CN1124340C

CN1124340C - L－缬氨酸和l－亮氨酸的生产方法

Info

Publication number: CN1124340C
Application number: CN95195879A
Authority: CN
Inventors: 富田房男; 横田笃; 桥口贤一; 石乡冈正子; 仓桥修
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-08-30
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 2003-10-15
Anticipated expiration: 2015-08-30
Also published as: EP0872547B1; US5888783A; US6214591B1; DE69535674D1; CN1162976A; DE69535674T2; EP0872547A4; JP3709564B2; WO1996006926A1; EP0872547A1

Abstract

通过在液体培养基中培养埃希氏菌属的具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力且生长需要硫辛酸的微生物，埃希氏菌属的具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力且H⁺-ATP酶活性缺失的微生物，埃希氏菌属的具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力且生长需要硫辛酸并且H⁺-ATP酶活性缺失的微生物，生成L-缬氨酸并积累于培养基中再收集，从而生产出L-缬氨酸。

Description

L-缬氨酸和L-亮氨酸的生产方法

技术领域

本发明涉及一种具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力的埃希氏菌属微生物，具体地说，一种L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力提高了的微生物。

发明背景

过去L-缬氨酸和L-亮氨酸主要利用能生产L-缬氨酸或L-亮氨酸的短杆菌属、棒状杆菌属或锯杆菌属(Serratia)的微生物或其突变株用发酵法生产(氨基酸发酵(Amino acid fermentation)，日本科学学会出版中心(Japan Scientific Society’s Press)，397-422页，1986)。尽管常规方法已相当程度地提高了这些氨基酸的生产能力，为了满足将来对L-缬氨酸和L-亮氨酸的日益增长的需求仍然需经济有效的技术。

另一方面，埃希氏菌属的微生物由于其生长快，遗传分析的进展和充足的遗传材料，有潜力用作生产L-缬氨酸或L-亮氨酸的微生物。然而，记载用埃希氏菌属微生物生产这些氨基酸的文献很少，对L-支链氨基酸，仅有几篇报道涉及L-异亮氨酸的生产(日本专利公开申请5-304969号(1993)和日本专利公开申请5-130882号(1993)。

本发明公开内容

鉴于以上几点，本发明的目的是通过提高埃希氏菌属微生物的L-缬氨酸和L-亮氨酸生产能力，提供一种经济高效的L-缬氨酸和L-亮氨酸生产方法。

经过对埃希氏菌属微生物突变株L-缬氨酸和L-亮氨酸的生产的深入研究，本发明人发现一种生长需要硫辛酸和/或H⁺-ATP酶缺陷的突变能提高生产L-缬氨酸或L-亮氨酸的微生物的生产能力。

因此，本发明的第一微生物是埃希氏菌属微生物，具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力生长需要硫辛酸。本发明的第二种微生物是埃希氏菌属微生物，具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力。H⁺-ATP酶缺陷。进一步，本发明的第三种微生物是埃希氏菌属微生物，具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力，生长需要硫辛酸并且H⁺-ATP酶缺陷。

本发明还提供一种生产L-缬氨酸或L-亮氨酸的方法，包括在液体培养基中培养上述微生物，生产L-缬氨酸或L-亮氨酸并使其在培养基中积累，然后收集。

在本说明中，词组“H⁺-ATP酶缺陷”指细胞基本上不表达H⁺-ATP酶活性，这包括由于编码H⁺-ATP酶8个亚基的atp操纵子部分或全部缺失或者atp操纵子断裂而不表达H⁺-ATP酶基因，和H⁺-ATP酶基因有一个或多个核苷酸替换，插入或缺失导致该基因表达产生的H⁺-ATP酶蛋白不具有H⁺-ATP酶活性。 ilvGMEDA操纵子指至少含有 ilvG、ilvM、 ilvE、 ilvD基因的操纵子，该操纵子可能还含有 ilvA基因，该基因表达失活的苏氨酸脱氨酶，该操纵子也可能基本不包括 ilvA基因。

本发明详述如下：(1)本发明的微生物

本发明的微生物属于埃希氏菌属，具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力并具有下列性质之一：

1.生长需要硫辛酸。

2 H⁺-ATP酶缺陷。

3生长需要硫辛酸且H⁺-ATP酶活性缺陷。

本发明中，该微生物可具有1，2，3任一条性质，优选地具有性质3。通过对埃希氏菌属的因自然突变或人为诱变而生长需要硫辛酸和/或H⁺-ATP酶缺陷的微生物赋于L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力，或提高上述突变株的L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力而获得具有这种性质的微生物。本发明的微生物也可通过在具有L-缬氨酸和/或L-亮氨酸生产能力的埃希氏菌属微生物中诱导生长需要硫辛酸的突变和/或H⁺-ATP酶缺陷的突变来获得。

用以获得上述微生物的微生物可以包括埃希氏菌属的例如大肠杆菌以后也称为 E.Coli并不表现致病性的菌株。例如可用下列菌株。

大肠杆菌K-12(ATCC10798)

大肠杆菌W3110(ATCC27325)

大肠杆菌W1485(ATCC12435)

为了将生长需要硫辛酸和/或H⁺-ATP酶缺陷的突变引入埃希氏菌属的这些微生物，可采用通常用来引入突变的方法，例如X射线或紫外线辐照，或与N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(此后缩写为NG)和亚硝酸等诱变剂接触。另外可用其它遗传技术如基因重组，转导，细胞融合等将突变引入埃希氏菌属的微生物。

获得突变株的具体方法举例如下：

在琼脂平板上培养诱导的细菌细胞，分离出需要硫辛酸的菌落(A.A.Herbert和J.R.Guest：遗传微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)， 53，363-381(1968)可获得生产需要硫辛酸的突变株(此后称为需硫辛酸突变株)。具体地可用需硫辛酸突变株大肠杆菌W1485lip2(ATCC25645)。

从诱变的细菌细胞中筛选不能在以柠檬酸为唯一碳源的琼脂平板上生长而能在以葡萄糖为唯一碳源的琼脂平板上生长的突变株，并从这些突变株中进一步选择不表现H⁺-ATP酶活性的突变株可以获得H⁺-ATP酶缺陷的突变株(此后称为H⁺-ATP酶缺陷突变株)。具体地可用H⁺-ATP酶缺陷株大肠杆菌AN718(大肠杆菌遗传贮备中心(E.coli Genetic StockCenter)，耶鲁大学生物系)。

H⁺-ATP酶是膜结合酶分子量约500,000KD。8种亚基复杂地联在一起，功能是用ATP水解的自由能变化将H⁺泵出细胞质，用细胞内呼吸造成的细胞质膜内外H⁺浓度梯度合成ATP。而且该酶分为定位于内膜上并具有H⁺转运活性的F0部分和定位于膜表面上并催化ATP的分解与合成的F1部分，F0由三种亚基a，b，c，组成，F1由五种亚基α、β、γ、δ、ε组成。在任一亚基有突变的菌株均可用作H⁺-ATP酶缺陷菌株。H⁺-ATP酶缺陷突变包括表达突变型亚基或由于启动子位点突变而不表达组成H⁺-ATP酶的亚基。

进一步，由于H⁺-ATP酶缺陷株不进行氧化磷酸化，能量由底物磷酸化获得，预计将包括H⁺-ATP酶抑制物，柠檬酸循环抑制物，呼吸链抑制物和解偶联剂在内的不同物质加入培养基。也会造成与H⁺-ATP酶缺陷的相同效果。

这类H⁺-ATP酶抑制物包括二环己基碳亚胺，三丁锡(tributyltin)和金黄素，柠檬酸循环抑制物包括丙二酸，单碘乙酸，甲基紫和2，4-二硝基苯酚，电子转运抑制物包括噻吩甲酰三氟丙酮，2-n-壬基-4-羟基喹啉-N-氧化物和抗霉素，解偶联剂包括缬氨霉素，阿的平和4，5，6，7-四氟-2-三氟甲基苯并咪唑。这些抑制物可单独使用或两种以上混用。

上述得到的需硫辛酸株作为母株，进一步诱变，筛选出H⁺-ATP酶缺陷株，或H⁺-ATP酶缺陷株作为母株，进一步诱变，筛选出需硫辛酸株，可得到既需硫辛酸又H⁺-ATP酶缺陷的突变株(此后称为需硫辛酸H⁺-ATP酶缺陷株)。进一步，用转导，转化细胞融合等将一种突变引入表现另一突变的突变株中得到既需硫辛酸又H⁺-ATP酶缺陷的突变株。

例如，将H⁺-ATP酶缺陷转导入需硫辛酸株母株可得到需硫辛酸H⁺-ATP酶缺陷株。这种情况下，上述W1485lip2菌株可用作母株。上述AN71 8株可用作供体株。将硫辛酸需要转导入H⁺-ATP酶缺陷株母株可得到需硫辛酸H⁺-ATP酶缺陷株。

由上述方法得到的需硫辛酸H⁺-ATP酶缺陷株可包括大肠杆菌AJ12631。菌株AJ12631于1991年7月24日保藏于工业通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERMP-12381，依据布达佩斯协议于1995年8月29日转移到国际保藏处，保藏号FERM BP-5029。

可以对埃希氏菌属的需硫辛酸突变株，H⁺-ATP酶缺陷突变株或需硫辛酸H⁺-ATP酶缺陷突变株赋于L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力，或者提高这些突变株的L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力得到本发明的微生物。另外将硫辛酸需要和/或H⁺-ATP缺陷引入埃希氏菌属具有L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力的微生物中也可获得本发明的微生物。进一步甚至对L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力较低的微生物，可通过引入硫辛酸需要和/或H⁺-ATP缺陷提高生产能力。(1)生产L-缬氨酸的微生物

可通过对埃希氏菌属微生物的需硫辛酸突变株，或H⁺-ATP酶突变株，或需硫辛酸H⁺-ATP酶突变株赋于L-缬氨酸生产能力，或提高上述突变株的L-缬氨酸生产能力得到生产L-缬氨酸的微生物。

通过将调控机制相当松弛的L-缬氨酸生物合成基因引入埃希氏菌属的微生物可以赋于或提高L-缬氨酸生产能力。可引入一种突变，导致埃希氏菌属微生物L-缬氨酸生物合成基因的调控机制受抑制。

在埃希氏菌属微生物中，L-缬氨酸生物合成的最后一步由一组ilvGMEDA操纵子编码的酶定成。 ilvGMEDA操纵子包括 ilvG、 ilvM、ilvE、 ilvD、 ilvA基因各一个，它们分别编码乙酰羟基酸(Acetohydroxy-acid)合成酶同功酶II的大亚基和小亚基，转氨酶，二羟基酸脱水酶和苏氨酸脱氨酶。这些酶中的乙酰羟基酸合成酶，转氨酶和二羟基酸脱水酶催化从丙酮酸到L-缬氨酸和从2-丁酮酸到L-异亮氨酸的合成途径，苏氨酸脱氨酶催化从L-苏氨酸到2-丁酮酸的脱氨反应，这是L-异亮氨酸生物合成的限速步。因此为使L-缬氨酸合成反应有效地进行。优选地使用不表达活性苏氨酸脱氨酶的操纵子。可用的 ilvGMEDA操纵子中 ilvA可引入导致生产失活的苏氨酸脱氨酶的突变。或 ilvA被破坏或 ilvA损失。

由于L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸对 ilvGMEDA操纵子表达的调节(衰减)，优选地衰减必需的区域应缺失或突变，使产物L-缬氨酸造成的表达调控松弛。

通过诱变野生型 ilvGMEDA操纵子或用遗传重组技术修饰它可得到前述的不表达苏氨酸脱氨酶活性并且衰减松弛的 ilvGMEDA操纵子。

该 ilvGMEDA操纵子可包括来源于埃希氏菌属微生物的操纵子，特别是来源于大肠杆菌的ilvGMEDA操纵子。埃希氏菌属微生物中并不特别限定用哪一种微生物，但特定地可用Neidhardt，F.C.等人描述的微生物(大肠杆菌和伤寒沙门氏菌，美国微生物学会(American Society forMicrobiology)，华盛顿(哥伦比亚特区)1208，表1)。若野生型株用作含有 ilvGMEDA操纵子的DNA供体株，可得到含有野生型 ilvGMEDA操纵子的DNA。

然而，若用大肠杆菌作野生型 ilvGMEDA操纵子的DNA供体株，由于 ilvG基因有移码突变，野生型K-12株不表达活性的乙酰羟基酸合成酶同功酶II(AHASII)(美国国家科学院院刊(Proc.NatlAcad.Sci.USA，)， 78，922，1991)。因此，若用K-12株作DNA供体株，则必需制备一种阅读框恢复因而重新具有 ilvG基因编码的乙酰羟基酸合成酶同功酶II活性的突变株用作DNA供体株，另外若用不是来源于K-12株的大肠杆菌作DNA供体可只分离 ilvG基因引入来源于K-12株的ilvGMEDA操纵子中。因此， ilvMEDA区从DNA供体K-12株中分离，只有 ilvG基因从不是来源于K-12株的大肠杆菌DNA供体中分离，得到的两段序列连接在一起形成全长的 ilvGMEDA操纵子。乙酰羟基酸合成酶同功酶II(AHASII)由两个不同的大亚基和小亚基组成。大亚基由 ilvG基因编码，小亚基由 ilvM基因编码。

若得衰减松弛的 ilvGMEDA操纵子的方法如下：

在 ilvGMEDA操纵子5′上游的衰减子定位与DNA序列由RP.Lawther等人报道(核酸研究(Nucleic Acids Res.) 15，2137(1987))。

从不表达活性苏氨酸脱氨酶的 ilvGMEDA开始，制备衰减子缺失的ilvGMEDA操纵子，可得到不表达苏氨酸脱氨酶活性且衰减子缺失的ilvGMEDA操纵子。

SEQ ID NO：1给出的核苷酸序列包括启动子， ilvGMEDA操纵子核苷酸序列中的 ilvG基因编码区，以及衰减必需的区域。 ilvG基因编码的氨基酸序列由SEQ ID NO：2给出。DNA序列中的核苷酸966至971编码导肽上的连续两个亮氨酸残基，核苷酸999至1007编码导肽上三个连续缬氨酸残基，核苷酸1008至1016编码导肽上三个连续异亮氨酸残基。核苷酸1081至1104编码衰减子中形成rho非依赖型类终止子茎环结构的部分。

细胞中L-异亮氨酸，L-缬氨酸和L-亮氨酸量足会使DNA序列上核苷酸1081至1104的转录物RNA形成rho-非依赖型类终止子茎环结构，从而RNA聚合酶终止转录，抑制 ilvGMEDA操纵子的表达。

例如，细胞中L-缬氨酸不足导致L-缬氨酸结合tRNA不足，使核糖体翻译在编码导肽区的连续缬氨酸残基处停顿。这会使其它mRNA结构形成新的三维结构，从而抑制由DNA序列的核苷酸1081至1104转导激发的RNA rho非依赖型类终止子茎环结构的形成。于是RNA聚合酶继续转录， ilvGMEDA操纵子表达。相似地，L-异亮氨酸或L-亮氨酸不足导致 ilvGMEDA操纵子表达。

因此若要去除L-缬氨酸衰减作用必需区域，可去除SEQ ID NO：1给出的DNA序列的核苷酸999至1007或1081至1104。相似地，若要去除下述产L-亮氨酸微生物生产中L-亮氨酸衰减作用必需区域，可去除SEQ ID NO：1给出的DNA序列的核苷酸966至971或1081至1104。

去除衰减作用必需区域意味着引入的突变使衰减作用松驰。因此该突变不仅限于去除 ilvGMEDA操纵子5′端上游的所有衰减子。关键地是该突变可能导致衰减子不形成rho非依赖性类终止子茎环结构。另外在产L-缬氨酸微生物生产过程中该突变可能导致导肽不含有连续缬氨酸残基。进而在产L-亮氨酸微生物生产过程中该突变可能导致导肽不含有连续亮氨酸残基。在上述任一情况下衰减均不起作用。

因此，去除衰减必需区的概念包括在衰减子中插入另外的DNA片段以及去除 ilvGMEDA操纵子5′上游衰减子的所有部分或一部分或相邻部分。(i)分离野生型 ilvGMEDA操纵子

为了分离含有 ilvGMEDA操纵子的DNA，可以分别分离 ilvGM、ilvE、 ilvD、 ilvA基因再连起来。但是在构建产L-缬氨酸微生物中，编码苏氨酸脱氨酶的 ilvA基因并非必需，因而可以连接 ilvGM、 ilvE和ilvD基因得到包括 ilvGMED的DNA。

首先培养大肠杆菌，例如大肠杆菌K-12，大肠杆菌W3110，大肠杆菌MC1061(所有这些均包括移码突变的 ilvG)，大肠杆菌MI162( thr- 10， car-94， λ ^-， relA1， ilvG603， thi-1)或大肠杆菌B(后两者包括正常的 ilvG)，得到培养物细胞。微生物可用通常的固体培养基法培养，考虑到收获细胞的效率，优选地用液体培养基法培养。所用培养基是将酵母提取物、胨、胰蛋白胨或由提取物加到氯化钠(NaCl)中。特别地用L-肉汤培养基(细菌培养用胰蛋白胨1％，细菌培养用酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，葡萄糖0.1％，pH7.2)。培养基起始pH优选地调至6-8。培养时30至42℃，优选地约37℃，4-24小时，通气搅拌并浸没于培养基中振荡培养或静止培养。大肠杆菌MI162可获自大肠杆菌遗传贮备中心(康涅迪格州，美国)。该菌株鉴别号(ID No.)是CGSC5919。该菌株详细的特性描述见分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)， 143，243(1976)和细菌学杂志(J.Bacteriol.)， 149，294(1982)。

于是获得的培养物离心例如3,000rpm 5分钟得到大肠杆菌片状沉淀。可用斋藤和三浦的方法(生物化学和生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta.)， 72，619(1963))或K.S.Kirby的方法(生化杂志(Biochem.J.)， 64，405(1956)从片状沉淀物中提取染色体DNA。

为了从得到的染色体DNA中分离 ilvGMEDA操纵子，制备染色体DNA文库。首先，用适当的限制酶部分消化染色体DNA，得到不同DNA片段的混和物。若消化反应要调整消化程度可利用许多限制酶。例如在不低于30℃，优选地是37℃用 Sau3AI消化染色体DNA，酶浓度1-10单位/ml。时间可变(1分至2小时)。

然后消化的DNA连接到在埃希氏菌属细胞内能自主复制的载体DNA上制备重组DNA。具体地讲，载体DNA用限制酶例如 BamHI完全消化和切割，温度30℃以上，酶浓度1-100单位/ml，1小时，优选地1-3小时，得到与 Sau3AI消化染色体DNA相同的限制末端。然后将上述得到的染色体DNA片段和切割的载体DNA混和，加入DNA连接酶。优选的是T4 DNA连接酶，4-16℃，酶浓度1-100单位/ml，反应1小时以上，优选的是6-24小时，得到重组DNA。

用得到的重组DNA转化埃希氏菌属的微生物，例如乙酰羟基酸合成酶活性缺陷突变株如大肠杆菌MI262( leuB6、 ilvI614、 ilvH612、 λ ^-、relA1、 spoT1、 ilvB619、 ilvG603、 ilvG605(am)、 thi-1)，转氨酶B缺陷突变株如大肠杆菌AB2070( proA2、 trp-3、 higG4、 ilvE12、 metE12、metE46、 th-1、 ara-9、 lac-Y1或 lacZ4， galK2， malA1， mtl-1， rpsL8或rpsL9， ton-1， tsx-3， λ ^R， λ ^-， supE44)，或双羟基酸脱水酶缺陷突变株如大肠杆菌AB1280( hisG1， ilvD16， metB1， argH1， thi-1， ara-13， lacY1或 lacZ4， gal-6， xyL-7， mt1-2， malA1， repsL8，9或17， tonA2， λ ^R，λ ^-， supE44)，制备染色体DNA文库。转化的操作方法可依D.MMorrison(酶学方法(Methods in Enzymology)， 68，326，1979)或用氯化钙处理受体细胞增加DNA通透性(Mandel，M.和Higa，A，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) 53，159，(1970)。大肠杆菌MI262获自大肠杆菌遗传贮备中心(康涅迪格州，美国)。该菌株鉴别号为CGSC5769。该菌株的详细特征描述见分子基因遗传学， 156，1(1977)。大肠杆菌AB2070获自大肠杆菌遗传贮备中心(康涅迪格州，美国)。该菌株鉴别号为CGSC2070。该菌株的详细特征描述见细菌学杂志， 109，730，(1972)。

由于全长 ilvGMEDA操纵子的核苷酸序列已见报道(核酸研究， 15，2137(1987)，用特定限制酶消化染色体DNA可制备含有目标基因的一定长度DNA片段。只有一定长度的DNA片段才连接到载体DNA上得到重组DNA制备染色体NDA文库，从而更有效地获得包含目标基因的DNA片段。

从得到的染色体DNA文库，通过筛选乙酰羟基酸合成酶活性增加的菌株或其乙酰羟基酸合成酶基因缺陷造成的营养需要被互补的菌株；得到含有包括 ilvGM基因的重组DNA的菌株。

从得到的染色体DNA文库，通过筛选转氨酶B活性增高的菌株或其因转氨酶B基因缺陷造成的营养需要被互补的菌株，得到含有包括 ilvE基因的重组DNA的菌株。

从得到的染色体DNA文库，通过筛选二羟基酸脱水酶活性增高的菌株或基因二羟基酸脱水酶基因缺陷造成的营养需要被互补的菌株，得到含有包括 ilvD基因的重组DNA的菌株。

为了检验要含有包括 ilvGM基因的重组DNA的候选物所含的重组DNA中 ilvGM基因是否克隆，先制备候选物的细胞提取物再从该提取物进一步制备粗酶溶液来证实乙酰羟基酸活性确定增高，乙酰羟基酸活性检测用M.D.Felice等人的方法进行(酶学方法(Methods inEnzymology)， 166，241)。

由于乙酰羟基酸合成酶缺陷菌株需要异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸，若用乙酰羟基酸合成酶缺陷突变株作宿主细胞，通过分离能在不含缬氨酸的基本培养基上生长的菌株，并从中收集重组DNA可得到含有 ilvGM基因的DNA片段。

另外，含 ilvGM基因的DNA序列已由R.P.Lawther等人报道(核酸研究， 15，2137(1987)。于是通过从候选物中分离重组DNA，测序并与报道中序列对比可完成证实工作。

如上述，大肠杆菌K-12 ilvG基因的开放阅读框内有突变。结果是产生的移码和中途终止密码子的出现造成翻译终止。终止密码子出现在ilvG基因起始密码子ATG(在1-3位)下游982-984位。当应用得自该菌株的ilvGM基因时需要用定点诱变技术将突变区回复到正常序列。例如对大肠杆菌MI162的 ilvG基因( ilvG603)，将982-984位的终止密码子TGA之前加上TG成基对恢复阅读框。其它突变描述见细菌学杂志(J.Bacteriol.)， 149，294(1982)的图2。

检验要含有包括 ilvE基因的重组DNA的候选物所含的重组DNA中 ilvE基因是否克隆的方法如下。由于转氨酶B缺陷突变株需要异亮氨酸，若用转氨酶B缺陷突变株作宿主细胞，通过分离能在不含异亮氨酸的基本培养基上生长的菌株并从中收集重组DNA可得到含有 ilvE基因的DNA片段。

另外，含 ilvE基因的DNA序列已由R.P.Lawther等人报道(核酸研究(Nucleic Acids Res.)，15，2137(1987)。于是通过从遗传物中分离重组DNA，测序并与报道中序列对比可完成证实工作。

检验要含有包括 ilvD基因的重组DNA的候选物所含的重组DNA中 ilvD基因是否克隆的方法如下。由于二羟基酸脱水酶缺陷突变株需要异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸，若用二羟基酸脱水酶缺陷突变株作宿主细胞，通过分离能在不含缬氨酸的基本培养基上生长的菌株并从中收集重组DNA可得到含有 ilvD基因的DNA片段。

另外，含有 ilvD基因的DNA序列已由R.P.Lawther等人报道(核酸研究， 15，2137(1987)。于是通过从候选物中分离重组DNA测序并与报道中序列对比，可完成证实工作。

从上述每种菌株中，可以用例如P.Guerry等人的方法(细菌学杂志(J.Bacteriol)， 166，1064(1973))和D.B.Clewell的方法(细菌学杂志， 110，667(1972)分离重组DNA。

为得到全长 ilvGMEDA操纵子将含有 ilvGM基因的DNA片段，含有 ilvE基因的DNA片段和含有ilvD基因的DNA片段连起来。连接时，由R.P.Lautther描述的全长 ilvGMEDA DNA序列。(核酸研究， 15，2137(1987))可当作参考。

从染色体中含有野生型 ilvGMEDA的菌株用斋藤、三蒲的方法制备染色体DNA，用聚合酶链式反应法(PCR；见White，T.J.等)；遗传技术趋势(Trends，Gent， 5，185(1989))扩增ilvGMEDA操纵子可得到野生型ilvGMEDA操纵子。与含有全部或部分 ilvGMEDA操纵子区的DNA双链的两个3′端互补的PCR引物用于扩增。若只扩增 ilvGMEDA操纵子区域的一部分，用上述DNA片段作探针从染色体DNA文库中搜索含有整个区域的DNA片段。若扩增整个 ilvGMEDA操纵子区域，含有包括扩增的 ilvGMEDA操纵子的DNA片段的PCR溶液作琼脂糖凝胶电泳，再提取目标DNA片段，才收集到包括 ilvGMEDA操纵子的DNA片段。由于这种情况下 ilvA基因对构建产L-缬氨酸微生物不是必需的，可见扩增 ilvGMED。

制备DNA引物时，由R.P.Lawther等人描述的全长 ilvGMEDA操纵子DNA序列可用作参考。(核酸研究， 15，2137(1987)。

PCR引物可用磷酸胺(phosphoramidite)等常用的法(四面体通报(Tetrahedron Letters)， 22，1859(1981))。在购置的DNA合成仪(例如应用生物系统(Applied Biosystems)，DNA合成仪380B型)中合成。可以在购置的PCR系统(珀金-埃尔默(Perkin Elmer)公司，DNA热循环仪PJ2000)用Tag DNA聚合酶(宝酒造公司(Takara Shuzo，Ltd.)提供)按供应商提供方法进行PCR反应。

PCR法扩增的 ilvGMEDA操纵子连到载体DNA上，载体能在埃希氏茵属微生物细胞中自主复制。再诱导入埃希氏菌属微生物细胞中，从而协助在 ilvA基因上诱导突变以及去除衰减必需区。载体DNA转化方法和 ilvGMEDA操纵子的进一步证实均同上。

当大肠杆菌K-12，大肠杆菌W3110和大肠杆菌MC1061用作ilvGMEDA操纵子的供体微生物时，由于 ilvG基因的开放阅读框架内有转移突变，该突变需要用定点突变法恢复。若用大肠杆菌MI162( thr-10，car-94， λ ^-， relA1， ilvG603， thi-1)和大肠杆菌B用作 ilvGMEDA操纵子的供体微生物， ilvG基因可直接用。(ii)去除 ilvGMEDA操纵子的衰减必需区

从 ilvGMEDA去除衰减必需区的概念包括将另一段DNA片段插入衰减子以及去除 ilvGMEDA操纵子上上游衰减子的全部，部分或其周围区域。此处“衰减子”指形成rho非依赖性类终止子茎环结构的DNA序列。例如SEQ ID NO：1给出的DNA序列中核苷酸1081至1104相对应的序列。

分布制备 ilvGMEDA操纵子衰减子上游和下游的DNA片段，将两段DNA片段连接可以去除衰减子。例如，用适当的限制酶切除一段包括 ilvGMEDA操纵子全长的DNA片段可制备 ilvGMEDA操纵子衰减子上游DNA片段，另外可用PCR法扩增 ilvGMEDA操纵子的衰减子上游DNA片段。PCR法用的引物DNA可在R.P.Lawther等人(核酸研究，15，2137(1987)和G.Coopola等人(基因(Gene)， 97，21(1991)描述的DNA序列基础上化学合成。而且， ilvGMEDA操纵子的衰减子上游DNA片段可以化学合成。

制备 ilvGMEDA操纵子的衰减子下游DNA片段的方法与上述相以。

从 ilvGMEDA操纵子开始，可以制备其中部分衰减子或其周围序列缺失的 ilvGMEDA操纵子。由于衰减子的定位与DNA序列已由R.P.Lawther等人报道(核酸研究， 15，2137(1987)，可根据该序列确定待去除的DNA。

待去除的DNA优选地是形成rho非依赖型类终止子茎环结构必需的DNA序列和/或包括茎环结构上游编码连续缬氨酸残基的区域或优选二者均包括在内的NDA片段，分别制备 ilvGMEDA操纵子的衰减子上游和下游的DNA片段，再将两段DNA片段联起来可以去除部分衰减子或其周围区域。例如用适当的限制酶切除一段包括 ilvGMEDA操纵子全长的DNA片段可制备 ilvGMEDA操纵子衰减子上游DNA片段，另外可用PCR法扩增 ilvGMEDA操纵子中待去除DNA的上游DNA片段。PCR法用的引物DNA可在R.P.Lawther等人(核酸研究， 15，2137(1987))和G.Coopola等人(基因， 97，21(1991))描述的DNA序列基础上化学合成。而且 ilvGMEDA操纵子中待去除DNA的上游NDA片段可化学合成。

制备 ilvGMEDA操纵子中待去除DNA的下游DNA片段的方法与上述相似。

从 ilvGMEDA操纵子开始，可制备衰减子中插入附中DNA片段的ilvGMEDA操纵子。由于衰减子的定位和DNA序列已由R.P.Lawther等人或G.Coopola等人报道，可根据该序列确定插入位置和插入的附加DNA片段的DNA序列。

插入的附加DNA片段优选地插入形成rho非依赖性类终止子茎环结构必需的DNA序列中或插入编码茎环结构上游连续缬氨酸残基的DNA区域中。插入的结果是衰减子不能形成rho非依赖性类终止子茎环结构，衰减子功能会松驰。

插入的附加DNA片段的DNA序列优选地设计成不会形成rho非依赖型类终止子茎环结构，并且插入后rho非依赖型类终止子茎环结构上游不存在连续缬氨酸残基。

插入的附加DNA片段，其上游 ilvGMEDA操纵子DNA片段及其下游 ilvGMEDA操纵子DNA片段制备出来并将三者连接起来，即可将该附加DNA片段插入衰减子中。例如，用适当的限制酶切割一段含有ilvGMEDA操纵子全长的DNA片段，可制备 ilvGMEDA操纵子中附加DNA片段的上游DNA片段。另外可用PCR方法扩增附加DNA片段上游的 ilvGMEDA操纵子DNA片段。PCR法用的引物DNA可根据R.P.Lawther等人(核酸研究， 15，2137(1987))和G.Coopola等人(基因，97，21(1991))描述的DNA序列化学合成，而且 ilvGMEDA操纵子中附加DNA片段上游DNA片段可化学合成。

制备 ilvGMEDA操纵子中附加DNA片段下游的DNA片段的方法与上述相似。

插入的附加DNA片段可化学合成。

用PCR扩增附加DNA片段上游或下游的 ilvGMEDA操纵子DNA片段时，可把附加DNA片段与引物DNA相连。例如，在 ilvGMEDA操纵子内用于扩增附加DNA片段插入区上游DNA片段的3′端DNA引物可与待插入的附加DNA片段一条链相连。相似地，用于扩增附加DNA片段插入区下游DNA片段的5′端DNA引物可与待插入附加DNA片段互补链相连。用上述引物扩增的两条不同DNA片段再相连。(iii)使苏氨酸脱氨酶失活

若得到的 ilv操纵子含有 ilvA基因，则去除 ilvA或修饰使其有突变、插入或缺失以使表达的苏氨酸脱酶失活。修饰的例子，切割 ilvA基因的限制位点，去除切割位点下游的DNA片段。在两个位点切割 ilvA基因再连接可切去一段DNA片段。进一步，在切割位点插入另一DNA片段如合成DNA可使表达的苏氨酸脱氨酶失活。若限制位点是粉末端，将粉末端处理成平末端，再将得到的两个末端相连，从而使表达的苏氨酸脱氨酶失活。而且用定点诱变等方法可使表达的苏氨酸脱氨酶失活。

此后，其中衰减受抑制，苏氨酸脱氨酶活性不表达的 ilvGMEDA操纵子或 ilvA被去除的 ilvGMEDA操纵子称为去抑制(derepressed)的ilvGMEDA ^*操纵子，A^*代表缺失 ilvA基因或 ilvA编码失活的苏氨酸脱氨酶或其部分。(iv)将去抑制的 ilvGMEDA ^*操纵子引入埃希氏菌属微生物。

如上得到的含有去抑制的 ilvGMEDA ^*操纵子的DNA片段用作重组DNA，引入适当的宿主微生物并表达，可得到参与缬氨酸生物合成的ilvGMEDA ^*操纵子编码的酶系统表达增强的微生物。埃希氏菌属微生物如大肠杆菌优选地用作宿主微生物。

可以用从一段重组DNA切下又插入另一段载体DNA的去抑制ilvGMEDA ^*操纵子。用于本发明的载体DNA优选质粒DNA例如，pUC19，pUC18，BR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219和pMW218。另外也可用噬菌体DNA载体。

进一步，为了更有效地表达去抑制的 ilvGMEDA ^*操纵子，可连上能在微生物中起作用的其它启动子，包括lac，trp和P_L， ilvGMEDA ^*操纵子本身固有的启动子有直接用或扩增后用。

如上述，将操纵子插入在宿主中自主表达的载体DNA可使含有去抑制 ilvGMEDA ^*操纵子的DNA片段以染色体外DNA如质粒形式存在于宿主微生物中，而去抑制 ilvGMEDA ^*操纵子可用转导，转变子(Berg.D.E.和Berg.C.M.，生物/技术(Bio/Technol.)， 1，417(1983))，Mu噬菌体(日本专利公开申请2-109985号(1990))或同源重组技术分子生物学实验(Experiments in Molecular Biology，冷泉港实验室(1972))插入宿主微生物的染色体。引入宿主的去抑制 ilvGMEDA ^*操纵子数目可以是1个或多个。

如上述，将含有去抑制 ilvGMEDA ^*操纵子的DNA片段引入需硫辛酸和/或H⁺-ATP酶缺陷的埃希氏菌属微生物可得到产L-缬氨酸微生物。也可将硫辛酸需要和/或H⁺-ATP酶缺陷引入含有去抑制 ilvGMEDA ^*操纵子的DNA片段的埃希氏菌属微生物得到产L-缬氨酸的微生物。(2)产L-亮氨酸微生物

如下面实施例中说明的，发现需硫辛酸或H⁺-ATP酶缺陷埃希氏菌属微生物能提高L-缬氨酸生产能力。该发现预示需硫辛酸突变或H⁺-ATP酶缺陷突变使细胞内新陈代谢激活L-缬氨酸合成。因此认为需硫辛酸突变或H⁺-ATP酶缺陷突变促进L-亮氨酸生物合成，该合成途径从L-缬氨酸的最后一个中间物处分出去。因而若在需硫辛酸突变株，H⁺-ATP酶突变株或需硫辛酸H⁺-ATP酶突变株引入L-亮氨酸生产能力或提高该能力，该菌株预计会带上L-亮氨酸生产能力或生产能力提高。

例如除了生产L-缬氨酸必需的性质外，将调节机制基本松弛的L-亮氨酸生物合成基因引入埃希氏菌属微生物。可以增加或提高L-亮氨酸生产能力。可引入使埃希氏菌属微生物L-亮氨酸生物合成机制基本松弛的突变。这些基因包括例如L-亮氨酸抑制基本松弛的leuA基因。

除了上述L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力，本发明的微生物可以具有有效提高其氨基酸生产能力的公认的特征。例如，各种营养需求，耐药性，药物敏感性，药物依赖性，或是具有以下特征：促进氨基酸生物合成的基因用基因工程手段扩增。(2)本发明的L-缬氨酸或L-亮氨酸生产方法

本发明生产L-缬氨酸或L-亮氨酸通过在液体培养基中培养本发明的微生物，生产L-缬氨酸或L-亮氨酸并在液体培养基中积累，再从液体培养基中收集L-缬氨酸或L-亮氨酸。本发明的产L-缬氨酸微生物用来生产L-缬氨酸，本发明的产L-亮氨酸微生物用来生产L-亮氨酸。

本发明生产方法中，产L-缬氨酸或L-亮氨酸微生物的培养，L-缬氨酸或L-亮氨酸从液体培养基的收集与纯化与利用微生物生产氨基酸的常规发酵方法相似。培养基可以是合成培养基或天然培养基。只要它含有氮源、碳源、无机物以及必需时，微生物生产需要的适量养料。碳源可包括各种碳水化合物如葡萄糖和蔗糖和各种有机酸。依据所用微生物同化作用方式不同，也可用醇类如乙醇和甘油。氮源可用各种铵盐如氨和硫酸铵，其它含氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨，大豆水解物和发酵菌体分解物。无机物可用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙等。

培养条件优选是通氧条件如振荡培养和通气搅拌培养。温度20至40℃，优选的30至38℃。培养物pH通常在5和9之间。优选地在6.5至7.2之间。培养物pH可用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节。通常培养1-3天，所需L-缬氨酸或L-亮氨酸即在液体培养基中积累。

培养后，用离心和膜过滤可以从液体培养基中除去固体如细胞，收集所需L-缬氨酸或L-亮氨酸。用离子交换，浓缩和结晶法纯化。

附图简述

图1是质粒pHSGSK的构建方案。

图2是质粒pdGM1的构建方案。

图3是质粒pMWGMA2的构建方案。

图4是质粒pMWD5的构建方案。

图5是质粒pMWdAR6的构建方案。

实施发明的最佳模式

本发明参考下列实施例描述：实施例1：构建产L-缬氨酸微生物(1)构建携带去抑制 ilvGMEDA ^*操纵子的质粒pMWdAR6。

从大肠杆菌MI162提取染色体DNA，用限制酶 HindIII切割，发现含有 ilvGM基因的 HindIII- HindIII DNA片段长4.8kb。于是将约4.8kb的 HindIII- HindIII DNA片段与 HindIII消化质粒载体pBR322(购自宝酒造公司)得到的DNA片段相连接。

得到的DNA连接混合物诱导入乙酰羟基酸合成酶缺陷株大肠杆菌MI262。选择转化后乙酰羟基酸合成酶缺陷被互补的菌株。从中分离质粒结构。质粒分析结果显示含有 ilvGM基因和 ilvE 4.8kb DNA片段插入pBR322的 HindIII位点。该质粒命名为 pBRGM7。

SEQ ID NO：3和NO：4给出的合成寡聚核苷酸参考基因， 97，21，(1991)，美国国家科学院院刊(Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)， 78，922，(1981)和细菌学杂志， 149，294，(1982)描述的 ilvGM基因DNA序列合成的。用两段合成DNA作引物，MI162菌株的染色体DNA作模板用PCR法扩增DNA。扩增的DNA片段包括SEQ ID NO：1给出的核苷酸序列的核苷酸25至952。该片段命名为片段(A)。

相似地，SEQ ID NO：5和NO：6给出的合成寡聚核苷酸参考基因，97，21，(1991)美国国家科学院院刊， 78，922，(1981)和细菌学杂志，149，294，(1982)描述的DNA序列合成。用两段合成DNA作引物，MI162菌株的染色体DNA作模板用PCR法扩增DNA。扩增的DNA片段包括SEQ ID NO：1给出的核苷酸序列的核苷酸1161至2421。该片段命名为片段(B)。

将用 SmaI消化片段(A)得到的大片段和用 SmaI消化载体pUC18(宝酒造公司)得到的DNA片段连接，制备质粒pUCA。将用 KpnI消化片段(B)得到的大片段和用 HincII和 KpnI消化载体pHSG399(宝酒造公司)得到的DNA片段连接，制备质粒pHSGB。

用 KpnI消化质粒pUCA，用DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)制备平末端片段，再用 PstI消化最后分离到含有片段(A)的DNA片段。用HindIII消化质粒pHSGB。用DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)制备平末端片段，再用 PstI消化。最后分离到含有片段(B)的DNA片段。连接两段DNA片段制备质粒pHSESK。

从pHSGSK中片段(A)和(B)得到的 SmaI- KpnI片段命名为片段(C)。片段(C)对应于用 SmaI和 KpnI消化含有ilvGM基因的4.8kb HindIII- HindIII片段得到的片段。含有一个启动子，SD序列和ilvG基因上游区域，但失去了从领导序列到衰减子的0.2kb DNA序列。构建pHSGSK的方法见图1。

用 SmaI和 KpnI消化质粒pHSGSK得到片段(C)，用 SmaI和 KpnI消化质粒pBRGM7得到大DNA片段，将两段片段连接起来。得到的质粒命名为pdGMI。pdGMI带有含有 ilvEM基因的4.6kb HindIII- HindIII片段，但失去了衰减必需区。这个失去了衰减必需区的 ilvGM代表“ΔattGM”。pdGM1的构建方案见图2。

将能在埃希氏菌属微生物和短杆菌属微生物中均自主复制的穿梭载体pDR1120，和来自大肠杆菌的包括编码苏氨酸脱氨酶的 ilvA基因、 ilvD基因3′末端-部分的 BamHI- BamHI片段连起来制备日本专利公开申请2-458(1990)描述的质粒pDRIA4，日本专利公开申请2-458(1990)描述 BamHI- BamHI片段长2.3kb；但现在发现该片段长2.75kb。质粒pDR1A4不存在于黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ12358(FERM P-9764)或黄色短杆菌AJ12359(FERM P-9765)的染色体DNA中。用常用方法可从这些菌株中制备pDR1A4质粒。L-异亮氨酸对pDRIA4中ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶的反馈抑制松弛。但这种反馈抑制松弛对本发明并不重要。

从质粒pDRIA4的275kb BamHI- BamHI DNA片段可制备含有L-异亮氨酸抑制松弛的编码苏氨酸脱氨酶的 ilvA基因的 HindIII- BamHI片段，并连到用 HindIII和 BamHI切割载体pMW119(日本基因(NipponGene)公司得到的DNA片段上。得到的质粒命名为pMWAI。

连接用 HindIII切割质粒pMWA1得到的DNA片段和用 HindIII切割质粒pdGM1得到的含 ilvGM基因的DNA片段。根据对连接得的质粒中限制位点位置的分析，选出 ilvGM和 ilvA基因转录取向相同的质粒。命名为pMWGMA2。pMWGMA2含有衰减子缺失的 ilvGM基因。 ilvE基团5′末端部分和 ilvD基因3′末端部分，pMWGMA2的构建方法见图3。

制备大肠杆菌MI162的染色体DNA，用 SalI和 PstI切割制备DNA片段混合物。另一方面，用 SalI和 PstI切割载体pUC19(宝酒造公司)制备一段DNA片段。将DNA片段混和物连接到pUC19切割得到的DNA片段上。得到DNA混和物，将该DNA混和物诱导入转氨酶B缺陷株AB2070(供自大肠杆菌遗传贮备中心，细菌学杂志，109，703(1972)，CGSC(2070)。选择其分支氨基酸需要被恢复的转化体。从该菌株制备质粒，该质粒包括相互连接的用 SalI和 PstI消化质粒pUC19得到的DNA片段和含有 ilvE基因的 SalI和 PstI DNA片段。该质粒命名为pUCE1。pUCE1含有 ilvM基因3′末端部分， ilvE基因， ilvD基因5′末端部分。

用 HindIII部分消化pMWGMA2制备DNA片段混和物。另外，用HindIII分割pUCE1制备含有 ilvE基因一部分和 ilvD基因5′末端部分的1.7kb HindIII- HindIII DNA片段。用连接两段DNA片段得到的DNA混和物转化二羟基酸脱水酶( ilvD基因产物)缺陷株AB1280，从转化体中选择恢复了分支氨基酸需要的菌株。从得到的菌株制备质粒，其中用HindIII仅切割pMWGMA2的ΔattGM和 ilvA之间的 HindIII位点得到的DNA片段和来自pUCE1含有一部分 ilvE基因和一部分 ilvD基因的1.7kb HindIII- HindIII DNA片段连接在一起，重构了 ilvGMEDA操纵子，该质粒命名为pMWD5。pMWD5的构建方案见图4。

来自载体pMW119的质粒pWM105带有衰减必需区缺失的ilvGMEDA操纵子。

然后质粒pMWD5用 SmaB1完全消化再用 AccIII部分消化。得到的DNA片段自连接得到仅有 ilvA基因被破坏的质粒pMWdAR6(图5)。质粒pMWdAR6含有衰减必需区缺失且 ilvA基因被破坏的 ilvGMEDA操纵子。(2)构建产L-缬氨酸微生物

用如上述得到的携带 ilvGMEDA操纵子的质粒pMWdAR6分别转化需硫辛酸突变株大肠杆菌W1485lip2(ATCC25645)，H⁺-ATP酶缺陷突变株大肠杆菌W1485arpA401；大肠杆菌AJ12631(FERM P-12381)，需硫辛酸H⁺-ATP缺陷突变株；和野生型大肠杆菌W1485(ATCC12435)，得到下述转化体：

1)大肠杆菌W1485/pMWdAR6

2)大肠杆菌W1485arpA401/pMWdAR6

3)大肠杆菌W1485lip2/pMWdAR6

4)大肠杆菌AJ12631/pMWdAR6

将编码来自大肠杆菌AN718(CGSC6308)的H⁺-ATP酶F1突变α亚基的突变基因atpA401由P1kc转导入大肠杆菌W1485lip2(ATCC25645)得到的大肠杆菌AJ12631(见日本专利公开申请5-137568号(1993))。在选择有H⁺-ATP酶缺陷突变的转导株时可用定位于atpA401基因附近的bg1基因作标记。由于bg1基因编码磷酸基-β葡糖苷酶。含有野生型bg1基因(bg1^-)的大肠杆菌不能同化水杨苷。而含有突变型bg1基因(bg1⁺)的大肠杆菌能用水杨苷作唯一碳源生长，于是同化水杨苷菌株由于生产一种有机酸使加了溴麝香草酚蓝的培养基平板变黄。因而若突变型(bg1)基因(bg1⁺)与arpA401基因连锁转化，可方便有效地筛选H⁺-ATP酶缺陷突变株。首先从大肠杆菌AN718中分离到同化水杨苷(bg1⁺)菌株，然后用PlKc感染AN718(bg1⁺)，用得到的水解物转导大肠杆菌W1485lip2。对得到的转导体要确定硫辛酸需要与H⁺-ATP酶活性以证实需硫辛酸和H⁺-ATP酶缺陷突变确实存在。

相似地用atpA401转导大肠杆菌W1485得到大肠杆菌W1485atpA401。实施例2：生产L-缬氨酸

评价实施例1得到的产L-缬氨酸微生物的L-缬氨酸生产能力。每个转化体铺平板，培养基包括细菌培养用胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％和氨苄青霉素100μg/ml，37℃培养18至24小时，将其中一部分用白金转移环转移到20ml发酵培养基(葡萄糖4％，硫酸铵1.6％，硫酸二氢钾0.1％，e水合硫酸镁0.1％，七水合硫酸亚铁0.001％，五水合硫酸锰0.001％，酵母提取物0.2％，细菌培养用胰蛋白胨0.2％，碳酸钙3％，pH7.0)中。37℃温育24小时。在需硫辛酸突变株培养物中，硫辛酸加至终浓度1μg/L。

除去细胞后培养物上清中L-缬氨酸浓度用阳离子交换柱(CPK08，Asahi化工公司)高效液相色谱确定。结果由表1给出。表1各菌株的L-缬氨酸生产能力大肠杆菌转化体 L-缬氨酸生产能力(g/L)W1485 0.1W1485/pMWdAR6 6.9W1485atpA401/pMWdAR6 8.0W1485lip2/pMWdAR6 7.8AJ12631/pMWdAR6 9.2

结果显示当把含有苏氨酸脱氨酶活性不表达且衰减必需区缺失的ilvGMEDA ^*操纵子的DNA片段引入需硫辛酸和/或H⁺-ATP酶缺陷大肠杆菌宿主细胞，得到的大肠杆菌显示L-缬氨酸生产能力提高。若用需硫辛酸H⁺-ATP酶缺陷菌株作宿主细胞，L-缬氨酸生产能力可进一步提高。

工业应用的可能性

根据本发明，有可能提高产L-缬氨酸或L-亮氨酸微生物的L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力。用本发明的微生物可有效地生产L-缬氨酸和L-亮氨酸。

序列表(1)一般资料：

(i)申请人：味之素株式会社

(ii)发明标题：L-缬氨酸和L-亮氨酸的生产方法

(iii)序列数：12

(iv)通讯地址：

(A)收信人：

(B)街道：

(C)城市：

(D)州：

(E)国家：

(F)邮政编码：

(v)计算机可阅读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：FastSEQ 1.5版

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(C)分类：

(viii)代理人/办事处资料：

(A)名称：

(B)登记号：

(C)参考/卷宗号：

(ix)通讯资料：

(A)电话：

(B)传真：(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2841碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑类型：线型

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1(iii)假设：无(iv)反义：无(vi)原始来源：

(A)生物体：大肠杆菌

(B)菌株：MI162(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：957..1055

(C)鉴定方法：S(ix)特征：

(A)名称/关键词：衰减子

(B)位置：1081..1104

(C)鉴定方法：S(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1195..2841

(C)鉴定方法：S(ix)特征：

(A)名称/关键词：切割位点(SmaI)

(B)位置：52..57

(C)鉴定方法：S(ix)特征：

(A)名称/关键词：切割位点(KpnI)

(B)位置：2395..2400

(C)鉴定方法：S(xi)序列描述：SEQ ID NO：1CTCGCTTTCC TTGTTCCTGA CCGATAACAT CACTGAGATC ATGTTGTAGC GCCCGGGATA 60CTGCATCAGT TGGTTTCGGG CGTTCGAGAG CGTGCTTACC TTCCAGAAAC GCACAGACAG 120CTTGCAGATG ATCGGCTATC AGGCATCCTT CACCGTTAAT TAGCCCCACT TCATCTTCGT 180TATCTTTCGC GACGATAATT TTTCTGCCCG ACTTAATAGC TTCAGTTGCA CTGGAGATTG 240CGCCGGGAAC GCCACGCAGA GCGCCTGTAA GCGCCAGTTC TCCGACTAAT TCATATTCAT 300CTAACTTATT GGCTGTAAGC TGTTCTGAGG CCGCCAGCAA CGCAATGGCG ATAGGTAAAT 360CATATCGTCC CCCTTCTTTT GGCAGATCAG CTGGAGCCAG GTTGATGGTG ATTTTTTTCG 420CCGGATATTC ATATCCGCTA TTGATAATGG CGCTGCGCAC GCGATCGCGA GCTTCTTTTA 480CCGTTGTTTC TGGTAAGCCC ACCATCGTTA AGCCGGGTAG ACCTTTACTG ATATGTACCT 540CAACAGTGAT CGGGGGCGCA TTTACTCCCA GGGCTGCGCG GGTATGAACA ATTGACAGTG 600ACATAAGCCC TCCTTGAGTC ACCATTATGT GCATAAGATA TCGCTGCTGT AGCCCGCTAA 660TTCGTGAATT TTAGTGGCTG ATTCCTGTTT ATTTGTGCAA GTGAAGTTGA GTTGTTCTGG 720CGGTGGAATG ATGCTCGCAA AAATGCAGCG GACAAAGGAT GAACTACGAG GAAGGGAACA 780ACATTCATAC TGAAATTGAA TTTTTTTCAC TCACTATTTT ATTTTTAAAA AACAACAATT 840TATATTGAAA TTATTAAACG CATCATAAAA ATCGGCCAAA AAATATCTTG TACTATTTAC 900AAAACCTATG GTAACTCTTT AGGCATTCCT TCGAACAAGA TGCAAGAAAA GACAAA 956ATG ACA GCC CTT CTA CGA GTG ATT AGC CTG GTC GTG ATT AGC GTG GTG 1004Met Thr Ala Leu Leu Arg Val Ile Ser Leu Val Val Ile Ser Val Val1 5 10 15GTG ATT ATT ATC CCA CCG TGC GGG GCT GCA CTT GGA CGA GGA AAG GCT 1052Val Ile Ile Ile Pro Pro Cys Gly Ala Ala Leu Gly Arg Gly Lys Ala

20 25 30TAGAGATCAA GCCTTAACGA ACTAAGACCC CCGCACCGAA AGGTCCGGGG GTTTTTTTTG 1112ACCTTAAAAA CATAACCGAG GAGCAGACAA TGAATAACAG CACAAAATTC TGTTTCTCAA 1172GATTCAGGAC GGGGAACTAA CT ATG AAT GGC GCA CAG TGG GTG GTA CAT GCG 1224

Met Asn Gly Ala Gln Trp Val Val His Ala

1 5 10TTG CGG GCA CAG GGT GTG AAC ACC GTT TTC GGT TAT CCG GGT GGC GCA 1272Leu Arg Ala Gln Gly Val Asn Thr Val Phe Gly TyrPro Gly Gly Ala

15 20 25ATT ATG CCG GTT TAC GAT GCA TTG TAT GAC GGC GGC GTG GAG CAC TTG 1320Ile Met Pro Val Tyr Asp Ala Leu Tyr Asp Gly Gly Val Glu His Leu

30 35 40CTA TGC CGA CAT GAG CAG GGT GCG GCA ATG GCG GCT ATC GGT TAT GCT 1368Leu Cys Arg His Glu Gln Gly Ala Ala Met Ala Ala Ile Gly Tyr Ala

45 50 55CGT GCT ACC GGC AAA ACT GGC GTA TGT ATC GCC ACG TCT GGT CCG GGC 1416Arg Ala Thr Gly Lys Thr Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly

60 65 70GCA ACC AAC CTG ATA ACC GGG CTT GCG GAC GCA CTG TTA GAT TCC ATC 1464Ala Thr Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Ile75 80 85 90CCT GTT GTT GCC ATC ACC GGT CAA GTG TCC GCA CCG TTT ATC GGC ACT 1512Pro Val Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Ser Ala Pro Phe Ile Gly Thr

95 100 105GAC GCA TTT CAG GAA GTG GAT GTC CTG GGA TTG TCG TTA GCC TGT ACC 1560Asp Ala Phe Gln Glu Val Asp Val Leu Gly Leu Ser Leu Ala Cys Thr

110 115 120AAG CAT AGC TTT CTG GTG CAG TCG CTG GAA GAG TTG CCG CGC ATC ATG 1608Lys His Ser Phe Leu Val Gln Ser Leu Glu Glu Leu Pro Arg Ile Met

125 130 135GCT GAA GCA TTC GAC GTT GCC TGC TCA GGT CGT CCT GGT CCG GTT CTG 1656Ala Glu Ala Phe Asp Val Ala Cys Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu

140 145 150GTC GAT ATC CCA AAA GAT ATC CAG TTA GCC AGC GGT GAC CTG GAA CCG 1704Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Ser Gly Asp Leu Glu Pro155 160 165 170TGG TTC ACC ACC GTT GAA AAC GAA GTG ACT TTC CCA CAT GCC GAA GTT 1752Trp Phe Thr Thr Val Glu Asn Glu Val Thr Phe Pro His Ala Glu Val

175 180 185GAG CAA GCG CGC CAG ATG CTG GCA AAA GCG CAA AAA CCG ATG CTG TAC 1800Glu Gln Ala Arg Gln Met Leu Ala Lys Ala Gln Lys Pro Met Leu Tyr

190 195 200GTT GGC GGT GGC GTG GGT ATG GCG CAG GCA GTT CCG GCT TTG CGT GAA 1848Val Gly Gly Gly Val Gly Met Ala Gln Ala Val Pro Ala Leu Arg Glu

205 210 215TTT CTC GCT GCC ACA AAA ATG CCT GCC ACC TGT ACG CTG AAA GGG CTG 1896Phe Leu Ala Ala Thr Lys Met Pro Ala Thr Cys Thr Leu Lys Gly Leu

220 225 230GGC GCA GTA GAA GCA GAT TAT CCG TAC TAT CTG GGC ATG CTG GGG ATG 1944Gly Ala Val Glu Ala Asp Tyr Pro Tyr Tyr Leu Gly Met Leu Gly Met235 240 245 250CAC GGC ACC AAA GCG GCA AAC TTC GCG GTG CAG GAG TGT GAC CTG CTG 1992His Gly Thr Lys Ala Ala Asn Phe Ala Val Gln Glu Cys Asp Leu Leu

255 260 265ATC GCC GTG GGC GCA CGT TTT GAT GAC CGG GTG ACC GGC AAA CTG AAC 2040Ile Ala Val Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Asn

270 275 280ACC TTC GCG CCA CAC GCC AGT GTT ATC CAT ATG GAT ATC GAC CCG GCA 2088Thr Phe Ala Pro His Ala Ser Val Ile His Met Asp Ile Asp Pro Ala

285 290 295GAA ATG AAC AAG CTG CGT CAG GCA CAT GTG GCA TTA CAA GGT GAT TTA 2136Glu Met Asn Lys Leu Arg Gln Ala His Val Ala Leu Gln Gly Asp Leu

300 305 310AAT GCT CTG TTA CCA GCA TTA CAG CAG CCG TTA AAT CAA TGT GAC TGG 2184Asn Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Asn Gln Cys Asp Trp315 320 325 330CAG CAA CAC TGC GCG CAG CTG CGT GAT GAA CAT TCC TGG CGT TAC GAC 2232Gln Gln His Cys Ala Gln Leu Arg Asp Glu His Ser Trp Arg Tyr Asp

335 340 345CAT CCC GGT GAC GCT ATC TAC GCG CCG TTG TTG TTA AAA CAA CTG TCG 2280His Pro Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Pro Leu Leu Leu Lys Gln Leu Ser

350 355 360GAT CGT AAA CCT GCG GAT TGC GTC GTG ACC ACA GAT GTG GGG CAG CAC 2328Asp Arg Lys Pro Ala Asp Cys Val Val Thr Thr Asp Val Gly Gln His

365 370 375CAG ATG TGG GCT GCG CAG CAC ATC GCC CAC ACT CGC CCG GAA AAT TTC 2376Gln Met Trp Ala Ala Gln His Ile Ala His Thr Arg Pro Glu Asn Phe

380 385 390ATC ACC TCC AGC GGT TTA GGT ACC ATG GGT TTT GGT TTA CCG GCG GCG 2424Ile Thr Ser Ser Gly Leu Gly Thr Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala395 400 405 410GTT GGC GCA CAA GTC GCG CGA CCG AAC GAT ACC GTT GTC TGT ATC TCC 2472Val Gly Ala Gln Val Ala Arg Pro Asn Asp Thr Val Val Cys Ile Ser

415 420 425GGT GAC GGC TCT TTC ATG ATG AAT GTG CAA GAG CTG GGC ACC GTA AAA 2520Gly Asp Gly Ser Phe Met Met Asn Val Gln Glu Leu Gly Thr Val Lys

430 435 440CGC AAG CAG TTA CCG TTG AAA ATC GTC TTA CTC GAT AAC CAA CGG TTA 2568Arg Lys Gln Leu Pro Leu Lys Ile Val Leu Leu Asp Asn Gln Arg Leu

445 450 455GGG ATG GTT CGA CAA TGG CAG CAA CTG TTT TTT CAG GAA CGA TAC AGC 2616Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Gln Leu Phe Phe Gln Glu Arg Tyr Ser

460 465 470GAA ACC ACC CTT ACT GAT AAC CCC GAT TTC CTC ATG TTA GCC AGC GCC 2664Glu Thr Thr Leu Thr Asp Asn Pro Asp Phe Leu Met Leu Ala Ser Ala475 480 485 490TTC GGC ATC CAT GGC CAA CAC ATC ACC CGG AAA GAC CAG GTT GAA GCG 2712Phe Gly Ile His Gly Gln His Ile Thr Arg Lys Asp Gln Val Glu Ala

495 500 505GCA CTC GAC ACC ATG CTG AAC AGT GAT GGG CCA TAC CTG CTT CAT GTC 2760Ala Leu Asp Thr Met Leu Asn Ser Asp Gly Pro Tyr Leu Leu His Val

510 515 520TCA ATC GAC GAA CTT GAG AAC GTC TGG CCG CTG GTG CCG CCT GGC GCC 2808Ser Ile Asp Glu Leu Glu Asn Val Trp Pro Leu Val Pro Pro Gly Ala

525 530 535AGT AAT TCA GAA ATG TTG GAG AAA TTA TCA TGA 2841Ser Asn Ser Glu Met Leu Glu Lys Leu Ser

540 545(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：548氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑类型：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Asn Gly Ala Gln Trp Val Val His Ala Leu Arg Ala Gln Gly Val1 5 10 15Asn Thr Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala Ile Met Pro Val Tyr Asp

20 25 30Ala Leu Tyr Asp Gly Gly Val Glu His Leu Leu Cys Arg His Glu Gln

35 40 45Gly Ala Ala Met Ala Ala Ile Gly Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Thr

50 55 60Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Ile Thr65 70 75 80Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Ile Pro Val Val Ala Ile Thr

85 90 95Gly Gln Val Ser Ala Pro Phe Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Val

100 105 110Asp Val Leu Gly Leu Ser Leu Ala Cys Thr Lys His Ser Phe Leu Val

115 120 125Gln Ser Leu Glu Glu Leu Pro Arg Ile Met Ala Glu Ala Phe Asp Val

130 135 140Ala Cys Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp145 150 155 160Ile Gln Leu Ala Ser Gly Asp Leu Glu Pro Trp Phe Thr Thr Val Glu

165 170 175Asn Glu Val Thr Phe Pro His Ala Glu Val Glu Gln Ala Arg Gln Met

180 185 190Leu Ala Lys Ala Gln Lys Pro Met Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Gly

195 200 205Met Ala Gln Ala Val Pro Ala Leu Arg Glu Phe Leu Ala Ala Thr Lys

210 215 220Met Pro Ala Thr Cys Thr Leu Lys Gly Leu Gly Ala Val Glu Ala Asp225 230 235 240Tyr Pro Tyr Tyr Leu Gly Met Leu Gly Met His Gly Thr Lys Ala Ala

245 250 255Asn Phe Ala Val Gln Glu Cys Asp Leu Leu Ile Ala Val Gly Ala Arg

260 265 270Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Asn Thr Phe Ala Pro His Ala

275 280 285Ser Val Ile His Met Asp Ile Asp Pro Ala Glu Met Asn Lys Leu Arg

290 295 300Gln Ala His Val Ala Leu Gln Gly Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala305 310 315 320Leu Gln Gln Pro Leu Asn Gln Cys Asp Trp Gln Gln His Cys Ala Gln

325 330 335Leu Arg Asp Glu His Ser Trp Arg Tyr Asp His Pro Gly Asp Ala Ile

340 345 350Tyr Ala Pro Leu Leu Leu Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Pro Ala Asp

355 360 365Cys Val Val Thr Thr Asp Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln

370 375 380His Ile Ala His Thr Arg Pro Glu Asn Phe Ile Thr Ser Ser Gly Leu385 390 395 400Gly Thr Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Val Gly Ala Gln Val Ala

405 410 415Arg Pro Asn Asp Thr Val Val Cys Ile Ser Gly Asp Gly Ser Phe Met

420 425 430Met Asn Val Gln Glu Leu Gly Thr Val Lys Arg Lys Gln Leu Pro Leu

435 440 445Lys Ile Val Leu Leu Asp Asn Gln Arg Leu Gly Met Val Arg Gln Trp

450 455 460Gln Gln Leu Phe Phe Gln Glu Arg Tyr Ser Glu Thr Thr Leu Thr Asp465 470 475 480Asn Pro Asp Phe Leu Met Leu Ala Ser Ala Phe Gly Ile His Gly Gln

485 490 495His Ile Thr Arg Lys Asp Gln Val Glu Ala Ala Leu Asp Thr Met Leu

500 505 510Asn Ser Asp Gly Pro Tyr Leu Leu His Val Ser Ile Asp Glu Leu Glu

515 520 525Asn Val Trp Pro Leu Val Pro Pro Gly Ala Ser Asn Ser Glu Met Leu

530 535 540Glu Lys Leu Ser545(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：22碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线型

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3TAACATCACT GAGATCATGT TG 22(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线型

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4TCTTTTCTTG CATCTTGTTC G 21(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：22碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线型

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5TCTGTTTCTC AAGATTCAGG AC 22(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线型

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6CGCCGGTAAA CCAAAACCC 19

Claims

1.一种埃希氏菌属的微生物，其被修饰以具有或增强了L-缬氨酸或L-亮氨酸生产能力，其生长需要硫辛酸，或缺失H⁺-ATP酶活性，或其生长需要硫辛酸并且缺失H⁺-ATP酶活性。

2.权利要求1的微生物，其用包含ilvGMEDA操纵子的DNA片断转化，所述操纵子缺失了SnaBI-AccIII区域。

3.权利要求1的微生物，其中L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸衰减所必需的ilvGMEDA操纵子区域缺失。

4.权利要求3的微生物，其中缺失的衰减必需的区域具有SEQ IDNO：1所示序列的核苷酸953-1160。

5.权利要求1的微生物，它是大肠杆菌。

6.权利要求1的微生物，它是经修饰而缺失H⁺-ATP酶的大肠杆菌W1485、大肠杆菌W1485lip2、或经修饰而缺失H⁺-ATP酶的大肠杆菌W1485lip2，其用包含ilvGMEDA操纵子的DNA片断转化，所述操纵子缺失了具有SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸953-1160区域和SnaBI-AccIII区域。

7. 一种生产L-缬氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养权利要求1的具有L-缬氨酸生产能力的微生物，生产L-缬氨酸并积累于培养基中，收集L-缬氨酸。

8.一种生产L-缬氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养权利要求2、3、5、6中任一权项的具有L-缬氨酸生产能力的微生物，生产L-缬氨酸并积累于培养基中，收集L-缬氨酸。

9.一种生产L-缬氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养权利要求4的具有L-缬氨酸生产能力的微生物，生产L-缬氨酸并积累于培养基中，收集L-缬氨酸。

10.一种生产L-亮氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养权利要求1的具有L-亮氨酸生产能力的微生物，生产L-亮氨酸并积累于培养基中，收集L-亮氨酸。

11.一种生产L-亮氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养权利要求2、3、5、6中任一权项的具有L-亮氨酸生产能力的微生物，生产L-亮氨酸并积累于培养基中，收集L-亮氨酸。

12.一种生产L-亮氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养权利要求4的具有L-亮氨酸生产能力的微生物，生产L-亮氨酸并积累于培养基中，收集L-亮氨酸。