KR20150127034A

KR20150127034A - 대사 공학을 통한 에르고티오네인 생성

Info

Publication number: KR20150127034A
Application number: KR1020157019727A
Authority: KR
Inventors: 핑후아 리오우; 헝 송; 원 후
Original assignee: 핑후아 리오우; 원 후; 헝 송
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-11-16
Also published as: WO2014100752A1; US10167490B2; JP6494522B2; EP2935603A4; KR102116734B1; CN104854245B; CN104854245A; EP2935603A1; JP2016502859A; US20150225755A1

Abstract

본 발명은 대사 공학에 의해 생성된 미생물을 이용하여 시험관내 효소적 형질전환 또는 발효를 통한 에르고티오네인의 생성에 관한 것이다. 또한 그러한 방법에서 유용한 형질전환된 세포 및 그러한 방법에 의해 생성된 에르고티오네인이 기재된다. 본 발명의 형질전환된 세포는 형질전환되지 않은 야생형 세포보다 큰 효율로 히스티딘과 시스테인 또는 헤르시닌과 시스테인을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있다.

Description

대사 공학을 통한 에르고티오네인 생성{ERGOTHIONEINE PRODUCTION THROUGH METABOLIC ENGINEERING}

관련 출원

본 출원은 2012년 12월 21일 출원된 미국 가특허출원 61/740,829호에 대한 우선권 및 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.

정부 지원

본 발명은 국립건강연구소에 의해 수여된 허가번호 GM093903호 및 국립 과학 재단에 의해 수여된 CHE-0748504호 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.

기술 분야

본 발명은 일반적으로 대사 공학에 의해 생성된 균주를 이용하여 세포-비함유 효소적 형질전환 또는 발효를 통한 에르고티오네인의 생성에 관한 것이다.

배경기술

에르고티오네인은 1909년에 Tanret에 의해 에르고트로부터 분리된 티올-함유 아미노산이다. 이의 독특한 산화환원-특성은 이를 최상의 천연 항산화제 중 하나로 만들었다. 또한, 다수의 인체 조직(예컨대, 간, 신장, 중추신경계 및 적혈구 세포)에 의한 식품으로부터의 이의 특수한 풍부화로 인해, 에르고티오네인은 인간 생리학에서 많은 유익한 역할을 하는 것으로 제안되었다. 현재, 에르고티오네인은 수십억 달러의 시장을 지닌 안티-에이징 제품의 핵심 구성요소로서 널리 사용되고 있다.

에르고티오네인은 5개-효소적 단계를 통해 2개의 아미노산(히스티딘 및 시스테인)으로부터 생성된다. 그러나, 발효를 통한 이의 생산을 위해 현재까지 알려진 에르고티오닌 생합성 경로의 이용을 막는 세 가지 주요 장벽이 있다: (i) EgtE 효소는 과발현될 수 없다; (ii) EgtB의 활성은 낮다; 3) 생성 수율을 제한할, γ-Glu-Cys에 대한 에르고티오네인과 글루타티온 간의 잠재적인 경쟁. 따라서, 현재, 에르고티오네인은 화학적 접근법을 이용하여 생성된다. 이와 같이, 에르고티오네인의 재조합 생합성에 대한 필요성이 당 분야에 남아 있다.

개요

세포-비함유 효소적 시스템 또는 세포 배양 시스템에서 에르고티오네인의 생성을 증가, 향상, 또는 최대화하기 위한 신규한 효소적 방법 및 대사 공학 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 대사 공학에 의해 생성된 조작된 미생물을 이용하는 세포-비함유 효소적 시스템 및 세포 배양 시스템은 에르고티오네인을 보다 높은 수준으로 생성하기 위해 이용될 수 있다. 본원에 기재된 이러한 공정은 다음과 같은 발명자들의 발견에 기초한다: 1) 세포-비함유 형질전환 또는 발효에 의한 현재까지 공지된 에르고티오네인 생합성 경로를 이용한 에르고티오네인의 생성을 가능하게 하는, 이. 콜라이(E. coli)에서 EgtE의 성공적인 생성 및 EgtB 활성을 개선시키기 위한 조건의 확인. 2) 오보티올(ovothiol) 생합성 경로 (OvoA)로부터의 효소를 이용하여 Cys와 트리메틸-히스티딘의 직접 산화성 커플링을 촉매작용함으로써 에르고티오네인의 생합성에 필요한 핵심 중간체를 생성할 수 있다. OvoA가 또한 Cys와 His의 산화성 커플링을 촉매작용하여 구조적으로 전혀 상이한 화합물을 생성하므로 이러한 발견은 놀랍고도 예기치 못한 것이다. 이론에 제한되길 바라지 않으며, 새롭게 발견된 OvoA 활성은 에르고티오네인 생합성 경로를 2 단계로 단축시킬 수 있고 에르고티오네인과 글루타티오닌 생합성 간의 경쟁을 제거할 수 있다. 에르고티오네인은 새롭게 발견된 OvoA 화학에 기반하여 세포-비함유 효소적 시스템 또는 세포 배양 시스템에 의해 생성될 수 있다. 3) 또 다른 효소 NcEgt1도 역시 Cys과 트리메틸-히스티딘 간의 직접 커플링을 촉매작용할 수 있었다. 에르고티오네인은 새롭게 발견된 NcEgt1 화학에 기반하여 세포-비함유 효소적 시스템 또는 세포 배양 시스템에 의해 생성될 수 있다.

따라서, 본원에 제공되는 특정한 양태는 재조합에 의해 발현된 에르고티오네인 생합성 경로의 하나 이상의 유전자 오보티올생합성 경로의 하나 이상의 유전자 또는 생물정보학 접근법을 통해 확인된 이들의 동족체 (예컨대, NcEgt1)를 포함하는 시험관내 세포-비함유 시스템에 관한 것이다. 다른 양태는 발효를 통해 에르고티오네인을 생성하기 위해 이러한 효소를 이용하여 대사 공학을 통해 생성된 미생물 균주를 포함한다.

일부 구체예에서, 세포는 재조합에 의해 (i) egtA 유전자; (ii) egtB 유전자; (iii) egtC 유전자; (iv) egtD; 및 (iv) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시킨다. 일부 구체예에서, 세포는 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자를 추가로 발현시킨다.

일부 구체예에서, 세포는 재조합에 의해 (i) ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자 또는 생물정보학에 의해 확인된 이들의 동족체; 및 (ii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시킨다.

일부 구체예에서, 세포는 재조합에 의해 (i) egtD 유전자; (ii) ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자; 및 (iii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시킨다. 일부 구체예에서, 세포는 재조합에 의해 (i) egtD 유전자; (ii) ovoA 유전자 유전자 또는 ncEgt -1 유전자; 및 (iii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자; 및 (iv) SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자를 발현시킨다.

본원에 제공된 일부 양태는 세포 배양 배지, 세포-비함유 효소적 혼합물, 또는 본원에 기재된 임의의 양태 또는 구체예의 발효로부터 수집된 세포를 용해시킨 후의 상청액에 관한 것이다.

본원에 제공된 다른 양태는 본원에 기재된 양태 또는 구체예 중 어느 하나의 세포 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

또한 본원에 제공된 다른 양태는 본원에 기재된 세포(들)의 용해로부터 수득된 세포 추출물을 인큐베이션시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본원에 기재된 다양한 양태는 에르고티오네인 생합성 경로의 하나 이상의 유전자 및 오보티올생합성 경로의 하나 이상의 유전자 또는 생물정보학에 의해 확인된 다른 동족체 (예컨대, NcEgt1)를 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본원에 제공된 일부 양태는 에르고티오네인을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 (i) EgtA 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (ii) EgtB 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (iii) EgtC 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (iv) EgtD 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (v) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; 및 (vi) FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 (i) ovoA 또는 ncEgt -1 유전자 또는 또는 생물정보학에 의해 확인된 다른 동족체; 및 (ii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 (i) egtD 유전자; (ii) ovoA 유전자 또는 ncEgt-1 유전자 또는 생물정보학에 의해 확인된 다른 동족체; 및 (iii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 것을 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하고, 배양 배지에는 시스테인, 히스티딘 또는 헤르시닌이 보충된다.

일부 구체예에서, 세포 배양 배지에는 하나 이상의 철 염이 추가로 보충된다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 세포를 용해시킨 후 세포 배양 배지 또는 상청액을 수집하는 것을 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 세포로부터 또는 세포가 성장한 배양 배지로부터 에르고티오네인을 회수하는 것을 추가로 포함한다.

도면의 간단한 설명

본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 필요한 수수료의 요청 및 지불시 컬러 도면(들)과 함께 본 특허 또는 특허 출원 공개물의 복사본이 제공될 것이다.

도 1은 에르고티오네인 및 오보티올에 대한 제안된 생합성 경로의 개략도이다.

도 2는 본원에 기재된 방법의 구체예에 따른 에르고티오네인 생성의 개략도이다. 경로 A는 EgtE의 성공적인 생성 및 EgtB 활성의 개선을 내포한다; 경로 B는 2에서 4 전환 및 EgtE의 성공적인 생성이 가능한 효소 (예컨대, OvoA 및 NcEgt1)의 발견을 내포한다.

도 3은 EgtB 및 OvoA 촉매작용에 대한 두 상이한 검정을 도시한다.

도 4는 EgtE의 정제된 샘플에 대한 SDS-PAGE 및 UV-VIS 데이터를 도시한다; 4A는 분자량 마커 (레인 M), 상청액 (레인 SN), 세포 펠렛 (레인 CP), 통과 유량(flow through) (레인 FT), 용리 분획 1 및 2 (각각 레인 E1 및 E2), 및 세척 분획 1, 2, 및 3 (각각 레인 W1,1, W2,1, 및 W3,1)에 대한 SDS-PAGE 데이터를 도시한다; 4B는 PLP 보조인자의 존재와 일치하는 정제된 EgtE에 대한 UV-VIS 데이터를 도시한다.

도 5는 (A) 상응하는 NMR 데이터와 함께 EgtB 촉매작용된 2에서 3으로의 전환, (B) 상응하는 NMR 데이터와 함께 OvoA 촉매작용된 1에서 6으로의 전환, 및 (C) 상응하는 NMR 데이터와 함께 OvoA 촉매작용된 2에서 4로의 전환을 도시한다.

도 6은 이. 콜라이 세포와 같은 세포에서 에르고티오네인의 생성을 위한 발현 벡터 (작제물 Ego-1)의 개략도이다.

도 7은 에르고티오네인의 생성을 추가로 향상시키기 위한 발현 벡터 (작제물 Ego-2)의 개략도이다.

도 8은 NcEgt1 및 EgtE에 의해 촉매작용된 헤르시닌에서 에르고티오네인으로의 전환을 도시한다.

도 9A 및 9B는 도 6 및 7에 기재된 둘 모두의 Ego-1 및 Ego-2 벡터 및 순수한 에르고티오네인으로 형질전환된 이. 콜라이 세포로부터 부분적으로 정제된 에르고티오네인의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다. 도 9A, 부분적으로 정제된 에르고티오네인; 도 9B, 순수한 에르고티오네인 첨가 후에 발효로부터 생성된 생성물의 정체 확인.

상세한 설명

특정 미생물로부터의 유전자, 다른 핵산 서열, 및 아미노산 서열이 하기 논의되고/거나 예시되는 한도까지, 다른 미생물이 유사한 대사 경로를 가질 뿐 아니라 유전자 및 단백질이 그러한 경로 내에서 유사한 구조 및 기능을 지님이 이해될 것이다. 이와 같이, 유전 물질의 공급원 또는 변형되는 숙주 세포로서 임의의 특정 미생물에 관해 하기 논의된 원리는 다른 미생물에 적용될 수 있고 명백히 본 발명에 포함된다.

부분적으로, 본 발명은 오보티올생합성 경로로부터의 효소 OvoA가 에르고티오네인 생합성에서의 중간체를 생성하기 위해 이용될 수 있다는 발명자들의 발견에 기초한다. 본 발명자들은, 그 중에서도 특히, 효소 OvoA (또는 NcEgt1)가 헤르시닌과 시스테인 간의 산화성 커플링을 촉매작용하여 에르고티오네인 생합성의 중간체인 화합물

을 생성할 수 있음을 발견하였다. 이는, OvoA가 일반적으로 히스티딘과 시스테인의 커플링을 촉매작용하여 화합물

을 생성하므로 놀랍고도 예기치 못한 것이다. 확인할 수 있는 바와 같이, 시스테인이 이미다졸 고리에 연결되는 위치가 두 생성물 간에 상이하므로 예상치 못한 놀라운 결과이다.

부분적으로, 본 발명의 별도 부분은 발현이 이전에 실현되지 않은 EgtE의 생성에 기반한다. 본 발명자들은 특히 EgtE가 FAD 합성효소를 지닌 유전적 배경 하에 재조합에 의해 생성될 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본원에 기재된 하나 이상의 유전자를 재조합에 의해 발현시키는 세포, 및 에르고티오네인을 생성하는데 있어서 그러한 세포의 이용이 본원에 기재된다. 상기 세포는 에르고티오네인 생합성 경로의 하나 이상의 유전자 및 오보티올생합성 경로의 하나 이상의 유전자를 재조합에 의해 발현시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 세포는 (i) EgtA 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (ii) EgtB 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (iii) EgtC 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (iv) EgtD 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; 및 (v) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편 중 적어도 하나를 재조합에 의해 발현하도록 형질전환된다.

일부 구체예에서, 상기 세포는 SAM 합성효소 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 재조합에 의해 발현하도록 추가로 형질전환된다.

일부 구체예에서, 상기 세포는 (i) ovoA 또는 ncEgt -1 유전자; 및 (ii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자 중 적어도 하나를 재조합에 의해 발현하도록 형질전환된다.

일부 다른 구체예에서, 상기 세포는 (i) ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자; 및 (ii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자 중 하나에 추가하여 적어도 egtD 유전자를 재조합에 의해 발현하도록 형질전환된다. 이의 일부 추가의 구체예에서, 상기 세포는 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현하도록 또한 추가로 형질전환된다.

일부 구체예에서, 상기 세포는 (i) ovoA 또는 ncEgt -1 유전자; 및 (ii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시킨다.

일부 다른 구체예에서, 상기 세포는 (i) ovoA 또는 ncEgt -1 유전자; (ii) egtE 유전자; 및 (iii) FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시킨다.

일부 구체예에서, 상기 세포는 (i) egtD 유전자; (ii) ovoA 유전자 또는 ncEgt-1 유전자; 및 (iii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시킨다.

일부 다른 구체예에서, 상기 세포는 (i) egtD 유전자; (ii) ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자; (iii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자; 및 (iv) SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시킨다.

여전히 다른 일부 구체예에서, 상기 세포는 (i) egtD 유전자; (ii) ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자; (iii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자; (iv) SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시킨다.

본원에 기재된 임의의 양태 또는 구체예에서, 상기 세포는 (i) egtD 유전자; (ii) ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자; (iii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자; (iv) SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자 중 하나 이상을 내생적으로 발현시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 형질전환된 세포는 코돈 최적화 유전자를 재조합에 의해 발현시킨다. 예를 들어, 상기 세포는 코돈 최적화 egtD 유전자, ovoA 유전자, ncEgt -1 유전자, egtE 유전자, SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자, 또는 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시킨다.

본원에서 사용되는 용어 "세포", "숙주 세포" 또는 "세포주"는 잘 특성화된 균질한, 생물학적으로 순수한 세포 집단을 의미하고자 한다. 이러한 세포는 신생물성이거나 당 분야에 공지된 방법에 의해 시험관내 "무한증식"하는 진핵생물 세포, 뿐만 아니라 일차 세포, 또는 원핵생물 세포일 수 있다. 비제한적으로, 숙주 세포 또는 세포주는 포유동물, 식물, 곤충, 진균(효모 포함), 또는 박테리아 기원의 것일 수 있다.

일부 구체예에서, 세포는 박테리아 세포이다. 이의 일부 추가의 구체예에서, 세포는 이. 콜라이 또는 S. 피로게네스(S. pyogenes)이다. 본원에 기재된 다양한 양태에 적용될 수 있는 이. 콜라이의 예시적인 균주는 비제한적으로 BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3)pLysE, BL21 (DE3)pLacl, BL21trxB(DE3), BL21trxB(DE3)pLysS, BLR(DE3), BLR(DE3)pLysS, AD494(DE3), AD494(DE3)pLysS, HMS174(DE3), HMS174(DE3)pLysS, HMS174(DE3)pLysE, Origami(DE3), Origami(DE3)pLysS, Origami(DE3)pLysE, Origami(DE3)pLacl, OrigamiB(DE3), OrigamiB(DE3)pLysS, OrigamiB(DE3)pLysE, OrigamiB(DE3)pLacl, Rosetta(DE3), Rosetta(DE3)pLysS, Rosetta(DE3)pLysE, Rosetta(DE3)pLacl, Tuner(DE3), Tuner(DE3)pLysS 및 Tuner(DE3)pLacl을 포함한다.

일부 다른 구체예에서, 세포는 곤충 (예컨대, Sf9, high five 및 Sf21 세포), 효모 (예컨대, P. 파스토리스(P. pastoris), P. 메타놀리카(P. methanolica), S. 폼베(S. pombe) 및 S. 세레비지애(S. cerevisiae)), 포유동물 (예컨대, 차이니스 햄스터 난소 세포(CHO), Cos-1, CV-1, HeLa, NIH3T3, PER-C6 및 NSO) 또는 식물에서 유래될 수 있다. 다른 적합한 세포가 또한 당업자에게 알려져 있다.

본원에서 사용되는 용어 "트랜스펙션된" 또는 "형질전환된"은 그 유전체가 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 유전자 조작의 분야에서 "이종성 DNA", "재조합 DNA", "외인성 DNA", "유전적으로 조작된", "비-자연", 또는 "외래 DNA" (여기서, 상기 DNA는 유전자 조작의 공정에 의해 분리되고 숙주 세포 또는 세포주로 도입된다)로도 지칭되는 DNA 서열의 존재에 의해 변경되거나 증가된 임의의 세포, 숙주 세포 또는 세포주를 포함한다. 트랜스펙션된 DNA는 염색체외 요소로서 또는 숙주 세포의 숙주 염색체에 안정하게 통합된 요소로서 유지될 수 있다. 염색체외 요소로서 또는 숙주 염색체에 통합된 안정한 요소로서 유지된 트랜스펙션된 DNA를 갖는 숙주 세포는 본원에서 "재조합 숙주 세포" 또는 "형질전환된 세포"로서 언급된다.

본 발명에 적합한 일부 세포는 본원에 기재된 유전자들 중 하나 이상의 내인성 복사체 뿐만 아니라 이의 재조합 복사체도 발현시킬 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 구체예에서 세포가 본원에 기재된 유전자들 중 하나 이상의 내인성 복사체인 경우, 본원에 기재된 세포 및 방법은 내생적으로 발현된 유전자(들)의 재조합 복사체를 반드시 첨가할 필요는 없을 것이다. 일부 구체예에서 상기 세포는 본원에 기재된 경로로부터의 하나 이상의 효소를 내생적으로 발현시킬 수 있고 에르고티오네인의 효율적인 생성을 위해 본원에 기재된 경로로부터의 하나 이상의 다른 효소를 재조합에 의해 발현시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 형질전환되지 않은 세포, 예컨대, 야생형 세포는 에르고티오네인을 생성하지 않는다.

일부 구체예에서, 형질전환된 세포는 동일한 조건 하에 형질전환되지 않은 숙주 세포에 의해 생성된 에르고티오네인의 양에 비해 적어도 (예컨대 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 1배, 적어도 1.25배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 75배, 적어도 100배 또는 그 초과)인 양의 에르고티오네인을 생성할 수 있다.

ovoA 유전자 (OvoA 효소)에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 5-히스티딜시스테인 설폭사이드 신타제이다. OvoA는 단핵 비-헴(non-heme) 효소이며 4-전자 산화 공정을 촉매작용한다. OvoA는 에르위니아 타스마니엔시스(Erwinia tasmaniensis) 및 트립파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)로부터 특성화된 제 1 오보티올생합성 효소이다. 동종 효소 동족체 OvoA는 프로테오박테리아에서 진균에 이르기까지 80개가 넘는 유전체에서 인코딩된다.

ncEgt -1 유전자 (뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)로부터의 NcEgt-1 효소)에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 헤르시닌과 시스테인으로부터

의 형성을 촉매작용한다.

egtE 유전자 (EgtE 효소)에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 헤르시닌과 시스테인 간의 산화성 커플링의 생성물에서 C-S 결합의 절단을 촉매작용한다.

egtD 유전자 (EgtD 효소) 효소에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 헤르시닌을 생성하기 위해 히스티딘의 N-메틸화를 촉매작용한다.

EgtD는 SAM 의존성 메틸트랜스퍼라제이고, SAM 합성효소는 EgtD와 공동-발현되어 EgtD의 활성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 세포는 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시키도록 추가로 형질전환될 수 있다. 효소 SAM 합성효소 (EC 2.5.1.6)는 메티오닌과 ATP의 S-아데노실메티오닌 (AdoMet 또는 SAM)으로의 전환을 촉매작용한다. SAM으로의 메티오닌의 전환을 촉매작용하는 SAM 합성효소에 대한 유전자는 이. 콜라이로부터 클로닝되었다.

SAM 합성효소 기질이 메티오닌 및 ATP이므로, 에르고티오네인의 생성을 위한 세포 배양 배지는 히스티딘 또는 헤르시닌 외에, 메티오닌으로 추가로 보충될 수 있다.

본 발명자들은 세포에서의 EgtE의 발현이 FAD 합성효소를 갖는 조건 하에 향상될 수 있음을 발견하였다. FAD 합성효소는 리보플라빈 및 ATP로부터 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드의 형성을 촉매작용한다.

따라서, 일부 구체예에서, 상기 세포는 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 재조합에 의해 발현하도록 추가로 형질전환될 수 있다.

금속-효소 (EgtB 또는 OvoA)의 흡수 및 성숙이 최대 효율을 위해 필수적이므로, Fe 흡수 시스템은 에르고티오네인을 생성하기 위해 형질전환된 세포에 포함될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 사이드로포어, 예컨대, 사이드로포어를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 기능성 단편을 발현시키기 위해 추가로 형질전환될 수 있고 배지에 하나 이상의 철 염이 보충될 수 있다.

본원에 기재된 유전자는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

일부 구체예에서, ovoA 유전자는 옥시다제이며, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열 (ETA_00030 [에르위니아 타스마니엔시스(Erwinia tasmaniensis) Et1/99], ACCESSION YP_001905965:

을 포함한다.

일부 구체예에서, ncEgt -1 유전자는 옥시다제이며, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열 (뉴로스포라 크라사 OR74A 가설 단백질 NCU04343 부분적인 mRNA, ACCESSION XM_951231, VERSION XM_951231.2 GI:164429491:

을 포함한다.

일부 구체예에서, egtD 유전자는 메틸트랜스퍼라제이며, SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 서열 (가설 단백질 MSMEG_6247 [마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 균주 MC2 155], ACCESSION YP_890466, VERSION YP_890466.1 GI:118473274:

을 포함한다.

일부 구체예에서, egtE 유전자는 C-S 리아제이며, SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열 (피리독살-포스페이트-의존성 트랜스퍼라제 [마이코박테리움 스메그마티스 균주 MC2 155], ACCESSION ABK70212, VERSION ABK70212.1 GI:118169316:

을 포함한다.

일부 구체예에서, FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열 (FAD 합성효소에 대한 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 유전자, 완전 cds, ACCESSION D37967, VERSION D37967.1 GI:840670:

을 포함한다.

일부 구체예에서, SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열 (S-아데노실메티오닌 합성효소를 코딩하는 이. 콜라이 metK 유전자. ACCESSION K02129 REGION: 86..1240, VERSION K02129.1 GI:146838:

을 포함한다.

당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 효소에 대한 동종 유전자는 다른 종으로부터 수득될 수 있고 상동성 검색에 의해, 예를 들어 생명공학 정보를 위한 국립 센터(NCBI) 인터넷 사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용가능한 단백질 BLAST 검색을 통해 확인될 수 있다. 본 발명과 관련된 유전자는 주어진 유전자를 함유하는 임의의 DNA 공급원으로부터의 DNA로부터 PCR 증폭될 수 있다. 특정 구체예에서, 유전자는 유전체 DNA (gDNA) 주형을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득된다. 일부 구체예에서, 본 발명과 관련된 유전자는 합성 유전자이다. 본 발명과 관련된 효소를 인코딩하는 유전자를 수득하는 임의의 수단이 본 발명에 적합하다.

본원에서 사용된 대로, 유전자를 발현시키는 것은 세포가 유전자에 의해 인코딩되는 전장 폴리펩티드 또는 전장 폴리펩티드의 기능성 단편을 생성하는 것을 의미한다. "단편"과 함께 사용될 때 용어 "기능성"은 그 단편이 되는 존재물 또는 분자의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 지니는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 문맥에서 "실질적으로 유사한"은 상응하는 야생형 펩티드의 적절하거나 요망되는 생물학적 활성의 적어도 25%, 적어도 35%, 적어도 50%가 유지됨을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 기능성 단편은 세포에서 발현되는 유전자에 의해 인코딩되는 전장 폴리펩티드의 효소적 활성과 실질적으로 유사한 효소적 활성을 보유한다.

본 경우에, egtE 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 기능성 단편은 헤르시닌과 시스테인 간의 산화성 커플링의 생성물에서 C-S 결합의 절단, 즉 중간체

에서 에르고티오네인으로의 전환을 촉매작용할 수 있는 펩티드일 것이다. ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 기능성 단편은 헤르시닌 및 시스테인으로부터

의 형성을 촉매작용할 수 있는 펩티드일 것이다. egtD 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 기능성 단편은 헤르시닌을 생성하기 위해 히스티딘의 N-메틸화를 촉매작용할 수 있는 펩티드일 것이다. SAM 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 기능성 단편은 메티오닌과 ATP의 S-아데노실메티오닌으로의 전환을 촉매작용할 수 있는 펩티드일 것이다. FAD 합성효소 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 기능성 단편은 FAD의 형성을 촉매작용할 수 있는 펩티드일 것이다. 그러한 기능성 단편은 실시예에서 본원에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 유전자 중 하나 이상은 재조합 발현 벡터 및 플라스미드에서 발현된다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 이식유전자를 숙주 세포에 전이시키기에 적합한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 용어 "벡터"는 플라스미드, 미니-염색체, 파지, 네이키드 DNA 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌[U.S. Pat. Nos. 4,980,285; 5,631,150; 5,707,828; 5,759,828; 5,888,783 and, 5,919,670, and, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)]을 참조하라. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션된 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 유전체에 라이게이션된다. 특정한 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예컨대, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 더욱이, 특정한 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, 플라스미드는 가장 흔하게 이용되는 벡터의 형태이므로 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 이용된다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 발현 벡터의 그러한 다른 형태를 포함하고자 한다.

클로닝 벡터는 자율적으로 복제하거나 숙주 세포의 유전체에 통합될 수 있고, 추가로 벡터가 확정적인 양상으로 절단될 수 있고 새로운 재조합 벡터가 숙주 세포에서 복제하는 그 능력을 보유하도록 요망되는 DNA 서열이 라이게이션될 수 있는 하나 이상의 엔도누클레아제 제한 부위를 특징으로 하는 벡터이다. 플라스미드의 경우에, 플라스미드가 숙주 박테리아와 같은 숙주 세포 내의 복사체 수에 있어서 증가함에 따라 요망되는 서열의 복제는 여러 번 발생할 수 있거나, 숙주가 유사분열에 의해 재생되기 전에 숙주 당 단 1회 발생할 수 있다. 파지의 경우에, 복제는 용해기 동안 능동적으로 또는 용원기 동안 수동적으로 발생할 수 있다.

발현 벡터는 요망되는 DNA 서열이 조절 서열에 작동적으로 연결되어 RNA 전사체로서 발현될 수 있도록, 요망되는 DNA 서열이 제한 및 라이게이션에 의해 삽입될 수 있는 벡터이다. 벡터는 벡터로 형질전환되었거나 형질전환되지 않았거나 형질전환되었거나 트랜스펙션된 세포의 확인에 이용하기에 적합한 하나 이상의 마커 서열을 추가로 함유할 수 있다. 마커는, 예를 들어, 항생제 또는 다른 화합물에 대한 내성 또는 민감성을 증가 또는 감소시키는 단백질을 인코딩하는 유전자, 그 활성이 당 분야에 공지된 표준 검정에 의해 검출가능한 효소를 인코딩하는 유전자(예컨대, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 또는 알칼린 포스파타제), 및 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포, 숙주, 콜로니 또는 플라크의 표현형에 가시적인 영향을 미치는 유전자 (예컨대, 그린 형광 단백질)를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에서 이용되는 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 DNA 세그먼트에 존재하는 구조적 유전자 생성물을 자율 복제 및 발현시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 대로, 코딩 서열 및 조절 서열은 이들이 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 코딩 서열의 발현 또는 전사를 배치하는 방식으로 공유적으로 연결될 때 "작동적으로" 연결된 것으로 일컬어진다. 코딩 서열이 기능성 단백질로 번역될 것이 요망되는 경우, 2개의 DNA 서열은, 5' 조절 서열에서의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 발생시키고, 2개의 DNA 서열 간의 연결 특성이 (1) 틀-이동 돌연변이의 도입을 발생시키지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, (3) 단백질로 번역되는 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는 경우, 작동적으로 연결된 것으로 언급된다. 따라서, 프로모터 영역은 생성된 전사체가 요망되는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 프로모터 영역이 그 DNA의 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있었던 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다.

본원에 기재된 임의의 효소를 인코딩하는 핵산 분자가 세포에서 발현될 때, 다양한 전사 제어 서열 (예컨대, 프로모터/인핸서 서열)을 이용하여 이의 발현을 지시할 수 있다. 프로모터는 자연 프로모터, 즉, 그 내인성 배경에서, 유전자 발현의 정상적인 조절을 제공하는 유전자의 프로모터일 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터는 항시적 프로모터일 수 있고, 즉 프로모터는 조절되지 않고 이와 관련 유전자의 지속적인 전사를 허용한다. 분자의 존재 또는 부재 하에 제어되는 프로모터와 같은 다양한 조건부 프로모터를 또한 이용할 수 있다.

유전자 발현에 필요한 조절 서열의 정확한 특성은 종 또는 세포 유형들 간에 달라질 수 있으나, 일반적으로, 필요한 경우, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 및 번역의 개시에 수반되는 각각 5' 비-전사 및 5' 비-번역된 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 5' 비-전사된 조절 서열은 작동적으로 연결된 유전자의 전사적 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 요망에 따라 인핸서 서열 또는 업스트림 활성제 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 5' 리더 및 신호 서열을 임의로 포함할 수 있다. 적절한 벡터의 선택 및 설계는 당업자의 능력 및 판단 내에 있다.

발현에 필요한 모든 요소를 함유하는 발현 벡터는 시판되며 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 참조하라. 세포는 이종성 DNA (RNA)의 세포로의 도입에 의해 유전적으로 조작된다. 상기 이종성 DNA (RNA)는 숙주 세포에서 이종성 DNA의 발현을 허용하는 전사 요소의 작동적인 제어 하에 놓인다.

일부 구체예에서, 벡터는 pETDuet 벡터이다.

일부 다른 구체예에서, 벡터는 pACYDuet 벡터이다.

일부 다른 구체예에서, 벡터는 pASK-IBA 벡터이다.

비제한적으로, 본원에 기재된 유전자는 하나의 벡터 또는 별도의 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자 및 egtE 유전자는 동일한 벡터 내에 포함될 수 있거나; egtE 유전자 및 FAD 합성효소 유전자를 인코딩하는 유전자는 동일한 벡터 내에 포함될 수 있거나; ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자, egtE 유전자, 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자는 동일한 벡터 내에 포함될 수 있거나; egtD 유전자 및 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자는 동일한 벡터 내에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자, egtE 유전자, 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자는 제 1 벡터 내에 포함될 수 있고; egtD 유전자, ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자, 및 egtE 유전자는 제 2 벡터 내에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 재조합에 의해 발현된 유전자 중 하나 이상은 세포의 유전체에 통합될 수 있다.

청구된 발명의 효소를 인코딩하는 핵산 분자는 당 분야에서 표준인 방법 및 기법을 이용하여 세포 또는 세포들에 도입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 화학적 형질전환을 포함하는 형질전환 및 전기천공, 형질도입, 유전자총 등과 같은 표준 프로토콜에 의해 도입될 수 있다. 청구된 발명의 효소를 인코딩하는 핵산 분자를 발현시키는 것은 또한 핵산 분자를 유전체에 통합시킴에 의해 달성될 수 있다.

본원에 제공된 일부 양태는 본원에 기재된 세포를 배양하여 수집된 세포 배양 배지 또는 상청액에 관한 것이다.

본원에 제공된 다른 양태는 본원에 기재된 세포를 세포 배양 배지에서 배양시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본원에 기재된 다양한 양태는 에르고티오네인 생합성 경로의 하나 이상의 유전자 및 오보티올생합성 경로의 하나 이상의 유전자를 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 (i) EgtA 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (ii) EgtB 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (iii) EgtC 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (iv) EgtD 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; 및 (v) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 (i) OvoA 단백질, NcEgt1단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (ii) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; 및 (iii) FAD 합성효소 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 (i) EgtD 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (ii) OvoA 단백질, NcEgt1단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; (iii) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편; 및 (iv) FAD 합성효소 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 적용의 일부 추가의 구체예에서, 세포는 SAM 합성효소 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 추가로 발현시킨다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 (i) ovoA 또는 ncEgt -1 유전자; 및 (ii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소 유전자를 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함한다.

본원에서 논의된 대로, 본 발명자들은 또한 에르고티오네인의 합성이, 헤르시닌에서 출발하여 형질전환된 세포에서 에르고티오네인을 생성함에 의해 추가로 단순해질 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 방법은 (i) egtD 유전자; (ii) ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자; 및 (iii) egtE 유전자 및 FAD 합성효소 유전자를 세포에서 재조합에 의해 발현시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 S-아데노실메티오닌 (SAM) 합성효소를 인코딩하는 유전자를 세포로부터 재조합에 의해 발현시키는 것을 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 세포를 세포 배양 배지에서 배양시키는 것을 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에서 제공된 양태 또는 구체예 중 어느 하나에 기재된 방법은 헤르시닌 또는 히스티딘을 세포에 공급하는 것을 포함한다. 예를 들어, 세포가 egtD 유전자를 발현시키지 않는 경우(재조합에 의해 또는 달리), 세포에 헤르시닌이 공급될 수 있고, 즉, 배양 배지에 헤르시닌이 보충될 수 있다. 또 다른 예에서, 세포가 egtD 유전자를 발현시키지 않는 경우(재조합에 의해 또는 달리), 세포에 히스티딘이 공급될 수 있고, 즉, 배양 배지에 히스티딘이 보충될 수 있다. egtD 유전자의 발현은 세포가 히스티딘을 헤르시닌으로 전환하도록 할 수 있고, 헤르시닌은 이후에 ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자에 발현된 폴리펩티드에 의해 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 세포를 배양한 후에 세포 배양 배지 또는 상청액을 수집하는 것을 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 순수한 효소 또는 이러한 효소를 발현시키는 세포로부터의 용해물, 예컨대 본원에 기재된 세포로부터 수득된 용해물을 이용한 시험관내 반응을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 에르고티오네인을 생성하는 방법은 (i) 히스티딘 또는 헤르시닌을, 재조합에 의해 발현된 EgtA 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, EgtB 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, EgtC 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, EgtD 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, 및 EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 포함하는 반응 혼합물과 인큐베이션시키고; (ii) 효소적 혼합물로부터 에르고티오네인을 분리시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 에르고티오네인을 제조하는 방법은 (i) 헤르시닌을, 재조합에 의해 발현된 (a) OvoA 단백질, NcEgt1단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편 및(b) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 포함하는 반응 혼합물과 인큐베이션시키고; (ii) 효소적 혼합물로부터 에르고티오네인을 분리시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 에르고티오네인을 제조하는 방법은 (i) 히스티딘을, 재조합에 의해 발현된 (a) EgtD 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, (b) OvoA 단백질 , NcEgt1단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, 및 (c) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 포함하는 반응 혼합물과 인큐베이션시키고; (ii) 효소적 혼합물로부터 에르고티오네인을 분리시키는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 반응 혼합물은 본원에 기재된 세포로부터의 세포 용해물을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 반응 혼합물은 본원에 기재된 세포로부터의 세포 용해물 (예컨대, 세포-비함유 용해물)을 포함한다.

일부 구체예에서, 반응 혼합물은 메토이네닌(methoinenine) 또는 시스테인을 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 반응 혼합물에는 철 염이 보충된다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 세포, 세포가 성장한 배양 배지, 또는 반응 혼합물로부터 에르고티오네인을 회수하는 것을 추가로 포함한다.

세포, 예컨대, 형질전환된 세포는 통상적인 세포 배양 또는 발효 생물반응기에서 배양될 수 있다. 세포는, 비제한적으로, 회분, 유가-회분, 세포 재순환, 및 연속 발효를 포함하는 임의의 배양 또는 발효 공정에 의해 배양될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 어떠한 유형(풍부 또는 최소)의 배지 및 임의의 조성물에서 배양될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 구체예에서, 일상적인 최적화는 다양한 유형의 배지의 이용을 허용할 것이다. 선택된 배지에는 다양한 추가 구성요소가 보충될 수 있다. 보충적 구성요소의 일부 비제한적인 예는 헤르시닌, 히스티딘, 항생제, IPTG 또는 유전자 도입을 위한 그 밖의 유도물질, 및 ATCC 미량 광물 보충물을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 세포의 성장 조건 및 배지의 다른 양태는 일상적인 실험을 통해 최적화될 수 있다. 예를 들어, pH 및 온도는 최적화될 수 있는 비제한적인 인자의 예이다. 일부 구체예에서, 배지의 선택, 배지 보충물, 및 온도와 같은 인자는 에르고티오네인의 생성 수준에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구체예에서 보충적 구성요소의 농도 및 양은 최적화될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 보충적 구성요소가 얼마나 자주 배지에 보충되는지와, 에르고티오네인을 회수하기 전 배지를 배양하는 시간의 양이 최적화된다.

본원에 기재된 양태에 따라, 높은 역가의 에르고티오네인은 세포 또는 세포-비함유 용해물에서, 본 발명과 관련된 유전자의 재조합 발현을 통해 생성된다. 본원에서 사용되는 "높은 역가"는 리터 당 수 밀리그램 (mg L^-1) 규모 또는 그 초과의 역가를 의미한다. 주어진 생성물에 대해 생성되는 역가는 배지의 선택을 포함하는 다수의 인자에 의해 영향을 받을 것이다. 일부 구체예에서 에르고티오네인의 생성을 위한 역가는 적어도 1000 mg L^-1이다.

특정 양태에서, 본원에 기재된 구체예와 관련된 세포를 성장시키기 위한 액체 배양액은 당 분야에 공지되고 이용되는 임의의 배양 용기에 수용된다. 일부 구체예에서, 교반된 탱크 반응기와 같은 통기성 반응 용기에서의 대규모 생성을 이용하여 에르고티오네인을 대량 생성한다.

에르고티오네인이 형질전환된 세포에 의해 생성된 후에, 에르고티오네인은 배양 배지에 축적될 수 있고 그로부터 수집되거나 회수될 수 있다. 에르고티오네인과 같은 생성물을 "수집"하는 것은 단순히 발효 생물반응기로부터 바이오매스를 수집하는 것을 의미할 수 있고, 분리, 회수, 또는 정제의 추가 단계를 함축할 필요는 없다. 예를 들어, 수집하는 단계는 생물반응기로부터 전체 배양액 (즉, 형질전환된 세포 및 발효 배지)을 제거하고/거나 생물반응기로부터 에르고티오네인을 함유하는 형질전환된 세포를 제거하는 것을 의미할 수 있다. 에르코티오네인을 회수하는 것과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "회수하는" 또는 "회수하다"는 에르고티오네인을 임의의 수준의 순도로 수득하기 위한 추가적인 처리 단계를 수행하는 것을 의미한다. 이러한 단계 뒤에 추가의 정제 단계가 올 수 있다. 예를 들어, 에르고티오네인은, 비제한적으로, 하기 단계를 포함하는 기법에 의해 바이오매스로부터 회수될 수 있다: 세포 용액의 용해, 에르고티오네인을 함유하는 남아 있는 고형물의 수집 및 세척, 적절한 완충제 또는 용액에서 세척된 고형물의 재현탁, 및 크로마토그래피에 의한 후속 정제와 함께 용액으로부터 에르고티오네인의 풍부화.

일부 구체예에서, 에르고티오네인은 실질적으로 순수한 형태로 회수된다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한"은 상업적 판매를 위한 화합물로서 에르고티오네인의 효과적인 이용을 가능케 하는 순도를 의미한다.

일부 구체예에서, 에르고티오네인 생성물은 바람직하게는 생산 유기체 및 다른 배양 배지 구성요소 또는 반응 혼합물로부터 분리된다. 그러한 분리를 달성하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 분리 기법은 비제한적으로 이온-교환 크로마토그래피 및 HPLC 정제의 조합을 포함한다.

본 발명의 양태는 세포로부터 에르고티오네인의 생성을 최적화하는 전략을 포함한다. 에르고티오네인의 최적화 생성은 상기 전략의 부재 하에 달성되는 것보다 최적화 전략의 수행 후에 더 높은 양의 에르고티오네인을 생성하는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 최적화는 적절한 프로모터 및 리보솜 결합 부위의 선택을 통해 본원에 기재된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서 이는 높은-복사체 수 플라스미드, 또는 낮거나 중간-복사체 수 플라스미드의 선택을 포함한다. 일부 구체예에서 플라스미드는 pETDuet와 같은 중간-복사체 수 플라스미드이다. 본원에 기재된 세포 및 방법에 이용될 수 있는 그 밖의 플라스미드는 pCDFDuet-1, pACYCDuet-1, pASK-IBA, 및 pCOLADuet-1을 포함한다. 전사 종료 단계는 또한, 줄기-루프와 같은 구조의 도입 또는 제거를 통해, 유전자 발현의 조절을 위해 일부 구체예에서 표적화될 수 있다.

일부 구체예에서, 에르고티오네인의 생성에 최적화된 세포가 이용된다. 일부 구체예에서, 에르고티오네인의 향상된 생성을 유도하는 돌연변이에 대한 스크리닝은 무작위 돌연변이유발 스크린을 통해, 또는 공지된 돌연변이의 스크리닝을 통해 수행된다. 다른 구체예에서, 유전체 단편의 샷건 클로닝을 이용하여, 에르고티오네인의 증가된 생성을 위한 이러한 단편을 갖는 유기체 또는 세포를 스크리닝함에 의해, 에르고티오네인의 생성을 증가시키는 유전체 영역을 확인한다. 일부 경우에, 하나 이상의 돌연변이가 동일한 세포 또는 유기체에서 조합된다.

단백질 발현의 최적화는 또한 일부 구체예에서 효소를 인코딩하는 유전자가 세포에 도입되기 전에, 예컨대 박테리아 세포에서의 발현에 대한 코돈 최적화를 통해 변형될 것을 요구할 수 있다. 다양한 유기체에 대한 코돈 사용은 코돈 사용 데이터베이스 (website: kazusa.or.jp/codon/)에서 평가될 수 있다.

일부 구체예에서, 단백질 조작은 본 발명과 관련된 하나 이상의 효소의 발현 또는 활성을 최적화하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 단백질 조작 접근법은 효소의 3D 구조를 결정하거나 관련 단백질의 구조에 기반하여 효소에 대한 3D 상동성 모델을 작제하는 것을 포함할 수 있다. 3D 모델에 기반하여, 효소에서의 돌연변이가 작제되고 세포 또는 유기체에 혼입된 후, 에르고티오네인의 증가된 생성에 대해 스크리닝될 수 있었다. 일부 구체예에서 세포에서 에르고티오네인의 생성은 본원에 기재된 경로와 관련된 효소와 동일한 경로로 작용하는 효소의 조작을 통해 증가된다. 예를 들어, 일부 구체예에서 효소 또는 본원에 기재된 경로 중 어느 하나 이상과 관련된 효소와 같은 표적 효소의 업스트림에 작용하는 다른 인자의 발현을 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 일부 구체예에서, 이는 임의의 표준 방법을 이용하여 업스트림 인자를 과발현시킴에 의해 달성된다.

일부 선택된 정의

편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구항에서 본원에 이용된 특정 용어는 여기에 수집된다. 달리 언급되거나 문맥에서 암시되지 않는 한, 하기 용어 및 구는 하기 제공된 의미를 포함한다. 명백하게 달리 언급되거나, 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 하기 용어 및 구는 본 발명이 속하는 분야에서 용어 또는 구가 갖는 의미를 배제하지 않는다. 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 제한되므로, 정의들은 특정 구체예의 설명을 돕기 위해 제공된 것이며, 청구된 발명을 제한하려는 것은 아니다. 추가로, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 임의의 공지된 방법, 장치, 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 이와 관련된 방법, 장치, 및 물질이 본원에 기재된다.

본원에서 사용되는 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 본 발명에 필수적인 조성물, 방법, 및 이의 개별적인 구성요소(들)에 관해 이용되며, 필수적이든 아니든 간에, 명시되지 않은 요소들의 포함에 개방되어 있다.

단수 용어는 문맥에서 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥에서 명백하게 달리 지시되지 않는 한 "및"을 포함하고자 한다.

동작 실시예 외에, 또는 달리 지시되지 않는 한, 본원에 이용된 성분의 양 또는 반응 조건을 표시하는 모든 숫자는 모든 예에서 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 이용되는 용어 "약"은 언급된 수치의 ±5%를 의미할 수 있다. 예를 들어, 약 100은 95 내지 105를 의미한다.

비록 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 설명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 용어 "포함하다(comprise)"는 "포함하다(include)"를 의미한다. 용어 "예컨대"는 라틴어 exempli gratia에서 유래되며, 비제한적인 예를 나타내기 위해 본원에서 이용된다. 따라서, 약어 "예컨대"는 용어 "예를 들어"와 동의어이다.

용어 "저하", "감소된", "감소", "저하시키다" 또는 "억제하다"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 본원에서 일반적으로 사용된다. 그러나, 의심의 여지를 없애기 위해, "감소된", "감소" 또는 "저하시키다" 또는 "억제하다"는 참조 수준에 비해 적어도 10%만큼의 감소, 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼의 감소 또는 100% 감소를 포함하는 100% 이하의 감소 (예컨대 기준 샘플에 비해 없는 수준), 또는 참조 수준에 비해 10-100% 사이의 임의의 감소를 의미한다.

용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "향상시키다" 또는 "활성화시키다"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 증가를 일반적으로 의미하기 위해 본원에서 사용된다; 어떠한 의심도 없도록, 용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "향상시키다" 또는 "활성화시키다"는 참조 수준에 비해 적어도 10%만큼의 증가, 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼의 증가 또는 100% 증가를 포함하는 100% 이하의 증가 또는 참조 수준에 비해 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준에 비해 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 또는 그 초과의 임의의 증가를 의미한다.

용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계적 유의성을 의미하고 일반적으로 참조 수준으로부터 적어도 2 표준 편차 (2SD)만큼 떨어진 것을 의미한다. 상기 용어는 차이가 있다는 통계적 근거를 의미한다. 이것은 귀무 가설이 실제로 참일 때 귀무 가설을 부정하는 결정을 할 확률로서 정의된다.

본원에서 사용되는 "유전 요소"는 경로 효소적 기능을 수행하거나 제어할 수 있는, 단백질, 아포단백질, 또는 안티센스 핵산 작제물과 같은 생성물에 대한 발현가능한 코딩 서열을 갖는 정의된 핵산 (일반적으로 DNA 또는 RNA)를 의미한다. 발현된 단백질은 효소로서 기능하거나, 효소 활성을 억제 또는 저하시키거나, 효소의 발현을 제어할 수 있다. 이러한 발현가능한 서열을 인코딩하는 핵산은, 예컨대 동종 재조합, 전위, 또는 일부 다른 방법에 의해 비인간 유기체의 염색체로 통합되는 염색체의 핵산, 또는 예컨대 플라스미드, 코스미드 등에 의해 운반되는 염색체외(에피솜) 핵산일 수 있다. 유전 요소는 제어 요소를 포함한다. 다수의 다른 유전 요소가 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국특허 4,980,285; 5,631,150; 5,759,828; 5,888,783 및 5,919,670을 참조하라.

본원에서 사용되는 용어 "유전자 조작"은 시험관내 기법, 생체내 기법, 또는 시험관내 및 생체내 기법 둘 모두의 조합에 의한 폴리뉴클레오티드 서열의 목적 변경을 의미한다. "유전자 조작"은 비인간 유기체의 염색체 또는 염색체외적으로 복제하는 요소로의 이종성 폴리뉴클레오티드 서열의 도입, 염색체 폴리뉴클레오티드 서열의 변경, 전사 및/또는 번역 조절 신호의 염색체 또는 플라스미드 인코딩된 유전자로의 첨가 및/또는 대체, 및 관심 유전자에서의 다양한 삽입, 결실 및 대체 돌연변이의 도입을 포함한다. 시험관내 및 생체내 유전자 조작을 위한 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989) and U.S. Pat. Nos. 4,980,285; 5,631, 150; 5,759,828; 5,888,783 and, 5,919,670]을 참조하라.

본원에서 사용되는 "작동적으로 연결된"은 구성요소의 정상 기능이 수행될 수 있도록 하는 근접부위(juxtaposition)를 의미한다. 따라서, 제어 서열에 "작동적으로 연결된" 코딩 서열은 코딩 서열이 이러한 서열들의 제어 하에 발현될 수 있는 배치를 의미한다. 그러한 제어는 직접적일 수 있거나, 즉 단일한 유전자가 단일한 프로모터에 결합될 수 있거나, 다시스트론 전사체가 단일 프로모터로부터 발현되는 경우에서와 같이, 간접적일 수 있다. 예를 들어, 문헌[U.S. Pat. Nos. 4,980,285; 5,631,150; 5,707,828; 5,759,828; 5,888,783 and, 5,919,670, and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)]을 참조하라.

본원에서 사용되는 "과발현"은 유전자 발현을 의미한다. 유전자 및 유전자 생성물은 과발현될 수 있다. 그러한 유전자 생성물은 RNA, 단백질 및 효소를 포함한다. 반면, "과생성"는, 특히 일부 특수한 용도를 위해 회수되어야 하는 세포 생성물이 축적된 세포 생성물을 의미한다. 따라서, 단백질, 물질 (예컨대, 중합체), 및 대사산물 (예컨대, 아미노산)은 과생성된다. 단백질은 과발현되거나 (유전자 발현의 제어를 언급하는 경우) 과생성될 수 있다 (단백질의 축적을 언급하는 경우). 에르고티오네인의 "과생성"에 의해, 에르고티오네인을 "과생성"하는 세포가 에르고티오네인을 "과생성"하지 않는 유사한 세포에 비해 주어진 성장 조건의 세트 하에 각 세포에 대해 더 많은 에르고티오네인 분자를 생성하는 것을 목적으로 한다.

본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하는 유전자의 일부를 표시하는, 당 분야에서 인정되는 의미를 갖는다. 프로모터 서열은 항상은 아니지만 보통 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다. 전사의 개시에 기능하는 프로모터 내의 서열 요소는 종종 컨센서스 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 유용한 프로모터는 항시적 및 유도성 프로모터를 포함한다. 다수의 그러한 프로모터 서열은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[U.S. Pat. Nos. 4,980,285; 5,631,150; 5,707,828; 5,759,828; 5,888,783; 5,919,670, and, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)]을 참조하라. 그 밖의 유용한 프로모터는 항시적이지 않고 특이적 (또는 공지된) 유도물질 분자에 반응성도 아닌 프로모터를 포함한다. 그러한 프로모터는 발달 신호 (예컨대 세포 분화의 단계 또는 배양의 성장기), 또는 환경 신호 (예컨대 pH, 삼투조절제, 열, 또는 세포 밀도)에 반응하는 것들을 포함할 수 있다. 이종성 프로모터는 유전자에 자연적으로 연결되지 않은 프로모터이다. 이종성 프로모터는 동일하거나 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 이종성 프로모터는 유전자와 동일한 유기체로부터 유래되나 자연적으로 상이한 유전자에 연결된 것이 발견된 프로모터일 수 있다.

폴리뉴클레오티드 서열에 관해 이용될 때 본원에서 사용되는 용어 "이식유전자"는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 따라서, 용어 "이식유전자"는, 예를 들어, A 및 B 유전자가 동일한 유기체에서 유래된 경우, 뿐만 아니라 한 종의 폴리뉴클레오티드 서열이 상이한 종(또는 균주)의 세포에 전이된 경우, 구조적 유전자 B에 작동적으로 연결된 유전자 A의 프로모터를 포함한다. 용어 "이식유전자"는 또한 그렇게 변형된 이식유전자의 클론을 포함한다. 미국특허 4,980,285; 5,631,150; 5,707,828; 5,759,828; 5,888,783 및, 5,919,670호를 참조하라.

본원에서 사용되는 용어 "배양 배지", 및 "세포 배양 배지"는 시험관내 세포의 성장(즉, 세포 배양)을 지지하기에 적합한 배지를 의미한다. 상기 용어는 임의의 특정한 세포 배양 배지로 제한하려는 것이 아니다. 예를 들어, 상기 정의는 증식 뿐만 아니라 유지 배지를 포함하고자 한다. 실제로, 상기 용어는 관심 세포 배양액의 성장에 적합한 임의의 배양 배지를 포함하고자 한다.

본원에서 사용되는 용어 "세포 유형"은 그 공급원 또는 특성과 무관하게, 임의의 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "형질전환된 세포주"는 본원에 기재된 특성을 지닌 연속 세포주로 형질전환된 세포 배양액을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "형질전환된 비인간 유기체"는 일차 형질전환된 해당 세포 및 이의 형질전환된 자손을 포함한다. 비인간 유기체는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 따라서, "형질전환주" 또는 "형질전환된 세포"는 전이의 횟수와 상관없이, 이식유전자로 형질전환된 일차 해당 세포, 및 그로부터 유래된 배양액을 포함한다. 모든 자손은, 고의적 또는 부주의에 의한 돌연변이 및/또는 변형으로 인해, DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 또한 이해되어야 한다. 원래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 것과 동일한 기능을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다. 예를 들어, 문헌[U.S. Pat. Nos. 4,980,285; 5,631,150; 5,707,828; 5,759,828; 5,888,783; 5,919,670, and, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 60 Cold Spring Harbor Press (1989)]을 참조하라.

본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 "사람의 손에 의해" 자연 상태로부터 변경됨을 의미한다. "분리된" 조성물 또는 물질은 이의 원래 환경으로부터 변화되거나 제거된 것이거나, 상기 둘 모두이다. 예를 들어, 세포 또는 살아 있는 동물에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리되지" 않은 것이지만, 그 자연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 상기 용어가 본원에 이용된 대로 "분리된" 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 또 다른 물질, 즉 "부모" 화합물로서 지칭될 수 있는 "원래" 물질과 구조적으로 관련된 화학 물질을 의미한다. "유도체"는 하나 이상의 단계에서 구조적으로-관련된 부모 화합물로부터 제조될 수 있다. 구 "밀접하게 관련된 유도체"는 분자량이 부모 화합물의 중량을 50% 넘게 초과하지 않는 유도체를 의미한다. 밀접하게 관련된 유도체의 일반적인 물리적 및 화학적 특성은 또한 부모 화합물과 유사하다.

아직 표시되지 않은 한도까지, 본원에 기재되고 예시된 다양한 구체예들 중 어느 하나는 본원에 기재된 다른 임의의 구체예에 도시된 특징을 포함하도록 추가로 변형될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 일부 구체예 및 양태를 예시한다. 다양한 변형, 첨가, 치환 등이 본 발명의 정신 또는 범위를 변경하지 않고 수행될 수 있고, 그러한 변형 및 변경이 하기 청구범위에 정의된 본 발명의 범위 내에 포함됨이 당업자에게 자명할 것이다. 하기 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1: 대사 공학을 통한 에르고티오네인의 생성 ( 시험관내 효소적 접근법)

에르고티오네인 생합성 유전자 클러스터의 확인. 에르고티오네인 및 오보티올(5 & 7, 도 1)은 1909년에 Tanret에 의해 에르고트에서 분리된 2개의 티올-이미다졸 함유 대사산물이다.^[1] 인간에서 에르고티오네인 특이적인 수송체의 존재^[2]는 식이로부터의 에르고티오네인을 소수의 기관 (예컨대, 간, 신장, 중추신경계 및 적혈구 세포)에서 밀리몰 농도로 풍부하게 할 수 있다.^[3] 다른 티올과 달리, 에르고티오네인 및 오보티올 중 티올-이미다졸 측쇄의 티올레이트 및 티온 형태 간의 평형은 주로 티온 형태를 선호하며 (예컨대, 도 1A에서 5),^[ ^{3f, 4]} 이는 다른 티올 (예컨대, 글루타티온)에 비해 이들을 산화에 훨씬 더 안정하게 만들었다.^[4a] 독특한 에르고티오네인 산화환원 특성^{[4a, 5]}은 헤모글로빈이 적혈구 세포에서 산화되는 것을 막고, 수정체에서 백내장 형성을 방지할 수 있다.^[6] 또한, 이것은 세포의 금속 해독을 위한 금속 킬레이터로서 기능할 수 있다. 현재, 에르고티오네인은 수십억 달러의 시장 크기를 갖는 많은 상용 제품 (안티-에이징 화장품, 보존제, 식이 보충제, 모발 및 손톱 성장 자극제 등) 에서 주요 구성요소 중 하나로서 널리 이용된다.

유전체-광범위 분석 및 생화학 특성화를 위한 생물정보학 도구의 조합을 이용하여, 에르고티오네인 생합성 경로 (도 1)가 2010년에 Seebeck에 의해 제안되었다.^[7] 에르고티오네인 (5)의 구조를 분석했을 때, 이것은 메틸화 및 티올케톤 작용기를 갖는 히스티딘 유도체임이 명백하다. Seebeck은 3개의 에르고티오네인 생합성 유기체인 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 유전체를 분석하였다. M. 아비움 유전체에서, 메틸트랜스퍼라제로 주석이 달린 78개 유전자가 존재한다.^[8] 그러한 78개 메틸트랜스퍼라제 중에서, N. 크라사에 동족체를 갖는 것은 단지 29개이다. 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 에르고티오네인을 생성하지 않으므로, 남아 있는 29개 메틸트랜스퍼라제 중에서, 이. 콜라이 또는 B. 서브틸리스에 동족체를 갖는 것들이 추가로 제거되었다. 생물정보학 도구를 이용한 유전체-광범위 분석에서 양성 및 음성 선택 규칙을 적용함에 의해, Seebeck은 메틸트랜스퍼라제의 수를 10개로 좁혔다. 박테리아에서 이차 대사산물의 생합성을 위한 유전자가 오페론 구조로의 클러스터 경향이 있으므로, 남아 있는 10개 메틸트랜스퍼라제의 근처를 추가로 분석함에 의해, 이를 M. 스메그마티스의 한 후보까지 좁혔다 (MSMEG_6247, 현재 도 1에서 EgtD로 지정됨). 유전자 클러스터에서의 메틸트랜스퍼라제 (EgtD) 외에, EgtA (MSMEG_6250)는 γ-글루타밀시스테인 리가제를 인코딩하고; EgtB는 알려지지 않은 기능을 가지며; EgtC는 아미도트랜스아미다제이고; EgtE는 PLP 의존성 효소인 것 같다. 또한, Seebeck은 시험관내 활성을 입증함에 의해 EgtA, EgtB, EgtC, 및 EgtD 기능을 확인하였다. 제안된 C-S 리아제 활성 (EgtE)은, Seebeck에 따르면, EgtE가 그로부터의 광범위한 노력에도 불구하고 발현될 수 없었기 때문에 확인되지 않았다.^[9]

에르고티오네인과 오보티올 간의 상당한 유사성으로 인해, 오보티올 생성 균주에서 EgtB 동족체는 오보티올 생합성에서 C-S 결합 형성의 원인이 될 수 있다는 가설이 세워졌다. 실제로, 오보티올 생성 균주인 에르위니아 타스마니엔시스(Erwinia tasmaniensis)에서 그러한 동족체 (OvoA, 도 1B)는 E. 타스마니엔시스 유전체에서의 EgtB 동족체의 검색에 의해 확인되었다. OvoA가 이. 콜라이에서 과발현되고 정제된 후에, 정제된 효소는 히스티딘과 시스테인 간의 커플링을 촉매작용하여 설폭사이드 (6, 도 1B)를 형성한다.^[10] 나머지 오보티올생합성 경로는 여전히 확인되어야 한다.

다수의 상용 제품에서 주요 구성요소 중 하나로서 에르고티오네인의 넓은 적용으로 인해 이에 대한 높은 수요가 존재한다. 그러나, 현재의 화학적 합성 도식은 효율적이지 않고,^[ ^11] 자연원 (예컨대, 버섯)으로부터의 분리는 이의 낮은 자연 풍부도로 인해 실용적이지 않다. 에르고티오네인 및 오보티올생합성 유전자 클러스터의 확인은 에르고티오네인 및 오보티올 생합성의 보다 상세한 역학적 연구 및 대사 공학을 통한 이들의 생성을 위한 단계를 설정한다. 도 1의 도식에 따라 대사 공학을 통한 에르고티오네인 생성을 위해서는, 다음 3가지 문제가 있다:

(i) EgtB 활성이 낮다. EgtB는 단핵 비-헴 철 효소인 것으로 제안된다. 현재 활성이 낮다. 본 발명자들은 이의 활성을 개선시키거나 더 나은 활성을 갖는 효소를 찾을 필요가 있다.

(ii) EgtE 단백질은 과발현될 수 없다. 현재까지, 성공적인 EgtE 과발현에 대한 문헌 보고는 없다. 에르고티오네인 생합성 경로를 재구성하기 위해, 이러한 문제가 해결되어야 한다.

(iii) 현재 에르고티오네인 생합성 경로는 최적화될 필요가 있다. 자연 에르고티오네인 생합성 경로, 특히 산화성 C-S 결합 형성 단계 (EgtB 촉매작용)는 최적화되어야 한다. 또한, 도 1A의 경로 이후에, 에르고티오네인과 글루타티온의 생합성 간에 경쟁이 존재한다.

도 1의 자연 에르고티오네인 생합성 경로의 경우에, EgtB는 헤르시닌 (2)과 γ-Glu-Cys를 산화적으로 커플링시켜 3을 형성한다. 3의 글루타메이트는 이후 또 다른 효소 EgtC에 의해 가수분해되어 EgtE 기질 4를 형성한다. 헤르시닌 (2)과 Cys의 직접 산화성 커플링 (도 1의 적색 화살표)을 촉매작용할 수 있는 효소가 확인될 수 있다면, 적어도 2가지 이점이 제공될 것이다: 1) 이는 에르고티오네인 생합성 경로를 2 단계로 나눌 것이다; 2) γ-Glu-Cys가 또한 글루타티온 생합성 경로에서의 기질이므로, 이는 에르고티오네인과 글루타티온 생합성의 경쟁을 제거할 것이다. 글루타티온은 세포내 환원 전위를 조절하는데 이용되고 mM 농도로 존재하는 주요 분자 중 하나이므로, 이러한 경쟁을 제거하는 것은 높은 수준의 에르고티오네인 생성 조건 하에 세포 스트레스를 줄이고 대사 공학을 통한 높은 수준의 에르고티오네인 생성에 현저한 이익을 제공할 것이다.

본 발명은 상기 모든 문제를 해결하고, 새로운 에르고티오네인 생합성 경로를 발생시키며, 그 구체예는 도 2에 도시된다.

단핵 비-헴 철 효소의 활성 개선. 이러한 단핵 비-헴 철 효소 (예컨대, EgtB, OvoA)를 개선시키기 위한 필수 단계로서, 본 발명자들은 적어도 두 상이한 활성 검정을 개발하였고, 이후 이를 이용하여 상기 효소의 활성을 개선시키는데 있어서 본 발명자들의 노력을 인도하였다.

활성 검정. 둘 모두의 EgtB 및 OvoA 촉매작용에 대해 두 상이한 검정을 개발하였다 (도 3). EgtB 및 OvoA 둘 모두는 옥시다제로 제안되며,^[ ^9-10] His과 Cys 간의 산화성 커플링을 촉매작용하여 C-S 결합을 형성한다. 동시에, 황은 설폭사이드로 산화된다. 전체 공정은 이소페니실린 N 신타제의 경우와 유사한 4-전자 산화 공정(도 1)이다.^[12] Seebeck의 초기 보고서에서, 이들은 260 nm에서의 흡수 변화를 모니터함에 의해 반응을 모니터하는데, 그 이유는 산화성 생성물 (3 또는 6, 도 1)이 이러한 영역에서 흡수되기 때문이다. 그러나, 이것은 매우 민감하지 않다. 혐기 조건 하에 검출가능한 생성물 형성이 없었기 때문에 산소가 요구된다. 이러한 특징에 기반하여, 본 발명자들은 NeoFoxy 산소 전극 (도 3-I-A)을 이용한 산소 소비율 (도 3-I-B)을 모니터함에 의한 EgtB 및 OvoA 활성 검정을 개발하였다. 이러한 검정 (도 3-I-B)을 EgtB 및 OvoA 활성에 대한 조건을 최적화하기 위한 루틴 검정으로서 이용하였다.

옥시게나제 또는 옥시다제-촉매작용 반응의 경우, 잠재적인 문제는 부반응의 존재, 비생산성 산소 소비, 또는 효소 자체의 산화성 불활성화를 포함한다. 다수의 활성 검정은 그러한 상황을 분석하기 위한 유용한 정보를 제공할 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 산소 소비 검정 외에, 본 발명자들은 또한 생성물 형성을 직접 모니터하기 위한 ¹H-NMR 검정을 개발하였다 (도 3- II). ¹H-NMR에서, 둘 모두의 생성물 (3 및 6, 도 3-II) 및 기질 (1 및 2)에서 이미다졸 H-원자의 화학적 이동은 나머지 반응 혼합물로부터 잘 분리된다. 따라서, 반응 혼합물은 생성물 분리의 요구 없이 일상적으로 분석될 수 있다. 도 3-II-B (OvoA 촉매작용)에서, 6.93 ppm 및 7.70 ppm에 화학적 이동을 갖는 신호는 2개의 히스티딘 이미다졸 H-원자에 할당된다. 7.83 ppm에서의 신호는 산화성 커플링 생성물 6의 이미다졸 H-원자로부터 비롯된 것이다. 한편 산화성 생성물 3 (EgtB 촉매작용)의 경우, 이의 이미다졸 H-원자는 7.10 ppm의 화학적 이동을 갖는다 (도 3-II- B). 따라서, 산소 소비 검정 및 ¹H-NMR 검정의 조합 이용은 다음과 같은 여러 역학적 특징을 수득할 수 있게 한다: 1) 산소 소비 및 생성물 형성 간의 비; 2) 생성물 C-S 결합 영역-선택성; 3) 제안된 산화성 C-S 결합 형성 이외의 반응의 존재.

개선된 OvoA 활성. EgtB 및 OvoA가 단핵 비-헴 철 효소로 제안되었으므로, 이들의 철 함유 효소인 경우, 이들은 촉매적 전도(turnover) 공정 동안 불활성화될 수 있다. 산소 소비 검정을 이용하여, 본 발명자들은 OvoA 활성 (572 ± 20 min^-1의 k _cat )을 Seebeck^[10]에 의해 보고된 것보다 300배만큼 개선시켰고, 이는 다음과 같은 여러 인자의 조합 결과이다: 1) 본 발명자들은 정제 공정 동안 OvoA 불활성화의 변화를 최소화하기 위해 호기성 대신 혐기성으로 OvoA를 정제하였다; 2) Fe² ⁺를 이용한 정제된 OvoA의 혐기적 재구성; 3) 촉매적 전도 공정 동안 Fe² ⁺에서 Fe³ ⁺으로의 산화에 의해 일부 OvoA가 실제로 불활성화되는 경우 Fe³ ⁺을 다시 Fe² ⁺로 환원시키기 위해 반응 완충제에 아스코르베이트를 포함시킨다. 이론에 구속되길 원치 않으며, 이러한 전략은 EgtB 및 NcEgt1단백질에도 적용될 수 있다.

이러한 초기 결과는, 1) 배양 배지에 Fe를 보충하고, 2) 금속-효소 (EgtB 또는 OvoA)의 흡수 및 성숙이 최대 생체내 효율에 필수적이므로, Fe 흡수 시스템이 에르고티오네인 생성 균주 (예컨대, 사이드로포어 생합성 유전자 클러스터)를 생성하는데 이용될 수 있음을 포함하는, 앞으로의 작업에서 EgtB 및 OvoA 생체내 활성을 개선시키는 것에 관한 방향을 지시한다.

단핵 비-헴 철 효소의 활성의 개선. Seebeck은 시험관내 활성을 입증함에 의해 EgtA, EgtB, EgtC, 및 EgtD 기능을 확인하였다. 그러나, EgtE 생성에 대한 다양한 방법을 조사하기 위한 이들의 광범위한 노력에도 불구하고, EgtE 단백질은 과발현되거나 정제될 수 없었다.^[9] 따라서, 합성 생물학을 통한 에르고티오네인 생성은 불가능하다. 본 발명자들의 예비 연구에서, 본 발명자들은 EgtE를 성공적으로 과발현시키고 정제하였다 (도 4A). 정제된 EgtE의 UV-가시 스펙트럼은 도 4B에 도시되며 약 400 nm에서의 흡수 특징은 PLP 보조인자의 존재와 일치한다. 이러한 노력으로부터의 가장 중요한 발견 중 하나는 EgtE가 또 다른 유전자, 예컨대, 소위 FAD-합성효소와 공동-발현될 필요가 있다는 것이다.

에르고티오네인 생성 생합성 경로의 최적화. 상기 섹션에서, 본 발명자들은 대사 공학을 통해 에르고티오네인 생성을 가능하게 하는 EgtE 문제를 성공적으로 해결하였다. 그러나, 원래의 에르고티오네인 생합성 경로 (도 1A)는 효율적이지 않다. 이러한 문제를 해소하기 위해, 본 발명자들은 도 2에 개요된 대로 헤르시닌 (2)과 Cys를 직접 산화적으로 커플링시킬 수 있는 효소에 대한 검색을 시작하였다. 그러한 효소들 중 2개 (도 1B의 OvoA 및 뉴로스포라 크라사로부터의 NcEgt-1^[13])가 생물정보학 분석 및 산소 및 ¹H-NMR 검정을 이용한 활성 분석의 조합에 의해 확인되었다.

Seebeck으로부터의 초기 보고서에 따르면,^[ ^9-10] EgtB 및 OvoA는 이들의 기질 선호도 및 이들의 생성물 C-S 결합 위치-선택성 둘 모두에 의해 서로에게서 자신을 구별한다 (도 1). 에르고티오네인 (5)의 C-S 결합은 히스티딘 ε-탄소에 위치하는 한편, 오보티올의 경우, C-S 결합은 히스티딘 δ-탄소 (8)에 위치한다. 이들의 기질 선호도 또한 상이하다. EgtB는 헤르시닌 (2)과 γ-Glu-Cys 간의 산화성 커플링을 촉매작용한다. OvoA는 His 및 Cys을 우선적으로 커플링시킨다 (도 1B). 도 2에 개요된 목적을 달성하기 위한 첫 번째 단계로서, 본 발명자들은 헤르시닌 (2) 및 Cys을 기질로서 이용하여 EgtB 활성을 조사하였다. Seebeck에 의해 초기에 보고된 바와 같이, EgtB는 Cys을 기질로서 인지할 수 없다. 따라서, EgtB를 촉매로서 이용하여 헤르시닌 (2)과 Cys 간의 직접 커플링을 달성할 수 없다. 요망되는 그러한 효소는 EgtB의 지시된 진화에 의해 이의 기질 특이성을 변경시키거나 Cys에 선호도를 갖는 효소를 검색함에 의해 수득될 수 있다. 확인된 그러한 효소 중 하나는 OvoA이다. OvoA의 제안된 생물학적 활성은 His 및 Cys의 산화성 커플링이고, 실제로, OvoA는 이러한 제안된 활성을 갖는다 (도 1B). 놀랍게도, 헤르시닌 (2)이 이용되어 기질로서 His을 대신했을 때, 본 발명자들은 OvoA가 또한 기질로서 헤르시닌 (2)을 이용할 수 있음을 발견하였다. 공기-포화된 HEPES 완충제에서 OvoA의 운동 분석은 Cys과 헤르시닌 (2) 간의 산화성 커플링에 대해 하기 운동 파라미터를 나타내었다: 270 ± 5 min^-1의 k _cat 및 헤르시닌의 경우 395 ± 30 μM의 K _m , Cys의 경우 3.19 ± 0.41 mM의 K _m . k _cat 은 기질로서 His을 이용한 반응에 비해 단지 2-배 미만이다.

보다 중요하게는, 생성물을 ¹H-NMR 검정에 의해 분석했을 때, 생성물은 그 자연 OvoA 반응의 C-S 결합을 갖는 화합물 (도 1B 및 도 5A) 대신 화합물 4 (도 5C)이다. 헤르시닌 (2)과 Cys 간의 OvoA-촉매작용된 커플링 반응의 ¹H-NMR 스펙트럼에서, 새로운 신호는 7.45 ppm에서 나타난다. 도 3에서 논의된 정보에 따르면, 이러한 신호는 거의 대부분 EgtB-유형의 커플링 생성물의 이미다졸 H-원자에서 비롯되며, 이는 Cys 및 헤르시닌 (2)이 δ-탄소 대신 히스티딘 ε-탄소에서 산화적으로 커플링됨을 함축하고, 이는 Cys과 헤르시닌 간의 OvoA-촉매작용된 산화성 커플링 생성물로서의 4의 초기 할당으로 이어진다 (도 5C). 명확한 답을 제공하기 위해, 헤르시닌 (2)과 Cys 간의 산화성 커플링 생성물을 분리하고 질량 분광분석 및 여러 NMR-분광학 (¹H-NMR, ¹³C-NMR, 및 COSY, HMBC 및 HMQC를 포함하는 2D-NMR, 첫 번째 원고의 정보를 뒷받침함)에 의해 특성화하였다. 이러한 모든 데이터는 헤르시닌 (2)과 Cys의 직접 산화성 커플링으로부터 OvoA-촉매작용된 4의 생성을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공하며, 이는 도 2에 개요된 목적인, 1-단계 2 → 4 전환을 달성할 수 있게 한다.

이러한 흥미로운 발견에 기반하여, 본 발명자들은 또한 뉴로스포라 크라사로부터의 또 다른 단백질 NcEgt-1을 조사하였다^[13]. 실제로, NcEgt-1은 또한 헤르시닌 (2)과 Cys의 산화성 커플링을 촉매작용하여 OvoA 촉매작용된 2 → 4 전환과 동일한 크기의 활성으로 4를 형성할 수 있다.

요약해 보면, 본 발명자들의 연구에서, 본 발명자들은 대사 공학을 통해 에르고티오네인 생성을 제공하기 위한 세 가지 문제를 모두 극복하였다: 1) 금속-효소 활성을 좌우하는 인자의 확인 (OvoA, EgtB 금속-보조인자 설치 및 효소 불활성화 방지); 2) 성공적인 직접 2 → 4 전환으로 생합성 경로 단순화 및 에르고티오네인과 글루타티온 생합성 간의 경쟁 제거; 3) EgtE 단백질을 과발현하는 조건 파악. 이러한 성과로부터, 본 발명자들은 도 2에 개요된 두 상이한 에르고티오네인 생합성 경로를 성공적으로 확립하였다: 1) EgtE의 성공적인 생성 후 원래 에르고티오네인 경로 (도 2A)에 의한 에르고티오네인의 생성; 2) 직접 2 → 4 전환 및 EgtE를 성공적으로 생성할 수 있는 효소의 발견 후 더 짧은 경로 (도 2B)를 통한 에르고티오네인의 생성. 후속 섹션에서, 본 발명자들은 발효를 통한 생체내 에르고티오네인 생성을 기재할 것이다.

대사 공학을 통한 에르고티오네인 생성

방법 I: 도 2에 개요된 새로운 에르고티오네인 생합성 경로에 따르면, 단 두 단계만이 요구된다: OvoA 또는 NcEgt-1에 의해 촉매작용된 화합물 4로의 헤르시닌 (2)과 Cys 간의 산화성 커플링 (2 → 4 전환) 및 EgtE-촉매작용된 C-S 용해 단계 (4 → 5 전환, 도 2). EgtE가 또 다른 유전자 (예컨대, FAD 합성효소 유전자)와 공동-발현되는 것만으로 EgtE 생성이 달성될 수 있으므로, 3개의 유전자 (OvoA 또는 NcΔEgt-1, EgtE, 및 FAD 합성효소)를 이용하여 최소의 에르고티오네인 생합성 유전자 클러스터가 어셈블링될 수 있다. 본 발명자들은 EgtE 및 FAD를 pETDuet 벡터의 다수 클로닝 부위 I로 클로닝시키고 NcEgt-1 유전자를 다수 클로닝 부위 II로 클로닝시켜 작제물을 생성하였고 이를 도 6에 도시된 대로 (Ego-1)로서 명명하였다.

Ego-1 벡터를 이용하여 에르고티오네인을 생성하기 위해, Ego-1 벡터로 형질전환되는 이. 콜라이 BL(21) DE3로 형질전환될 수 있고 요망되는 세포는 100 μg/mL의 Amp가 보충된 LB 플레이트에서 선택된다. 에르고티오네인을 생성하기 위해, 상기 세포의 밤새 배양을 이용하여 37℃에서 새로운 LB 또는 TB 배지 (100 μg/mL의 Amp., 1 mM의 헤르시닌, 1 mM의 Cys 및 1 mM의 Met가 보충됨)를 접종하였다. OD₆₀₀이 0.6에 도달하면, 배양 배지의 온도를 25℃로 감소시키고, 0.4 - 1 mM의 IPTG를 첨가하여 NcEgt-1, EgtE, 및 FAD 합성효소 생성을 유도함에 의해 에르고티오네인 생성을 개시하였다. 에르고티오네인 생성은 1 mL의 배양 배지를 회수하여 ¹H-NMR에 의해 시간 경과에 따른 헤르시닌 농도를 직접 분석함에 의해 모니터될 수 있다. 일단 모든 헤르시닌이 소비되거나 에르고티오네인의 생성이 더 증가하지 않고 중단되면, 발효 공정을 중지시킨다. 상청액 및 세포를 원심분리에 의해 분리시켰다. 상청액과 세포 펠렛 둘 모두로부터의 에르고티오네인을 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다.

방법 II: 방법 I을 이용할 때, 본 발명자들은 실험실에서 화학적으로 합성된 헤르시닌 (2)을 배양 배지에 보충할 필요가 있다. 발효 비용을 추가로 감소시키기 위해, 본 발명자들은 EgtD 유전자를 pACYCDuet 벡터의 다수 클로닝 부위 II에 클로닝시키고 SAM 합성효소 유전자를 다수 클로닝 부위 I에 클로닝시킴에 의해 제 2 플라스미드 (Ego-2)를 생성하였다. 헤르시닌 (2)으로의 히스티딘의 메틸화를 책임지는 EgtD 유전자를 도입하여, 본 발명자들은 헤르시닌 (2) 대신 His을 배양 배지에 보충할 수 있고, 이는 발효 비용을 더 감소시킬 것이다. 이러한 메틸화 공정은 또 다른 공동-기질인 S-아데노실메티오닌 (SAM)을 필요로 하므로, SAM 합성효소의 도입은 His → 헤르시닌 (2) 전환에서 EgtD의 최대 활성을 보장할 것이다. SAM 합성효소 기질이 His 외에 메티오닌 및 ATP이기 때문에, Met이 또 다른 배지 보충물로서 포함될 것이다.

최적 조건 하에 에르고티오네인을 생성하기 위해, BL21(DE3) 이. 콜라이 세포를 Ego-1 및 Ego-2 둘 모두로 형질전환하고 100 μg/mL의 Amp 및 20 μg/mL의 클로로페니콜이 보충된 LB 플레이트 상에서 선택하였다. 그 후 BL21(DE3)-Ego1-Ego2 밤새 배양을 이용하여 100 μg/mL의 Amp 및 20 μg/mL의 클로로페니콜, 1 mM의 His, 1 mM의 Met이 보충된 새로운 LB 또는 TB 배지를 37℃에서 접종하였다. OD₆₀₀이 0.6에 도달하면, 온도를 25℃로 감소시키고, 0.4 - 1 mM의 IPTG로 에르고티오네인 생성을 유도할 것이다. 에르고티오네인 생성은 1 mL의 배양 배지를 회수하여 ¹H-NMR에 의해 시간 경과에 따른 His 농도를 직접 분석함에 의해 모니터될 수 있다. 일단 모든 His이 소비되거나 에르고티오네인의 생성이 더 증가하지 않고 중단되면, 발효 공정을 중지시킬 것이다. 상청액 및 세포를 원심분리에 의해 분리시켰다. 상청액과 세포 펠렛 둘 모두로부터의 에르고티오네인을 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다.

에르고티오네인의 한 세포-비함유 효소적 형질전환 합성에서, 반응 혼합물은 TCEP 완충제에 OvoA, EgtE, 헤르시닌 및 시스테인을 함유하였다. 반응을 호기 조건 하에 25℃에서 수행하였다. 반응을 ¹H-NMR에 의해 모니터하고, 일단 반응이 완료되면, 에르고티오네인을 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

참조문헌:

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비록 바람직한 구체예가 본원에 상세하게 묘사되고 기재되었으나, 다양한 변형, 첨가, 치환 등이 본 발명의 정신을 벗어나지 않으며 이루어질 수 있고, 따라서 이들은 하기 청구범위에 정의된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려됨이 관련 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 추가로, 아직 표시되지 않은 한도까지, 본원에 기재되고 예시된 다양한 구체예들 중 어느 하나는 본원에 기재된 다른 임의의 구체예에 도시된 특징을 포함하도록 추가로 변형될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Liu, Pinghua <120> Ergothioneine Production through Metabolic Engineering <130> 46644-501001WO <140> PCT/US13/77287 <141> 2013-12-20 <150> 61/740,829 <151> 2012-12-21 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2160 <212> DNA <213> Erwinia tasmaniensis <400> 1 atggcaaaat gggagcacga cgtgaccgcg caacaacacc agacaggatt acccgcccca 60 acccgcatgc tgacgctcag cggtggcgat ccacaacaaa aacgactgca gatactgagc 120 gacttcagca agacctggga actctatgaa agcctgtttg actgccttac cgatgagcgc 180 gcctggtaca ccaaggccat ttcactgcgt cacccgctga tcttctatta cggccatacc 240 gccaccttct atatcaacaa gttgatggcg ggggggctta tcgacgcgcg cgttgacgac 300 aggatcgaag cgacaatggc gattggcgtc gacgaaatga gctgggacga cctggataac 360 agccactaca gctggccgtc gctggcagaa ctgcgcgact atcgtggaaa agttcgccac 420 ctcgttgagc agtttattca gcagatgccg ttgacgttgc cgatcggctg ggatagcccg 480 gcatgggtta tcctgatggg gatcgagcat gagcgcatcc atctggaaac ctcaagcgtg 540 ctgatccgcc agctgccgct ggcgtgggtc agcgcccagc cgcactggcc tgcctgtccc 600 gatgcgcgtc 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MC2 155 <400> 3 atgacgctct cactggccaa ctacctggca gccgactcgg ccgccgaagc actgcgccgt 60 gacgtccgcg cgggcctcac cgcggcaccg aagagtctgc cgcccaagtg gttctacgac 120 gccgtcggca gtgatctgtt cgaccagatc acccggctcc ccgagtatta ccccacccgc 180 accgaggcgc agatcctgcg gacccggtcg gcggagatca tcgcggccgc gggtgccgac 240 accctggtgg aactgggcag tggtacgtcg gagaaaaccc gcatgctgct cgacgccatg 300 cgcgacgccg agttgctgcg ccgcttcatc ccgttcgacg tcgacgcggg cgtgctgcgc 360 tcggccgggg cggcaatcgg cgcggagtac cccggtatcg agatcgacgc ggtatgtggc 420 gatttcgagg aacatctggg caagatcccg catgtcggac ggcggctcgt ggtgttcctg 480 gggtcgacca tcggcaacct gacacccgcg ccccgcgcgg agttcctcag tactctcgcg 540 gacacgctgc agccgggcga cagcctgctg ctgggcaccg atctggtgaa ggacaccggc 600 cggttggtgc gcgcgtacga cgacgcggcc ggcgtcaccg cggcgttcaa ccgcaacgtg 660 ctggccgtgg tgaaccgcga actgtccgcc gatttcgacc tcgacgcgtt cgagcatgtc 720 gcgaagtgga actccgacga ggaacgcatc gagatgtggt tgcgtgcccg caccgcacag 780 catgtccgcg tcgcggcact ggacctggag gtcgacttcg ccgcgggtga ggagatgctc 840 accgaggtgt cctgcaagtt ccgtcccgag aacgtcgtcg ccgagctggc ggaagccggt 900 ctgcggcaga cgcattggtg gaccgatccg gccggggatt tcgggttgtc gctggcggtg 960 cggtga 966 <210> 4 <211> 1116 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis str. MC2 155 <400> 4 gtgatgctcg cgcagcagtg gcgtgacgcc cgtcccaagg ttgccgggtt gcacctggac 60 agcggggcat gttcgcggca gagcttcgcg gtgatcgacg cgaccaccgc acacgcacgc 120 cacgaggccg aggtgggtgg ttatgtggcg gccgaggctg cgacgccggc gctcgacgcc 180 gggcgggccg cggtcgcgtc gctcatcggt tttgcggcgt cggacgtggt gtacaccagc 240 ggatccaacc acgccatcga cctgttgctg tcgagctggc cggggaagcg cacgctggcc 300 tgcctgcccg gcgagtacgg gccgaatctg tctgccatgg cggccaacgg tttccaggtg 360 cgtgcgctac cggtcgacga cgacgggcgg gtgctggtcg acgaggcgtc gcacgaactg 420 tcggcccatc ccgtcgcgct cgtacacctc accgcattgg caagccatcg cgggatcgcg 480 caacccgcgg cagaactcgt cgaggcctgc cacaatgcgg ggatccccgt ggtgatcgac 540 gccgcgcagg cgctggggca tctggactgc aatgtcgggg ccgacgcggt gtactcatcg 600 tcgcgcaagt ggctcgccgg cccgcgtggt gtcggggtgc tcgcggtgcg gcccgaactc 660 gccgagcgtc tgcaaccgcg gatccccccg tccgactggc caattccgat gagcgtcttg 720 gagaagctcg aactaggtga gcacaacgcg gcggcgcgtg tgggattctc cgtcgcggtt 780 ggtgagcatc tcgcagcagg gcccacggcg gtgcgcgaac gactcgccga ggtggggcgt 840 ctctctcggc aggtgctggc agaggtcgac gggtggcgcg tcgtcgaacc cgtcgaccaa 900 cccaccgcga tcaccaccct tgagtccacc gatggtgccg atcccgcgtc ggtgcgctcg 960 tggctgatcg cggagcgtgg catcgtgacc accgcgtgtg aactcgcgcg ggcaccgttc 1020 gagatgcgca cgccggtgct gcgaatctcg ccgcacgtcg acgtgacggt cgacgaactg 1080 gagcagttcg ccgcagcgtt gcgtgaggcg ccctga 1116 <210> 5 <211> 1017 <212> DNA <213> Corynebacterium stationis <400> 5 gtggatattt ggtacggaac agcagcagtc ccaaaagact tagacaacag tgcagtcacc 60 attggtgtct tcgacggcgt gcatcgcggg catcagaaat tgattaatgc cactgttgaa 120 aaagcacgcg aggtgggcgc gaaagccatc atggttactt ttgacccgca cccagtgtcc 180 gtgtttctcc cgcgccgtgc gccgctgggg attactacct tggctgagcg ctttgcgctg 240 gcggaaagct ttggcattga tggcgtgcta gtcattgatt ttacccgcga actctctggt 300 acttcgccgg agaagtacgt ggaatttctt ctagaagaca cgctgcatgc ctcacacgtg 360 gtggtcggag ctaactttac ttttggggaa aatgccgccg gcaccgcaga ttccttgcgg 420 cagatttgcc agtcgcgttt gaccgttgat gtcatcgact tgcttgacga tgaaggcgtg 480 aggatctctt ccacgaccgt gcgcgagttt ctatctgaag gagatgttgc gcgagccaac 540 tgggctttgg ggcggcactt ttatgtcaca ggtccagtag tccgtggtgc tggccgcgga 600 ggcaaggagc tgggatttcc cacggcgaat cagtactttc acgatactgt cgctttgcct 660 gccgatgggg tctatgccgg ctggttgacc attttgccca ccgaggcacc cgtaagcggg 720 aatatggaac ctgaggtggc ttatgccgcc gctatttcag tgggaaccaa cccgaccttt 780 ggcgatgagc agcgttctgt ggagtctttt gtactcgata gagatgctga tctttatggt 840 cacgacgtca aagtggaatt tgttgaccac gtgcgggcaa tggaaaagtt tgactccgtc 900 gagcagcttt tggaagtcat ggctaaagac gtgcagaaaa cccgcacttt gctagctcag 960 gatgtgcaag cacataagat ggcgcctgag acctactttc tacaagcaga aagctaa 1017 <210> 6 <211> 1155 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atggcaaaac acctttttac gtccgagtcc gtctctgagg gccatcctga caaaattgct 60 gaccaaattt ctgatgccgt tttagacgcg atcctcgaac aggatccgaa agcacgcgtt 120 gcttgcgaaa cctacgtaaa aaccggcatt ggttttagtt ggcggcgaaa tcaccaccag 180 cgaccttggg tagacatcga agagatcacc cgtaacaccg ttcgcgaaat tggctatgtg 240 cattccgaca tgggctttga cgctaactcc tgtgcggttc tgagcgctat cggcaaacag 300 tctcctgaca tcaaccaggg cgttgaccgt gccgatccgc tggaacaggg cgcgggtgac 360 cagggtcttg atgtttcggc tacgcaacta atgaaaccga cgtgcctgat gccagcacct 420 atcacctatg cccaccgtct ggtacagcgt caggctgaag tgcgtaaaaa cggcactctg 480 cgtgtgcgcc cggacgcgaa aagccaggtg acttttagct atgacgacgg caaaatcgtt 540 ggtatcgatg ctgtcgtgct ttccactcag cactctgaag agatcgacca gaaatcgctg 600 caagaagcgg taatggaaga gatcatcaag ccaattctgc ccgctgaatg gctgacttct 660 gccaccaaat tcttcatcaa cccgaccggt cgtttcgtta tcggtggccc aatgggtgac 720 tgcggtctta ctggtcgtaa aattatcgtt gatactaccg gcggcatggc gcgtcacggt 780 ggcggtgcat tctctggtaa agatccatca aaagtggacc gttccgcagc ctacgcagca 840 cgttatgtcg cgaaaaacat cgttgctgct ggcctggccg atcgttgtga aattcaggtt 900 tcctacgcaa tcggcctggc tgaaccgacc tccatcatgg tagaaacttt cggtactgag 960 aaagtgcctt ctgaacaact gaccctgctg gtacgtgagt tcttcgacct gccaatcggt 1020 ctgattcaga tgctggatct gctgcacccg atctacaaag aaaccgcagc atacggtcac 1080 tttggtcgtg aacatttccc gtgggaaaaa accgacaaag cgcagctgct gcgcgatgct 1140 gccggtctga agtaa 1155

Claims

(i) 히스티딘 또는 헤르시닌을, 재조합에 의해 발현된: (a) EgtA 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, (b) EgtB 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, (c) EgtC 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, (d) EgtD 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, 및 (e) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 포함하는 반응 혼합물과 함께 인큐베이션시키고; (ii) 효소적 혼합물로부터 에르고티오네인을 분리시키는 것을 포함하는, 에르고티오네인을 제조하는 방법.
(i) 헤르시닌을, 재조합에 의해 발현된: (a) OvoA 단백질, NcEgt1단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편 및 (b) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 포함하는 반응 혼합물과 함께 인큐베이션시키고; (ii) 효소적 혼합물로부터 에르고티오네인을 분리시키는 것을 포함하는, 에르고티오네인을 제조하는 방법.
(i) 히스티딘을, 재조합에 의해 발현된: (a) EgtD 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, (b) OvoA 단백질, NcEgt1단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편, 및 (c) EgtE 단백질 또는 효소적 활성을 보유한 이의 기능성 단편을 포함하는 반응 혼합물과 함께 인큐베이션시키고; (ii) 효소적 혼합물로부터 에르고티오네인을 분리시키는 것을 포함하는, 에르고티오네인을 제조하는 방법.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, EgtD 단백질이 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자와 재조합에 의해 공동-발현되는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, EgtE 단백질이 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자와 재조합에 의해 공동-발현되어 EgtE 생성을 촉진하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 효소적 혼합물이 메티오네인 또는 시스테인을 추가로 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소적 혼합물이 철 염을 추가로 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물이 세포 용해물을 포함하는 방법.
에르고티오네인을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이,
(i) 세포를 적합한 배양 배지에서 적합한 대사 조건 하에 배양하는 단계로서, 상기 세포가 재조합에 의해 EgtA, EgtB, EgtC, EgtD, EgtE 유전자를 발현시키는 단계; 및
(ii) 에르고티오네인을 배양 배지 또는 세포 매스에 축적시킨 후 그로부터 에르고티오네인을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
에르고티오네인을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이,
(i) 세포를 적합한 배양 배지에서 적합한 대사 조건 하에 배양하는 단계로서, 상기 세포가 재조합에 의해 (a) ovoA 유전자 또는 NcEgt -1; 및 (b) egtE 유전자를 발현시키는 단계; 및
(ii) 에르고티오네인을 배양 배지 또는 세포 매스에 축적시킨 후 그로부터 에르고티오네인을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
에르고티오네인을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이,
(i) 세포를 적합한 배지에서 적합한 대사 조건 하에 배양하는 단계로서, 상기 세포가 재조합에 의해 (a) egtD 유전자; (b) ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자; 및 (c) egtE 유전자를 발현시키는 단계; 및
(ii) 에르고티오네인을 배양 배지에 축적시킨 후 그로부터 에르고티오네인을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
제 11항에 있어서, 세포가 S-아데노실메티오네인 (SAM) 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시키는 방법.
제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자를 재조합에 의해 발현시켜 EgtE 생성을 촉진하는 방법.
제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 사이드로포어(siderophore)를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 재조합에 의해 발현시키는 방법.
제 9항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 일반적으로 에르고티오네인을 생성하지 않는 방법.
제 9항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 박테리아 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 또는 식물 세포인 방법.
제 16항에 있어서, 박테리아 세포가 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포인 방법.
제 9항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지에 철 염이 추가로 보충되는 방법.
제 9항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지에 메티오닌, 헤르시닌, 히스티딘, 또는 시스테인 중의 다른 하나 이상이 추가로 보충되는 방법.
제 9항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합에 의해 발현된 유전자 중 하나 이상이 하나 이상의 발현 벡터 또는 플라스미드로부터 발현되는 방법.
제 9항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, egtD 유전자, ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자, egtE 유전자, FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자, 및 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자가 상이한 벡터로부터 발현되는 방법.
제 9항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자, egtE 유전자, 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자가 한 벡터로부터 발현되는 방법.
제 9항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, egtD 유전자 및 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자가 한 벡터로부터 발현되는 방법.
제 9항 내지 제 20항, 제 22항 또는 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자, egtE 유전자, 및 FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자가 제 1 벡터로부터 발현되고, egtD 유전자 및 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자가 제 2 벡터로부터 발현되는 방법.
제 9항 내지 제 20항, 제 22항 또는 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, egtD 유전자, ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자, egtE 유전자, FAD 합성효소를 인코딩하는 유전자, 및 SAM 합성효소를 인코딩하는 유전자가 모두 동일한 벡터로부터 발현되는 방법.
제 9항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합에 의해 발현된 유전자 중 하나 이상이 세포의 유전체에 통합되는 방법.
제 11항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, egtD 유전자의 생성물이 히스티딘의 헤르시닌으로의 전환을 촉매작용하는 방법.
제 9항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, ovoA 유전자 또는 ncEgt -1 유전자의 생성물이 헤르시닌과 시스테인 간의 산화성 커플링을 촉매작용하는 방법.
제 9항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, egtE 유전자의 생성물이 헤르시닌과 시스테인 간의 산화성 커플링의 생성물에서 C-S 결합의 절단을 촉매작용하는 방법.
제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 에르고티오네인.