CN112795586B

CN112795586B - 羧酸还原酶重组质粒及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN112795586B
Application number: CN202110096419.1A
Authority: CN
Inventors: 欧阳嘉; 陶渊明; 邹丽花; 郑兆娟
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2041-01-25
Also published as: CN112795586A

Abstract

本发明公开一种羧酸还原酶重组质粒，该重组质粒通过将羧酸还原酶基因和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因连接到pRSFDuet‑1载体上得到。本发明进一步提出了包含该重组质粒的重组菌，并进一步利用该重组菌生产羧酸还原酶SrCAR并应用于1，2‑丙二醇生产。本发明实现了生物制备1，2‑丙二醇的高效合成途径，具有很高的应用前景，利用上述羧酸还原酶SrCAR催化葡萄糖产1，2‑丙二醇，在未对大肠杆菌菌株进行基因敲除的情况下，4h得到的1，2‑丙二醇产量是文献报道利用含有羧酸还原酶MavCAR的基因敲除大肠杆菌菌株合成1，2‑丙二醇产量的4‑5倍。

Description

羧酸还原酶重组质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物技术领域，具体涉及羧酸还原酶重组质粒及其构建方法和应用。

背景技术

传统化学法催化羧酸到醛的还原反应，不仅需要贵金属作为催化剂，而且存在反应条件极端、对相邻官能团的耐受性差、产生副反应等缺点。羧酸还原酶(Carboxylic acidreductase,CAR,EC 1.2.1.30和EC 1.2.1.31)是一类广泛分布于细菌、真菌及部分植物体内的多功能酶，可高效催化由羧酸到醛的化学反应，利用羧酸还原酶生物还原羧酸为相应醛，不仅反应条件温和、底物谱宽泛、针对性强，可专一识别羧酸基团，还能解决化学合成法产生的环保压力和能源问题，显著降低生产过程中的资源与能源消耗。羧酸还原酶还可与醇脱氢酶形成级联反应生成醇类等具有高附加值的下游化合物，可用于添加剂、清洁能源、精细化工及生物医药等领域。具有重要的研究意义及广阔的市场应用前景。

1，2-丙二醇是一种商品化学品，全球需求量约为136万吨/年。1，2-丙二醇主要用于不饱和聚酯树脂、液体洗涤剂、药品、化妆品、防冻剂和除冰剂。生物法制备1， 2-丙二醇的方法主要涉及葡萄糖的糖酵解代谢，在此途径中糖酵解中间体磷酸二羟丙酮首先被脱磷酸化为丙酮醛，丙酮醛随后被还原为D-乳醛和羟基丙酮，D-乳醛最后被还原为R-1，2-丙二醇。该工艺的主要缺点在于丙酮醛等有毒中间体的存在对细胞有所损害，合成途径相对复杂，工业化生产受限。

因此，寻求能够高效转化D-乳酸合成1，2-丙二醇的羧酸还原酶，不仅对于提供 1，2-丙二醇生产工艺具有重要的作用，更重要的意义在于羧酸还原酶法制备1，2-丙二醇是一种简单高效的生物途径，且更贴合绿色化学的宗旨，对1，2-丙二醇的生物合成潜力有重大贡献。迄今为止，适用于D-乳酸合成1，2-丙二醇的羧酸还原酶制备与开发的报道很少，目前仅有一篇应用羧酸还原酶MavCAR还原乳酸合成1，2丙二醇的研究，且该羧酸还原酶在导入工程化大肠杆菌菌株后4h仅合成了不到1mM的R-1， 2-丙二醇，因此亟待寻找能高效还原乳酸合成1，2-丙二醇的羧酸还原酶。

发明内容

发明目的：为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种羧酸还原酶SrCAR的重组质粒、包含其的重组菌及其应用。

为实现上述目的，本发明提出了一种羧酸还原酶重组质粒，该重组质粒通过将羧酸还原酶基因和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因连接到pRSFDuet-1载体上得到。

具体地，所述羧酸还原酶基因为编码羧酸还原酶SrCAR的基因，其核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因为编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Bssfp的基因，其核苷酸序列如SEQ NO.4所示。

本发明通过对已报道的对乳酸有活力的羧酸还原酶序列进行序列比对从NCBI数据库搜索获得了羧酸还原酶SrCAR的序列，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。CAR主要分布在霉菌、放线菌、厚壁菌、和变形细菌中，序列分析显示原核生物的CAR主要包括5种(CAR1-5)，CAR1-2包含了大多数的原核生物CAR，其中CAR1目前是主要的研究热点，代表酶来自于诺卡氏菌属N.iowensis和分枝杆菌属M.marinum；CAR3 主要为假单胞菌，CAR4主要为肠细菌；CAR5主要为变形细菌。基于此，从NCBI 数据库中筛选出来自于塞格尼氏杆菌的SrCAR(ADG98140.1，thioester reductase domain protein[Segniliparus rotundus DSM44985])，其属于CAR1类羧酸还原酶。其蛋白编码序列包含3个典型的CAR家族domain：N端腺苷酸化结构域(A-结构域)、磷酸泛酰巯基乙胺结合结构域(T-结构域)和C端NADP+还原酶结构域(R-结构域)。经序列比对，SrCAR与本菌属广泛研究的ATCC BAA-974的CAR(WP_007468889)相似度最高，为73％，其次为MaCAR(WP_06287945.1和WP_074339516)，序列是相似度为59％和60％。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Bssfp(WP_003234549.1)的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

本发明进一步提出了一种重组菌，所述重组菌为将上诉的重组质粒转入大肠杆菌细胞中得到。

优选地，所述大肠杆菌细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

进一步地，本发明提出了一种生产羧酸还原酶SrCAR的方法，通过培养上述重组菌，并用IPTG诱导表达，诱导之后采用超声波破碎细胞，经纯化后获得了具有活性的羧酸还原酶纯酶。

优选地，诱导表达条件为：诱导时间6-9h，诱导温度25-35℃，IPTG浓度1-3mM。

更优选地，诱导表达条件为：诱导时间8h，诱导温度30℃，IPTG浓度1.5mM，在该条件下获得了最高的蛋白表达量。

本发明进一步提出了上述重组菌在制备1，2-丙二醇上的应用。

具体地，通过将所述重组菌进行扩大培养以诱导表达羧酸还原酶并利用其催化葡萄糖生成1，2-丙二醇。

有益效果：本发明找到了一种适于乳酸合成1，2-丙二醇的羧酸还原酶SrCAR，并进一步提出了用于表达该羧酸还原酶SrCAR的重组菌，可以应用于以葡萄糖为底物生物制备1，2-丙二醇，实现生物制备1，2-丙二醇的高效合成途径，具有很高的应用前景，利用上述羧酸还原酶SrCAR催化葡萄糖产1，2-丙二醇，在未对大肠杆菌菌株进行基因敲除的情况下，4h得到的1，2-丙二醇产量是文献报道利用含有羧酸还原酶MavCAR的基因敲除大肠杆菌菌株合成1，2-丙二醇产量的4～5倍。

附图说明

图1为含有羧酸还原酶SrCAR基因和来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Bssfp基因的质粒pRSFDuet-1-SrCAR-Bssfp结构图；

图2是对含有SrCAR基因的重组质粒pRSFDuet-1-SrCAR-Bssfp双酶切电泳结果，其中，M:Marker DL5,000；1-5为重组质粒pRSFDuet-1-SrCAR-Bssfp；1’-5’为重组质粒pRSFDuet-1-SrCAR-Bssfp双酶切产物；

图3是诱导表达后粗酶液和纯酶液的SDS-PAGE电泳结果图，其中，1为重组蛋白纯酶液；2为重组蛋白粗酶液；M为Marker；

图4是1，2-丙二醇标准品的HPLC图谱，1，2-丙二醇于17.5min左右出峰

图5为重组菌株的的发酵滤液的HPLC图谱，其中17.8min的峰为1，2-丙二醇，13.2min的峰为乳酸，9.3min的峰为葡萄糖，8.7min的峰为PBS缓冲液。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

在下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如《分子克隆实验指南》。

实施例1：含有羧酸还原酶SrCAR基因序列的重组菌的构建。

通过化学合成法合成编码本发明中羧酸还原酶SrCAR的基因(序列表中SEQ NO.3所示)片段，并将其与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因片段(SEQ NO.4所示)连接到pRSFDuet-1载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析，验证得到载有SrCAR基因的重组质粒 pRSFDuet-SrCAR-Bssfp，重组表达载体pRSFDuet-SrCAR-Bssfp图如图1所示。羧酸还原酶的硫醇化结构域需要转录后修饰，即在辅助的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶 (phosphopantetheinyltransferase，PPTase)催化下将磷酸泛酰巯基乙胺基团共价连接到保守的丝氨酸上，进而获得全酶的最大催化活性。上述重组质粒的构建交由通用生物系统(安徽)有限公司进行连接。

将重组质粒pRSFDuet-SrCAR-Bssfp转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化的细胞涂布于含有1‰卡那霉素的LB平板上37℃进行培养，对平板上生长出来的单菌落提取质粒进行双酶切电泳验证，电泳结果(图2)表明，单克隆菌落含有目的基因片段，可用于羧酸还原酶蛋白的诱导表达的实验。

分别对该蛋白的诱导时间、诱导温度、IPTG浓度进行优化实验，结果表明，在诱导时间8h，诱导温度30℃，IPTG浓度1.5mM的条件下获得了该羧酸还原酶蛋白的最高表达量。

实施例2

将实施例1中鉴定正确的克隆进行过夜培养，再转接到含有1μg/mL卡那霉素的 LB培养基中进行培养，待菌液OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为1.5mM的IPTG于 30℃下进行诱导表达，诱导8h之后，收集菌液，8000rpm，5min，倒掉上清培养基，用PBS等体积洗涤两次，加入适量PBS，使得重悬菌液OD₆₀₀＝40，加入15％(v/v) 甘油，1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)，并在涡旋机上混匀；用超声波破碎仪破碎，超声波破碎条件：工作时间设为20min，每次工作5s，休息4s，功率设为25％，破碎后获得羧酸还原酶粗酶液。对获得的羧酸还原酶粗酶液用0.22μm膜过滤除去杂质，留 2mL过膜后的粗酶液用于SDS-PAGE电泳，剩下的均采用亲和介质填充层析镍柱(HisTrap HP 5mL)对其进行纯化，上样前预先5倍柱体积的ElutionBuffer(pH＝7.4， Na₂PO₄ 20mM，NaCl 0.5M，咪唑500mM)平衡亲和柱，上样后先以100％的Binding Buffer(pH＝7.4，Na₂PO₄ 20mM，NaCl 0.5M，咪唑20mM)洗脱杂蛋白，再用20％、40％、60％的Elution Buffer逐级洗脱，在60％的洗脱液中获得了目的蛋白，将洗脱好后收集在离心管中的溶液进行超滤管超滤以获得纯酶液，取300μL纯酶液，加入1.7mL 含有10％甘油的PBS溶液保藏。获得的羧酸还原酶粗酶液在4℃下10000rpm离心10min，取粗酶上清，将粗酶上清和纯酶液分别与5×蛋白加样缓冲液4:1体积比于100℃水浴加热5min，失活后，用SDS-PAGE进行蛋白验证，验证结果如图3所示。其中，1为重组蛋白纯酶液；2为重组蛋白粗酶液；M为Marker。

实施例3：羧酸还原酶SrCAR酶学性质的研究。

将实施例2中获得的纯酶液进行酶学性质的研究，包括酶活、比活性、最适温度和最适pH等。酶活采用紫外分光光度计进行测定。

羧酸还原酶酶活测定采用1mL反应体系，其中含有400mM Tris-HCl(pH＝7.5)，5mM D-乳酸，10mM MgCl₂，150mM NaCl，1mM ATP，0.15mM NADPH，1mM DTT 和20μL酶，设定波长为340nm，每隔2s测一次，测定了3min，空白对照不加酶。一个活性单位定义为每分钟氧化1μmol的NADPH所用的酶量为1个酶活力单位。根据以下公式计算比酶活：

式中：V_T为反应总体积，ml；V_S为样品体积，ml；ΔA为每分钟吸光度的变化值。比酶活定义为：每毫克酶蛋白所含的酶活单位(U/mg)。

SrCAR以D-乳酸为底物，最适温度的测定在pH 7.5条件下，温度30℃～55℃反应5min，最适pH在温度45℃，pH 6.0～8.5范围内测定。

用Bradford微量分析法测定蛋白浓度，加待测试样100μL于2mL离心管中，顺试管壁分别加入1.5mL Bradford试剂，将离心管小心上下翻转几次使液体混合均匀 (尽量不产生气泡)，在加入试剂后的15min后，于595nm波长下测定各样品的吸光度A值。根据蛋白质浓度标准曲线y＝1.9386x+0.0156和待测的蛋白酶的A值求得蛋白质的浓度。

表1重组羧酸还原酶SrCAR的酶学性质

纯酶的酶学性质，检测结果如表1所示，纯酶液的酶活为7.404×10^-2U/mL，比酶活为7.58×10^-2U/mg，最适反应pH为7.5，最适温度为40℃。该酶较高的耐热性有利于与嗜热的产乳酸菌株凝结芽孢杆菌结合形成级联反应，具有极强的应用潜力。

实施例4：利用羧酸还原酶SrCAR催化葡萄糖生成1，2-丙二醇的转化反应。

将实施例1中构建的重组大肠杆菌过夜培养，得到种子液，按体积比1％的比例接种到新的LB培养基中，37℃200rpm震荡培养。当OD₆₀₀至0.6～0.8左右时加入终浓度为1.0～1.5mM的IPTG进行诱导，转至30℃200rpm震荡培养8h。

诱导过后收菌，4℃8000rpm，离心3min。后用1/15M磷酸缓冲液(pH7.0)洗两次。后用100mM磷酸缓冲液(pH7.5)重悬至OD₆₀₀约为50左右。加入终浓度为50mM 的D-葡萄糖作为底物，30℃200rpm反应2h进行全细胞反应。之后，取反应液，用于进行产物检测。对照菌株Bl21(DE3)(pETDuet-1)以相同方法进行全细胞催化测试。实验重复三次。其中，100mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)的配方如下：NaH₂PO₄·2H₂O 4.992g，Na₂HPO₄ 23.856g，定容至1L去离子水中。通过HPLC分析反应体系中产物的含量，如图4-5所示，全细胞催化反应4h初步得到了4.968mM的1，2-丙二醇。其中，1，2-丙二醇的检测方法如下：

1，2-丙二醇标准品溶液的制备：取1，2-丙二醇标准品(sigma，目录号398039), 用去离子水配置成适当浓度的溶液。

待测样品溶液的制备：将步骤一所获得的发酵液，12000rpm，2min离心后取上清，用0.22μm滤膜过滤，得到待上机的待测样品溶液。

将1，2-丙二醇标准品溶液和待测样品溶液菌按照如下条件进行HPLC检测：色谱柱为有机酸柱300mm×7.8mm Aminex HPX-87H(Bio-Rad)；流动相为5mM H₂SO₄；流速为0.6mL/min；上样量为10微升；柱温55℃；示差折光检测器。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 羧酸还原酶重组质粒及其构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1186

<212> PRT

<213> SrCAR(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Gln Ser His Thr Gln Gly Pro Gln Ala Ser Ala Ala His Ser

1 5 10 15

Arg Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu Leu Leu Ala Thr Asp Pro Gln Ala

20 25 30

Ala Ala Thr Leu Pro Asp Pro Glu Val Val Arg Gln Ala Thr Arg Pro

35 40 45

Gly Leu Arg Leu Ala Glu Arg Val Asp Ala Ile Leu Ser Gly Tyr Ala

50 55 60

Asp Arg Pro Ala Leu Gly Gln Arg Ser Phe Gln Thr Val Lys Asp Pro

65 70 75 80

Ile Thr Gly Arg Ser Ser Val Glu Leu Leu Pro Thr Phe Asp Thr Ile

85 90 95

Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Glu Arg Ala Thr Ala Ile Ala Ser Asp Leu

100 105 110

Ala His His Pro Gln Ala Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Leu Ala Ser

115 120 125

Ile Gly Phe Ile Ser Val Asp Tyr Val Ala Ile Asp Ile Ala Gly Val

130 135 140

Phe Ala Gly Leu Thr Ala Val Pro Leu Gln Thr Gly Ala Thr Leu Ala

145 150 155 160

Thr Leu Thr Ala Ile Thr Ala Glu Thr Ala Pro Thr Leu Phe Ala Ala

165 170 175

Ser Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Val Asp Ala Val Leu Ala Thr Pro

180 185 190

Ser Val Arg Arg Leu Leu Val Phe Asp Tyr Arg Ala Gly Ser Asp Glu

195 200 205

Asp Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Arg Lys Ile Ala Asp Ala Gly

210 215 220

Ser Ser Val Leu Val Asp Val Leu Asp Glu Val Ile Ala Arg Gly Lys

225 230 235 240

Ser Ala Pro Lys Ala Pro Leu Pro Pro Ala Thr Asp Ala Gly Asp Asp

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys

260 265 270

Gly Ala Met Tyr Pro Glu Arg Asn Val Ala His Phe Trp Gly Gly Val

275 280 285

Trp Ala Ala Ala Phe Asp Glu Asp Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ile

290 295 300

Asn Ile Thr Phe Leu Pro Leu Ser His Val Ala Ser Arg Leu Ser Leu

305 310 315 320

Met Pro Thr Leu Ala Arg Gly Gly Leu Met His Phe Val Ala Lys Ser

325 330 335

Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Lys Leu Ala Arg Pro Thr Asn

340 345 350

Leu Phe Leu Val Pro Arg Val Val Glu Met Leu Tyr Gln His Tyr Gln

355 360 365

Ser Glu Leu Asp Arg Arg Gly Val Gln Asp Gly Thr Arg Glu Ala Glu

370 375 380

Ala Val Lys Asp Asp Leu Arg Thr Gly Leu Leu Gly Gly Arg Ile Leu

385 390 395 400

Thr Ala Gly Phe Gly Ser Ala Pro Leu Ser Ala Glu Leu Ala Gly Phe

405 410 415

Ile Glu Ser Leu Leu Gln Ile His Leu Val Asp Gly Tyr Gly Ser Thr

420 425 430

Glu Ala Gly Pro Val Trp Arg Asp Gly Tyr Leu Val Lys Pro Pro Val

435 440 445

Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Ser Thr

450 455 460

Asp Ser Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Thr Gln Thr Ile

465 470 475 480

Leu Pro Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Thr Thr Ala Glu Val Phe Asp

485 490 495

Glu Asp Gly Phe Tyr Leu Thr Gly Asp Val Val Ala Gln Ile Gly Pro

500 505 510

Glu Gln Phe Ala Tyr Val Asp Arg Arg Lys Asn Val Leu Lys Leu Ser

515 520 525

Gln Gly Glu Phe Val Thr Leu Ala Lys Leu Glu Ala Ala Tyr Ser Ser

530 535 540

Ser Pro Leu Val Arg Gln Leu Phe Val Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Ser

545 550 555 560

Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Pro Asp Ala Leu Lys Lys Phe

565 570 575

Gly Val Gly Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Gly Glu Ser Leu Gln Lys

580 585 590

Ile Ala Arg Asp Glu Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Arg Asp Phe

595 600 605

Ile Ile Glu Thr Asp Pro Phe Thr Val Glu Asn Gly Leu Leu Ser Asp

610 615 620

Ala Arg Lys Ser Leu Arg Pro Lys Leu Lys Glu His Tyr Gly Glu Arg

625 630 635 640

Leu Glu Ala Met Tyr Lys Glu Leu Ala Asp Gly Gln Ala Asn Glu Leu

645 650 655

Arg Asp Ile Arg Arg Gly Val Gln Gln Arg Pro Thr Leu Glu Thr Val

660 665 670

Arg Arg Ala Ala Ala Ala Met Leu Gly Ala Ser Ala Ala Glu Ile Lys

675 680 685

Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu

690 695 700

Thr Phe Ser Asn Phe Leu His Asp Leu Phe Glu Val Asp Val Pro Val

705 710 715 720

Gly Val Ile Val Ser Ala Ala Asn Thr Leu Gly Ser Val Ala Glu His

725 730 735

Ile Asp Ala Gln Leu Ala Gly Gly Arg Ala Arg Pro Thr Phe Ala Thr

740 745 750

Val His Gly Lys Gly Ser Thr Thr Ile Lys Ala Ser Asp Leu Thr Leu

755 760 765

Asp Lys Phe Ile Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys His Leu Pro

770 775 780

Lys Pro Ala Asp Pro Pro Arg Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Asn Gly

785 790 795 800

Trp Leu Gly Arg Phe Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu Arg Leu Ala Pro

805 810 815

Ala Gly Gly Lys Leu Ile Thr Ile Val Arg Gly Lys Asp Ala Ala Gln

820 825 830

Ala Lys Ala Arg Leu Asp Ala Ala Tyr Glu Ser Gly Asp Pro Lys Leu

835 840 845

Ala Gly His Tyr Gln Asp Leu Ala Ala Thr Thr Leu Glu Val Leu Ala

850 855 860

Gly Asp Phe Ser Glu Pro Arg Leu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Trp Asn

865 870 875 880

Arg Leu Ala Asp Glu Val Asp Phe Ile Ser His Pro Gly Ala Leu Val

885 890 895

Asn His Val Leu Pro Tyr Asn Gln Leu Phe Gly Pro Asn Val Ala Gly

900 905 910

Val Ala Glu Ile Ile Lys Leu Ala Ile Thr Thr Arg Ile Lys Pro Val

915 920 925

Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ala Val Ala Ala Gly Val Glu Pro Ser Ala

930 935 940

Leu Asp Glu Asp Gly Asp Ile Arg Thr Val Ser Ala Glu Arg Ser Val

945 950 955 960

Asp Glu Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Gly Gly Glu

965 970 975

Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Arg Thr Gly Leu Pro Val Arg Val

980 985 990

Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His Gln Lys Tyr Thr Gly Gln Val

995 1000 1005

Asn Ala Thr Asp Gln Phe Thr Arg Leu Val Gln Ser Leu Leu Ala Thr

1010 1015 1020

Gly Leu Ala Pro Lys Ser Phe Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Gly Asn Arg

1025 1030 1035 1040

Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Ile Pro Val Asp Phe Thr Ala Glu Ser

1045 1050 1055

Ile Thr Thr Leu Gly Gly Asp Gly Leu Glu Gly Tyr Arg Ser Tyr Asn

1060 1065 1070

Val Phe Asn Pro His Arg Asp Gly Val Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp

1075 1080 1085

Trp Leu Ile Glu Ala Gly His Pro Ile Thr Arg Ile Asp Asp Tyr Asp

1090 1095 1100

Gln Trp Leu Ser Arg Phe Glu Thr Ser Leu Arg Gly Leu Pro Glu Ser

1105 1110 1115 1120

Lys Arg Gln Ala Ser Val Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Ala Arg Pro

1125 1130 1135

Gly Pro Ala Val Asp Gly Ser Pro Phe Arg Asn Thr Val Phe Arg Thr

1140 1145 1150

Asp Val Gln Lys Ala Lys Ile Gly Ala Glu His Asp Ile Pro His Leu

1155 1160 1165

Gly Lys Ala Leu Val Leu Lys Tyr Ala Asp Asp Ile Lys Gln Leu Gly

1170 1175 1180

Leu Leu

1185

<210> 2

<211> 203

<212> PRT

<213> BsSFP(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys Arg Arg Phe Tyr

1 5 10 15

His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp Val Leu Val Arg

20 25 30

Ser Val Ile Ser Gly Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser Asp Ile Arg Phe

35 40 45

Ser Thr Gln Glu Tyr Gly Lys Pro Cys Ile Pro Asp Leu Pro Asp Ala

50 55 60

His Phe Asn Ile Ser His Ser Gly Arg Trp Val Ile Gly Ala Phe Asp

65 70 75 80

Ser Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Lys Met Lys Pro Ile Ser Leu

85 90 95

Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr Ser Asp Leu Leu

100 105 110

Ala Lys Asn Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Phe Tyr His Leu Trp Ser

115 120 125

Met Lys Glu Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gly Lys Gly Leu Ser Leu Pro

130 135 140

Leu Asp Ser Phe Ser Val Arg Leu His Gln Asn Gly Glu Val Ser Ile

145 150 155 160

Glu Leu Pro Asp Ser His Ser Pro Cys Tyr Ile Lys Thr Tyr Asp Val

165 170 175

Asp Pro Gly Tyr Lys Met Ala Val Cys Ala Ala His Pro Asp Phe Pro

180 185 190

Glu Asp Ile Thr Met Val Ser Tyr Glu Ala Phe

195 200

<210> 3

<211> 3561

<212> DNA

<213> 羧酸还原酶SrCAR(Artificial Sequence)

<400> 3

atgactcagt cgcacactca aggtccgcaa gcgtctgcgg cgcacagccg tctcgcccgt 60

cgcgcggcgg agcttctcgc gacggacccg caggccgccg cgaccctccc cgacccggag 120

gtcgtgcggc aggcgacgcg tccagggctg cggctcgcgg agcgggtcga cgcgatcctc 180

agcggctacg ccgaccgccc ggctctcggg cagcgctctt ttcagaccgt caaagatccc 240

atcaccggac gctcctcggt cgagttgctc cccacgttcg acaccatcac ctaccgcgag 300

ctgcgagagc gcgccacagc gatcgcaagc gacctggcgc atcacccgca ggccccggcc 360

aagcccggag atttcctcgc gagcatcggc ttcatcagcg tcgattacgt cgccatcgac 420

atcgccgggg tcttcgccgg gctcaccgcc gtcccgctcc agaccggcgc gacactcgcg 480

acgttgacgg cgatcaccgc agagaccgcg ccaaccctgt tcgcggcgag catcgagcac 540

ctgccgaccg ccgtggacgc cgttctcgcc acgccctcag tgcgccggtt gctcgtcttc 600

gactaccgcg ccgggtcgga cgaggaccgc gaggcggtcg aggcggccaa gcggaaaatc 660

gccgacgcgg gcagctcggt gctcgtggac gttttggacg aggtgatcgc acgcgggaaa 720

tcggcgccga aggcgccgct gccccccgcc accgacgcgg gcgacgactc gctgtccttg 780

ctcatctaca cctccggctc caccgggacg cccaaggggg cgatgtaccc ggagcgcaac 840

gtcgcgcact tctggggcgg cgtctgggcc gccgcgttcg acgaggacgc cgccccgccc 900

gtcccagcga tcaacatcac gttcctgccg ctcagccacg tcgccagcag actttcgctc 960

atgccgaccc tcgcccgggg cggcctcatg cacttcgtcg cgaagagcga cctgtccacc 1020

ctcttcgagg acttgaaact cgctcgtccg acgaacctgt tcctggtgcc cagagtggtc 1080

gagatgctgt accagcacta ccagagcgaa ttagaccgca ggggagtgca ggacggcacc 1140

cgcgaagccg aagcggtgaa ggacgacctg cgcacggggc tcctcggcgg ccggatcctc 1200

actgcgggct tcggctcggc gccgctgtcc gccgagctgg ctggcttcat cgaatccctg 1260

ctgcagatcc acctggtgga cggctacggg tccaccgagg cggggccggt gtggcgcgac 1320

ggctacctcg tcaaaccgcc ggtgaccgac tacaagctca tcgacgtgcc cgagctcggg 1380

tacttctcca ccgactcccc gcatccccgg ggcgagctgg ccatcaagac gcagaccatc 1440

ctccccggct attacaagcg ccccgagacg accgcggaag tcttcgacga ggacggcttc 1500

tacctcaccg gggacgtggt cgcgcagatc gggccggaac agttcgcgta cgtcgaccgg 1560

cgcaagaacg tcctcaagct ctcccagggc gagttcgtga ccctcgcgaa gctcgaggcc 1620

gcgtacagct ccagcccgct ggtgcgacag ctcttcgtct acggctccag cgaacgctcg 1680

tacttgctcg ccgtgatcgt gcccaccccg gacgccctga agaagttcgg cgtcggcgag 1740

gcggcgaaag ccgcgctcgg ggagtctctg cagaagatcg ctcgcgacga gggcctgcaa 1800

tcctacgagg tgccgcgcga cttcatcatc gaaacggatc cgttcacggt cgagaacggc 1860

ctgctctccg acgcccgcaa gtcgttgcgc ccgaagctca aggagcatta cggcgaacgg 1920

ctcgaagcga tgtacaaaga gctcgcggac ggtcaggcga acgagctgcg cgacatccgc 1980

agaggcgtgc aacaacgccc gacgctcgaa accgtgcggc gcgccgcggc cgcgatgctg 2040

ggcgcgagcg ccgcggaaat caagccggac gcccatttca ccgacctcgg cggcgactcg 2100

ctctccgcgc tgacgttctc gaacttcctg cacgacctct tcgaagtcga tgtgcccgtc 2160

ggggtgatcg tgagcgccgc gaacacattg ggctccgtgg ccgagcacat cgacgcgcag 2220

ctcgcggggg gccgtgcccg gccgacgttc gcgaccgtgc acggcaaagg ctccaccacg 2280

atcaaggcca gcgatctgac cttggacaag ttcatcgacg agcagaccct cgaggccgcg 2340

aagcacttgc ccaagcccgc cgacccgccg cgcaccgtgc tgctcaccgg cgcgaacggc 2400

tggctcggcc ggttcctcgc ccttgaatgg ctcgaaaggc tcgcccccgc cggcggcaag 2460

ctcatcacga tcgtgcgcgg caaggacgcg gcacaggcaa aggctcggct cgacgccgcg 2520

tacgagagcg gcgacccgaa gctcgccggt cattaccagg atttggccgc gacgacgctc 2580

gaagtgctcg cgggcgattt cagcgagccg cgtctcgggc tggacgaggc gacctggaac 2640

cggctggccg acgaggtgga cttcatctcg caccccggcg ctctggtcaa ccatgtcctg 2700

ccgtacaacc agctgttcgg gccgaacgtg gccggtgtgg ccgagatcat caagctcgcg 2760

atcaccacac ggatcaagcc cgtcacgtac ctgtccacag tcgccgtcgc ggcgggcgtc 2820

gagccgtcgg ccttagacga ggacggcgac atccggacgg tgagcgctga gcgctcggtc 2880

gacgagggct acgccaacgg gtacgggaac agcaaatggg gcggcgaggt gctgctgcgc 2940

gaagcgcacg atcgcacggg actgccggtt cgggtgttcc gctcggacat gatcctcgcg 3000

catcagaaat acaccggaca agtgaacgcg accgaccagt tcacccggct cgtccagagc 3060

cttttggcaa ccgggctcgc accgaagtcc ttctacgagc tcgacgccca gggcaaccgg 3120

cagcgggccc actacgacgg gatacccgtg gacttcaccg ccgagtcgat caccacgctc 3180

ggcggcgacg gtttggaagg ctaccgcagc tacaacgtgt tcaacccgca tcgcgacggc 3240

gtcggtttgg acgagttcgt cgactggctc atcgaagccg gacacccgat cacacggatc 3300

gacgactacg accagtggct ctcgcgcttc gagacctcgt tgcgcggcct gcccgaatcc 3360

aagcgccaag cctccgtgct cccgttgctg cacgccttcg cccggccagg gcccgccgtg 3420

gacggctcgc ctttccggaa cacggtgttc cgcaccgacg tgcagaaggc gaagatcggc 3480

gcggaacacg acatccccca cctgggcaaa gcgctcgtgc tcaagtacgc cgacgacatc 3540

aagcagctcg gtctgctctg a 3561

<210> 4

<211> 609

<212> DNA

<213> 磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码基因(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtctttca tctcgcccga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 60

gcacatcgca ccctgctggg agatgtgctt gttcgttcag tcataagcgg gcagtatcag 120

ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccctg catccccgat 180

cttcctgacg cccatttcaa catttctcat tccggccgct gggtcattgg tgcgtttgat 240

tcacagccca tcggcatcga tattgaaaaa atgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 300

cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcca aaaacaagga cgagcaaaca 360

gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacaaga gggcaagggg 420

ttatcactac cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcatc agaacggaga agtatccatt 480

gagcttccag acagccattc cccctgctat atcaaaacgt atgatgtcga tcccggctac 540

aaaatggctg tatgcgccgc gcaccctgat ttccctgagg atatcacaat ggtctcgtac 600

gaagccttt 609

Claims

1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌通过将羧酸还原酶重组质粒转入大肠杆菌细胞中得到，其中，所述羧酸还原酶重组质粒通过将羧酸还原酶基因和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因连接到pRSFDuet-1载体上得到，所述羧酸还原酶基因为编码羧酸还原酶SrCAR的基因，其核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因为编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Bssfp的基因，其核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述大肠杆菌细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

2.一种生产羧酸还原酶SrCAR的方法，其特征在于，培养权利要求1所述的重组菌，并用IPTG诱导表达，诱导之后采用超声波破碎细胞，纯化后得到具有活性的羧酸还原酶SrCAR纯酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特在于，诱导表达条件为：诱导时间6-9h，诱导温度25-35℃，IPTG浓度1-3mM。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导表达条件为：诱导时间8h，诱导温度30℃，IPTG浓度1.5mM。

5.权利要求1所述的重组菌在制备1，2-丙二醇上的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括将权利要求1所述的重组菌进行扩大培养以诱导表达羧酸还原酶并利用其催化葡萄糖生成1，2-丙二醇。