CN114181877A

CN114181877A - 一种合成香兰素的基因工程菌及其应用

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Publication number: CN114181877A
Application number: CN202111487135.1A
Authority: CN
Inventors: 谭天伟; 朱浩文; 张洋
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2041-12-08
Also published as: CN114181877B

Abstract

本发明涉及一种合成香兰素的基因工程菌，其包括由香草酸合成天然香兰素的途径：香草酸在羧酸还原酶Car和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp的催化作用下生成天然香兰素。本发明通过将羧酸还原酶(Car)基因和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Sfp)基因导入宿主菌中，成功构建了能够高效催化香草酸还原生成香兰素的基因工程菌；同时，本发明还通过底物/产物耐受性驯化和全细胞催化过程优化调控相结合的方式来进一步提高天然香兰素的产量。多次重复实验表明，采用本发明的基因工程菌香兰素的最高产量能够达到4.05g/L，是目前已报道的相关研究中生物法催化香草酸生成香兰素的最高产量，这对生物法高效生产香兰素具有很大的工业化应用前景。

Description

一种合成香兰素的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因重组和全细胞催化技术领域，涉及一种合成香兰素的基因工程菌及其应用，具体涉及高效转化香草酸生产天然香兰素的基因工程菌的构建及其应用。

背景技术

香兰素(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)是全世界使用非常广泛的一种食品调味剂，常用于食品、饮料、香水以及药品当中，天然香兰素是从兰科植物的种子荚中提取出来的一种植物次生代谢产物。全世界香兰素的年消费量超过16000吨，但由于兰科植物生长缓慢且植物中香兰素含量仅为香草豆荚干重的2％，食用香兰素中只有约0.25％来自天然香草豆荚。全球大部分香兰素的市场需求是通过化学法(主要有愈创木酚法和邻苯二酚法)合成香兰素来满足的，但此方法缺乏底物选择性并且污染环境。化学合成法的第二个缺点是化学合成的香兰素属于“非天然”香兰素，其生物相容性差，且附加值较低。

基于上述情况，我们决定通过使用天然底物结合生物工程技术生产天然香兰素，其产品被欧盟和美国的食品法规归类为天然香兰素。在各种天然底物中，以阿魏酸作为前体生物法合成香兰素的研究较早，但是香草酸作为另一种生物法合成香兰素的常用前体，其理化性质与阿魏酸相比有更多优势，具有化学性质稳定、水溶性良好、见光不易分解等优点。目前随着研究的不断深入，以香草酸作为底物生物法合成香兰素的产量与转化率已经有了显著提升，在2000年Stentelaire等进行了利用P.cinnabarinus MUCL39533转化香草酸生产香兰素，产量能够达到1.58g/L，摩尔转化率为82.1％，但是生物法转化香草酸生产香兰素的产量和转化率仍旧有很大的提升空间。

因此，目前存在的问题是构建更加高效转化香草酸生产天然香兰素的基因工程菌并对全细胞催化过程进行优化调控。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种合成香兰素的基因工程菌。该基因工程菌能够高效地催化香草酸生产天然香兰素；同时，本发明还通过底物/产物耐受性驯化和全细胞催化过程优化调控相结合的方式来进一步提高天然香兰素的产量；本发明所构建的工程菌能够非常高效地催化香草酸生产天然香兰素。

为此，本发明第一方面提供了一种合成香兰素的基因工程菌，其包括由香草酸合成天然香兰素的途径：香草酸在羧酸还原酶Car和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp的催化作用下生成天然香兰素。

根据本发明，所述基因工程菌为含有编码羧酸还原酶的基因Car和编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的基因Sfp的合适宿主生物体。

在本发明的一些实施例中，所述编码羧酸还原酶的基因Car包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Car、来源于海分枝杆菌的基因Car以及基于上述基因的序列的不引起所述羧酸还原酶功能改变的基因取代、缺失、加入或密码子优化。

优选地，所述编码羧酸还原酶的基因Car包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Car或来源于艾阿华诺卡氏菌且经过密码子优化的基因Car、来源于海分枝杆菌的基因Car或来源于海分枝杆菌且经过密码子优化的基因Car。

在本发明的另一些实施例中，所述编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Sfp、来源于海分枝杆菌的基因Sfp、来源于枯草芽孢杆菌的基因Sfp以及基于上述基因的序列的不引起所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶功能改变的基因取代、缺失、加入或密码子优化。

优选地，所述编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Sfp或来源于艾阿华诺卡氏菌且经过密码子优化的基因Sfp、来源于海分枝杆菌的基因Sfp或来源于海分枝杆菌且经过密码子优化的基因Sfp、来源于枯草芽孢杆菌的基因Sfp或来源于枯草芽孢杆菌且经过密码子优化的基因Sfp。

本发明中，所述合适宿主生物体包括大肠杆菌BL21(DE3)、酿酒酵母S288C、毕赤酵母X-33、亚罗酵母ATCC:MYA-2613和谷氨酸棒状杆菌ATCC:13032。

本发明第二方面提供了一种利用本发明第一方面所述的合成香兰素的基因工程菌由香草酸合成天然香兰素的方法，其包括：将合成香兰素的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得香兰素。

在本发明的一些实施例中，所述发酵培养的底物香草酸浓度为1.0-30.0g/L，优选为1.0-10.0g/L。

在本发明的一些实施例中，发酵培养的过程中，葡萄糖补加量为1.0-40.0g/L，优选为4.0-20.0g/L。

在本发明的一些实施例中，所述发酵培养的培养转速为100-400rpm，优选为150-300rpm。

在本发明的一些实施例中，发酵培养的菌体富集倍数为1-20倍，优选为3-10倍。

在本发明的一些实施例中，发酵培养的过程中，诱导时间为2-16小时，优选为4-16小时。

本发明的有益效果如下：

本发明通过将羧酸还原酶(Car)基因和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Sfp)基因导入宿主菌中，成功构建了能够高效催化香草酸还原生成香兰素的基因工程菌；同时，本发明还通过底物/产物耐受性驯化和全细胞催化过程优化调控相结合的方式来进一步提高天然香兰素的产量。

多次重复实验表明，采用本发明的基因工程菌香兰素的最高产量能够达到4.05g/L，是目前已报道的相关研究中生物法催化香草酸生成香兰素的最高产量，这对生物法高效生产香兰素具有很大的工业化应用前景。

在相同转化条件下，进一步将底物香草酸浓度提升，香兰素产量进一步大幅提升，表明本发明构建的工程菌株具有很强的催化香草酸还原生产香兰素的工业化潜力，有希望实现香兰素大规模绿色高效生产。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1示出香草酸标品的HPLC出峰结果；

图2示出香兰素标品的HPLC出峰结果；

图3示出摇瓶发酵样品的HPLC出峰结果；

图4示出香兰素标品的LC-MS出峰结果；

图5示出摇瓶发酵样品的LC-MS出峰结果；

图6示出对最优工程菌株E-C(M)+S(N)-A进行全细胞催化过程优化调控在不同时间下的香兰素产量；其中，A的菌体富集(浓缩)倍数为10，B的菌体富集倍数为5。

图7示出在最优全细胞催化条件下对最优工程菌株E-C(M)+S(N)-A进行更高底物浓度(5g/L)下的香兰素产量；

图8示出最优工程菌E-C(M)+S(N)-A上罐发酵催化香草酸生产天然香兰素在不同时间下的产量；

图9为羧酸还原酶(Car)和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Sfp)催化香草酸还原生成香兰素的反应示意图。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图和实施例详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌，如大肠杆菌、克雷伯菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为为重组微生物。

本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。

本发明中所述用语“全细胞催化”是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。

Ⅱ.实施方案

为了构建更加高效转化香草酸生产天然香兰素的基因工程菌并对全细胞催化过程进行优化调控。

为此，本发明第一方面所涉及的合成香兰素的基因工程菌包括以下由香草酸合成天然香兰素的途径：香草酸在羧酸还原酶Car和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp的催化作用下生成天然香兰素，如图9所示。

为实现上述合成天然香兰素的途径，本发明人通过以下方法构建了合成香兰素的基因工程菌：

本发明人基于基因工程的操作手段对多种不同物种来源的Car和多种不同物种来源的Sfp进行排列组合，筛选得到更适配的Car和Sfp高效催化组合，并通过底物/产物耐受性驯化得到能够更高效催化香草酸还原生成香兰素的工程菌株。

容易理解，本发明中所提供的合成香兰素的基因工程菌为含有编码羧酸还原酶的基因Car和编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的基因Sfp的合适宿主生物体。

本发明中所述合适宿主生物体包括大肠杆菌BL21(DE3)、酿酒酵母S288C、毕赤酵母X-33、亚罗酵母ATCC:MYA-2613和谷氨酸棒状杆菌ATCC:13032，优选为大肠杆菌BL21(DE3)(北京全式金生物技术有限公司)。

具体优选地，本发明中所述合成香兰素的基因工程菌为含有编码羧酸还原酶的基因Car和编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的基因Sfp的大肠杆菌。

在本发明的一些实施例中，所述编码羧酸还原酶的基因Car包括来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的基因Car、来源于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)的基因Car以及基于上述基因的序列的不引起所述羧酸还原酶功能改变的基因取代、缺失、加入或密码子优化。

优选地，所述编码羧酸还原酶的基因Car包括来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardiaiowensis)的基因Car或来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)且经过密码子优化的基因Car、来源于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)的基因Car或来源于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)且经过密码子优化的基因Car。

具体地，所述来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的基因Car(GenBank:AY495697.1)如SEQ ID No.1所示，来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)且经过密码子优化的基因Car的序列如SEQ ID No.6所示；所述来源于海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)的基因Car(GenBank:CP000854.1)如SEQ ID No.2所示，来源于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)且经过密码子优化的基因Car的序列如SEQ ID No.7所示。

在本发明的另一些实施例中，所述编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp包括来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的基因Sfp、来源于海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)的基因Sfp、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因Sfp以及基于上述基因的序列的不引起所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶功能改变的基因取代、缺失、加入或密码子优化。

优选地，所述编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp包括来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的基因Sfp或来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)且经过密码子优化的基因Sfp、来源于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)的基因Sfp或来源于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)且经过密码子优化的基因Sfp、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因Sfp或来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)且经过密码子优化的基因Sfp。

具体地，来源于所述来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的基因Sfp(GenBank:CP078145.1)如SEQ ID No.3所示，来源于艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)且经过密码子优化的基因Sfp的序列如SEQ ID No.8所示；所述来源于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)的基因Sfp(GenBank:CP054013.1)如SEQ ID No.4所示，来源于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)且经过密码子优化的基因Sfp的序列如SEQ ID No.9所示；所述来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因Sfp(GenBank:CP054013.1)如SEQ ID No.5所示，来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)且经过密码子优化的基因Sfp的序列如SEQ ID No.10所示。

本领域技术人员应该了解的是，当所述合适宿主生物体包括大肠杆菌BL21(DE3)时，所述密码优化为适合于在大肠杆菌中表达的密码子优化。

本发明第二方面提供了一种利用本发明第一方面所述的合成香兰素的基因工程菌由香草酸合成天然香兰素的方法，其也可以理解为如本发明第一方面所述的合成香兰素的基因工程菌在由香草酸合成天然香兰素中的应用，其包括：将合成香兰素的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得香兰素。

本发明人通过全细胞催化过程优化调控方式，从底物浓度、菌体生物量、氧气供应与葡萄糖供应等多个在微生物生长和生物转化过程中起着至关重要作用的方面对全细胞催化香草酸生成香兰素做了有效的优化调控，其优化调控方法概述如下：

本发明中，所使用的底物香草酸浓度为1.0-30.0g/L，优选为1.0-10.0g/L，进一步优选为1.0g/L、2.5g/L、5.0g/L、10.0g/L，其中最适的香草酸浓度为5.0g/L。

本发明中，所使用的培养转速为100-400rpm，优选为150-300rpm，进一步优选为150rpm、200rpm、250rpm、300rpm，其中最适的培养转速为200rpm。

本发明中，所使用的菌体富集倍数为1-20倍，优选为3-10倍，进一步优选为3倍、5倍、7倍、10倍，其中最适的菌体富集倍数为10倍。

本发明中，所使用的诱导时间为2-16小时，优选为4-16小时，进一步优选为4小时、8小时、12小时、16小时，其中最适的诱导时间为4小时。

本发明中，所使用的葡萄糖补加量为1.0-40.0g/L，优选为4.0-20.0g/L，进一步优选为4.0g/L、6.0g/L、10.0g/L、14.0g/L、20.0g/L，其中最适的葡萄糖补加量为4.0g/L。

首先本发明所使用的全细胞生物催化转化法，相比于植物细胞培养法和酶法，具有细胞生长与产酶相同步、细胞膜的存在和保护性质有助于稳定酶以及宿主体内辅因子的供应等优点。

其次，本发明通过将基因工程和底物/产物耐受性驯化相结合的方式，筛选得到了一株能够高效转化香草酸生产天然香兰素的工程化大肠杆菌(将其命名为E-C(M)+S(N)-A)，最优工程菌E-C(M)+S(N)-A导入了来源于Mycobacterium marinum的羧酸还原酶基因Car和来源于Nocardia iowensis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp，然后又对其进行了香草酸耐受性驯化，接下来对全细胞催化转化过程进行了优化调控后，最终香兰素的最高产量能够达到国内外相关报道的最高摩尔转化率。在相同转化条件下，进一步将底物香草酸浓度提升，香兰素产量进一步大幅提升，表明本发明构建的工程菌株具有很强的催化香草酸还原生产香兰素的工业化潜力，有希望实现香兰素大规模绿色高效生产。

实施例

以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得，且下列实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂。

实施例1：

在本发明的一些具体实施例中，构建上述以香草酸为底物生产香兰素的基因工程菌，并将该工程菌株用于全细胞催化生产香兰素，反应原理如图9所示，其包括以下步骤：

(一)过表达多种不同物种来源的羧酸还原酶基因Car和多种不同物种来源的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp重组质粒及重组菌株的构建，其中以SEQ ID No.1-10为例进行描述，但羧酸还原酶(Car)和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Sfp)的保护范围不限于以上物种来源：

1.以表1中的C(N)+S(N)-CF和C(N)+S(N)-CR为上下游引物，以公司合成SEQ IDNO.6序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Nocardia iowensis的羧酸还原酶基因Car，所述基因序列如SEQ ID NO.6所示。以表1中的C(N)+S(N)-SF和C(N)+S(N)-SR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.8序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Nocardia iowensis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp，所述基因序列如SEQ ID NO.8所示。然后将来源于Nocardiaiowensis的羧酸还原酶基因Car与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII进行消化，将来源于Nocardia iowensis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行消化，依次插入到表达质粒pRSFDuet-1得到pRSFDuet-C(N)+S(N)重组质粒，将pRSFDuet-C(N)+S(N)重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含50μg/mL的卡那霉素LB平板培养基，挑选阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，命名为E-C(N)+S(N)，如表2所示。

表1

2.以表1中的C(M)+S(M)-CF和C(M)+S(M)-CR为上下游引物，以公司合成SEQ IDNO.7序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Mycobacterium marinum的羧酸还原酶基因Car，所述基因序列如SEQ ID NO.7所示。以表1中的C(M)+S(M)-SF和C(M)+S(M)-SR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.9序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Mycobacterium marinum的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp，所述基因序列如SEQ ID NO.9所示。然后将来源于Mycobacterium marinum的羧酸还原酶基因Car与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII进行消化，将来源于Mycobacterium marinum的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行消化，依次插入到表达质粒pRSFDuet-1得到pRSFDuet-C(M)+S(M)重组质粒，将pRSFDuet-C(M)+S(M)重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含50ug/mL的卡那霉素LB平板培养基，挑选阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，命名为E-C(M)+S(M)，如表2所示。

3.以表1中的C(N)+S(M)-CF和C(N)+S(M)-CR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.6序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Nocardia iowensis的羧酸还原酶基因Car，所述基因序列如SEQ ID NO.6所示。以表1中的C(N)+S(M)-SF和C(N)+S(M)-SR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.9序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Mycobacterium marinum的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp，所述基因序列如SEQ ID NO.9所示。然后将来源于Nocardiaiowensis的羧酸还原酶基因Car与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII进行消化，将来源于Mycobacterium marinum的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行消化，依次插入到表达质粒pRSFDuet-1得到pRSFDuet-C(N)+S(M)重组质粒，将pRSFDuet-C(N)+S(M)重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含50ug/mL的卡那霉素LB平板培养基，挑选阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，命名为E-C(N)+S(M)，如表2所示。

4.以表1中的C(M)+S(N)-CF和C(M)+S(N)-CR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.7序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Mycobacterium marinum的羧酸还原酶基因Car，所述基因序列如SEQ ID NO.7所示。以表1中的C(M)+S(N)-SF和C(M)+S(N)-SR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.8序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Nocardia iowensis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp，所述基因序列如SEQ ID NO.8所示。然后将来源于Mycobacteriummarinum的羧酸还原酶基因Car与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII进行消化，将来源于Nocardia iowensis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行消化，依次插入到表达质粒pRSFDuet-1得到pRSFDuet-C(M)+S(N)重组质粒，将pRSFDuet-C(M)+S(N)重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含50ug/mL的卡那霉素LB平板培养基，挑选阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，命名为E-C(M)+S(N)，如表2所示。

5.以表1中的C(N)+S(B)-CF和C(N)+S(B)-CR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.6序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Nocardia iowensis的羧酸还原酶基因Car，所述基因序列如SEQ ID NO.6所示。以表1中的C(N)+S(B)-SF和C(N)+S(B)-SR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.10序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Bacillus subtilis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp，所述基因序列如SEQ ID NO.10所示。然后将来源于Nocardiaiowensis的羧酸还原酶基因Car与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII进行消化，将来源于Bacillus subtilis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行消化，依次插入到表达质粒pRSFDuet-1得到pRSFDuet-C(N)+S(B)重组质粒，将pRSFDuet-C(N)+S(B)重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含50ug/mL的卡那霉素LB平板培养基，挑选阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，命名为E-C(N)+S(B)。

6.以表1中的C(M)+S(B)-CF和C(M)+S(B)-CR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.7序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Mycobacterium marinum的羧酸还原酶基因Car，所述基因序列如SEQ ID NO.7所示。以表1中的C(M)+S(B)-SF和C(M)+S(B)-SR为上下游引物，公司合成SEQ ID NO.10序列为模板，通过PCR扩增得到来源于Bacillus subtilis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp，所述基因序列如SEQ ID NO.10所示。然后将来源于Mycobacterium marinum的羧酸还原酶基因Car与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII进行消化，将来源于Bacillus subtilis的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp与pRSFDuet-1质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行消化，依次插入到表达质粒pRSFDuet-1得到pRSFDuet-C(M)+S(B)重组质粒，将pRSFDuet-C(M)+S(B)重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含50ug/mL的卡那霉素LB平板培养基，挑选阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，命名为E-C(M)+S(B)。

(二)对工程大肠杆菌进行底物/产物耐受性驯化：

1.将步骤(1)获得的工程菌株E-C(N)+S(N)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香草酸进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香草酸耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(N)+S(N)-A。将步骤(1)获得的工程菌株E-C(N)+S(N)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香兰素进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香兰素耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(N)+S(N)-V，上述工程菌株信息如表2所示。

表2

2.将步骤(1)获得的工程菌株E-C(M)+S(M)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香草酸进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香草酸耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(M)+S(M)-A。将步骤(1)获得的工程菌株E-C(M)+S(M)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香兰素进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香兰素耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(M)+S(M)-V，上述工程菌株信息如表2所示。

3.将步骤(1)获得的工程菌株E-C(M)+S(N)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香草酸进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香草酸耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(M)+S(N)-A。将步骤(1)获得的工程菌株E-C(M)+S(N)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香兰素进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香兰素耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(M)+S(N)-V，上述工程菌株信息如表2所示。

4.将步骤(1)获得的工程菌株E-C(N)+S(M)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香草酸进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香草酸耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(N)+S(M)-A。将步骤(1)获得的工程菌株E-C(N)+S(M)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香兰素进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香兰素耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(N)+S(M)-V，上述工程菌株信息如表2所示。

5.将步骤(1)获得的工程菌株E-C(N)+S(B)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香草酸进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香草酸耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(N)+S(B)-A。将步骤(1)获得的工程菌株E-C(N)+S(B)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香兰素进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香兰素耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(N)+S(B)-V，上述工程菌株信息如表2所示。

6.将步骤(1)获得的工程菌株E-C(M)+S(B)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香草酸进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香草酸耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(M)+S(B)-A。将步骤(1)获得的工程菌株E-C(M)+S(B)分别向固体LB平板中添加了0.1-10.0g/L，优选为0.1g/L，0.3g/L，0.5g/L，0.7g/L的香兰素进行耐受性驯化，其中0.1g/L的香兰素耐受性驯化效果最好，驯化后的的工程菌命名为E-C(M)+S(B)-V，上述工程菌株信息如表2所示。

(三)摇瓶发酵验证工程大肠杆菌催化香草酸生产天然香兰素：

将步骤(1)获得的工程菌株在含50mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，长出的单菌落进行菌落PCR验证、划线纯化等操作，然后挑取合适的阳性克隆接种到含有4mL种子培养基的试管中(加入4微升50mg/L卡那霉素)，过夜培养后转接到含有20mL种子培养基的100mL不带挡板的摇瓶里，培养至细菌生产量(即OD600值)为0.6-0.8后，再转接到含有50mL发酵培养基(添加底物香草酸和50微升50mg/L卡那霉素)的250mL带挡板的摇瓶里，培养至细菌生产量(即OD600值)为0.6-0.8后，添加50微升IPTG，在37℃下培养48～72小时。工程菌株发酵样品的LC-MS/MS的检测结果及其发酵培养产物的出峰时间如图4、图5所示。

(四)生物量的测定

菌株的生物量是利用紫外分光光度计测定菌液在600纳米处的吸光度值表示。

实施例2：培养基的配方

种子培养基的配方包括：酵母粉5.0g/L，氯化钠5.0g/L，蛋白胨10.0g/L；

发酵培养基的配方包括(LB)：酵母粉5.0g/L，氯化钠5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖20.0g/L；

发酵培养基的配方包括(M9)：甘油10.0g/L，葡萄糖3.0g/L，M9 Minimal Salt(5×)11.28g/L，酵母粉5.0g/L，MOPS 2.0g/L；

上罐发酵培养基的配方包括，甘油20.0g/L，葡萄糖10.0g/L，M9 Minimal Salt(5×)11.28g/L，酵母粉5.0g/L，0.05mM CaCl₂，0.5mM MgSO₄，微量元素(100×)：EDTA5 g/L，FeCl₃.6H2O 0.83g/L，ZnCl₂0.084 g/L，CuCl₂.2H₂O 0.013g/L，CoCl₂.2H₂O 0.01g/L，H₃BO₃0.01 g/L，MnCl₂.4H₂O 0.0016g/L。

实施例3：重组菌株的构建—大肠杆菌化学转化方法

从-80℃冰箱中取出购买的E.coli菌株BL21(DE3)感受态细胞置于冰浴中，加入要转化的重组质粒充分混匀后，在冰浴中放置30分钟后，将体系放入42℃水浴中精确计时45秒，然后迅速放入冰浴中保持冰浴2分钟，加入500微升预冷的LB培养基，然后放入37℃摇床中复苏，1小时复苏结束后取100微升菌液涂平板(含有重组质粒对应的抗生素)倒置与37℃培养箱中培养。

实施例4：

对最优工程菌株E-C(M)+S(N)-A的全细胞催化转化过程进行了优化调控，包括底物浓度、菌体生物量、氧气供应与葡萄糖供应等多个在微生物生长和生物转化过程中起着至关重要作用的方面：

(1)底物浓度：

本发明中，所使用的底物香草酸浓度为1.0-30.0g/L，优选为1.0g/L，2.5g/L，5.0g/L，10.0g/L，其中最适的香草酸浓度为5.0g/L。

(2)培养转速：

本发明中，所使用的培养转速为100-400rpm，优选为150rpm，200rpm，250rpm，300rpm，其中最适的培养转速为200rpm。

(3)菌体富集倍数

本发明中，所使用的菌体富集倍数为1-20倍，优选为3倍，5倍，7倍，10倍，其中最适的菌体富集倍数为10倍。

(4)诱导时间：

本发明中，所使用的诱导时间为2-16小时，优选为4小时，8小时，12小时，16小时，其中最适的诱导时间为4小时。

(5)补加碳源：

本发明中，所使用的葡萄糖补加量为1.0-40.0g/L，优选为4.0g/L，6.0g/L，10.0g/L，14.0g/L，20.0g/L，其中最适的葡萄糖补加量为4.0g/L。

(6)最优全细胞催化条件：

本发明中，所筛选出的最优全细胞催化条件为：底物香草酸浓度5.0g/L，转速200rpm，菌体富集10倍，诱导4小时，葡萄糖补加量4.0g/L。如图6所示，在此最优条件下，多次重复实验表明，香兰素的最高产量能够达到2.15g/L，摩尔转化率高达95.1％，是目前相关研究已报道的的最高摩尔转化率。如图7所示，在相同转化条件下，进一步将底物香草酸浓度提升至5.0g/L，香兰素的最高产量能够达到2.77g/L，是目前摇瓶发酵已报道的最高香兰素产量，发酵样品的高效液相色谱(HPLC)检测结果如图1～3。

实施例5：最优工程菌E-C(M)+S(N)-A上罐发酵催化香草酸生产天然香兰素

使用实施例2中的上罐发酵培养基的配方进行工程菌上罐发酵催化香草酸生产天然香兰素，上罐发酵的影响因素包括底物浓度、菌体生物量、氧气供应与葡萄糖供应等多个在微生物生长和生物转化过程中起着至关重要作用的方面：

(1)底物浓度：

本发明中，所使用的底物香草酸浓度为1.0-30.0g/L，优选为2.0g/L，4.0g/L，6.0g/L，8.0g/L，10.0g/L，其中最适的香草酸浓度6.0g/L。

(2)搅拌转速：

本发明中，所使用的搅拌转速为100-600rpm，优选为200rpm，300rpm，400rpm，500rpm，其中最适的培养转速为500rpm。

(3)诱导时间：

本发明中，所使用的诱导时间为2-16小时，优选为4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，其中最适的诱导时间为4小时。

(4)补加碳源：

在本发明中使用了多种补加碳源的方式，其中溶氧联动补加碳源的方式发酵效果最好，所使用的溶氧上限值为5-40％，优选为10％，15％，20％，25％，30％，其中最适的溶氧联动补加碳源的溶氧上限值为30％。

(5)最优上罐发酵条件：

本发明中，所筛选出的最优上罐发酵条件为：底物香草酸浓度6.0g/L，转速500rpm，诱导4小时，溶氧联动补加碳源的溶氧上限值为30％。如图8所示，在此最优上罐条件下，多次重复实验表明，香兰素的最高产量能够达到4.05g/L，是目前已报道的相关研究中生物法催化香草酸生成香兰素的最高产量。

实施例6：工程菌株产物的鉴定

LC-MS/MS的检测方法：重组菌株通过生物法新途径生产的香兰素采用LC-MS/MS进行定性和定量分析，结果由本实验室购买安捷伦牌三重四级杆液质联用仪测定完成。

样品的测定方法为：取发酵上清液，使用甲醇稀释1000倍，之后采用C18柱进行检测。分别检测了香兰素标准品以及重组菌株发酵产物的出峰时间，结果见图4～5。在相同检测方法及条件下，将香兰素标准品与工程菌株发酵培养产物的出峰时间进行对比可以看出，工程菌株发酵培养产物的出峰时间与香兰素标准品的出峰时间几乎完全一致，由此证明发酵产物是香兰素。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种合成香兰素的基因工程菌及其应用

<130> RB2101111-FF

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3525

<212> DNA

<213> （来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Car）

<400> 1

atggcagtgg attcaccgga tgagcggcta cagcgccgca ttgcacagtt gtttgcagaa 60

gatgagcagg tcaaggccgc acgtccgctc gaagcggtga gcgcggcggt gagcgcgccc 120

ggtatgcggc tggcgcagat cgccgccact gttatggcgg gttacgccga ccgcccggcc 180

gccgggcagc gtgcgttcga actgaacacc gacgacgcga cgggccgcac ctcgctgcgg 240

ttacttcccc gattcgagac catcacctat cgcgaactgt ggcagcgagt cggcgaggtt 300

gccgcggcct ggcatcatga tcccgagaac cccttgcgcg caggtgattt cgtcgccctg 360

ctcggcttca ccagcatcga ctacgccacc ctcgacctgg ccgatatcca cctcggcgcg 420

gttaccgtgc cgttgcaggc cagcgcggcg gtgtcccagc tgatcgctat cctcaccgag 480

acttcgccgc ggctgctcgc ctcgaccccg gagcacctcg atgcggcggt cgagtgccta 540

ctcgcgggca ccacaccgga acgactggtg gtcttcgact accaccccga ggacgacgac 600

cagcgtgcgg ccttcgaatc cgcccgccgc cgccttgccg acgcgggcag cttggtgatc 660

gtcgaaacgc tcgatgccgt gcgtgcccgg ggccgcgact taccggccgc gccactgttc 720

gttcccgaca ccgacgacga cccgctggcc ctgctgatct acacctccgg cagcaccgga 780

acgccgaagg gcgcgatgta caccaatcgg ttggccgcca cgatgtggca ggggaactcg 840

atgctgcagg ggaactcgca acgggtcggg atcaatctca actacatgcc gatgagccac 900

atcgccggtc gcatatcgct gttcggcgtg ctcgctcgcg gtggcaccgc atacttcgcg 960

gccaagagcg acatgtcgac actgttcgaa gacatcggct tggtacgtcc caccgagatc 1020

ttcttcgtcc cgcgcgtgtg cgacatggtc ttccagcgct atcagagcga gctggaccgg 1080

cgctcggtgg cgggcgccga cctggacacg ctcgatcggg aagtgaaagc cgacctccgg 1140

cagaactacc tcggtgggcg cttcctggtg gcggtcgtcg gcagcgcgcc gctggccgcg 1200

gagatgaaga cgttcatgga gtccgtcctc gatctgccac tgcacgacgg gtacgggtcg 1260

accgaggcgg gcgcaagcgt gctgctcgac aaccagatcc agcggccgcc ggtgctcgat 1320

tacaagctcg tcgacgtgcc cgaactgggt tacttccgca ccgaccggcc gcatccgcgc 1380

ggtgagctgt tgttgaaggc ggagaccacg attccgggct actacaagcg gcccgaggtc 1440

accgcggaga tcttcgacga ggacggcttc tacaagaccg gcgatatcgt ggccgagctc 1500

gagcacgatc ggctggtcta tgtcgaccgt cgcaacaatg tgctcaaact gtcgcagggc 1560

gagttcgtga ccgtcgccca tctcgaggcc gtgttcgcca gcagcccgct gatccggcag 1620

atcttcatct acggcagcag cgaacgttcc tatctgctcg cggtgatcgt ccccaccgac 1680

gacgcgctgc gcggccgcga caccgccacc ttgaaatcgg cactggccga atcgattcag 1740

cgcatcgcca aggacgcgaa cctgcagccc tacgagattc cgcgcgattt cctgatcgag 1800

accgagccgt tcaccatcgc caacggactg ctctccggca tcgcgaagct gctgcgcccc 1860

aatctgaagg aacgctacgg cgctcagctg gagcagatgt acaccgatct cgcgacaggc 1920

caggccgatg agctgctcgc cctgcgccgc gaagccgccg acctgccggt gctcgaaacc 1980

gtcagccggg cagcgaaagc gatgctcggc gtcgcctccg ccgatatgcg tcccgacgcg 2040

cacttcaccg acctgggcgg cgattccctt tccgcgctgt cgttctcgaa cctgctgcac 2100

gagatcttcg gggtcgaggt gccggtgggt gtcgtcgtca gcccggcgaa cgagctgcgc 2160

gatctggcga attacattga ggcggaacgc aactcgggcg cgaagcgtcc caccttcacc 2220

tcggtgcacg gcggcggttc cgagatccgc gccgccgatc tgaccctcga caagttcatc 2280

gatgcccgca ccctggccgc cgccgacagc attccgcacg cgccggtgcc agcgcagacg 2340

gtgctgctga ccggcgcgaa cggctacctc ggccggttcc tgtgcctgga atggctggag 2400

cggctggaca agacgggtgg cacgctgatc tgcgtcgtgc gcggtagtga cgcggccgcg 2460

gcccgtaaac ggctggactc ggcgttcgac agcggcgatc ccggcctgct cgagcactac 2520

cagcaactgg ccgcacggac cctggaagtc ctcgccggtg atatcggcga cccgaatctc 2580

ggtctggacg acgcgacttg gcagcggttg gccgaaaccg tcgacctgat cgtccatccc 2640

gccgcgttgg tcaaccacgt ccttccctac acccagctgt tcggccccaa tgtcgtcggc 2700

accgccgaaa tcgtccggtt ggcgatcacg gcgcggcgca agccggtcac ctacctgtcg 2760

accgtcggag tggccgacca ggtcgacccg gcggagtatc aggaggacag cgacgtccgc 2820

gagatgagcg cggtgcgcgt cgtgcgcgag agttacgcca acggctacgg caacagcaag 2880

tgggcggggg aggtcctgct gcgcgaagca cacgatctgt gtggcttgcc ggtcgcggtg 2940

ttccgttcgg acatgatcct ggcgcacagc cggtacgcgg gtcagctcaa cgtccaggac 3000

gtgttcaccc ggctgatcct cagcctggtc gccaccggca tcgcgccgta ctcgttctac 3060

cgaaccgacg cggacggcaa ccggcagcgg gcccactatg acggcttgcc ggcggacttc 3120

acggcggcgg cgatcaccgc gctcggcatc caagccaccg aaggcttccg gacctacgac 3180

gtgctcaatc cgtacgacga tggcatctcc ctcgatgaat tcgtcgactg gctcgtcgaa 3240

tccggccacc cgatccagcg catcaccgac tacagcgact ggttccaccg tttcgagacg 3300

gcgatccgcg cgctgccgga aaagcaacgc caggcctcgg tgctgccgtt gctggacgcc 3360

taccgcaacc cctgcccggc ggtccgcggc gcgatactcc cggccaagga gttccaagcg 3420

gcggtgcaaa cagccaaaat cggtccggaa caggacatcc cgcatttgtc cgcgccactg 3480

atcgataagt acgtcagcga tctggaactg cttcagctgc tctga 3525

<210> 2

<211> 3525

<212> DNA

<213> （来源于海分枝杆菌的基因Car）

<400> 2

atgtcgccaa tcacgcgtga agagcggctc gagcgccgca tccaggacct ctacgccaac 60

gacccgcagt tcgccgccgc caaacccgcc acggcgatca ccgcagcaat cgagcggccg 120

ggtctaccgc taccccagat catcgagacc gtcatgaccg gatacgccga tcggccggct 180

ctcgctcagc gctcggtcga attcgtgacc gacgccggca ccggccacac cacgctgcga 240

ctgctccccc acttcgaaac catcagctac ggcgagcttt gggaccgcat cagcgcactg 300

gccgacgtgc tcagcaccga acagacggtg aaaccgggcg accgggtctg cttgttgggc 360

tcaacagcg tcgactacgc cacgatcgac atgactttgg cgcggctggg cgcggtggcc 420

gtaccactgc agaccagcgc ggcgataacc cagctgcagc cgatcgtcgc cgagacccag 480

cccaccatga tcgcggccag cgtcgacgca ctcgctgacg ccaccgaatt ggctctgtcc 540

ggtcagaccg ctacccgagt cctggtgttc gaccaccacc ggcaggttga cgcacaccgc 600

cagcggtcg aatccgcccg ggagcgcctg gccggctcgg cggtcgtcga aaccctggcc 660

aggccatcg cgcgcggcga cgtgccccgc ggtgcgtccg ccggctcggc gcccggcacc 720

gatgtgtccg acgactcgct cgcgctactg atctacacct cgggcagcac gggtgcgccc 780

aagggcgcga tgtacccccg acgcaacgtt gcgaccttct ggcgcaagcg cacctggttc 840

gaaggcggct acgagccgtc gatcacgctg aacttcatgc caatgagcca cgtcatgggc 900

cgccaaatcc tgtacggcac gctgtgcaat ggcggcaccg cctacttcgt ggcgaaaagc 960

gatctctcca ccttgttcga agacctggcg ctggtgcggc ccaccgagct gaccttcgtg 1020

ccgcgcgtgt gggacatggt gttcgacgag tttcagagtg aggtcgaccg ccgcctggtc 1080

gacggcgccg accgggtcgc gctcgaagcc caggtcaagg ccgagatacg caacgacgtg 1140

ctcggtggac ggtataccag cgcactgacc ggctccgccc ctatctccga cgagatgaag 1200

gcgtgggtcg aggagctgct cgacatgcat ctggtcgagg gctacggctc caccgaggcc 1260

gggatgatcc tgatcgacgg agccattcgg cgcccggcgg tactcgacta caagctggtc 1320

gatgttcccg acctgggtta cttcctgacc gaccggccac atccgcgggg cgagttgctg 1380

gtcaagaccg atagtttgtt cccgggctac taccagcgag ccgaagtcac cgccgacgtg 1440

ttcgatgctg acggcttcta ccggaccggc gacatcatgg ccgaggtcgg ccccgaacag 1500

ttcgtgtacc tcgaccgccg caacaacgtg ttgaagctgt cgcagggcga gttcgtcacc 1560

gtctccaaac tcgaagcggt gtttggcgac agcccactgg tacggcagat ctacatctac 1620

ggcaacagcg cccgtgccta cctgttggcg gtgatcgtcc ccacccagga ggcgctggac 1680

gccgtgcctg tcgaggagct caaggcgcgg ctgggcgact cgctgcaaga ggtcgcaaag 1740

gccgccggcc tgcagtccta cgagatcccg cgcgacttca tcatcgaaac aacaccatgg 1800

acgctggaga acggcctgct caccggcatc cgcaagttgg ccaggccgca gctgaaaaag 1860

cattacggcg agcttctcga gcagatctac acggacctgg cacacggcca ggccgacgaa 1920

ctgcgctcgc tgcgccaaag cggtgccgat gcgccggtgc tggtgacggt gtgccgtgcg 1980

gcggccgcgc tgttgggcgg cagcgcctct gacgtccagc ccgatgcgca cttcaccgat 2040

ttgggcggcg actcgctgtc ggcgctgtcg ttcaccaacc tgctgcacga gatcttcgac 2100

atcgaagtgc cggtgggcgt catcgtcagc cccgccaacg acttgcaggc cctggccgac 2160

tacgtcgagg cggctcgcaa acccggctcg tcacggccga ccttcgcctc ggtccacggc 2220

gcctcgaatg ggcaggtcac cgaggtgcat gccggtgacc tgtccctgga caaattcatc 2280

gatgccgcaa ccctggccga agctccccgg ctgcccgccg caaacaccca agtgcgcacc 2340

gtgctgctga ccggcgccac cggcttcctc gggcgctacc tggccctgga atggctggag 2400

cggatggacc tggtcgacgg caaactgatc tgcctggtcc gggccaagtc cgacaccgaa 2460

gcacgggcgc ggctggacaa gacgttcgac agcggcgacc ccgaactgct ggcccactac 2520

cgcgcactgg ccggcgacca cctcgaggtg ctcgccggtg acaagggcga agccgacctc 2580

ggactggacc ggcagacctg gcaacgcctg gccgacacgg tcgacctgat cgtcgacccc 2640

gcggccctgg tcaaccacgt actgccatac agccagctgt tcgggcccaa cgcgctgggc 2700

accgccgagc tgctgcggct ggcgctcacc tccaagatca agccctacag ctacacctcg 2760

acaatcggtg tcgccgacca gatcccgccg tcggcgttca ccgaggacgc cgacatccgg 2820

gtcatcagcg ccacccgcgc ggtcgacgac agctacgcca atggctactc gaacagcaag 2880

tgggccggcg aggtgctgtt gcgcgaggcg catgacctgt gtggcctgcc ggttgcggtg 2940

ttccgctgcg acatgatcct ggccgacacc acatgggcgg gacagctcaa tgtgccggac 3000

atgttcaccc ggatgatcct gagcctggcg gccaccggta tcgcgccggg ttcgttctat 3060

gagcttgcgg ccgacggcgc ccggcaacgc gcccactatg acggtctgcc cgtcgagttc 3120

atcgccgagg cgatttcgac tttgggtgcg cagagccagg atggtttcca cacgtatcac 3180

gtgatgaacc cctacgacga cggcatcgga ctcgacgagt tcgtcgactg gctcaacgag 3240

tccggttgcc ccatccagcg catcgctgac tatggcgact ggctgcagcg cttcgaaacc 3300

gcactgcgcg cactgcccga tcggcagcgg cacagctcac tgctgccgct gttgcacaac 3360

tatcggcagc cggagcggcc cgtccgcggg tcgatcgccc ctaccgatcg cttccgggca 3420

gcggtgcaag aggccaagat cggccccgac aaagacattc cgcacgtcgg cgcgccgatc 3480

atcgtgaagt acgtcagcga cctgcgccta ctcggcctgc tctga 3525

<210> 3

<211> 669

<212> DNA

<213> （来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Sfp）

<400> 3

atgatcgaga caattttgcc tgctggtgtc gagtcggctg agctgctgga gtatccggag 60

gacctgaagg cgcatccggc ggaggagcat ctcatcgcga agtcggtgga gaagcggcgc 120

cgggacttca tcggggccag gcattgtgcc cggctggcgc tggctgagct cggcgagccg 180

ccggtggcga tcggcaaagg ggagcggggt gcgccgatct ggccgcgcgg cgtcgtcggc 240

agcctcaccc attgcgacgg atatcgggcc gcggcggtgg cgcacaagat gcgcttccgt 300

tcgatcggca tcgatgccga gccgcacgcg acgctgcccg aaggcgtgct ggattcggtc 360

agcctgccgc cggagcggga gtggttgaag accaccgatt ccgcactgca cctggaccgt 420

ttactgttct gcgccaagga agccacctac aaggcgtggt ggccgctgac cgcgcgctgg 480

ctcggcttcg aggaagcgca catcaccttc gagatcgaag acggctccgc cgattccggc 540

aacggcacct ttcacagcga gctgctggtg ccgggacaga cgaatgacgg tgggacgccg 600

ctgctttcgt tcgacggccg gtggctgatc gccgacgggt tcatcctcac cgcgatcgcg 660

tacgcctga 669

<210> 4

<211> 684

<212> DNA

<213> （来源于海分枝杆菌的基因Sfp）

<400> 4

atgacggtag gcacgctggt ggcgtcggtg ttgccggcga ccgtgttcga ggatttggcg 60

tatgccgagt tgtactccga cccacccggt ctcaccccgc tgcccgagga ggcgccgttg 120

atcgcacgat cggttgccaa gcggcgcaac gaattcatca ccgtgcgtca ctgcgcccgc 180

atcgcgctgg accagctcgg tgtgccgccg gcgccgatcc tcaagggcga caagggcgaa 240

ccgtgctggc ccgacggcat ggtcggtagc ctcacccact gcgccggtta ccgcggcgcg 300

gttgtcggac gcagggatgc ggtgcgttcc gtgggcatcg acgccgaacc gcacgacgtg 360

ttgcccaatg gtgtgctgga tgcgatcagc ctgccggccg agcgcgccga catgccccgc 420

accatgccag cggcgttgca ttgggatcga atcctgttct gcgccaagga agcaacgtac 480

aaggcgtggt ttccgctgac caagaggtgg ctgggtttcg aggacgcgca catcacgttc 540

gaaaccgata gcaccggctg gacgggtcgc ttcgtctccc gtatcctcat cgacgggtcc 600

accctgtcgg gtccgccgct gacaacgctg cggggacgct ggtcggttga gcgcggactg 660

gtgctgaccg cgatcgtgct atga 684

<210> 5

<211> 675

<212> DNA

<213> （来源于枯草芽孢杆菌的基因Sfp）

<400> 5

atgaagattt acggaattta tatggaccgc ccgctttcac aggaagaaaa tgaacggttc 60

atgactttca tatcacctga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 120

gctcaccgca ccctgctggg agatgtgctc gttcgctcag tcataagcag gcagtatcag 180

ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccgtg catccctgat 240

cttcccgacg ctcatttcaa catttctcac tccggccgct gggtcattgg tgcgtttgat 300

tcacagccga tcggcataga tatcgaaaaa acgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 360

cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcaa aagacaagga cgagcagaca 420

gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacagga aggcaaaggc 480

ttatcgcttc cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcatc aggacggaca agtatccatt 540

gagcttccgg acagccattc cccatgctat atcaaaacgt atgaggtcga tcccggctac 600

aaaatggctg tatgcgccgc acaccctgat ttccccgagg atatcacaat ggtctcgtac 660

gaagagcttt tataa 675

<210> 6

<211> 3525

<212> DNA

<213> （来源于艾阿华诺卡氏菌且经过密码子优化的基因Car）

<400> 6

atggcggttg attctccgga tgaacgtctg cagcgtcgta tcgcacagct gtttgccgaa 60

gatgaacagg taaaagctgc acgtccgctg gaagcagtta gcgcggcggt tagcgcgccg 120

ggcatgcgtc tggctcagat cgcagctacc gttatggcgg gttacgctga ccgtccggcg 180

gcaggtcagc gtgcttttga actgaacact gatgatgcaa ccggccgtac tagcctgcgt 240

ctgctgccgc gttttgaaac catcacctac cgtgaactgt ggcagcgtgt tggtgaagtt 300

gcggctgcgt ggcaccatga cccggaaaat ccgctgcgcg caggtgattt cgtggctctg 360

ctgggcttca cttccatcga ctacgcgacc ctggatctgg ccgatatcca cctgggtgcg 420

gtgaccgtac cgctgcaggc ctcggcggca gtctcgcagc tgattgctat cctgactgaa 480

acctctccgc gtttattagc aagtacgccg gagcatctgg acgcagccgt ggaatgtctg 540

ttggctggta cgaccccgga acgcctggtt gttttcgact accatccaga agatgacgac 600

cagcgtgcag catttgaatc tgcgcgtcgt cgtttagctg atgctggcag cctggtgatt 660

gtagaaaccc tggacgcggt tcgcgcacgt ggccgtgatc tgccggctgc gccgctgttt 720

gttccggata ctgatgacga cccgctcgca ctcctcattt acacctctgg tagcaccggt 780

accccgaaag gcgcaatgta tactaaccgt ctggcggcga ctatgtggca gggcaacagc 840

atgctgcagg gtaactcaca gcgtgttggt atcaacttga actatatgcc aatgtcccac 900

atcgcgggtc gtatctctct gttcggcgtg ctggcacgtg gcggcaccgc gtatttcgca 960

gctaaatcgg acatgtctac cctgttcgaa gatatcggcc tggtgcgtcc aactgaaatc 1020

ttcttcgttc cgcgtgtttg tgacatggtg ttccagcgct accagtctga actggaccgc 1080

cgttccgtgg ctggtgctga tctggacacc ctggatcgtg aagtaaaagc tgatctgcgc 1140

caaaactacc tgggtggtcg ctttctggtt gctgtggtag gtagcgcacc gctggctgca 1200

gaaatgaaaa ccttcatgga atctgtgctg gacctcccgc tgcacgacgg ctatggttct 1260

actgaagctg gcgcatccgt tctgttagat aaccaaattc agcgtccgcc agttttagac 1320

tataaattag ttgatgtgcc ggaattaggc tacttccgca ctgatcgtcc gcacccccgt 1380

ggtgaactgc tgctgaaagc agaaaccacc atccctggtt actacaaacg tccggaagtg 1440

accgctgaga tcttcgatga agatggcttc tacaagaccg gtgacattgt agctgaactg 1500

gaacatgatc gcctggttta cgttgatcgc cgcaacaacg ttctgaaact gagtcagggt 1560

gaattcgtca ctgtggcgca tctggaggca gtctttgcga gctcaccgct gatccgtcag 1620

atcttcatct acggttcttc cgaacgcagc tatctgcttg ccgttattgt tccaaccgac 1680

gatgcattgc gtggccgtga cacggcgact ctgaaatctg cactggcgga aagcattcag 1740

cgcatcgcga aagatgcgaa cctgcagccg tacgaaatcc ctcgtgactt cttaatcgag 1800

accgaaccgt ttaccatcgc gaacggcctg ctgagcggca ttgctaaact gctgcgtccg 1860

aacctgaaag aacgttacgg tgcccagctg gaacagatgt atactgacct cgcaacgggc 1920

caggcagatg aactgctggc tctgcgtcgc gaagccgccg atctgccggt tctggaaacc 1980

gtatcgcgtg ctgccaaagc tatgctgggc gttgcttccg cggacatgcg ccctgacgct 2040

cacttcactg atctgggcgg tgattcttta tccgctctgt ctttttctaa cctgctgcac 2100

gaaattttcg gtgttgaagt cccggttggt gttgttgtgt ccccggctaa cgaactgcgt 2160

gaccttgcga actatatcga ggcggaacgc aacagcggcg ctaaacgtcc gactttcact 2220

agtgtgcatg gcggtggttc tgaaatccgt gcggctgacc tgaccttaga taaattcatt 2280

gacgcccgta ccctggcggc ggcggattca attccgcatg ctccggtgcc ggctcagacc 2340

gttctgctga caggcgcgaa cggctatctt ggtcgttttc tctgcctgga atggctggaa 2400

cgtctggata aaactggcgg caccttgatc tgcgttgttc gtggttccga tgcggcagca 2460

gctcgcaaac gcctggattc cgcgttcgat agcggcgatc cgggcctgct cgaacactac 2520

cagcagctgg ccgctcgcac gctggaagta ttagcgggcg acatcggtga tccgaatctt 2580

ggtctggacg atgcgacttg gcaacgtttg gcggaaaccg ttgatctgat tgttcacccg 2640

gcggcgctgg ttaaccacgt cctgccgtac acccaattgt tcggcccgaa cgtcgttggc 2700

acagcagaaa tcgttcgtct ggctatcacc gcacgtcgca aaccggttac ctatctgagc 2760

accgtgggtg ttgctgacca ggttgacccg gcggagtatc aagaagattc tgatgtgcgc 2820

gaaatgtcag ctgtgcgtgt tgttcgcgaa tcctacgcta acggctatgg taacagcaaa 2880

tgggctggtg aagtgctgct gcgtgaagca catgatctgt gtggtctgcc ggtggcagtt 2940

ttccgttctg atatgatcct ggcccactcc cgttatgccg gtcagctgaa tgtgcaggac 3000

gtgtttaccc gtctgatcct gtctctggta gcaactggca tcgcaccgta cagcttttac 3060

cgtaccgacg cggacggcaa ccgccagcgt gctcattacg atggcctgcc ggctgatttc 3120

accgccgcgg cgattaccgc gctgggtatc caggccaccg agggtttccg tacctatgat 3180

gtgctgaacc cttacgacga cggcatttcc ctggacgaat tcgtggattg gctggttgaa 3240

tctggtcacc cgatccagcg catcaccgac tactctgatt ggttccaccg cttcgaaacc 3300

gccatccgtg cactgccgga aaaacagcgt caggcgtccg ttctgccgct gctggatgcg 3360

taccgtaacc cgtgcccggc cgtgcgtggc gcgatcctgc cggcgaaaga attccaagca 3420

gcggtgcaga ctgcaaaaat tggtccggaa caggatatcc cgcacctgag cgccccgctg 3480

atcgataaat atgttagcga cctggaactg ctgcagctgc tgtaa 3525

<210> 7

<211> 3525

<212> DNA

<213> （来源于海分枝杆菌且经过密码子优化的基因Car）

<400> 7

atgtcgccga tcacccgtga agaacgtctg gaacgtcgta tccaggatct gtacgctaac 60

gatccgcagt tcgcagcggc taaaccggct accgcgatca ccgcggcaat tgaacgtccg 120

ggtctgccgc tgccgcagat cattgaaacc gtgatgaccg gctacgctga tcgtccggct 180

ctggcacagc gttctgttga attcgtgacg gatgcgggta ctggtcacac caccctgcgc 240

ctgctgccgc acttcgaaac catcagctac ggtgaactgt gggatcgcat tagcgcgctg 300

gctgatgttc tgagcacgga acagactgtt aaacctggtg atcgtgtgtg tctgttgggt 360

ttcaatagtg tggattacgc taccatcgat atgactctgg cacgtctggg tgctgttgca 420

gtgccgctgc agaccagcgc ggcgattact cagctgcagc cgattgtggc agaaactcag 480

ccgaccatga ttgcggcctc cgttgatgca ttagcagatg cgacggaact ggcgctgagc 540

ggccagaccg cgactcgtgt tctggtcttt gaccaccatc gtcaggttga tgcccatcgt 600

gcagcggttg aatctgcccg tgaacgctta gccggcagcg cggttgttga aaccctggcg 660

gaggctatcg cccgtggtga tgttcctcgc ggtgctagcg cgggctctgc gccaggtact 720

gatgtgtctg acgatagcct ggcgctgtta atttacactt ctggtagcac cggcgcgccg 780

aaaggtgcca tgtatccgcg tcgtaacgtt gcgaccttct ggcgtaaacg cacctggttt 840

gaaggtggtt atgaaccatc tatcacttta aacttcatgc cgatgtcaca tgtgatgggt 900

cgtcagatcc tgtacggcac cctgtgtaac ggcggcaccg catatttcgt tgcaaaatct 960

gacctgtcca cgctgttcga ggatctggcg ctggtgcggc cgaccgaact gaccttcgtc 1020

ccgcgcgttt gggacatggt gttcgacgaa tttcagtccg aagttgaccg ccgtctggtg 1080

gacggggcag atcgcgttgc gctggaggca caagtcaaag cggagatccg caacgatgtt 1140

ctgggcggtc gttataccag cgcactgact ggcagcgcac cgatttccga tgaaatgaaa 1200

gcctgggtag aagaactgct cgacatgcac ctggtcgaag gctacggatc taccgaggcg 1260

ggcatgatcc tgattgacgg tgccatccgc cgcccggctg tgcttgacta taaactggtt 1320

gatgtgccgg atctcggtta tttcctgact gaccgcccgc atccgcgtgg cgaactgctg 1380

gtcaaaactg actctttatt cccaggctac tatcagcgtg cggaagttac ggcggacgtg 1440

tttgatgccg atggctttta ccgtactggc gacattatgg ctgaagtggg tcctgaacag 1500

ttcgtttacc tggaccgccg taacaacgtt ctgaaactga gccagggtga atttgtgact 1560

gtttctaaac tggaagccgt tttcggtgat tcgccgctgg ttcgccagat ctacatttac 1620

ggtaactccg cccgtgcata cctcttagcc gtgattgttc cgacgcaaga agctctggat 1680

gcggttcctg tggaagagct gaaagcacgc ctgggtgact ctctgcagga agtggccaaa 1740

gccgcgggtc tgcagagcta cgaaatccct cgtgacttca tcatcgagac cactccgtgg 1800

actctggaga acggcctgct gaccggcatt cgcaaactgg cacgcccgca gcttaaaaaa 1860

cattacggtg aactgttaga acagatttac accgatctgg cgcatggcca agcagacgag 1920

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gcggcagcgc tgctcggcgg ttctgcgtct gacgtgcagc cggatgctca tttcactgat 2040

ttgggcggcg attccctgtc tgcgctgtca tttaccaacc tgcttcatga aatctttgat 2100

attgaagttc cggttggtgt aattgttagc ccggctaatg acctccaggc gctggcggac 2160

tacgtggaag cggcacgtaa accgggtagc agccgcccaa ccttcgcaag cgttcacggc 2220

gcgtctaacg gccaggtaac tgaagttcac gccggtgatc tttccttgga caaattcatc 2280

gatgctgcga ctctggcaga agcgccgcgc ctgccggcag ctaacaccca ggtgcgtacc 2340

gtcctgctga ccggcgcaac cggtttcctg gggcgctatc tggcactgga atggctggaa 2400

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cgtgcgctgg ccggtgacca cctggaagtt ctggcaggcg ataaaggtga agcagatctg 2580

ggtctggatc gtcagacttg gcaacgtctg gcagacactg ttgatctgat cgttgaccca 2640

gctgcgctgg tcaaccacgt tttgccgtat tctcagctgt ttggtccgaa cgctctgggt 2700

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accatcggtg tggccgatca aatccctccg agcgccttca ccgaggacgc tgacatccgc 2820

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tttcgttgcg acatgatcct ggcggacact acgtgggctg gtcagctgaa cgtgccggac 3000

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gtgatgaacc cttatgatga tggcatcggt ctggatgagt ttgtagattg gctgaacgaa 3240

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gcgctgcgtg ccctgccgga tcgtcagcgt cattcctcgc tgctgccgct gctgcataac 3360

taccgccagc cagaacgtcc ggttcgtggt agcatcgcac cgaccgatcg tttccgtgct 3420

gccgtgcagg aagcgaaaat cggtccggat aaagatattc cgcacgttgg tgcgccgatt 3480

atcgttaaat acgtgtccga tctgcgtctg ctgggcctgc tgtaa 3525

<210> 8

<211> 669

<212> DNA

<213> （来源于艾阿华诺卡氏菌且经过密码子优化的基因Sfp）

<400> 8

atgatcgaaa ccatcctgcc ggcgggtgtt gaaagcgcgg aactgctgga atacccggaa 60

gatctgaaag cgcacccggc ggaagaacac ctgatcgcga aaagcgttga aaaacgtcgt 120

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ccggttgcga tcggtaaagg cgaacgtggc gcgccgatct ggccgcgtgg cgttgttggc 240

tccctgaccc actgcgatgg gtaccgcgcg gcggcggttg cgcacaaaat gcgtttccgt 300

agcatcggca tcgatgcgga accgcacgcg accctgccgg aaggcgttct ggattctgtt 360

agcctgccgc cggaacgtga atggctgaaa accaccgatt ctgcgctgca cctggatcgt 420

ctgctgttct gcgcgaaaga agcaacctac aaagcgtggt ggccgctgac cgctcgttgg 480

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aatggtactt tccatagtga actgctggta ccggggcaga ccaacgacgg aggtaccccg 600

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tatgcgtaa 669

<210> 9

<211> 684

<212> DNA

<213> （来源于海分枝杆菌且经过密码子优化的基因Sfp）

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tacgctgaac tgtattctga tccgccgggc ctgaccccac tgccggaaga agctccactg 120

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gttgttggcc gtcgtgatgc ggttcgttct gttggcatcg atgcggaacc gcacgatgtt 360

ctgccgaacg gtgttctgga cgcgatcagc ctgccggcgg aacgtgcgga tatgccgcgt 420

accatgccgg cggcgctgca ctgggatcgt atcctgttct gcgcgaaaga agcgacctac 480

aaagcgtggt tcccgctgac caaacgttgg ctgggtttcg aagatgcgca catcaccttc 540

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gttctgactg cgatcgttct gtaa 684

<210> 10

<211> 675

<212> DNA

<213> （来源于枯草芽孢杆菌且经过密码子优化的基因Sfp）

<400> 10

atgaaaatct acggcatcta catggatcgt ccgctgagcc aggaagaaaa cgaacgtttc 60

atgaccttca tcagcccgga aaaacgtgaa aaatgccgtc gtttctacca caaagaagat 120

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ctggataaaa gcgatatccg tttcagcacc caggaatacg gtaaaccgtg catcccggat 240

ctgccggatg cgcacttcaa catcagccac agcggtcgtt gggttatcgg tgcgttcgat 300

tctcagccga tcggcatcga tatcgaaaaa accaaaccga tcagcctgga aatcgcgaaa 360

cgtttcttca gcaaaaccga atacagcgat ctgctggcga aagataaaga tgaacagacc 420

gattacttct accacctgtg gtctatgaaa gaatctttca tcaaacagga aggcaaaggc 480

ctgagcttac cgctggatag cttcagcgtt cgtctgcacc aggacggaca ggttagtatt 540

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<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(N)-CF）

<400> 11

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<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(N)-CR）

<400> 12

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<210> 13

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<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(N)-SF）

<400> 13

ggaattccat atgatgatcg aaaccatcct gccg 34

<210> 14

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<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(N)-SR）

<400> 14

ccgctcgagt tacgcataag cgattgccgt ca 32

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<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(M)-CF）

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<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(M)-CR）

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cccaagcttt tacagcaggc ccagcagac 29

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<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(M)-SF）

<400> 17

ggaattccat atgatgaccg ttggtacttt agtagctt 38

<210> 18

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<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(M)-SR）

<400> 18

ccgctcgagt tacagaacga tcgcagtcag aacc 34

<210> 19

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<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(M)-CF）

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cgcggatccc atggcggttg attctccgg 29

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<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(M)-CR）

<400> 20

cccaagcttt tacagcagct gcagcagttc 30

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<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(M)-SF）

<400> 21

ggaattccat atgatgaccg ttggtacttt agtagctt 38

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(M)-SR）

<400> 22

ccgctcgagt tacagaacga tcgcagtcag aacc 34

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<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(N)-CF）

<400> 23

cgcggatccc atgtcgccga tcacccgtg 29

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(N)-CR）

<400> 24

cccaagcttt tacagcaggc ccagcagac 29

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<212> DNA

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<400> 25

ggaattccat atgatgatcg aaaccatcct gccg 34

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(N)-SR）

<400> 26

ccgctcgagt tacgcataag cgattgccgt ca 32

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(B)-CF）

<400> 27

cgcggatccc atgtcgccga tcacccgtg 29

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(B)-CR）

<400> 28

cccaagcttt tacagcaggc ccagcagac 29

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(B)-SF）

<400> 29

ggaattccat atgatgaaaa tctacggcat ctacatgga 39

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> （引物C(M)+S(B)-SR）

<400> 30

ccgctcgagt tacagcagtt cttcatagct aaccatc 37

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(B)-CF）

<400> 31

cgcggatccc atggcggttg attctccgg 29

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(B)-CR）

<400> 32

cccaagcttt tacagcagct gcagcagttc 30

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(B)-SF）

<400> 33

ggaattccat atgatgaaaa tctacggcat ctacatgga 39

<210> 34

<211> 37

<212> DNA

<213> （引物C(N)+S(B)-SR）

<400> 34

ccgctcgagt tacagcagtt cttcatagct aaccatc 37

Claims

1.一种合成香兰素的基因工程菌，其包括由香草酸合成天然香兰素的途径：香草酸在羧酸还原酶Car和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp的催化作用下生成天然香兰素。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为含有编码羧酸还原酶的基因Car和编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的基因Sfp的合适宿主生物体。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码羧酸还原酶的基因Car包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Car、来源于海分枝杆菌的基因Car以及基于上述基因的序列的不引起所述羧酸还原酶功能改变的基因取代、缺失、加入或密码子优化；优选地，所述编码羧酸还原酶的基因Car包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Car或来源于艾阿华诺卡氏菌且经过密码子优化的基因Car、来源于海分枝杆菌的基因Car或来源于海分枝杆菌且经过密码子优化的基因Car。

4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Sfp、来源于海分枝杆菌的基因Sfp、来源于枯草芽孢杆菌的基因Sfp以及基于上述基因的序列的不引起所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶功能改变的基因取代、缺失、加入或密码子优化；优选地，所述编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因Sfp包括来源于艾阿华诺卡氏菌的基因Sfp或来源于艾阿华诺卡氏菌且经过密码子优化的基因Sfp、来源于海分枝杆菌的基因Sfp或来源于海分枝杆菌且经过密码子优化的基因Sfp、来源于枯草芽孢杆菌的基因Sfp或来源于枯草芽孢杆菌且经过密码子优化的基因Sfp。

5.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述合适宿主生物体包括大肠杆菌BL21(DE3)、酿酒酵母S288C、毕赤酵母X-33、亚罗酵母ATCC:MYA-2613和谷氨酸棒状杆菌ATCC:13032。

6.一种利用权利要求1-5中任意一项所述的合成香兰素的工程菌由香草酸合成天然香兰素的方法，其包括：将合成香兰素的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得香兰素。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的底物香草酸浓度为1.0-30.0g/L，优选为1.0-10.0g/L；和/或，发酵培养的过程中，葡萄糖补加量为1.0-40.0g/L，优选为4.0-20.0g/L。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养转速为100-400rpm，优选为150-300rpm。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养的菌体富集倍数为1-20倍，优选为3-10倍。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养的过程中，诱导时间为2-16小时，优选为4-16小时。