进行生物法合成聚3-羟基丙酸的方法；该申请以甘油为底物生物合成P3HP的代谢途径中，NAD⁺作为辅酶在催化3-羟基丙醛生产3HP的同时会产生大量的NADH，所述重组大肠杆菌菌株代谢甘油生成1，3-PDO的过程会消耗NADH，因此在P3HP的合成途径中引入1，3-PDO的合成，可以平衡菌体内还原力。

大部分的研究主要集中在以甘油为底物发酵生产1，3-PDO，但微生物容易受到甘油中大量杂质的影响，其发酵过程中1，3-PDO的产量、生产效率及生产强度等不可避免地受到限制（jamul Det al. lmpurities of Crude glycerol and their effect onmetabolite production.Ann Microbiol. 2014.64(3):891-898）。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明特此提出了一种1，3-丙二醇氧化还原酶突变体及含其融合蛋白。

自然界中能代谢甘油生产1，3-PDO的微生物主要有肠杆菌属的克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、梭菌属的巴氏梭状芽孢杆菌（Clostridia pasteuianum）、丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridia butyricum）以及乳杆菌属的短乳杆菌（Lactobacilli brevis）等。微生物代谢甘油途径分为氧化和还原两条分支，在还原途径中甘油经甘油脱水酶（glycerol dehydratase，GDHt）的催化作用，脱去一分子水生成中间产物3-羟基丙醛（3-hydroxypro-pionaldehyde，3-HPA），在NADH存在下，通过1，3-PDO氧化还原酶（1，3-propanediol oxidoreductase，PDOR）催化3-HPA生成1，3-PDO。1，3-PDO氧化还原酶又称1，3-PDO脱氢酶，是微生物通过还原途径代谢甘油生成1，3-PDO的关键酶之一。

本发明人从驯化的巴氏梭菌中分离出一种1，3-PDOR突变体，所述突变体全长386个氨基酸，与野生型1，3-PDOR相比具有21个氨基酸位点的取代。该突变体与野生型同源性较高，根据氨基酸理化性质分析，氨基酸取代位点中差异较大的为第61位、第217位和第348位，也就是说这三个位点对突变体的性能影响较大。所述突变体的氨基酸取代位点为G61D、L217S和N348K。

本发明第一个目的在于提供一种1，3-丙二醇氧化还原酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：

MRMYDFLAPSVNFMGAGSIKVVGERCKILGGRKALIVTDKFLRDMEDGAVAQTVKYLRESDIDVAFYDDVEPNPKDTNVRDGLKIYQQENCDLIVTVGGGSSHDCGKGIGIAATHEGDLYDYAGIETLTNPLPPIVAVNTTAGTGSEVTRHCVITNTETKIKFVIVSWRNLPLVSINDPMLMVKKPAGLTAATGMDALTHAIEAYVSKDANPVTDASAIQAIKLISNNLRQAVALGENLEARENMAYASLLAGMAFNNANLGYVHAMAHQLGGLYDMAHGVANAMLLPHVERYNLISNPKKFADIAEFMGENIQGLSVMEAAEKAIDAMFRLSKDVGIPASLKEMGVKEEDFEYMAKMALKDGNAFSNPRKGNERDIVKIFREAF。

所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：

ATGCGTATGTACGACTTCCTGGCTCCGTCTGTTAACTTCATGGGTGCTGGTTCTATCAAAGTTGTTGGTGAACGTTGCAAAATCCTGGGTGGTCGTAAAGCTCTGATCGTTACCGACAAATTCCTGCGTGACATGGAAGACGGTGCTGTTGCTCAGACCGTTAAATACCTGCGTGAATCTGACATCGACGTTGCTTTCTACGACGACGTTGAACCGAACCCGAAAGACACCAACGTTCGTGACGGTCTGAAAATCTACCAGCAGGAAAACTGCGACCTGATCGTTACCGTTGGTGGTGGTTCTTCTCACGACTGCGGTAAAGGTATCGGTATCGCTGCTACCCACGAAGGTGACCTGTACGACTACGCTGGTATCGAAACCCTGACCAACCCGCTGCCGCCGATCGTTGCTGTTAACACCACCGCTGGTACCGGTTCTGAAGTTACCCGTCACTGCGTTATCACCAACACCGAAACCAAAATCAAATTCGTTATCGTTTCTTGGCGTAACCTCCCACTGGTAAGCATCAACGACCCGATGCTGATGGTTAAAAAACCGGCTGGTCTGACCGCTGCTACCGGTATGGACGCTCTGACCCACGCTATCGAAGCTTACGTTTCTAAAGACGCTAACCCGGTTACCGACGCTTCTGCTATCCAGGCTATCAAACTGATCTCTAACAACCTGCGTCAGGCTGTTGCTCTGGGTGAAAACCTGGAAGCTCGTGAAAACATGGCTTACGCTTCTCTGCTGGCTGGTATGGCTTTCAACAACGCTAACCTGGGTTACGTTCACGCTATGGCTCACCAGCTGGGTGGTCTGTACGACATGGCTCACGGTGTTGCTAACGCTATGCTGCTGCCGCACGTTGAACGTTACAACCTGATCTCTAACCCGAAAAAATTCGCTGACATCGCTGAATTCATGGGTGAAAACATCCAGGGTCTGTCTGTTATGGAAGCTGCTGAAAAAGCTATCGACGCTATGTTCCGTCTGTCTAAAGACGTTGGTATCCCGGCTTCTCTGAAAGAAATGGGTGTTAAAGAAGAAGACTTCGAATACATGGCTAAAATGGCTCTGAAAGACGGTAACGCTTTCTCTAACCCGCGTAAAGGTAACGAACGTGACATCGTTAAAATCTTTCGTGAAGCGTTCTAA。

本发明第二个目的在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含所述突变体和标签蛋白。

本领域技术人员可根据需要选择标签蛋白，优选分子量小、不影响融合蛋白表达和水溶性的标签蛋白。

在一个优选的实施方案中，所述标签蛋白可以位于所述突变体的N端。

在一个优选的实施方案中，所述标签蛋白可以为His标签蛋白，例如6×His标签蛋白。

在一个优选的实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

MHHHHHHMRMYDFLAPSVNFMGAGSIKVVGERCKILGGRKALIVTDKFLRDMEDGAVAQTVKYLRESDIDVAFYDDVEPNPKDTNVRDGLKIYQQENCDLIVTVGGGSSHDCGKGIGIAATHEGDLYDYAGIETLTNPLPPIVAVNTTAGTGSEVTRHCVITNTETKIKFVIVSWRNLPLVSINDPMLMVKKPAGLTAATGMDALTHAIEAYVSKDANPVTDASAIQAIKLISNNLRQAVALGENLEARENMAYASLLAGMAFNNANLGYVHAMAHQLGGLYDMAHGVANAMLLPHVERYNLISNPKKFADIAEFMGENIQGLSVMEAAEKAIDAMFRLSKDVGIPASLKEMGVKEEDFEYMAKMALKDGNAFSNPRKGNERDIVKIFREAF。

所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：

ATGcatcatcatcatcatcacATGCGTATGTACGACTTCCTGGCTCCGTCTGTTAACTTCATGGGTGCTGGTTCTATCAAAGTTGTTGGTGAACGTTGCAAAATCCTGGGTGGTCGTAAAGCTCTGATCGTTACCGACAAATTCCTGCGTGACATGGAAGACGGTGCTGTTGCTCAGACCGTTAAATACCTGCGTGAATCTGACATCGACGTTGCTTTCTACGACGACGTTGAACCGAACCCGAAAGACACCAACGTTCGTGACGGTCTGAAAATCTACCAGCAGGAAAACTGCGACCTGATCGTTACCGTTGGTGGTGGTTCTTCTCACGACTGCGGTAAAGGTATCGGTATCGCTGCTACCCACGAAGGTGACCTGTACGACTACGCTGGTATCGAAACCCTGACCAACCCGCTGCCGCCGATCGTTGCTGTTAACACCACCGCTGGTACCGGTTCTGAAGTTACCCGTCACTGCGTTATCACCAACACCGAAACCAAAATCAAATTCGTTATCGTTTCTTGGCGTAACCTCCCACTGGTAAGCATCAACGACCCGATGCTGATGGTTAAAAAACCGGCTGGTCTGACCGCTGCTACCGGTATGGACGCTCTGACCCACGCTATCGAAGCTTACGTTTCTAAAGACGCTAACCCGGTTACCGACGCTTCTGCTATCCAGGCTATCAAACTGATCTCTAACAACCTGCGTCAGGCTGTTGCTCTGGGTGAAAACCTGGAAGCTCGTGAAAACATGGCTTACGCTTCTCTGCTGGCTGGTATGGCTTTCAACAACGCTAACCTGGGTTACGTTCACGCTATGGCTCACCAGCTGGGTGGTCTGTACGACATGGCTCACGGTGTTGCTAACGCTATGCTGCTGCCGCACGTTGAACGTTACAACCTGATCTCTAACCCGAAAAAATTCGCTGACATCGCTGAATTCATGGGTGAAAACATCCAGGGTCTGTCTGTTATGGAAGCTGCTGAAAAAGCTATCGACGCTATGTTCCGTCTGTCTAAAGACGTTGGTATCCCGGCTTCTCTGAAAGAAATGGGTGTTAAAGAAGAAGACTTCGAATACATGGCTAAAATGGCTCTGAAAGACGGTAACGCTTTCTCTAACCCGCGTAAAGGTAACGAACGTGACATCGTTAAAATCTTTCGTGAAGCGTTCTAA。

本发明第三个目的在于提供一种包含所述突变体或所述融合蛋白的多核苷酸。

本发明第四个目的在于提供一种包含所述多核苷酸的表达载体。

在一个优选的实施方案中，所述表达载体可以为重组表达载体。

在一个优选的实施方案中，所述表达载体为可以真核表达载体或原核表达载体。

在一个优选的实施方案中，所述表达载体可以为强启动子表达载体，例如，T7启动子表达载体、SV40启动子表达载体、CMV启动子表达载体等。

在一个优选的实施方案中，所述表达载体可以为pET表达载体，例如，pET-21a(+)、pET-28a(+)等。

本发明第五个目的在于提供一种包含所述表达载体的宿主细胞。

在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞可以为真核细胞或原核细胞。

在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞可以为酵母细胞，例如毕赤酵母；

和/或，所述宿主细胞可以为大肠杆菌。

本发明第六个目的在于提供所述突变体、所述融合蛋白、所述多核苷酸、所述表达载体和/或所述宿主细胞在制备1，3-丙二醇中的应用。

本发明第七个目的在于提供一种所述突变体、所述融合蛋白和/或所述宿主细胞制备1，3-丙二醇的方法，所述方法包括以下步骤：

将具有酶活性的突变体和/或融合蛋白的纯化液与底物孵育，以催化制备得到1，3-丙二醇。

在一个优选的实施方案中，所述底物可以为甘油和/或甘油衍生物。

在一个优选的实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

采用破碎缓冲液将所述宿主细胞进行破碎，离心取上清液，得到突变体和/或融合蛋白的发酵液或酶液；

可选地，对发酵液或酶液进行亲和层析后，采用超滤浓缩或脱盐柱进行脱盐。

在一个优选的实施方案中，所述破碎包括但不限于超声破碎或均质破碎。所有可使宿主细胞释放包含的活性蛋白的破碎方式均可采用。

在一个优选的实施方案中，所述破碎缓冲液的pH可以约为7-8。

在一个优选的实施方案中，所述破碎缓冲液可以为50 mmol/L Tris-HCl。

在一个优选的实施方案中，所述亲和层析可以为镍离子亲和层析，其包括以下步骤：

（1）使结合缓冲液透过层析柱，以活化层析柱；

（2）将所述发酵液或酶液过层析柱，使所述突变体和/或融合蛋白吸附在层析柱上；

（3）采用结合缓冲液冲洗，以去除杂蛋白；

（4）采用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白液。

在一个优选的实施方案中，所述结合缓冲液的pH可以约为7-8。

在一个优选的实施方案中，所述洗脱缓冲液的pH可以约为7-8。

在一个优选的实施方案中，所述结合缓冲液可以为50 mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl中的至少一种。

在一个优选的实施方案中，所述洗脱缓冲液可以为50 mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl和500 mmol/L咪唑中的至少一种。

在一个优选的实施方案中，所述超滤浓缩包括以下步骤：

（1）将所述洗脱蛋白液进行超滤，得到超滤液；

（2）使用脱盐缓冲液对超滤液进行洗涤，得到突变体和/或融合蛋白的纯化液。

在一个优选的实施方案中，所述脱盐包括以下步骤：

（1）使脱盐缓冲液透过脱盐柱，以活化脱盐柱；

（2）将所述洗脱蛋白液过层析柱，使所述突变体和/或融合蛋白在脱盐柱上与盐分离；

（3）采用脱盐缓冲液冲洗，得到突变体和/或融合蛋白的纯化液。

在一个优选的实施方案中，所述脱盐缓冲液的pH可以约为7-8。

在一个优选的实施方案中，所述脱盐缓冲液可以为50 mmol/L Tris-HCl。

本发明提供的突变体及含其的融合蛋白至少具有以下有益效果：

（1）与野生型1，3-PDOR相比，可溶性更高，且热稳定性更好；

（2）比酶活可达野生型1，3-PDOR的3.0倍；

（3）催化效率可达野生型1，3-PDOR的4.7倍。

附图说明

图1为C5和C8蛋白纯化过程中的蛋白SDS-PAGE电泳图。

图2为亲和层析过程中的纯化色谱图。

图3为亲和层析过程中的纯化色谱图的局部放大图。

图4为亲和层析纯化过程中收集的不同样品的SDS-PAGE电泳图。

图5为NADH浓度标准曲线。

图6为C5米氏方程曲线。

图7为C8米氏方程曲线。

具体实施方式

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5%的范围。

本发明中的术语“氨基酸取代”或“氨基酸替换”，是指不同氨基酸替换多肽序列中特定位置的氨基酸，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力，也可使用非天然存在的类似物。

本发明中的术语“蛋白”或“蛋白质”，是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。该术语还包括蛋白质的表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该术语还包括指对天然蛋白质或多肽的氨基酸序列的修饰如缺失、替换、插入后所得的变体。

本发明中的术语“位点”或“位置”，是指蛋白质序列中的位置。在大多数情况下，除非另有说明，位置编号是相对于野生型蛋白质、成熟蛋白质或酶（例如，排除信号肽）的第一个氨基酸的。

本发明中的术语“表达载体”，是指可以在宿主细胞中自主复制的载体，其优选为多拷贝载体。此外，载体通常具有用于选择转化体的抗生素抗性基因等标志物。此外，载体可以具有用于表达引入的基因的启动子和/或终止子。载体可以是例如病毒载体，源自细菌质粒的载体，源自酵母质粒的载体，源自噬菌体的载体，粘粒，噬菌粒等。基因工程载体是指使得目的基因能够在细胞中表达的载体，并通常为包括编码蛋白质或多肽的多核苷酸并且可操作地连接至表达控制序列的直链或环状DNA分子。

本发明中的术语“多核苷酸”，通常指核苷酸（例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸）的聚合物，并且可包括天然存在的（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶）、非天然存在的和经修饰的核酸。

本发明中的术语“氨基酸”，是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一，或人工合成的氨基酸之一。

本发明中的术语“启动子”，是指允许基因转录的通常位于基因上游（朝向有义链的5’区域）的DNA的调节区。启动子包含称为转录因子的蛋白质识别的特定DNA序列和应答元件。

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

所涉及的仪器与试剂分别如表1和表2所示：

表1 仪器列表

表2 试剂列表

实施例1 C5和C8的表达载体构建

C5为野生型1，3-PDOR，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示：

MRMYDFLAPNVNFMGAGAIKLVGERCKILGGKKALIVTDKFLRNMEDGAVAQTVKYIKEAGIDVAFYDDVEPNPKDTNVRDGLKVYRKENCDLIVTVGGGSSHDCGKGIGIAATHEGDLYDYAGIETLTNPLPPIVAVNTTAGTGSEVTRHCVITNTKTKIKFVIVSWRNLPLVSINDPILMIKKPAGLTAATGMDALTHAIESYVSKDANPVTDALAIQAIKLIANNLRQAVALGENLEARENMAYASLLAGMAFNNANLGYVHAMAHQLGGLYDMAHGVANAMLLPHVERYNLISNPKKFADIAEFMGENIEGLSVMEAAEKAIDAMFRLSKDVGIPASLKEMGVNEEDFEYMAKMALKDGNAFSNPRKGNEKDIVKIFREAF。

发明人对C5的序列进行了密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：

ATGCGTATGTACGACTTCCTGGCTCCGAACGTTAACTTCATGGGTGCTGGTGCTATCAAACTGGTTGGTGAACGTTGCAAAATCCTGGGTGGTAAAAAAGCTCTGATCGTTACCGACAAATTCCTGCGTAACATGGAAGACGGTGCTGTTGCTCAGACCGTTAAATACATCAAAGAAGCTGGTATCGACGTTGCTTTCTACGACGACGTTGAACCGAACCCGAAAGACACCAACGTTCGTGACGGTCTGAAAGTTTACCGTAAAGAAAACTGCGACCTGATCGTTACCGTTGGTGGTGGTTCTTCTCACGACTGCGGTAAAGGTATCGGTATCGCTGCTACCCACGAAGGTGACCTGTACGACTACGCTGGTATCGAAACCCTGACCAACCCGCTGCCGCCGATCGTTGCTGTTAACACCACCGCTGGTACCGGTTCTGAAGTTACCCGTCACTGCGTTATCACCAACACCAAAACCAAAATCAAATTCGTTATCGTTTCTTGGCGTAACCTCCCACTGGTAAGCATCAACGACCCGATCCTGATGATCAAAAAACCGGCTGGTCTGACCGCTGCTACCGGTATGGACGCTCTGACCCACGCTATCGAATCTTACGTTTCTAAAGACGCTAACCCGGTTACCGACGCTCTGGCTATCCAGGCTATCAAACTGATCGCTAACAACCTGCGTCAGGCTGTTGCTCTGGGTGAAAACCTGGAAGCTCGTGAAAACATGGCTTACGCTTCTCTGCTGGCTGGTATGGCTTTCAACAACGCTAACCTGGGTTACGTTCACGCTATGGCTCACCAGCTGGGTGGTCTGTACGACATGGCTCACGGTGTTGCTAACGCTATGCTGCTGCCGCACGTTGAACGTTACAACCTGATCTCTAACCCGAAAAAATTCGCTGACATCGCTGAATTCATGGGTGAAAACATCGAAGGTCTGTCTGTTATGGAAGCTGCTGAAAAAGCTATCGACGCTATGTTCCGTCTGTCTAAAGACGTTGGTATCCCGGCTTCTCTGAAAGAAATGGGTGTTAACGAAGAAGACTTCGAATACATGGCTAAAATGGCTCTGAAAGACGGTAACGCTTTCTCTAACCCGCGTAAAGGTAACGAAAAAGACATCGTTAAAATCTTTCGTGAAGCGTTCTAA。

C8为1，3-PDOR突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。发明人对1，3-PDOR序列进行了密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在C5、C8的核苷酸序列的N端加入His标签，进行人工合成，再连接至pET-21a表达载体（酶切位点为Nde I和Xho I），得到重组质粒C5-dhaT-pET-21a和C8-dhaT-pET-21a。

实施例2 C5、C8的蛋白诱导表达

将合成的C5、C8的质粒分别用无菌水溶解，然后分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）。将重组大肠杆菌在固体LB培养基中培养，37℃恒温培养箱中过夜。取12 mL无菌摇菌管，加入2 mL无菌LB培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素），用无菌的移液管枪头挑取已生长的BL21单菌落接种于培养基中，置于恒温摇床过夜培养，培养条件为37℃、180 rpm、5 h（转速和时间可根据菌液浓度做适当调整，OD600>0.5），培养后的菌液可进行甘油保藏（甘油浓度17.5%，配制方法为200 μL 70%甘油+600 μL菌液），放于-80℃冰箱中，或进行下一步诱导。

在250 mL三角瓶中加入50 mL液体LB培养基（提前高温高压灭菌并冷却至室温），加入氨苄青霉素至终浓度为100 μg/mL，接种上述增殖菌液1.5 mL，置于恒温摇床中，在37℃、220 rpm的条件下培养约2.5 h，待其OD600至0.8后，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，30℃过夜培养15 h。

2.1 小量表达鉴定

（1）菌体收集。取5 mL菌液置于1.5 mL离心管中，在4℃、12000 rpm的条件下离心1min收集菌体，作为小量表达鉴定样本。剩余菌液置于50 mL离心管中，在4℃、12000 rpm的条件下离心10 min收集菌体，置于-20℃保存。

（2）菌体重悬及破碎。向5 mL菌液收集的菌体中加入500 μL破碎缓冲液，反复吸打重悬菌体。利用超声波细胞破碎仪破碎菌体（2号探头、功率130W、开2 s/关4 s、超声3min），直至液体呈均一且透光良好后停止破碎。

（3）离心取上清。将破碎后的菌液在4℃、12000 rpm的条件下离心5 min，取上清液。

（4）取上述各步骤的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

电泳鉴定结果显示，C5和C8的实际分子量大小与理论计算值42.66 kDa和42.77kDa较为接近，两个蛋白都能够可溶表达且表达量较高。相比于C5蛋白，C8蛋白的可溶性更高（图1）。在将蛋白样品在60℃条件下加热15 min后，结果显示C8蛋白上清液中目的蛋白含量更高，可见其热稳定性更好（图1）。

实施例3 C5和C8的蛋白纯化

蛋白纯化涉及的试剂如下所示：

破碎缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8；

结合缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Imidazole，pH7.8；

洗脱缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L Imidazole，pH7.8；

脱盐缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8。

3.1 菌体破碎

按每2 mL发酵液加入1 mL破碎缓冲液的比例，往收集的菌体中加入破碎缓冲液并重悬菌体，利用超声波细胞破碎仪破碎菌体（6号探头、功率230W、3 s/6 s、超声15 min），直至液体呈均一且透光良好后停止破碎（即“总”样品）。将破碎后的菌液在4℃、12000 rpm的条件下离心30 min，取上清液（即“上”样品），过0.22 μm水系滤膜，置于冰上备用。用等比例蒸馏水重悬沉淀（即“沉”样品），用于电泳鉴定。

3.2 亲和层析纯化

使用AKTA蛋白纯化仪和镍离子亲和层析柱纯化蛋白，操作流程如下：

（1）将A泵和B泵均放入纯水中，进行泵冲洗；冲洗完成后，设定50%B，流速1 mL/min，安装镍柱；设定流速3 mL/min，冲洗系统至基线平稳；

（2）将A泵换入结合缓冲液中，B泵换入洗脱缓冲液中，进行泵冲洗；冲洗完成后，设定100%B，冲洗系统至基线平稳；

（3）设定100%A，冲洗系统至基线平稳后，调零；

（4）将A泵放入样品中，设定流速2 mL/min，开始上样，直至底部剩余约0.5 mL样品，收集流出的样品，即为穿透液（即“穿”样品）；

（5）用纯水清洗A泵泵头，将A泵放回结合缓冲液中，设定流速3 mL/min，冲洗杂蛋白至基线平稳；

（6）设定8%B，冲洗杂蛋白至基线平稳，并收集洗脱峰样品（即“8%B”样品）；

（7）设定流速5 mL/min，设定线性洗脱条件：8%-50%B，60 mL，并收集洗脱峰样品（即“Ni纯”样品）；

（8）设定100%B，冲洗系统至基线平稳；

（9）将A泵和B泵均放入纯水中，进行泵冲洗，冲洗完成后，设定50%B，冲洗系统至基线平稳；

（10）将A泵和B泵均放入20%乙醇中，冲洗系统至基线平稳后，拆掉镍柱并关闭系统。

亲和层析的纯化色谱结果显示，随着洗脱缓冲液中咪唑浓度的逐渐增大，目的蛋白C5和C8逐渐被洗脱下来，收集洗脱下来的目的蛋白，用于后续超滤浓缩与脱盐（图2和图3）。将纯化过程蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示纯化后C5和C8两个蛋白条带均较单一，杂蛋白较少，说明纯化得到的目的蛋白纯度较高（图4）。在亲和层析纯化过程中，8%B即可洗脱下来大部分蛋白，C5蛋白约1/10留在穿透液中，C8蛋白还有约1/4留在穿透液中，说明C5和C8两个蛋白的挂柱能力较弱（图4）。

3.3 超滤浓缩

用10 KDa超滤管将纯化后的蛋白溶液进行超滤浓缩，超滤条件设置为：4℃、3000×g，超滤至约1.5 mL。加入脱盐缓冲液，稀释约8倍，再次超滤浓缩，如此反复冲洗蛋白3次以上，以充分洗净溶液中的NaCl和咪唑，最后一遍超滤至约3 mL。

3.4 蛋白浓度测定

按照赛默飞BCA蛋白定量试剂盒说明书建立蛋白浓度标准曲线，同时测定超滤浓缩后的目的蛋白浓度。根据BCA蛋白浓度标准曲线，将测得的样品OD562代入标准曲线方程，计算得到C5摇瓶发酵并纯化的蛋白得率为104.27 mg/L发酵液，C8摇瓶发酵并纯化的蛋白得率为74.87 mg/L发酵液。

实施例4 酶活和酶催化效率测定

主要试剂配制：

1 mol/L KHCO₃-K₂CO₃缓冲液：分别配制1 mol/L KHCO₃和1 mol/L K₂CO₃，将两个组分按2：1的比例进行调配，在25℃下用pH测量计测定pH，直至调配pH为9.5；

5×Reation Buffer（500 mmol/L KHCO₃-K₂CO₃，150 mmol/L (NH₄)₂SO₄，pH 9.5）：配制300 mmol/L (NH₄)₂SO₄，然后取20 mL 300 mmol/L (NH₄)₂SO₄与20 mL 1 mol/L KHCO₃-K₂CO₃缓冲液，按1：1混合；

10 mmol/L NADH溶液：称取7.1 mg还原性辅酶Ⅰ二钠盐（即NADH），加入pH 7.8，1mL 10 mmol/L Tris-HCl（可超声使其充分溶解）；

10 mmol/L NAD+溶液：称取6.6 mg β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（即NAD+），加入pH7.8，1 mL 10 mmol/L Tris-HCl（可超声使其充分溶解）。

4.1 建立NADH标准曲线

将5×Reation Buffer稀释为1×Reation Buffer后，用1×Reation Buffer将NADH溶液进行梯度稀释（0、0.03、0.06、0.11、0.22、0.45、0.6 mmol/L），分别取200 μL加入96孔板中，每个梯度做3个重复。用酶标仪测定其在340 nm下的吸光度，建立NADH浓度标准曲线（图5）。该曲线方程为：y=3.695x+0.1036，R²=1。

4.2 酶活测定

表3 酶活测试反应体系

表4 酶活测试反应程序

用pH 7.8，10 mmol/L Tris-HCl分别将C5和C8纯酶进行梯度稀释，其中C5设置梯度400、500、600、700、800、900、1000、1100 nmol/L，C8设置梯度200、250、300、350、400、450、500、550 nmol/L。按照表3进行反应体系配制，按照表4进行反应程序设置，用八排枪加酶，吹打一次混匀后，立即检测（延迟时间越长，误差越大），重复实验三次。一个酶活单位（Unit）定义为1 min产生1 μmol NADH所需的酶量。分别计算C5和C8的酶活。结果显示C5的比酶活浓度约为5.94 U/mg，C8比酶活浓度约为17.85 U/mg，C8酶的比酶活约为C5酶的3.0倍。

4.3 酶催化效率测定

表5K_m值测定反应体系

用ddH₂O对1，3-PDO进行梯度稀释（12.5、25、50、100、200、300、400、500 mmol/L），按照表5进行反应体系配制，按照表4进行反应程序设置，用八排枪加1，3-PDO，吹打一次混匀后，立即检测，重复实验三次。其中C5和C8酶的终浓度分别为140 nmol/L和60 nmol/L。

米氏方程（Michaelis-Menten方程）v₀=V_max[S]/(K_m+[S])，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中K_m值称为米氏常数，V_max是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。根据上述测得的数据建立C5和C8米氏方程曲线分别如图6和图7所示，根据米氏方程曲线可知，酶催化效率测定结果如表6所示，其中K_cat= V_max/[E₀]，[E₀]为酶初始浓度。结果显示，C8酶的K_cat/K_m值是C5酶的4.7倍，说明C8酶对底物1，3-PDO的催化效率更高。

表6 酶催化效率测定结果

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种1，3-丙二醇氧化还原酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种编码根据权利要求1所述的突变体或根据权利要求2所述的融合蛋白的多核苷酸。

4.一种包含根据权利要求3所述的多核苷酸的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET表达载体。

7.一种包含权利要求4-6中任一所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

9.根据权利要求1所述的突变体、根据权利要求2所述的融合蛋白、根据权利要求3所述的多核苷酸、根据权利要求4-6中任一所述的表达载体或根据权利要求7-8中任一所述的宿主细胞在制备1，3-丙二醇中的应用。

10.一种利用根据权利要求1所述的突变体、根据权利要求2所述的融合蛋白或根据权利要求7-8中任一所述的宿主细胞制备1，3-丙二醇的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：