CN116410945A

CN116410945A - 一种酮还原酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN116410945A
Application number: CN202111673893.2A
Authority: CN
Inventors: 王舒; 高文君; 孙传民; 焦琦; 徐文选; 程占冰; 田振华
Original assignee: Ecolab Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Ecolab Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-07-11

Abstract

本发明公开了一种酮还原酶突变体及其应用。所述酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相比，存在第154位氨基酸残基差异；以及，第199位氨基酸残基差异，和/或第203位氨基酸残基差异。本发明还公开了编码所述酮还原酶突变体的核酸、包含所述核酸的重组表达载体以及包含所述核酸或重组表达载体的转化体。本发明还公开了所述酮还原酶突变体的制备方法、包含所述酮还原酶突变体的催化剂。本发明还公开了一种利用所述酮还原酶突变体制备(R)‑1,3‑丁二醇的方法及其应用。本发明所述酮还原酶突变体的酶活性高、立体选择性高、工艺成本更低，用其制备(R)‑1,3‑丁二醇时，在保持较高的转化率和光学纯度的同时，所能够催化的底物浓度更高。

Description

一种酮还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种酮还原酶突变体及其应用。

背景技术

1,3-丁二醇(1,3-BDO)通常被用作为食品调味剂的有机溶剂，还可用作具有多种用途的化学品，例如保湿剂、树脂原料、表面活性剂、吸湿剂和溶剂等，以及作为它们的原材料而具有利用价值。它的光学活性分子(R)-1,3-丁二醇和(S)-1,3丁二醇也可用作医药、农药等的合成原料而具有利用价值。其中(R)-1,3-丁二醇被广泛地用于碳青霉烯类抗生素母核氮杂环丁酮、香料、信息激素和杀虫剂等物质的合成。(R)-1,3-丁二醇(1,3-BDO)的结构如下所示：

(R)-1,3-丁二醇可由4-羟基-2-丁酮经酶催化制得，国内外相关报道如下：

US5219757中公开了很多种微生物催化4-羟基-2-丁酮制备光学纯的1,3-丁二醇，其中利用乳酸克鲁维酵母Kluvermyces lactis IFO 1267可以制得(R)-1,3-丁二醇，其产率达到98％，光学纯度达到93％。其光学纯度还有待提高。

Adv.Synth.Catal.2019,361,3182-3190中报道了Thermoanaerobacter brockii来源的醇脱氢酶(又称酮还原酶，TbSADH)突变体T15(A85G-I86L)可以催化4-羟基-2-丁酮得到(R)-1,3-丁二醇，其产率达到99％，光学纯度达到99％。但是反应中底物浓度只有10mM，达不到工业生产的需要。

CN102625846B公布了有1,3-丁二醇通路的微生物，包括4-羟基-2-丁酮还原酶(基因名称：bdh，Genbank ID号：AAA58352.1)，其在丙氨酸到1,3-BDO的通路中，催化还原4-羟基-2-丁酮合成1,3-丁二醇，其合成路径如下所示：

其中并未给出产物的光学纯度以及转化效率等数据。

CN109749968A公布了一种能够以4-羟基-2-丁酮为底物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)菌株SWGC31011，保藏编号为CGMCCNo.13354，合成途径是该菌株利用本身表达的羰基还原酶催化还原4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇，产物光学纯度达到100％，转化效率大于95％，但是底物浓度只有5～45g/L。且此方法为微生物活细胞的催化方法，在工业生产中，催化反应过程难以控制。

发明内容

针对现有技术中酶催化4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇方法中所催化的底物浓度较低等问题，提供了一种酮还原酶突变体、将其用于催化4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇的方法及其应用。

本发明人通过对催化4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇时酶活较低的酮还原酶——Leifsonia sp.S749来源的(GenBank:BAD99642.1)酮还原酶进行突变，意外获得了高活性的酮还原酶突变体，将其用于催化4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇时，4-羟基-2-丁酮的转化率可达99％以上，(R)-1,3-丁二醇ee值可达99％以上，并且所能够催化的底物浓度很高，可达150g/L以上。

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种酮还原酶突变体，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相比，存在第154位氨基酸残基差异；以及，第199位氨基酸残基差异，和/或第203位氨基酸残基差异。

在本发明的一些具体实施例中，所述第154位氨基酸残基差异选自S154M、S154H和S154K；所述第199位氨基酸残基差异选自L199R和L199Y；所述第203位氨基酸残基差异选自A203G、A203H和A203N。

在本发明的一些具体实施例中，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示。

在本发明的一些具体实施例中，编码所述酮还原酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22所示。

为解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种分离的核酸，所述核酸编码如本发明第一方面所述的酮还原酶突变体。

为解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种包含如本发明第二方面所述的核酸的重组表达载体。

所述重组表达载体的骨架可为本领域常规，在本发明一具体实施例中，所述重组表达载体的骨架为质粒pET21a。

为解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种转化体，其为在宿主中导入如本发明第二方面所述的核酸或如本发明第三方面所述的重组表达载体。按照本领域常规，所述宿主为大肠杆菌。

在本发明的一些具体实施例中，所述宿主为大肠杆菌BL21。

为解决上述技术问题，本发明第五方面提供了一种酮还原酶突变体的制备方法，其包括如下步骤：培养如本发明第四方面所述的转化体，从培养物中获得酮还原酶突变体。

为解决上述技术问题，本发明第六方面提供了一种酮还原酶突变体催化剂，其包括从如本发明第五方面所述的方法中所述的培养物中获得的含酮还原酶突变体的菌体，或者用其加工的制品；所述制品是指通过对所述菌体中的酮还原酶突变体进行均质、分离或纯化得到的产品，或通过固定化所述产品而得到的固定化制品。

为解决上述技术问题，本发明第七方面提供了一种(R)-1,3-丁二醇的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在反应溶剂、如本发明第一方面所述的酮还原酶突变体或如本发明第六方面所述的酮还原酶突变体催化剂、以及还原型辅酶NADPH/NADH的存在下，将底物4-羟基-2-丁酮进行还原反应，即得(R)-1,3-丁二醇。

在本发明一具体实施例中，所述的反应溶剂为水。

在本发明的一些具体实施例中，所述底物4-羟基-2-丁酮的浓度为20～300g/L。

在本发明的优选实施例中，所述底物4-羟基-2-丁酮的浓度为86g/L，150g/L。

在本发明的一些具体实施例中，所述含酮还原酶突变体的菌体与所述底物4-羟基-2-丁酮的质量比为0.1:1～1:1。

在本发明的优选实施例中，所述含酮还原酶突变体的菌体与所述底物4-羟基-2-丁酮的质量比为0.3:1～0.5:1。

在本发明的一些具体实施例中，所述还原型辅酶NADPH/NADH的质量与所述底物4-羟基-2-丁酮的质量比为1:10000～1:10。

在本发明的优选实施例中，所述还原型辅酶NADPH/NADH的质量与所述底物4-羟基-2-丁酮的质量比为1:1000。

在本发明的一些具体实施例中，所述的还原反应的反应体系的pH为6～8。

在本发明的优选实施例中，所述的还原反应的反应体系的pH为7；

在本发明的一些具体实施例中，所述的还原反应的反应体系的温度为20～45℃。

在本发明的优选实施例中，所述的还原反应的反应体系的温度为30℃，40℃。

在本发明的一些具体实施例中，还包括在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NADP+/NAD+进行还原反应，得到所述还原型辅酶NADPH/NADH的步骤。

在本发明的较佳实施例中，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；和/或，所述供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐。

在本发明的更佳实施例中，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。

在本发明的一些具体实施例中，所述供氢体的摩尔量与所述底物4-羟基-2-丁酮的摩尔量比为：1:1～5:1。

在本发明的优选实施例中，所述供氢体的摩尔量与所述底物4-羟基-2-丁酮的摩尔量比为：2.5:1，1.3:1。

在本发明的一些具体实施例中，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶、所述的供氢体为异丙醇时，本发明的酮还原酶突变体可以同时实现辅酶的循环，不需要额外地添加能使辅酶循环的酶，其原理如图7所示。

在本发明的一些具体实施例中，当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、所述的供氢体为葡萄糖时，其实现辅酶循环的原理如图8所示。

所述葡萄糖脱氢酶可为本领域常规，在本发明一具体实施例中，所述葡萄糖脱氢酶NCBI登录号为NP_388275.1。

在本发明的优选实施例中，所述葡萄糖脱氢酶的浓度为100～1000U/mL，例如168U/mL。

为解决上述技术问题，本发明第八方面提供了一种如本发明第一方面所述的酮还原酶突变体在制备(R)-1,3-丁二醇中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述的酮还原酶突变体的酶活性高，立体选择性高，工艺成本更低。将本发明所述的酶用于催化4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇时，在保持较高的转化率和光学纯度的同时，所能够催化的底物浓度更高。

附图说明

图1为底物4-羟基-2-丁酮对照品GC图谱，4-羟基-2-丁酮对照品的保留时间为6.848min。

图2为产物(R)-1,3-丁二醇对照品GC图谱，(R)-1,3-丁二醇的保留时间为7.549min。

图3为实施例3中Enz.10反应液GC转化率检测图谱。

图4为1,3-丁二醇二乙酸酯消旋体对照品HPLC手性图谱，(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯的保留时间为7.727min，(S)-1,3-丁二醇二乙酸酯的保留时间为8.904min。

图5为(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯对照品HPLC手性图谱，(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯的保留时间为7.710min。

图6为实施例3中Enz.10反应液中产物(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯ee值检测图谱。

图7显示了实施例3中当供氢体为异丙醇时，酮还原酶突变体可以同时实现辅酶的循环。

图8显示了实施例5中当供氢体为葡萄糖时，酮还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶实现辅酶的循环。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。

表1

所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。

表2

感受态细胞E.coli BL21(DE3)采购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；4-羟基-2-丁酮来源于陕西精化快车生物科技有限公司，消旋体1,3-丁二醇采购自上海麦克林生化科技有限公司，(R)-1,3-丁二醇对照品采购自杭州馨海生物科技有限公司。

转化率＝(反应物-剩余反应物)/反应物×100％(反应物：4-羟基-2-丁酮)。

GC转化率分析方法：

色谱柱：DB-1；进样口温度：220℃；检测器温度：270℃；分流比：30:1；进样体积：0.5μl；柱流速：1mL/min；升温程序：100℃保持3min，以15℃/min的速率升温至230℃，保持10min；运行时间：21.7min；氢气流速：30mL/min；空气流速：300mL/min；尾吹流量：25mL/min。

HPLC手性分析方法：

色谱柱：Daicel Chiralpak IG(4.6mm*250mm,5μm)；流动相：正己烷：乙醇＝90:10；检测波长：210nm；流速：0.8mL/min；进样体积：10μl；柱温：25℃；运行时间：20min。

实施例1 KRED酶的获取

根据已报道的酮还原酶Enz.01和Enz.02的氨基酸序列：SEQ ID NO:1(Adv.Synth.Catal.2019,361,3182–3190上突变体T15)、SEQ ID NO:3(NCBI登录号为BAD99642.1)按照大肠杆菌密码子偏爱优化编码基因，全基因合成，酶切位点NdeI、HindIII，连入载体pET21a(生工生物工程(上海)股份有限公司)。将合成的酮还原酶基因转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有酮还原酶基因的工程菌株。

同样地，将表1中工程化得到的列在表3中的酮还原酶Enz.03-Enz.011的基因(SEQID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22)，按照大肠杆菌密码子偏爱优化，全基因合成，酶切位点NdeI、HindIII，连入载体pET21a(生工生物工程(上海)股份有限公司)。含有酮还原酶基因的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有酮还原基因的工程菌株。

将含有酮还原酶基因的工程菌分别在平皿划线活化后，挑单菌落接种装有150mLTB培养基的摇瓶，37℃培养至OD600值0.5左右，降温至30℃，加入终浓度0.1mM IPTG诱导，过夜培养。培养液4000rpm离心20min，去上清，留菌体，加入30mL PBS(50mM pH7.0)，4℃低温冷循均质，4000rpm离心20分钟后，取上清酶液酶活测定。

酶活定义：在pH7.0，25℃下，每分钟生成1μmol R-1,3-丁二醇所需的酶量为1个酶活力单位(1U)。

酶活测定方法：

200μl反应体系，加入4-羟基-2-丁酮和NADH的50mM pH7.0 PBS溶液共180μl，其中4-羟基-2-丁酮终浓度10mM，NADH终浓度1mM，再加入合理稀释的酶液20μl。连续检测340nm的吸光值变化，做出反应动力学曲线，计算酶活。

表3

由上表可以看出，相比于已报道的酮还原酶Enz.01和Enz.02，本发明中的酮还原酶突变体Enz.05、Enz.06、Enz.09、Enz.10、Enz.11的酶活显著提高。

实施例2酮还原酶催化4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇

实施例1中制得的含有酮还原酶基因的工程菌的菌体用0.1M PBS 7.0按照1:4(M/V,g/mL)均质，均质后加入2-4‰的絮凝剂絮凝，备用。

50mL反应容器中，加入20mL 0.1M PBS7.0缓冲液，2mL酶液，20mg NAD⁺，2.6mL的异丙醇，1g的4-羟基-2丁酮，30℃下反应。检测结果见表4。

表4

酶编号	突变位点	4H转化率	16H转化率	ee值
					Enz.01	无	45％	67％	92.6
Enz.02	无	19％	41％	/
					Enz.03	Enz.02-S154R/L199I	23％	46％	/
Enz.04	Enz.02-S154W/L199T	10％	37％	/
					Enz.05	Enz.02-S154M/L199R	61％	84％	>99
Enz.06	Enz.02-S154H/L199Y	56％	85％	>99
					Enz.07	Enz.02-S154W/A203E	10％	40％	/
Enz.08	Enz.02-S154W/A203G	13％	51％	/
					Enz.09	Enz.02-S154K/A203G	72％	85％	>99
Enz.10	Enz.02-S154K/A203H	66％	88％	>99
					Enz.11	Enz.02-S154K/A203N	72％	84％	>99

“/”表示因其转化率较低故未检测。

结果显示，经初步筛选Enz.05、Enz.06、Enz.09、Enz.10、Enz.11催化效果较好。

实施例3Enz.05、Enz.06、Enz.09、Enz.10、Enz.11催化4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇

实施例1中制得的含有Enz.05、Enz.06、Enz.09、Enz.10、Enz.11的工程菌的菌体用0.1M PBS 7.0按照1:4均质(M/V,g/mL)，均质后加入2-4‰的絮凝剂絮凝，备用。

2L反应釜中加入750mL水，130g(2eq)的异丙醇和絮凝好的酶液200mL，100mg的NAD⁺，20％的碳酸钠控制pH在7.0-7.5之间，100g 4-羟基-2丁酮流加到反应液中，4h-5h内完成流加。反应到8-10h转化率达到60％-70％，开始通气(通气量1100mL/min)，通气6h后补加40g(0.5eq)的异丙醇，反应24h后结束反应。检测转化率、产品用乙酸酐酯化为(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯后检测ee值见下表5。

表5

酶编号	突变位点	24H转化率	ee值(％)
				Enz.05	S154M/L199R	>99％	>99
Enz.06	S154H/L199Y	>99％	>99
				Enz.09	S154K/A203G	>99％	>99
Enz.10	S154K/A203H	>99％	>99
				Enz.11	S154K/A203N	>99％	>99

底物4-羟基-2-丁酮对照品GC图谱见图1，4-羟基-2-丁酮对照品的保留时间为6.848min。

产物(R)-1,3-丁二醇对照品GC图谱见图2，(R)-1,3-丁二醇的保留时间为7.549min。

以Enz.10为例，转化率检测图谱见图3，其中7.687min为1,3-丁二醇的出峰位置，6.604min为4-羟基-2-丁酮的出峰位置。

1,3-丁二醇二乙酸酯消旋体对照品HPLC手性图谱见图4，(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯的保留时间为7.727min，(S)-1,3-丁二醇二乙酸酯的保留时间为8.904min。

(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯对照品HPLC手性图谱见图5，保留时间为7.710min。

以Enz.10为例，反应液中产物(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯ee值检测图谱见图6，ee值为99.42。

由此可知，该实施例中产物乙酸酯的出峰时间与对照品(R)-1,3-丁二醇二乙酸酯的出峰时间一致，说明该实施例制备得到(R)-1,3-丁二醇。

虽然上述结果图均以Enz.10为例，但是发明人进行了所有其他突变的实验，也均验证了本发明的这些突变在参与上述反应时能够催化底物，并且均生成了正确的产物。

此外，由以上数据可以看出，上述的酮还原酶突变体Enz.05、Enz.06、Enz.09、Enz.10、Enz.11还可以同时实现辅酶的循环，不需要额外地添加能使辅酶循环的酶(如图7所示)。

实施例4葡萄糖脱氢酶的制备

根据来源于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168(NCBI登录号为NP_388275.1)的葡萄糖脱氢酶基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司全合成葡萄糖脱氢酶基因。

葡萄糖脱氢酶基因连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌株。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，121℃灭菌20min，4℃储存。

将含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50mL同样含50μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。

葡萄糖脱氢酶的酶活测定

将收集到的菌体取10g，重悬于50mL 0.1M pH7.5磷酸钠缓冲液中，高压均质破碎，得到葡萄糖脱氢酶粗酶液，往粗酶液中缓慢滴加终浓度为3‰的絮凝剂，搅拌10min，4000rpm离心20min取上清酶液，4℃保存，待用。

酶活检测方法：1mL反应体系，25℃条件下，先加880μL的pH 7.0 0.1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含葡萄糖400mM)，再加100μL 25mM的NADP⁺溶液，最后加20μL稀释了200倍的酶液，紫外分光光度计测定340nm处OD值。

单位酶活定义：在特定反应条件(25℃，pH 7.0)下，每分钟产生1μmoL NADPH所需要的酶量。

测得NCBI登录号为NP_388275.1的葡萄糖脱氢酶酶活为2240.23U/mL。

实施例5 Enz.05、Enz.06、Enz.09、Enz.10、Enz.11催化4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇

将90g实施例1中制得的含有Enz.05、Enz.06、Enz.09、Enz.10、Enz.11的工程菌的菌体和30g实施例4制备的葡萄糖脱氢酶的菌体加水按照1:4(M/V,g/mL)均质。均质压力在650-750MPa左右，均质两遍，得KRED酶和葡萄糖脱氢酶混合粗酶液。

混合粗酶液中加入797g(1.3eq)葡萄糖，1.5g NAD⁺，调节pH在6.5-7.5之间，加入300g的4-羟基-2-丁酮，加水至2L，40℃下反应(反应原理如图8所示)。每隔两小时取样一次检测转化率。

取样方式：取500μL加入氯化钠使之饱和，加入1.5mL的正丁醇萃取，取正丁醇相加入无水硫酸钠后过滤，GC检测转化率。检测转化率、ee值如表6所示。

表6

SEQUENCE LISTING

<110> 弈柯莱生物科技（上海）股份有限公司

<120> 一种酮还原酶突变体及其应用

<130> P20013682C

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 352

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.01 氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu

1 5 10 15

Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

20 25 30

Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala

35 40 45

Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

50 55 60

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg

65 70 75 80

Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln

85 90 95

Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe

100 105 110

Ser Asn Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp

115 120 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala

130 135 140

Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys

195 200 205

Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu

210 215 220

Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val

245 250 255

Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu

260 265 270

Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

275 280 285

Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg

290 295 300

Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val

305 310 315 320

Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu

325 330 335

Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala

340 345 350

<210> 2

<211> 1066

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.01 核苷酸序列

<400> 2

catatgaaag gttttgcaat gctgagcatt ggtaaagttg gttggattga aaaagaaaaa 60

ccggcaccgg gtccgtttga tgcaattgtt cgtccgctgg cagtggcgcc gtgtaccagc 120

gatattcata ccgtttttga aggcgccatt ggtgaacgcc ataatatgat tctgggtcat 180

gaagcagtgg gcgaagttgt tgaagttggt agcgaagtta aagattttaa accgggtgat 240

cgtgtggttg ttccggcaat taccccggat tggcgcacca gcgaagttca gcgcggttat 300

catcagcata gcggtggtat gctggcaggt tggaaattta gtaatgtgaa agatggcgtt 360

tttggtgaat ttttccatgt taatgatgca gatatgaatc tggcccatct gccgaaagaa 420

attccgctgg aagcagcagt tatgattccg gatatgatga ccaccggttt tcatggtgca 480

gaactggccg atattgaact gggtgccacc gttgccgttc tgggtattgg tccggttggt 540

ctgatggcag tggcaggtgc caaactgcgt ggcgctggcc gtattattgc agttggtagc 600

cgcccggttt gtgtggatgc cgccaaatat tatggtgcaa ccgatattgt taattataaa 660

gatggcccga ttgaaagcca gattatgaat ctgaccgaag gcaaaggtgt ggatgcggca 720

attattgccg gtggtaatgc cgatattatg gcaaccgcag tgaaaattgt taaaccgggt 780

ggtaccattg caaatgttaa ttattttggt gaaggtgaag tgctgccggt tccgcgtctg 840

gaatggggtt gtggtatggc acataaaacc attaaaggtg gcctgtgtcc gggtggtcgt 900

ctgcgtatgg aacgtctgat tgatctggtg ttttataaac gtgttgatcc gagcaaactg 960

gtgacccatg tttttcgtgg ttttgataat attgaaaaag catttatgct gatgaaagat 1020

aaaccgaaag atctgattaa accggttgtt attctggcct aagctt 1066

<210> 3

<211> 251

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.02 氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ser Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Ala Leu Ala Phe Leu Glu

195 200 205

Gly Lys His Ala Leu Gly Arg Leu Gly Glu Pro Glu Glu Val Ala Ser

210 215 220

Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser Asp Ala Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser

225 230 235 240

Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 4

<211> 765

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.02 核苷酸序列

<400> 4

catatggcac agtatgacgt ggccgaccgt agtgcaattg ttaccggtgg tggtagcggt 60

attggtcgtg cagtggcact gacactggcc gcaagcggtg cagcagtgct ggtgaccgat 120

ttaaacgaag agcatgccca agctgttgtg gccgaaattg aagccgctgg tggtaaagcc 180

gccgcactgg ctggtgacgt taccgatccg gcctttggcg aagcaagcgt ggctggtgca 240

aatgctttag ccccgctgaa gattgccgtg aacaatgctg gtattggcgg tgaagccgcc 300

accgtgggtg attactcttt agatagctgg cgcacagtga tcgaggtgaa tttaaatgcc 360

gtgttctacg gcatgcaacc gcagctgaaa gccatggcag ccaacggtgg cggcgcaatt 420

gttaatatgg caagtattct gggcagcgtt ggctttgcca acagcagcgc ctatgtgacc 480

gccaaacatg cactgctggg tctgacccaa aacgccgctt tagaatatgc agccgataaa 540

gtgcgcgtgg tggcagttgg cccgggtttt attcgcaccc ctctggtgga agccaattta 600

agcgcagatg cactggcctt tctggagggt aaacatgctt taggtcgtct gggtgaaccg 660

gaagaagtgg ccagtctggt tgcctttctg gccagcgatg ccgccagctt tatcaccggc 720

agctaccatc tggttgacgg cggttataca gcccagtaac tcgag 765

<210> 5

<211> 205

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.03 氨基酸序列

<400> 5

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Arg Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Ile Ser Ala Asp Ala Leu Ala

195 200 205

<210> 6

<211> 610

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.03 核苷酸序列

<400> 6

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaacc gcagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caatattagc 600

gcagatgcac 610

<210> 7

<211> 205

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.04 氨基酸序列

<400> 7

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Trp Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Thr Ser Ala Asp Ala Leu Ala

195 200 205

<210> 8

<211> 610

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.04 核苷酸序列

<400> 8

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaact ggagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caataccagc 600

gcagatgcac 610

<210> 9

<211> 205

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.05 氨基酸序列

<400> 9

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Met Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Arg Ser Ala Asp Ala Leu Ala

195 200 205

<210> 10

<211> 610

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.05 核苷酸序列

<400> 10

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaaca tgagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caatcgcagc 600

gcagatgcac 610

<210> 11

<211> 205

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.06 氨基酸序列

<400> 11

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn His Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Tyr Ser Ala Asp Ala Leu Ala

195 200 205

<210> 12

<211> 610

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.06 核苷酸序列

<400> 12

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaacc atagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caattatagc 600

gcagatgcac 610

<210> 13

<211> 210

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.07 氨基酸序列

<400> 13

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Trp Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Glu Leu Ala Phe Leu Glu

195 200 205

Gly Lys

210

<210> 14

<211> 613

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.07 核苷酸序列

<400> 14

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaact ggagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caatttaagc 600

gcagatgagc tgg 613

<210> 15

<211> 210

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.08 氨基酸序列

<400> 15

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Trp Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Gly Leu Ala Phe Leu Glu

195 200 205

Gly Lys

210

<210> 16

<211> 613

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.08 核苷酸序列

<400> 16

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaact ggagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caatttaagc 600

gcagatggtc tgg 613

<210> 17

<211> 210

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.09 氨基酸序列

<400> 17

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Lys Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Gly Leu Ala Phe Leu Glu

195 200 205

Gly Lys

210

<210> 18

<211> 613

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.09 核苷酸序列

<400> 18

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaaca aaagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caatttaagc 600

gcagatggtc tgg 613

<210> 19

<211> 210

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.10 氨基酸序列

<400> 19

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Lys Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp His Leu Ala Phe Leu Glu

195 200 205

Gly Lys

210

<210> 20

<211> 613

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.10 核苷酸序列

<400> 20

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaaca aaagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caatttaagc 600

gcagatcatc tgg 613

<210> 21

<211> 210

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.11 氨基酸序列

<400> 21

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Lys Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Asn Leu Ala Phe Leu Glu

195 200 205

Gly Lys

210

<210> 22

<211> 613

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.11 核苷酸序列

<400> 22

atggcacagt atgacgtggc cgaccgtagt gcaattgtta ccggtggtgg tagcggtatt 60

ggtcgtgcag tggcactgac actggccgca agcggtgcag cagtgctggt gaccgattta 120

aacgaagagc atgcccaagc tgttgtggcc gaaattgaag ccgctggtgg taaagccgcc 180

gcactggctg gtgacgttac cgatccggcc tttggcgaag caagcgtggc tggtgcaaat 240

gctttagccc cgctgaagat tgccgtgaac aatgctggta ttggcggtga agccgccacc 300

gtgggtgatt actctttaga tagctggcgc acagtgatcg aggtgaattt aaatgccgtg 360

ttctacggca tgcaaccgca gctgaaagcc atggcagcca acggtggcgg cgcaattgtt 420

aatatggcaa gtattctggg cagcgttggc tttgccaaca aaagcgccta tgtgaccgcc 480

aaacatgcac tgctgggtct gacccaaaac gccgctttag aatatgcagc cgataaagtg 540

cgcgtggtgg cagttggccc gggttttatt cgcacccctc tggtggaagc caatttaagc 600

gcagataacc tgg 613

Claims

1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ IDNO:3相比，存在第154位氨基酸残基差异；以及，

第199位氨基酸残基差异，和/或第203位氨基酸残基差异。

2.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述第154位氨基酸残基差异选自S154M、S154H和S154K；所述第199位氨基酸残基差异选自L199R和L199Y；所述第203位氨基酸残基差异选自A203G、A203H和A203N。

3.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示。

4.如权利要求3所述的酮还原酶突变体，其特征在于，编码所述酮还原酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22所示。

5.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～4任一项所述的酮还原酶突变体。

6.一种包含如权利要求5所述的核酸的重组表达载体；

较佳地，所述重组表达载体的骨架为质粒pET21a。

7.一种转化体，其为在宿主中导入如权利要求5所述的核酸或如权利要求6所述的重组表达载体；

较佳地，所述宿主为大肠杆菌；优选大肠杆菌BL21。

8.一种酮还原酶突变体的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求7所述的转化体，从培养物中获得酮还原酶突变体。

9.一种酮还原酶突变体催化剂，其包括从如权利要求8所述的方法中所述的培养物中获得的含酮还原酶突变体的菌体，或者用其加工的制品；所述制品是指通过对所述菌体中的酮还原酶突变体进行均质、分离或纯化得到的产品，或通过固定化所述产品而得到的固定化制品。

10.一种(R)-1,3-丁二醇的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：在反应溶剂、如权利要求1～4任一项所述的酮还原酶突变体或如权利要求9所述的酮还原酶突变体催化剂、以及还原型辅酶NADPH/NADH的存在下，将底物4-羟基-2-丁酮进行还原反应，即得(R)-1,3-丁二醇；

优选地，所述的反应溶剂为水。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述底物4-羟基-2-丁酮的浓度为20～300g/L；所述浓度优选86g/L，150g/L；

和/或，所述含酮还原酶突变体的菌体与所述底物4-羟基-2-丁酮的质量比为0.1:1～1:1；优选为0.3:1～0.5:1；

和/或，所述还原型辅酶NADPH/NADH的质量与所述底物4-羟基-2-丁酮的质量比为1：10000～1:10；优选为1:1000；

和/或，所述的还原反应的反应体系的pH为6～8，优选为7；

和/或，所述的还原反应的反应体系的温度为20～45℃，优选为30℃，40℃。

12.权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于，还包括在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NADP⁺/NAD⁺进行还原反应，得到所述还原型辅酶NADPH/NADH的步骤；

较佳地，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；和/或，所述供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐；

更佳地，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐；

进一步更佳地，所述供氢体的摩尔量与所述底物4-羟基-2-丁酮的摩尔量比为：1:1～5:1，优选2.5:1，1.3:1。

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶NCBI登录号为NP_388275.1；

较佳地，所述葡萄糖脱氢酶的浓度为100～1000U/mL，例如168U/mL。

14.一种如权利要求1～4任一项所述的酮还原酶突变体在制备(R)-1,3-丁二醇中的应用。