JP3237134B2 - アミノ酸生産能を有する微生物及び当該微生物を用いるアミノ酸の製造法 - Google Patents
アミノ酸生産能を有する微生物及び当該微生物を用いるアミノ酸の製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は発酵工業に関し、更に詳
しくはアミノ酸生産株の育種方法、それによって育種さ
れた菌株及びそれら菌株を用いるアミノ酸の製造方法に
関する。
しくはアミノ酸生産株の育種方法、それによって育種さ
れた菌株及びそれら菌株を用いるアミノ酸の製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物が生産するアミノ酸は、農畜産で
の飼料及び食品産業での添加物、医療での栄養製剤、化
学合成及び薬品工業での試薬、等の用途に広く使用され
ている。既知の技術としては、種々の変異原を使用した
Ｌ−リジン（Ｌｙｓ），Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ），Ｌ
−イソロイシン（Ｉｌｅ），Ｌ−バリン（Ｖａｌ）等の
生産株の育種方法が知られている。これらの変異株は、
代謝制御における遺伝的な解除を既に受けており、この
ために、これらの変異株は対応するアミノ酸を培地中に
放出し、蓄積する。これらの変異株は、伝統的な方法、
すなわち栄養要求変異株或はアミノ酸アナログ非感受性
変異株として育種される。
の飼料及び食品産業での添加物、医療での栄養製剤、化
学合成及び薬品工業での試薬、等の用途に広く使用され
ている。既知の技術としては、種々の変異原を使用した
Ｌ−リジン（Ｌｙｓ），Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ），Ｌ
−イソロイシン（Ｉｌｅ），Ｌ−バリン（Ｖａｌ）等の
生産株の育種方法が知られている。これらの変異株は、
代謝制御における遺伝的な解除を既に受けており、この
ために、これらの変異株は対応するアミノ酸を培地中に
放出し、蓄積する。これらの変異株は、伝統的な方法、
すなわち栄養要求変異株或はアミノ酸アナログ非感受性
変異株として育種される。
【０００３】アミノ酸を生産する栄養要求変異株は対応
アミノ酸生合成の側路をブロックするか或は阻害因子と
してのアミノ酸の生成をブロックする事で得られる。例
えばＶａｌ生産バントテン酸要求大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）変異株（Ｍａａｓ Ｗ．Ｋ．， Ｖｏｇｅｌ Ｈ．
Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖ．６５，ｐ．３８
８，１９５３）、 Ｌｙｓ生産ホモセリン要求コリネバ
グテリウム グルタミカス（Ｃｏｒｙｎｅ． ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｓ）変異株（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔａ
ｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．， ｖ．７， ｐ．４１， １９６１）、およびＶ
ａｌ生産Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，または ホモセリン要求アル
スロバクター パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏ． ｐａ
ｒａｆｆｉｎｅｕｓ）及びコリネバクテリウム ハイド
ロカーボクラスタス（Ｃｏｒｙｎｅ． ｈｙｄｒｏｃａ
ｒｂｏｃｌａｓｔｕｓ）変異株（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．，
Ｎｏ．３，７００５５６）が知られている。
アミノ酸生合成の側路をブロックするか或は阻害因子と
してのアミノ酸の生成をブロックする事で得られる。例
えばＶａｌ生産バントテン酸要求大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）変異株（Ｍａａｓ Ｗ．Ｋ．， Ｖｏｇｅｌ Ｈ．
Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖ．６５，ｐ．３８
８，１９５３）、 Ｌｙｓ生産ホモセリン要求コリネバ
グテリウム グルタミカス（Ｃｏｒｙｎｅ． ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｓ）変異株（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔａ
ｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．， ｖ．７， ｐ．４１， １９６１）、およびＶ
ａｌ生産Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，または ホモセリン要求アル
スロバクター パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏ． ｐａ
ｒａｆｆｉｎｅｕｓ）及びコリネバクテリウム ハイド
ロカーボクラスタス（Ｃｏｒｙｎｅ． ｈｙｄｒｏｃａ
ｒｂｏｃｌａｓｔｕｓ）変異株（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．，
Ｎｏ．３，７００５５６）が知られている。
【０００４】アミノ酸アナログ非感受性変異株のアミノ
酸の生産はアミノ酸生合成酵素活性のネガティブ・フィ
ードバック阻害、もしくは酵素蛋白生成の制御が解除さ
れているために起こる。Ｌｙｓ生産アミノエチルシステ
イン非感受性 ブレビバクテリウム属変異株（Ｓａｎｏ
Ｋ．，Ｓｈｉｉｏ Ｉ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖ．１６ ｐ３７３，１９７０．
Ｓｈｉｉｏ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
ｖ．６８，ｐ７０１，１９７０）、 Ｔｈｒ生産 アミ
ノハイドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）非感受性Ｅ．ｃｏｌｉ
変異株（Ｓｈｉｉｏ Ｉ．，Ｎａｋａｍｏｒｉ Ｓ．，
Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖ．３３，ｐ１１５
２，１９６９）、 同ブレビバクテリウム 属変異株
（Ｓｈｉｉｏ Ｉ．，Ｎａｋａｍｏｒｉ Ｓ．，Ａｇ
ｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖ．３４，ｐ４４８，１９
７０）、Ｉｌｅ生産ＡＨＶ非感受性ブレビバクテリウム
属またはコリネバクテリウム属変異株（Ｕ．Ｓ．Ｐａ
ｔ．， Ｎｏ．３， ７６７５２９）、Ｖａｌ生産２−
チアゾールアラニン非感受性ブレビバクテリウム及びコ
リネバクテリウム属変異株（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．， Ｎ
ｏ．３，８９３８８８）、Ｉｌｅ生産イソロイシン ハ
イドロキサメート非感受性セラチア マルセッセンス
（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（Ｋｉｓ
ｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
ｖ．１１０，ｐ．７６１， １９７２）が知られてい
る。
酸の生産はアミノ酸生合成酵素活性のネガティブ・フィ
ードバック阻害、もしくは酵素蛋白生成の制御が解除さ
れているために起こる。Ｌｙｓ生産アミノエチルシステ
イン非感受性 ブレビバクテリウム属変異株（Ｓａｎｏ
Ｋ．，Ｓｈｉｉｏ Ｉ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖ．１６ ｐ３７３，１９７０．
Ｓｈｉｉｏ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
ｖ．６８，ｐ７０１，１９７０）、 Ｔｈｒ生産 アミ
ノハイドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）非感受性Ｅ．ｃｏｌｉ
変異株（Ｓｈｉｉｏ Ｉ．，Ｎａｋａｍｏｒｉ Ｓ．，
Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖ．３３，ｐ１１５
２，１９６９）、 同ブレビバクテリウム 属変異株
（Ｓｈｉｉｏ Ｉ．，Ｎａｋａｍｏｒｉ Ｓ．，Ａｇ
ｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖ．３４，ｐ４４８，１９
７０）、Ｉｌｅ生産ＡＨＶ非感受性ブレビバクテリウム
属またはコリネバクテリウム属変異株（Ｕ．Ｓ．Ｐａ
ｔ．， Ｎｏ．３， ７６７５２９）、Ｖａｌ生産２−
チアゾールアラニン非感受性ブレビバクテリウム及びコ
リネバクテリウム属変異株（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．， Ｎ
ｏ．３，８９３８８８）、Ｉｌｅ生産イソロイシン ハ
イドロキサメート非感受性セラチア マルセッセンス
（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（Ｋｉｓ
ｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
ｖ．１１０，ｐ．７６１， １９７２）が知られてい
る。
【０００５】アミノ酸の生産性が改善されたものとし
て、アミノ酸アナログ非感受性変異と栄養要求性変異を
組み合わせたものが知られている（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．，
Ｎｏ．３， ８９３８８８）が、これらは栄養要求性
であるため、その栄養物質含有培地でしか生育出来ず、
産業上更に改善が望まれる。
て、アミノ酸アナログ非感受性変異と栄養要求性変異を
組み合わせたものが知られている（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．，
Ｎｏ．３， ８９３８８８）が、これらは栄養要求性
であるため、その栄養物質含有培地でしか生育出来ず、
産業上更に改善が望まれる。
【０００６】また、組換えＤＮＡ技術の応用として、遺
伝子供与生物のアミノ酸合成遺伝子含有染色体ＤＮＡフ
ラグメントを分離し、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで多コピ
ープラスミドＤＮＡと組み合わせて得たハイブリッドＤ
ＮＡを高アミノ酸生産性株に導入する方法（Ｕ．Ｓ．Ｐ
ａｔ．， Ｎｏ．４， ２７８７６５； ４， ３９１
９０７）を基本とするアミノ酸生産株の調製法がある。
本法によると、染色体ＤＮＡフラグメントを分離し、変
異させて、アミノ酸生合成の調節を消去している。一般
論として、組換えＤＮＡの受容株は、合目的に作られた
株、もしくは、ＤＮＡ供与株そのものが用いられる。然
しながら、上述の種々の方法では、これまでのところ、
ＩｌｅまたはＶａｌ生産Ｅ．ｃｏｌｉ優秀株を育種する
ことが出来なかったのである。それ故、アミノ酸生産株
の新育種方法の開発が依然として要求されているわけで
ある。
伝子供与生物のアミノ酸合成遺伝子含有染色体ＤＮＡフ
ラグメントを分離し、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで多コピ
ープラスミドＤＮＡと組み合わせて得たハイブリッドＤ
ＮＡを高アミノ酸生産性株に導入する方法（Ｕ．Ｓ．Ｐ
ａｔ．， Ｎｏ．４， ２７８７６５； ４， ３９１
９０７）を基本とするアミノ酸生産株の調製法がある。
本法によると、染色体ＤＮＡフラグメントを分離し、変
異させて、アミノ酸生合成の調節を消去している。一般
論として、組換えＤＮＡの受容株は、合目的に作られた
株、もしくは、ＤＮＡ供与株そのものが用いられる。然
しながら、上述の種々の方法では、これまでのところ、
ＩｌｅまたはＶａｌ生産Ｅ．ｃｏｌｉ優秀株を育種する
ことが出来なかったのである。それ故、アミノ酸生産株
の新育種方法の開発が依然として要求されているわけで
ある。
【０００７】さて現在までのところ、我々が関心を持っ
て研究し、成果をあげたアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵
素遺伝子を変異せしめることを特徴とした対応するアミ
ノ酸の高生産性株は、知られていない。
て研究し、成果をあげたアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵
素遺伝子を変異せしめることを特徴とした対応するアミ
ノ酸の高生産性株は、知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】アミノアシルｔ−ＲＮ
Ａ合成酵素、即ちアミノ酸の活性化酵素は、素材である
アミノ酸から蛋白質を合成する場合の必須因子であり、
活性化されたアミノ酸の合成、つまり、 アミノ酸の対
応ｔ−ＲＮＡへの結合を触媒する。 多くの場合、ひと
つのアミノ酸に対し一種のアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成
酵素しか存在しないので完全失活は致命的であり、条件
づき変異しか起り得ないと思われる。
Ａ合成酵素、即ちアミノ酸の活性化酵素は、素材である
アミノ酸から蛋白質を合成する場合の必須因子であり、
活性化されたアミノ酸の合成、つまり、 アミノ酸の対
応ｔ−ＲＮＡへの結合を触媒する。 多くの場合、ひと
つのアミノ酸に対し一種のアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成
酵素しか存在しないので完全失活は致命的であり、条件
づき変異しか起り得ないと思われる。
【０００９】アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素が変化し
た変異株について、以下の報告がある。 １．Ｒｏｔｈ Ｊ．Ｒ．， ａｎｄ Ａｍｅｓ Ｂ．
Ｎ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖ．２２， ｐ．
３２５， １９６６． ２．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ Ｆ．Ｃ．， Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ． Ｒｅｖ．， ｖ．３０， ｐ．７０１， １９
６６． ３．Ｆｏｌｋ Ｗ．Ｒ．， ａｎｄ Ｂｅｒｇ Ｐ．
Ｊ．， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖ．１０２， ｐ．
１９３， １９７０． ４．Ｉａｃｃａｒｉｎｏ Ｍ．， ａｎｄ Ｂｅｒｇ
Ｐ．Ｊ．， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖ．１０５，
ｐ．５２７， １９７１． ５．Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｅ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖ．１２９， ｐ．６６， １
９７９．
た変異株について、以下の報告がある。 １．Ｒｏｔｈ Ｊ．Ｒ．， ａｎｄ Ａｍｅｓ Ｂ．
Ｎ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖ．２２， ｐ．
３２５， １９６６． ２．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ Ｆ．Ｃ．， Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ． Ｒｅｖ．， ｖ．３０， ｐ．７０１， １９
６６． ３．Ｆｏｌｋ Ｗ．Ｒ．， ａｎｄ Ｂｅｒｇ Ｐ．
Ｊ．， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖ．１０２， ｐ．
１９３， １９７０． ４．Ｉａｃｃａｒｉｎｏ Ｍ．， ａｎｄ Ｂｅｒｇ
Ｐ．Ｊ．， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖ．１０５，
ｐ．５２７， １９７１． ５．Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｅ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖ．１２９， ｐ．６６， １
９７９．
【００１０】アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変異にお
いて栄養要求性を示す場合があるが、これは、通常の栄
養要求変異株ではない。というのは、アミノ酸生合成能
が損なわれているのではなく、アミノ酸を蛋白合成へ利
用する能力が低下しているからである。一方、この種の
栄養要求性変異は、対応アミノ酸の生合成を増強する変
異、すなわち対応アミノ酸の細胞内濃度を増大させる更
なる変異により抑制されて、表現上は栄養非要求性とな
ることが報告されている（上記文献１， ４−５）。然
しながら、この栄養要求性を示すアミノアシルｔ−ＲＮ
Ａ合成酵素変異に基づいて、育種されたアミノ酸生産
株、及びその育種方法については未だ知られていないの
である。当然アミノ酸の過剰生産をもたらすこれら変異
の役割についても解析されていない。本発明はアミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素遺伝子に変異を施すことによ
り、最終的には栄養要求性を付加することなく、アミノ
酸生産能の増強した菌株を育種すること、更に詳しく
は、Ｉｌｅ及びＶａｌ生産Ｅ．ｃｏｌｉ株の育種方法と
それにより得られた変異株によるＩｌｅ及びＶａｌの発
酵生産の方法を提供することにある。
いて栄養要求性を示す場合があるが、これは、通常の栄
養要求変異株ではない。というのは、アミノ酸生合成能
が損なわれているのではなく、アミノ酸を蛋白合成へ利
用する能力が低下しているからである。一方、この種の
栄養要求性変異は、対応アミノ酸の生合成を増強する変
異、すなわち対応アミノ酸の細胞内濃度を増大させる更
なる変異により抑制されて、表現上は栄養非要求性とな
ることが報告されている（上記文献１， ４−５）。然
しながら、この栄養要求性を示すアミノアシルｔ−ＲＮ
Ａ合成酵素変異に基づいて、育種されたアミノ酸生産
株、及びその育種方法については未だ知られていないの
である。当然アミノ酸の過剰生産をもたらすこれら変異
の役割についても解析されていない。本発明はアミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素遺伝子に変異を施すことによ
り、最終的には栄養要求性を付加することなく、アミノ
酸生産能の増強した菌株を育種すること、更に詳しく
は、Ｉｌｅ及びＶａｌ生産Ｅ．ｃｏｌｉ株の育種方法と
それにより得られた変異株によるＩｌｅ及びＶａｌの発
酵生産の方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、後に詳
述する様に、本発明に基づいて、培地への通常量以上の
対応アミノ酸の添加により生育が回復される栄養要求性
を発現するアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変異と、当
該アミノ酸の生合成阻害が解除された変異を結びつける
ことにより当該アミノ酸生産能が増強された生産株を育
種する方法を開発することにより、達成された。即ち、
生産しようとするアミノ酸に対応するアミノアシルｔ−
ＲＮＡ合成酵素遺伝子の変異であって、生育のために該
アミノ酸の生合成経路が遮断された変異株の該アミノ酸
の要求性変異と、該アミノ酸生合成の代謝制御変異とか
らなるアミノ酸生産菌の育種方法であり、該アミノ酸生
合成の代謝調節変異株をアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵
素遺伝子の変異株より復帰変異法を用いて得られる育種
方法に関する。すなわち、本願に係る発明は、(1)生産
しようとするアミノ酸に対応するアミノアシルt-RNA合
成酵素遺伝子の変異であって、当該変異を有する変異株
に生育のために当該アミノ酸の添加を必要とするアミノ
酸要求性の表現形を与え、当該アミノ酸の生合成経路が
遮断された他の変異株が生育のために要求する量以上の
当該アミノ酸の添加を生育のために必要とする第一の変
異、及び(2) 当該アミノ酸要求性の表現形を相補する変
異であって、アミノ酸の生産に係わる遺伝子上にある第
二の変異を有し、並びに当該アミノ酸の生産能を有する
微生物、第二の変異が、アミノアシルt-RNA合成酵素遺
伝子の第一の変異を有する変異株のアミノ酸要求性を相
補する復帰変異法を用いて得られるものである上記の微
生物、生産しようとするアミノ酸がイソロイシン又はバ
リンである上記の微生物、及び微生物が大腸菌である上
記の微生物である。さらに、本願に係る発明は、上記の
微生物を培地に培養し、該培地に生産しようとするアミ
ノ酸を蓄積させることを特徴とする当該アミノ酸の製造
法であり、詳しくは生産しようとするアミノ酸がイソロ
イシン又はバリンである上記の製造法である。
述する様に、本発明に基づいて、培地への通常量以上の
対応アミノ酸の添加により生育が回復される栄養要求性
を発現するアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変異と、当
該アミノ酸の生合成阻害が解除された変異を結びつける
ことにより当該アミノ酸生産能が増強された生産株を育
種する方法を開発することにより、達成された。即ち、
生産しようとするアミノ酸に対応するアミノアシルｔ−
ＲＮＡ合成酵素遺伝子の変異であって、生育のために該
アミノ酸の生合成経路が遮断された変異株の該アミノ酸
の要求性変異と、該アミノ酸生合成の代謝制御変異とか
らなるアミノ酸生産菌の育種方法であり、該アミノ酸生
合成の代謝調節変異株をアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵
素遺伝子の変異株より復帰変異法を用いて得られる育種
方法に関する。すなわち、本願に係る発明は、(1)生産
しようとするアミノ酸に対応するアミノアシルt-RNA合
成酵素遺伝子の変異であって、当該変異を有する変異株
に生育のために当該アミノ酸の添加を必要とするアミノ
酸要求性の表現形を与え、当該アミノ酸の生合成経路が
遮断された他の変異株が生育のために要求する量以上の
当該アミノ酸の添加を生育のために必要とする第一の変
異、及び(2) 当該アミノ酸要求性の表現形を相補する変
異であって、アミノ酸の生産に係わる遺伝子上にある第
二の変異を有し、並びに当該アミノ酸の生産能を有する
微生物、第二の変異が、アミノアシルt-RNA合成酵素遺
伝子の第一の変異を有する変異株のアミノ酸要求性を相
補する復帰変異法を用いて得られるものである上記の微
生物、生産しようとするアミノ酸がイソロイシン又はバ
リンである上記の微生物、及び微生物が大腸菌である上
記の微生物である。さらに、本願に係る発明は、上記の
微生物を培地に培養し、該培地に生産しようとするアミ
ノ酸を蓄積させることを特徴とする当該アミノ酸の製造
法であり、詳しくは生産しようとするアミノ酸がイソロ
イシン又はバリンである上記の製造法である。
【００１２】栄養要求性を示すアミノアシルｔ−ＲＮＡ
合成酵素変異は、対応アミノ酸への該酵素の基質親和性
を数倍減少（すなわちＫｍを増加）させた（上記文献
３−４）。それ故、細胞内の活性化アミノ酸（対応アミ
ノアシルｔ−ＲＮＡ）生成が減少する。この状況下で
は、もし当該アミノ酸の生合成に関与する構造遺伝子の
発現が、アテニュエーションによる制御機構をもってい
るものであれば、転写は著しく増大する。この制御機構
は、Ｅ．ｃｏｌｉなど数種の細菌の多数のアミノ酸オペ
ロンに存在していることが知られている（Ｋｏｌｔｅｒ
Ｒ．， Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ．， Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｇｅｎｅｔ．， ｖ．１６，ｐ．１１３， １９８
２； Ｍａｔｓｕｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ｖ．１４， ｐ．１
０１１３， １９８６； Ｓｈｉｍｏｔｓｕ Ｈ． ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖ．１６
６，ｐ．４６１， １９８６； Ｋｕｒｏｄａ Ｍ．
Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
ｖ．１６７， ｐ．７９２， １９８６）。
合成酵素変異は、対応アミノ酸への該酵素の基質親和性
を数倍減少（すなわちＫｍを増加）させた（上記文献
３−４）。それ故、細胞内の活性化アミノ酸（対応アミ
ノアシルｔ−ＲＮＡ）生成が減少する。この状況下で
は、もし当該アミノ酸の生合成に関与する構造遺伝子の
発現が、アテニュエーションによる制御機構をもってい
るものであれば、転写は著しく増大する。この制御機構
は、Ｅ．ｃｏｌｉなど数種の細菌の多数のアミノ酸オペ
ロンに存在していることが知られている（Ｋｏｌｔｅｒ
Ｒ．， Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ．， Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｇｅｎｅｔ．， ｖ．１６，ｐ．１１３， １９８
２； Ｍａｔｓｕｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ｖ．１４， ｐ．１
０１１３， １９８６； Ｓｈｉｍｏｔｓｕ Ｈ． ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖ．１６
６，ｐ．４６１， １９８６； Ｋｕｒｏｄａ Ｍ．
Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
ｖ．１６７， ｐ．７９２， １９８６）。
【００１３】更に、アミノアシルｔ−ＲＮＡ生成の減少
は、細胞内グアノシン−４−リン酸（ｐｐＧｐｐ）濃度
を増大させ、これがアミノ酸オペロンの転写の始動を活
性化することが知られている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｊ．
Ｃ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ｖ．７２， ｐ．３８９， １９７
５；Ｃａｓｈｅｌ Ｍ．， ａｎｄ Ｒｕｄｄ Ｋ．
Ｅ． Ｉｎ：Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏ
ｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．１２， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ Ｆ．
Ｃ．， ｅｄ．）， ｐ．１４１０，ＡＳＭ， Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ， １９８７）．これらの事実を結合す
ると、対応するアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変異に
よって当該アミノ酸の過剰生産の可能性が生まれる。そ
して、この可能性は、当該アミノ酸の生合成酵素活性阻
害などの調節を解除することで実現されると考えられ
る。
は、細胞内グアノシン−４−リン酸（ｐｐＧｐｐ）濃度
を増大させ、これがアミノ酸オペロンの転写の始動を活
性化することが知られている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｊ．
Ｃ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ｖ．７２， ｐ．３８９， １９７
５；Ｃａｓｈｅｌ Ｍ．， ａｎｄ Ｒｕｄｄ Ｋ．
Ｅ． Ｉｎ：Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏ
ｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．１２， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ Ｆ．
Ｃ．， ｅｄ．）， ｐ．１４１０，ＡＳＭ， Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ， １９８７）．これらの事実を結合す
ると、対応するアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変異に
よって当該アミノ酸の過剰生産の可能性が生まれる。そ
して、この可能性は、当該アミノ酸の生合成酵素活性阻
害などの調節を解除することで実現されると考えられ
る。
【００１４】アミノ酸の過剰生産の目的の実現のために
必要なアミノ酸生合成酵素遺伝子の高度発現は対応アミ
ノ酸を培地に通常量添加してもアミノ酸の要求性が充分
には抑制されない、アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変
異によってのみ可能となる。これらの変異は、対応アミ
ノ酸非要求性の親株Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンで処理する様な伝統的変異誘導法によ
り誘導され得るであろう。目的変異株のスクリーニング
は、対応アミノ酸高濃度（３−１０ｍｇ／ｍｌ）添加培
地で緩慢に生育し、無添加培地もしくは通常量の対応ア
ミノ酸添加培地には生育しない栄養要求株を選ぶことに
より行われる。このスクリーニング法によってアミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性低下変異株のみが得られ
る、というのは、対応アミノ酸生合成経路をブロックさ
れた変異株の生育は培地へのアミノ酸低濃度（０．００
５−０．０５ｍｇ／ｍｌ）添加で回復され得るからであ
る。
必要なアミノ酸生合成酵素遺伝子の高度発現は対応アミ
ノ酸を培地に通常量添加してもアミノ酸の要求性が充分
には抑制されない、アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変
異によってのみ可能となる。これらの変異は、対応アミ
ノ酸非要求性の親株Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンで処理する様な伝統的変異誘導法によ
り誘導され得るであろう。目的変異株のスクリーニング
は、対応アミノ酸高濃度（３−１０ｍｇ／ｍｌ）添加培
地で緩慢に生育し、無添加培地もしくは通常量の対応ア
ミノ酸添加培地には生育しない栄養要求株を選ぶことに
より行われる。このスクリーニング法によってアミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性低下変異株のみが得られ
る、というのは、対応アミノ酸生合成経路をブロックさ
れた変異株の生育は培地へのアミノ酸低濃度（０．００
５−０．０５ｍｇ／ｍｌ）添加で回復され得るからであ
る。
【００１５】この変異株を更に変異処理し、対応アミノ
酸無添加もしくは低濃度添加培地に生育する復帰変異株
を選ぶことにより、細胞内関連アミノ酸生成濃度が増大
した変異株を得ることが出来る。ここで言う復帰変異株
とは、当初起こった変異が原形に復するような変異が起
こったものではなく、他の遺伝子などＤＮＡ上の別の場
所に生じた変異が、当初の変異による傷害を修復したと
いう場合の復帰変異株をいい、擬復帰変異株とも言われ
るものである。この方法によって、アミノ酸の大量生産
に係わる多種類の遺伝子レベルでの変異を誘導すること
ができ、変異株の選択を繰り返すことによりアミノ酸高
生産株が得られるのである。復帰変異株がなおアミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性の低下の状態にあること
は、アテニュエーションの除去などそのアミノ酸の高生
産性に役だっているわけである。以上の様にして、有用
なアミノ酸生産株を育種することができる。更に言え
ば、アナログ非感受性変異などの既知の変異と、上述の
アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性低下変異と、もし
くは更に（擬）復帰変異をも加えた上で、これらの変異
を形質転換法、形質導入法、接合法、あるいは、プロト
プラスト融合法等で組み合わせてアミノ酸生産性を向上
せしめることが可能である。変異を集合する手段として
組換えＤＮＡ技法を適用することも可能である。本発明
によって、エシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属細
菌人工変異株を使用する既知の方法よりも高収率でＶａ
ｌ及びＩｌｅを生産する変異株が育種されたのである。
酸無添加もしくは低濃度添加培地に生育する復帰変異株
を選ぶことにより、細胞内関連アミノ酸生成濃度が増大
した変異株を得ることが出来る。ここで言う復帰変異株
とは、当初起こった変異が原形に復するような変異が起
こったものではなく、他の遺伝子などＤＮＡ上の別の場
所に生じた変異が、当初の変異による傷害を修復したと
いう場合の復帰変異株をいい、擬復帰変異株とも言われ
るものである。この方法によって、アミノ酸の大量生産
に係わる多種類の遺伝子レベルでの変異を誘導すること
ができ、変異株の選択を繰り返すことによりアミノ酸高
生産株が得られるのである。復帰変異株がなおアミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性の低下の状態にあること
は、アテニュエーションの除去などそのアミノ酸の高生
産性に役だっているわけである。以上の様にして、有用
なアミノ酸生産株を育種することができる。更に言え
ば、アナログ非感受性変異などの既知の変異と、上述の
アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性低下変異と、もし
くは更に（擬）復帰変異をも加えた上で、これらの変異
を形質転換法、形質導入法、接合法、あるいは、プロト
プラスト融合法等で組み合わせてアミノ酸生産性を向上
せしめることが可能である。変異を集合する手段として
組換えＤＮＡ技法を適用することも可能である。本発明
によって、エシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属細
菌人工変異株を使用する既知の方法よりも高収率でＶａ
ｌ及びＩｌｅを生産する変異株が育種されたのである。
【００１６】以上、本発明について説明したが、実施例
において更に詳細に説明する。
において更に詳細に説明する。
【００１７】
【００１８】
【実施例１】 １、高濃度Ｉｌｅ要求性変異株の採取
【００１９】Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３３５０株をＮ
−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで処
理し、Ｉｌｅ １０ｍｇ／ｍｌ存在下、３７℃、２４時
間振とう培養した。細胞を洗い、グルコース０．２％含
有最少培地に懸濁し、３７℃でインキュベートした。吸
光度 ５９０ｎｍ（Ａ５９０）の濁度で測定して２倍に
生育した時点で、ペニシリン Ｇ を２０００ ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｌになるように添加し、３７゜Ｃ、３時間イン
キュベート後、細胞を洗い、グルコース ０．２％及び
Ｉｌｅ １０ｍｇ／ｍｌ含有最少寒天培地にスプレッ
ドした。その後常法により、Ｉｌｅ高濃度含有培地生育
可能Ｉｌｅ要求変異株を採取した。この様にして、それ
ぞれ独立にＩｌｅＳ２， ＩｌｅＳ１７， 及び、 Ｉ
ｌｅＳ３２の３株を分離した。表１に、種々のＩｌｅ濃
度の最少培地にて１８時間培養したＩｌｅ要求変異株の
生育度（５９０ ｎｍ における吸光度、 Ａ５９０）
を示す。
−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで処
理し、Ｉｌｅ １０ｍｇ／ｍｌ存在下、３７℃、２４時
間振とう培養した。細胞を洗い、グルコース０．２％含
有最少培地に懸濁し、３７℃でインキュベートした。吸
光度 ５９０ｎｍ（Ａ５９０）の濁度で測定して２倍に
生育した時点で、ペニシリン Ｇ を２０００ ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｌになるように添加し、３７゜Ｃ、３時間イン
キュベート後、細胞を洗い、グルコース ０．２％及び
Ｉｌｅ １０ｍｇ／ｍｌ含有最少寒天培地にスプレッ
ドした。その後常法により、Ｉｌｅ高濃度含有培地生育
可能Ｉｌｅ要求変異株を採取した。この様にして、それ
ぞれ独立にＩｌｅＳ２， ＩｌｅＳ１７， 及び、 Ｉ
ｌｅＳ３２の３株を分離した。表１に、種々のＩｌｅ濃
度の最少培地にて１８時間培養したＩｌｅ要求変異株の
生育度（５９０ ｎｍ における吸光度、 Ａ５９０）
を示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】一般的な、アミノ酸生合成経路がブロック
されたタイプのＩｌｅ要求変異株ＶＬ３３０（ｉｌｖ
Ａ、 スレオニン デアミナーゼ遺伝子）は、Ｉｌｅ
０．０５ｍｇ／ｍｌ含有培地で、最大生育に達してい
る。変異株ＩｌｅＳ２，ＩｌｅＳ１７， ＩｌｅＳ３２
は、生育に、遥かに高濃度のＩｌｅを要求している。更
に、変異株ＩｌｅＳ１７は、Ｉｌｅ ５ｍｇ／ｍｌ含有
培地においても、なお、不充分な生育を示している。
されたタイプのＩｌｅ要求変異株ＶＬ３３０（ｉｌｖ
Ａ、 スレオニン デアミナーゼ遺伝子）は、Ｉｌｅ
０．０５ｍｇ／ｍｌ含有培地で、最大生育に達してい
る。変異株ＩｌｅＳ２，ＩｌｅＳ１７， ＩｌｅＳ３２
は、生育に、遥かに高濃度のＩｌｅを要求している。更
に、変異株ＩｌｅＳ１７は、Ｉｌｅ ５ｍｇ／ｍｌ含有
培地においても、なお、不充分な生育を示している。
【００２２】遺伝解析の結果、ＩｌｅＳシリーズのＩｌ
ｅ要求性変異は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上、スレオニンオ
ペロンとロイシンオペロンの間で、イソロイシルｔ−Ｒ
ＮＡ合成酵素遺伝子のある場所にマッピングされた。さ
らに常法により測定したＩｌｅＳ２及びＩｌｅＳ１７の
イソロイシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性は、各々、親株
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３３５０株の活性の４３％及び３７％
と低い値を示した。
ｅ要求性変異は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上、スレオニンオ
ペロンとロイシンオペロンの間で、イソロイシルｔ−Ｒ
ＮＡ合成酵素遺伝子のある場所にマッピングされた。さ
らに常法により測定したＩｌｅＳ２及びＩｌｅＳ１７の
イソロイシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性は、各々、親株
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３３５０株の活性の４３％及び３７％
と低い値を示した。
【００２３】２、高Ｖａｌ要求性変異株の採取
【００２４】Ｗ３３５０株から誘導したＥ．ｃｏｌｉ
ＶＬ１５０２（ＶａｌＲ， ｐｙｒＢ：：Ｔｎ５）、を
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処
理し、Ｖａｌ １０ｍｇ／ｍｌ存在下、３７℃、３０時
間通気培養した。ついで既述のペニシリン濃縮を２回施
した後、Ｖａｌ要求変異株を採取した。調べたコロニー
の約２０％が、Ｖａｌ要求性であった。この様にして、
それぞれ独立の９株のＶａｌＳシリーズ変異株を分離し
た。表２に、種々のＶａｌ濃度の最少培地にて２０時間
培養した３株のＶａｌＳシリーズ変異株の生育度（５９
０ ｎｍ での吸光度、 Ａ５９０）を示す。
ＶＬ１５０２（ＶａｌＲ， ｐｙｒＢ：：Ｔｎ５）、を
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処
理し、Ｖａｌ １０ｍｇ／ｍｌ存在下、３７℃、３０時
間通気培養した。ついで既述のペニシリン濃縮を２回施
した後、Ｖａｌ要求変異株を採取した。調べたコロニー
の約２０％が、Ｖａｌ要求性であった。この様にして、
それぞれ独立の９株のＶａｌＳシリーズ変異株を分離し
た。表２に、種々のＶａｌ濃度の最少培地にて２０時間
培養した３株のＶａｌＳシリーズ変異株の生育度（５９
０ ｎｍ での吸光度、 Ａ５９０）を示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】ＶａｌＳシリーズＶａｌ要求性変異は、す
べて、ｐｙｒＢ：：Ｔｎ５をマーカーとするＰ１ファー
ジ形質導入で、高頻度（８２−９６％）に形質導入され
た。本結果は、ＶａｌＳ変異がマップされている同じ遺
伝子位置に，Ｖａｌ要求性変異が存在することを示して
いる。数種のＶａｌＳ変異株につき、常法によりバリル
ｔ−ＲＮＡ合成酵素活性を測定したところ、その数値は
減少しており、ＶａｌＳ５２株のバリルｔ−ＲＮＡ合成
酵素活性は親株の１６％にしか過ぎなかった。この様に
して、上述の方法を用いることにより、アミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素活性が低下した変異株を容易に得るこ
とができる。
べて、ｐｙｒＢ：：Ｔｎ５をマーカーとするＰ１ファー
ジ形質導入で、高頻度（８２−９６％）に形質導入され
た。本結果は、ＶａｌＳ変異がマップされている同じ遺
伝子位置に，Ｖａｌ要求性変異が存在することを示して
いる。数種のＶａｌＳ変異株につき、常法によりバリル
ｔ−ＲＮＡ合成酵素活性を測定したところ、その数値は
減少しており、ＶａｌＳ５２株のバリルｔ−ＲＮＡ合成
酵素活性は親株の１６％にしか過ぎなかった。この様に
して、上述の方法を用いることにより、アミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素活性が低下した変異株を容易に得るこ
とができる。
【００２７】３、ＩｌｅＳ１７変異株中のグアノシン−
４−リン酸（ｐｐＧｐｐ）濃度の測定
４−リン酸（ｐｐＧｐｐ）濃度の測定
【００２８】対応アミノ酸飢餓培養の期間、ＩｌｅＳ変
異株、及び、ＶａｌＳ変異株では、対応アミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素活性が弱いために、イソロイシルｔ−
ＲＮＡ濃度、或は、バリルｔ−ＲＮＡ濃度が減少するも
のと考えられる。その結果、ｐｐＧｐｐ生成が増加して
いるに違いない。それ故、Ｉｌｅ含有最少培地で生育し
た親株Ｗ３３５０と変異株ＩｌｅＳ１７の細胞内ｐｐＧ
ｐｐ濃度を常法により測定した。
異株、及び、ＶａｌＳ変異株では、対応アミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素活性が弱いために、イソロイシルｔ−
ＲＮＡ濃度、或は、バリルｔ−ＲＮＡ濃度が減少するも
のと考えられる。その結果、ｐｐＧｐｐ生成が増加して
いるに違いない。それ故、Ｉｌｅ含有最少培地で生育し
た親株Ｗ３３５０と変異株ＩｌｅＳ１７の細胞内ｐｐＧ
ｐｐ濃度を常法により測定した。
【００２９】
【表３】
【００３０】表３の結果の中で、変異株ＩｌｅＳ１７の
ｐｐＧｐｐ濃度は、同一条件で生育した親株Ｗ３３５０
のｐｐＧｐｐ濃度の４倍である。更に、ｐｐＧｐｐ濃度
は、生育培地のＩｌｅ濃度に依存している、すなわち、
Ｉｌｅ濃度が高くなるにつれて、ＩｌｅＳ１７細胞中の
ｐｐＧｐｐ濃度は低くなった。
ｐｐＧｐｐ濃度は、同一条件で生育した親株Ｗ３３５０
のｐｐＧｐｐ濃度の４倍である。更に、ｐｐＧｐｐ濃度
は、生育培地のＩｌｅ濃度に依存している、すなわち、
Ｉｌｅ濃度が高くなるにつれて、ＩｌｅＳ１７細胞中の
ｐｐＧｐｐ濃度は低くなった。
【００３１】４、ＩｌｅＳシリーズ変異株のスレオニン
デアミナーゼ活性の測定
デアミナーゼ活性の測定
【００３２】Ｅ．ｃｏｌｉ株のＩｌｅ及びＶａｌ生産
は、ｉｌｖ−オペロンの発現量に依存するに違いない。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの作用発現に対するＩｌｅＳ
変異の効果を測定するために、Ｉｌｅ低濃度（０．０１
または０．０５ｍｇ／ｍｌ）添加、及び、高濃度（５．
２ｍｇ／ｍｌ）添加培地で生育させたＩｌｅＳシリーズ
変異株について、スレオニン デアミナーゼ（ｉｌｖ
Ａ）活性を、常法を用いて測定した（表４）。
は、ｉｌｖ−オペロンの発現量に依存するに違いない。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの作用発現に対するＩｌｅＳ
変異の効果を測定するために、Ｉｌｅ低濃度（０．０１
または０．０５ｍｇ／ｍｌ）添加、及び、高濃度（５．
２ｍｇ／ｍｌ）添加培地で生育させたＩｌｅＳシリーズ
変異株について、スレオニン デアミナーゼ（ｉｌｖ
Ａ）活性を、常法を用いて測定した（表４）。
【００３３】
【表４】
【００３４】表４に示した結果の中で、スレオニン デ
アミナーゼ活性は、いずれのＩｌｅ添加濃度において
も、ＩｌｅＳシリーズ変異株の方が、親株Ｗ３３５０よ
り高かった。また、Ｉｌｅ ５．２０ｍｇ／ｍｌ添加培
地で、変異株ＩｌｅＳ１７が最大のスレオニン デアミ
ナーゼ活性（親株Ｗ３３５０の１４培）を示している。
アミナーゼ活性は、いずれのＩｌｅ添加濃度において
も、ＩｌｅＳシリーズ変異株の方が、親株Ｗ３３５０よ
り高かった。また、Ｉｌｅ ５．２０ｍｇ／ｍｌ添加培
地で、変異株ＩｌｅＳ１７が最大のスレオニン デアミ
ナーゼ活性（親株Ｗ３３５０の１４培）を示している。
【００３５】
【実施例２】 １、ＩｌｅＳシリーズ変異株よりのＩｌｅ生産性復帰変
異株の採取
異株の採取
【００３６】ＩｌｅＳ２、 ＩｌｅＳ１７ ａｎｄ Ｉ
ｌｅＳ３２をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン処理し、グルコース ０．２％添加 または
グルコース ０．２％ と Ｔｈｒ ３ｍｇ／ｍｌ添加
最小培地プレートにスプレッドし、４８〜７２時間培養
した。出現した復帰変異株について、培地へのＩｌｅ分
泌能、及びＩｌｅ要求（ｉｌｖＡ）変異株を用いるハロ
ー生成能（表５）を調べた。
ｌｅＳ３２をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン処理し、グルコース ０．２％添加 または
グルコース ０．２％ と Ｔｈｒ ３ｍｇ／ｍｌ添加
最小培地プレートにスプレッドし、４８〜７２時間培養
した。出現した復帰変異株について、培地へのＩｌｅ分
泌能、及びＩｌｅ要求（ｉｌｖＡ）変異株を用いるハロ
ー生成能（表５）を調べた。
【００３７】
【表５】
【００３８】この様にして、ＩｌｅＳシリーズ変異株を
用いることによりＩｌｅ生産性変異株が、容易に得られ
る。
用いることによりＩｌｅ生産性変異株が、容易に得られ
る。
【００３９】Ｉｌｅ生産性復帰変異株について、スレオ
ニン デアミナーゼ活性、及び最終生産物Ｉｌｅによる
当該活性阻害を測定した。殆どのＩｌｅ生産性復帰変異
株のスレオニンデアミナーゼは、１ｍＭ Ｉｌｅによっ
て阻害されなかった。更に、Ｉｌｅ生産復帰変異株Ｒｅ
ｖ７４３４（ＩｌｅＳ２からの誘導株）のスレオニンデ
アミナーゼは、最終生産物に対し全く非感受性であっ
た。Ｒｅｖ７４３４株についての遺伝解析、及びＤＮＡ
シーケンス分析の結果、その最終生産物による阻害の完
全な解除の変異は、スレオニン デアミナーゼをコード
しているｉｌｖＡ遺伝子内で起こっていることがわかっ
た（ｉｌｖＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ）。
ニン デアミナーゼ活性、及び最終生産物Ｉｌｅによる
当該活性阻害を測定した。殆どのＩｌｅ生産性復帰変異
株のスレオニンデアミナーゼは、１ｍＭ Ｉｌｅによっ
て阻害されなかった。更に、Ｉｌｅ生産復帰変異株Ｒｅ
ｖ７４３４（ＩｌｅＳ２からの誘導株）のスレオニンデ
アミナーゼは、最終生産物に対し全く非感受性であっ
た。Ｒｅｖ７４３４株についての遺伝解析、及びＤＮＡ
シーケンス分析の結果、その最終生産物による阻害の完
全な解除の変異は、スレオニン デアミナーゼをコード
しているｉｌｖＡ遺伝子内で起こっていることがわかっ
た（ｉｌｖＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ）。
【００４０】２、ＶａｌＲ， ｉｌｖＡ７４３４，及び
ｉｌｅＳ１７変異をもつＩｌｅ生産株の育種
ｉｌｅＳ１７変異をもつＩｌｅ生産株の育種
【００４１】Ｒｅｖ７４３４株は他のＥ．ｃｏｌｉ Ｋ
１２株と同じく、ｉｌｖＧＭＥＤＡ オペロンの発現を
減少させる作用を示す変異をｉｌｖＧ遺伝子に受けてい
る。この損傷を除くために、Ｒｅｖ７４３４株からＶａ
ｌ耐性変異株を、グルコース ０．２％ 及び Ｖａｌ
１ｍｇ／ｍｌ添加寒天培地にスプレッドすることによ
り採取した。この様にして、ｉｌｖＧＭＥＤＡ オペロ
ンに存在するＶａｌ耐性関与遺伝子においてあらたに変
異が起こったＶａｌＲ株ＶＬ１８８６を得た。ＶＬ１８
８６株で増殖させたファージＰ１を用いて、ＶＬ３３４
株（ｔｈｒＣｉｌｖＡ）へ形質導入した。グルコース
０．２％ 及び Ｔｈｒ ０．０５ｍｇ／ｍｌ添加最少
培地でＩｌｅ＋ 形質導入株を採取した。その９０％以
上が、Ｖａｌ耐性株で、Ｉｌｅによるスレオニン デア
ミナーゼ阻害に対し非感受性であった。この様にして、
ＶＬ１８８７（ｔｈｒＣ ｉｌｖＡ７４３４ ｖａｌ
Ｒ）を得た。次いでＩｌｅＳ１７で増殖させたファージ
Ｐ１をＶＬ１８８７株への形質導入に使用した。グルコ
ース添加最少培地にて、Ｔｈｒ＋形質導入株を採取し
た。その５０％が緩慢な生育を示し、Ｉｌｅ添加により
生育が促進された。これらの株は、いずれも、ＩｌｅＳ
変異を受けとった形質導入株であった。この様にして、
ｖａｌＲ，ｉｌｖＡ７４３４，及びＩｌｅＳ１７変異を
同時にもっている変異株ＶＬ１８９２株を得た。この株
は、Ｉｌｅ非感受性スレオニン デアミナーゼを有し、
活性もＲｅｖ７４３４の場合より６−１０倍高い値を示
した。ハロー形成法により、ＶＬ１８９２株のＩｌｅ生
産性が明かになった。
１２株と同じく、ｉｌｖＧＭＥＤＡ オペロンの発現を
減少させる作用を示す変異をｉｌｖＧ遺伝子に受けてい
る。この損傷を除くために、Ｒｅｖ７４３４株からＶａ
ｌ耐性変異株を、グルコース ０．２％ 及び Ｖａｌ
１ｍｇ／ｍｌ添加寒天培地にスプレッドすることによ
り採取した。この様にして、ｉｌｖＧＭＥＤＡ オペロ
ンに存在するＶａｌ耐性関与遺伝子においてあらたに変
異が起こったＶａｌＲ株ＶＬ１８８６を得た。ＶＬ１８
８６株で増殖させたファージＰ１を用いて、ＶＬ３３４
株（ｔｈｒＣｉｌｖＡ）へ形質導入した。グルコース
０．２％ 及び Ｔｈｒ ０．０５ｍｇ／ｍｌ添加最少
培地でＩｌｅ＋ 形質導入株を採取した。その９０％以
上が、Ｖａｌ耐性株で、Ｉｌｅによるスレオニン デア
ミナーゼ阻害に対し非感受性であった。この様にして、
ＶＬ１８８７（ｔｈｒＣ ｉｌｖＡ７４３４ ｖａｌ
Ｒ）を得た。次いでＩｌｅＳ１７で増殖させたファージ
Ｐ１をＶＬ１８８７株への形質導入に使用した。グルコ
ース添加最少培地にて、Ｔｈｒ＋形質導入株を採取し
た。その５０％が緩慢な生育を示し、Ｉｌｅ添加により
生育が促進された。これらの株は、いずれも、ＩｌｅＳ
変異を受けとった形質導入株であった。この様にして、
ｖａｌＲ，ｉｌｖＡ７４３４，及びＩｌｅＳ１７変異を
同時にもっている変異株ＶＬ１８９２株を得た。この株
は、Ｉｌｅ非感受性スレオニン デアミナーゼを有し、
活性もＲｅｖ７４３４の場合より６−１０倍高い値を示
した。ハロー形成法により、ＶＬ１８９２株のＩｌｅ生
産性が明かになった。
【００４２】３、低コピープラスミドを用いることによ
るｉｌｖ−オペロンを有するＩｌｅ生産株の育種
るｉｌｖ−オペロンを有するＩｌｅ生産株の育種
【００４３】ＡＢ１２０６株は低コピープラスミドＦ’
１４を宿し、Ｆ’１４上にはｉｌｖ−オペロンの染色体
フラグメントが存在し、同時に対応する染色体上の遺伝
子を欠損している。ＶＬ１８８６で増殖させたファージ
Ｐ１を、ＡＢ１２０６株の形質導入に使用した。グルコ
ース ０．２％ 及び Ｖａｌ １ｍｇ／ｍｌ添加最少
培地で形質導入株を採取した。この様にしてｖａｌＲ変
異、及びｉｌｖ７４３４変異（常法によるスレオニン
デアミナーゼ活性測定で立証された）をもっているＦ’
１４プラスミドを有する株ＫＸ１３９を得た。このプラ
スミドは、接合によって、多種類のＥ．ｃｏｌｉ株中
に、具体的には、ＩｌｅＳ１７に、移行され得る。然し
ながら、ｒｅｃＡ＋株中では、高頻度の染色体への挿入
が原因で、このＦ’１４プラスミドは不安定である。そ
れ故、ｒｅｃＡ変異を、ＮＫ６６５９（Ｈｆｒ ＫＬ１
６ ｓｒｌ：：Ｔｎ１０ ｒｅｃＡ）株から通常の接合
法を用いて導入した。組換え株は、テトラサイクリン
０．０１ｍｇ／ｍｌ添加 Ｌ−ｂｒｏｔｈ寒天培地上で
採取し、当該株中、ＵＶ感受性ＩｌｅＳ株を選択した。
この様にして、遺伝子型がｉｌｅＳ１７ ｒｅｃＡを有
する変異株ＫＸ１４０を採取した。接合により、ＫＸ１
４０細胞中に、プラスミドＦ’１４（ｖａｌＲｉｌｖＡ
７４３４）を挿入してＫＸ１４１株を育種した。ハロー
形成法により、当該株のＩｌｅ生産性が示された。
１４を宿し、Ｆ’１４上にはｉｌｖ−オペロンの染色体
フラグメントが存在し、同時に対応する染色体上の遺伝
子を欠損している。ＶＬ１８８６で増殖させたファージ
Ｐ１を、ＡＢ１２０６株の形質導入に使用した。グルコ
ース ０．２％ 及び Ｖａｌ １ｍｇ／ｍｌ添加最少
培地で形質導入株を採取した。この様にしてｖａｌＲ変
異、及びｉｌｖ７４３４変異（常法によるスレオニン
デアミナーゼ活性測定で立証された）をもっているＦ’
１４プラスミドを有する株ＫＸ１３９を得た。このプラ
スミドは、接合によって、多種類のＥ．ｃｏｌｉ株中
に、具体的には、ＩｌｅＳ１７に、移行され得る。然し
ながら、ｒｅｃＡ＋株中では、高頻度の染色体への挿入
が原因で、このＦ’１４プラスミドは不安定である。そ
れ故、ｒｅｃＡ変異を、ＮＫ６６５９（Ｈｆｒ ＫＬ１
６ ｓｒｌ：：Ｔｎ１０ ｒｅｃＡ）株から通常の接合
法を用いて導入した。組換え株は、テトラサイクリン
０．０１ｍｇ／ｍｌ添加 Ｌ−ｂｒｏｔｈ寒天培地上で
採取し、当該株中、ＵＶ感受性ＩｌｅＳ株を選択した。
この様にして、遺伝子型がｉｌｅＳ１７ ｒｅｃＡを有
する変異株ＫＸ１４０を採取した。接合により、ＫＸ１
４０細胞中に、プラスミドＦ’１４（ｖａｌＲｉｌｖＡ
７４３４）を挿入してＫＸ１４１株を育種した。ハロー
形成法により、当該株のＩｌｅ生産性が示された。
【００４４】４、Ｉｌｅ新生産菌株を用いたＩｌｅ生産
【００４５】Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＬ１８９２株 及び Ｋ
Ｘ１４１株を、Ｍ９寒天培地で培養したのち、５０ｍｌ
のＬ−ブロス（ペプトン １０ｇ／ｌ，酵母エキス ５
ｇ／ｌ，グルコース １ｇ／ｌ及び塩化ナトリウム ５
ｇ／ｌ， ｐＨ７．２）含有エーレンマイヤーフラスコ
に、白金耳にて接種した。フラスコを、回転シェーカー
に架けて、２００ ｒ．ｐ．ｍ．、３７℃，１８時間培
養し、シード培養液を得た。グルコース ３０ｇ／ｌ，
硫酸アンモニウム ５ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ／
ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ，ＦｅＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０２ｇ／ｌ，酵母エキス ０．２ｇ／ｌ，及びＴｈ
ｒ １ｇ／ｌ含有メイン培地を調製した。３００ｍｌの
培地を、５００ｍｌ容ジャーファーメンターに注入し、
１２１℃，１５分殺菌した。３０ｍｌの上記のシード培
養液を接種し、９００ｒ．ｐ．ｍ．回転、１：１／ｍｉ
ｎ通気して 培養した。培養ｐＨを約７．２に、ｐＨモ
ニター指示により、自動的に、 １０％−Ｔｈｒ， ６
０％−グルコース，及び２５％−ＮＨ４ＯＨ（１０：
７：１）混合液をフィードすることにより、制御した。
４６時間培養後のＶＬ１８９２株培養液、及び、ＫＸ１
４１培養液中のＩｌｅ蓄積濃度は、それぞれ、８−１３
ｇ／ｌ，および、１１−１７．８ｇ／ｌであった。 Ｋ
Ｘ１４１株はブタペスト条約で認められているソ連のＡ
ｌｌ−Ｕｎｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉ
ｎ ＶＮＩＩＧＥＮＥＮＴＩＫＡにＶＫＰＭ Ｂ−４７
８１として寄託されている。
Ｘ１４１株を、Ｍ９寒天培地で培養したのち、５０ｍｌ
のＬ−ブロス（ペプトン １０ｇ／ｌ，酵母エキス ５
ｇ／ｌ，グルコース １ｇ／ｌ及び塩化ナトリウム ５
ｇ／ｌ， ｐＨ７．２）含有エーレンマイヤーフラスコ
に、白金耳にて接種した。フラスコを、回転シェーカー
に架けて、２００ ｒ．ｐ．ｍ．、３７℃，１８時間培
養し、シード培養液を得た。グルコース ３０ｇ／ｌ，
硫酸アンモニウム ５ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ／
ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ，ＦｅＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０２ｇ／ｌ，酵母エキス ０．２ｇ／ｌ，及びＴｈ
ｒ １ｇ／ｌ含有メイン培地を調製した。３００ｍｌの
培地を、５００ｍｌ容ジャーファーメンターに注入し、
１２１℃，１５分殺菌した。３０ｍｌの上記のシード培
養液を接種し、９００ｒ．ｐ．ｍ．回転、１：１／ｍｉ
ｎ通気して 培養した。培養ｐＨを約７．２に、ｐＨモ
ニター指示により、自動的に、 １０％−Ｔｈｒ， ６
０％−グルコース，及び２５％−ＮＨ４ＯＨ（１０：
７：１）混合液をフィードすることにより、制御した。
４６時間培養後のＶＬ１８９２株培養液、及び、ＫＸ１
４１培養液中のＩｌｅ蓄積濃度は、それぞれ、８−１３
ｇ／ｌ，および、１１−１７．８ｇ／ｌであった。 Ｋ
Ｘ１４１株はブタペスト条約で認められているソ連のＡ
ｌｌ−Ｕｎｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉ
ｎ ＶＮＩＩＧＥＮＥＮＴＩＫＡにＶＫＰＭ Ｂ−４７
８１として寄託されている。
【００４６】
【実施例３】 １、Ｖａｌ生産ＩｌｅＳ３２ ＶａｌＲ復帰変異株の採
取
取
【００４７】Ｖａｌ生産株採取のため、ＩｌｅＳ及び
ＶａｌＲ（ｉｌｖＧ）の変異を受けた菌株の育種を試み
た。 先ずＶａｌＲ（ｉｌｖＧ）変異により、Ｅ．ｃｏ
ｌｉＫ１２株が本来欠損している、Ｖａｌ生合成路のキ
イ酵素のひとつであるＶａｌ非感受性アセトヒドロキシ
酸合成酵素ＩＩを回復させた。ファージＰ１媒介の形質
導入によって、Ｃ６００ ＶａｌＲ（Ｖａｌ １ｍｇ／
ｍｌに耐性）株からＶａｌＲ変異形質を、また、Ｉｌｅ
Ｓ３２株からｉｌｅＳ３２変異を、ＶＬ３３４（ｔｈｒ
Ｃ ｉｌｖＡ）株の染色体中に導入した。グルコース
０．２％及びＶａｌ ２ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９寒天培地
で、ｖａｌＲ形質導入株を採取し、またＩｌｅ ２ｍｇ
／ｍｌ含有Ｍ９寒天培地で、Ｔｈｒ＋，ＩｌｅＳ形質導
入株を採取した。
ＶａｌＲ（ｉｌｖＧ）の変異を受けた菌株の育種を試み
た。 先ずＶａｌＲ（ｉｌｖＧ）変異により、Ｅ．ｃｏ
ｌｉＫ１２株が本来欠損している、Ｖａｌ生合成路のキ
イ酵素のひとつであるＶａｌ非感受性アセトヒドロキシ
酸合成酵素ＩＩを回復させた。ファージＰ１媒介の形質
導入によって、Ｃ６００ ＶａｌＲ（Ｖａｌ １ｍｇ／
ｍｌに耐性）株からＶａｌＲ変異形質を、また、Ｉｌｅ
Ｓ３２株からｉｌｅＳ３２変異を、ＶＬ３３４（ｔｈｒ
Ｃ ｉｌｖＡ）株の染色体中に導入した。グルコース
０．２％及びＶａｌ ２ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９寒天培地
で、ｖａｌＲ形質導入株を採取し、またＩｌｅ ２ｍｇ
／ｍｌ含有Ｍ９寒天培地で、Ｔｈｒ＋，ＩｌｅＳ形質導
入株を採取した。
【００４８】この様にして、ＩｌｅＳ３２ ＶａｌＲ株
を育種した。次いで、当該株のＩｌｅ非要求性復帰変異
株を、Ｉｌｅ無含有Ｍ９培地にプレートすることにより
選択した。本プレートに生育したコロニーについて、Ｉ
ｌｅ ０．０５ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９最少寒天培地でのＩ
ｌｅ及びＶａｌ要求性のＥ．ｃｏｌｉを用いてハロー形
成能を調べた。この様にして、Ｖａｌを分泌するＲｅｖ
８３５， Ｒｅｖ８３９ ａｎｄ Ｒｅｖ８７４を採取
した。ファージＰ１による形質導入によって、これら復
帰変異株が、他のＥ．ｃｏｌｉ株に移行させ得るｉｌｅ
Ｓ変異を保持していることが判った。
を育種した。次いで、当該株のＩｌｅ非要求性復帰変異
株を、Ｉｌｅ無含有Ｍ９培地にプレートすることにより
選択した。本プレートに生育したコロニーについて、Ｉ
ｌｅ ０．０５ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９最少寒天培地でのＩ
ｌｅ及びＶａｌ要求性のＥ．ｃｏｌｉを用いてハロー形
成能を調べた。この様にして、Ｖａｌを分泌するＲｅｖ
８３５， Ｒｅｖ８３９ ａｎｄ Ｒｅｖ８７４を採取
した。ファージＰ１による形質導入によって、これら復
帰変異株が、他のＥ．ｃｏｌｉ株に移行させ得るｉｌｅ
Ｓ変異を保持していることが判った。
【００４９】２、栄養要求復帰変異株を用いるＶａｌ生
産
産
【００５０】採取した変異株のＶａｌ生産能を試験管培
養で調べた。発酵培地組成は、グルコース ５０ｇ／
ｌ，硫酸アンモニウム １０ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １
ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ，ＦｅＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２
Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，及びＣａＣｏ３（別殺菌） ２０
ｇ／ｌ，ｐＨ７．２であった。２０ｍｌ容試験管に、３
ｍｌの培地を注入し、被検株菌体を一白金耳接種し、３
７℃、４６時間培養した。 表６に、発酵ブロス上澄液
中の、Ｖａｌ含量を示す。
養で調べた。発酵培地組成は、グルコース ５０ｇ／
ｌ，硫酸アンモニウム １０ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １
ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ，ＦｅＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２
Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，及びＣａＣｏ３（別殺菌） ２０
ｇ／ｌ，ｐＨ７．２であった。２０ｍｌ容試験管に、３
ｍｌの培地を注入し、被検株菌体を一白金耳接種し、３
７℃、４６時間培養した。 表６に、発酵ブロス上澄液
中の、Ｖａｌ含量を示す。
【００５１】
【表６】
【００５２】３、Ｖａｌ高生産有用株の育種
【００５３】Ｖａｌ生産株を改良するために、またＶａ
ｌ生産に対しｉｌｅＳ変異が果たす役割を明らかにする
ために、Ｒｅｖ８７４株をもとに、ＩｌｅＳ＋株及びＩ
ｌｅＳ−株を採取した。ＤＮＡ供与株ＮＫ６０６６（ｔ
ｈｒ：：Ｔｎ９）細胞に増殖させたファージＰ１を用
い、Ｒｅｖ８７４株の染色体中に ｔｈｒ：：Ｔｎ９を
形質導入した。クロラムフェニコール １０μｇ／ｍｌ
含有Ｌ−ブロス寒天培地にて、形質導入株を採取した。
それらの中から、Ｉｌｅ無添加最少培地で迅速に生育す
る（ＩｌｅＳ＋）Ｔｈｒ要求株ＶＬ１９６６を得た。当
該株の細胞を、ＩｌｅＳ１７株で増殖させたファージＰ
１を用いて形質導入した。形質導入株は、グルコース
０．２％及びＩｌｅ ２ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９最少培地に
て選択した。Ｔｈｒ＋形質導入株中から、ＶＬ１９６８
（ＩｌｅＳ＋）、及び、ＶＬ１９７０（ＩｌｅＳ１７）
の二株を得た。この二株とＲｅｖ８７４のＶａｌ生産性
を、前述の培養法を用いて調べた。生産性は、培養液の
吸光度に対するＶａｌ蓄積濃度の比率で計算した。結果
を、表７に示した。
ｌ生産に対しｉｌｅＳ変異が果たす役割を明らかにする
ために、Ｒｅｖ８７４株をもとに、ＩｌｅＳ＋株及びＩ
ｌｅＳ−株を採取した。ＤＮＡ供与株ＮＫ６０６６（ｔ
ｈｒ：：Ｔｎ９）細胞に増殖させたファージＰ１を用
い、Ｒｅｖ８７４株の染色体中に ｔｈｒ：：Ｔｎ９を
形質導入した。クロラムフェニコール １０μｇ／ｍｌ
含有Ｌ−ブロス寒天培地にて、形質導入株を採取した。
それらの中から、Ｉｌｅ無添加最少培地で迅速に生育す
る（ＩｌｅＳ＋）Ｔｈｒ要求株ＶＬ１９６６を得た。当
該株の細胞を、ＩｌｅＳ１７株で増殖させたファージＰ
１を用いて形質導入した。形質導入株は、グルコース
０．２％及びＩｌｅ ２ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９最少培地に
て選択した。Ｔｈｒ＋形質導入株中から、ＶＬ１９６８
（ＩｌｅＳ＋）、及び、ＶＬ１９７０（ＩｌｅＳ１７）
の二株を得た。この二株とＲｅｖ８７４のＶａｌ生産性
を、前述の培養法を用いて調べた。生産性は、培養液の
吸光度に対するＶａｌ蓄積濃度の比率で計算した。結果
を、表７に示した。
【００５４】
【表７】
【００５５】表７から、ｉｌｅＳ変異が、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｖａｌ生産株のＶａｌ生産性を著しく増大することが
判る。また、培地へのＩｌｅ添加で、僅かにしか生育が
回復されないｉｌｅＳ１７変異が、Ｖａｌ生産性をより
大幅に高めることが判る。Ｖａｌ生産改良株ＶＬ１９７
０が、Ｖａｌ生産に効果があるｉｌｖオペロンと、イソ
ロイシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性が低下したｉｌｅＳ１
７変異とを、組み合わせることにより育種出来たのであ
る。
Ｖａｌ生産株のＶａｌ生産性を著しく増大することが
判る。また、培地へのＩｌｅ添加で、僅かにしか生育が
回復されないｉｌｅＳ１７変異が、Ｖａｌ生産性をより
大幅に高めることが判る。Ｖａｌ生産改良株ＶＬ１９７
０が、Ｖａｌ生産に効果があるｉｌｖオペロンと、イソ
ロイシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性が低下したｉｌｅＳ１
７変異とを、組み合わせることにより育種出来たのであ
る。
【００５６】４、Ｅ．ｃｏｌｉ新株ＶＬ１９７０を用い
るＶａｌ生産
るＶａｌ生産
【００５７】Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＬ１９７０株を、シード
培地を注入したエーレンマイヤーフラスコにて３７℃，
１８時間，３００ｒ．ｐ．ｍ．で、回転培養した。シー
ド培地として、グルコース １％含有Ｍ９最少培地を用
いた。メイン培地として、グルコース ３０ｇ／ｌ，硫
酸アンモニウム ５ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ／ｌ，
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ，ＦｅＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．
０２ｇ／ｌ，塩化ナトリウム ０．６ｇ／ｌ，及び酵母
エキス ０．２５ｇ／ｌ，ｐＨ７．２、組成の培地を調
製した。３００ｍｌのメイン培地を５００ｍｌ容ジャー
・ファーメンターに注入し、１２１℃，１５分殺菌し
た。３０ｍｌの上記組成のシード培養液を接種し、３７
℃，９００ｒ．ｐ．ｍ．回転、１：１／ｍｉｎ通気し
て、培養した。培養ｐＨを、約７．２に、ｐＨ−モニタ
ー指示により、自動的に、５０％ ｇｌｕｃｏｓｅ及び
２５％−ＮＨ４ＯＨ（６：１）混合液をフィードするこ
とにより制御した。４６時間培養したブロス中のＶａｌ
濃度は、８．２−１０．６ｇ／ｌであり、組換えＤＮＡ
法で育種したＥ．ｃｏｌｉの場合の７倍であった。 Ｖ
Ｌ１９７０株はブタペスト条約で認められているソ連の
Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
ｉｎ ＶＮＩＩＧＥＮＥＴＩＫＡにＶＫＰＭ Ｂ−４４
１１として寄託されている。
培地を注入したエーレンマイヤーフラスコにて３７℃，
１８時間，３００ｒ．ｐ．ｍ．で、回転培養した。シー
ド培地として、グルコース １％含有Ｍ９最少培地を用
いた。メイン培地として、グルコース ３０ｇ／ｌ，硫
酸アンモニウム ５ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ／ｌ，
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ，ＦｅＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．
０２ｇ／ｌ，塩化ナトリウム ０．６ｇ／ｌ，及び酵母
エキス ０．２５ｇ／ｌ，ｐＨ７．２、組成の培地を調
製した。３００ｍｌのメイン培地を５００ｍｌ容ジャー
・ファーメンターに注入し、１２１℃，１５分殺菌し
た。３０ｍｌの上記組成のシード培養液を接種し、３７
℃，９００ｒ．ｐ．ｍ．回転、１：１／ｍｉｎ通気し
て、培養した。培養ｐＨを、約７．２に、ｐＨ−モニタ
ー指示により、自動的に、５０％ ｇｌｕｃｏｓｅ及び
２５％−ＮＨ４ＯＨ（６：１）混合液をフィードするこ
とにより制御した。４６時間培養したブロス中のＶａｌ
濃度は、８．２−１０．６ｇ／ｌであり、組換えＤＮＡ
法で育種したＥ．ｃｏｌｉの場合の７倍であった。 Ｖ
Ｌ１９７０株はブタペスト条約で認められているソ連の
Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
ｉｎ ＶＮＩＩＧＥＮＥＴＩＫＡにＶＫＰＭ Ｂ−４４
１１として寄託されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ウラジミール・ゲオルギェウィッチ・デ バボフ ソビエト連邦、113545、１ モスクワ、 １ ドロジュニー プロイエズド、 フ セソユーズヌイ・ナウチノ−イスレドワ ーチェルキー・インスチツート・ゲネキ チ・イ・セレクツイー・プロムイシュレ ンヌイフ・ミクロオルガニズモフ内 (72)発明者 ガブリローバ ソビエト連邦、113545、１ モスクワ、 １ ドロジュニー プロイエズド、 フ セソユーズヌイ・ナウチノ−イスレドワ ーチェルキー・インスチツート・ゲネキ チ・イ・セレクツイー・プロムイシュレ ンヌイフ・ミクロオルガニズモフ内 (72)発明者 ザカタエバ ソビエト連邦、113545、１ モスクワ、 １ ドロジュニー プロイエズド、 フ セソユーズヌイ・ナウチノ−イスレドワ ーチェルキー・インスチツート・ゲネキ チ・イ・セレクツイー・プロムイシュレ ンヌイフ・ミクロオルガニズモフ内 (72)発明者 ルステム・サイドウィッチ・シャクロフ ソビエト連邦、113545、１ モスクワ、 １ ドロジュニー プロイエズド、 フ セソユーズヌイ・ナウチノ−イスレドワ ーチェルキー・インスチツート・ゲネキ チ・イ・セレクツイー・プロムイシュレ ンヌイフ・ミクロオルガニズモフ内 (72)発明者 タチアナ・アレキサンドロフナ・バッチ ーニ ソビエト連邦、113545、１ モスクワ、 １ ドロジュニー プロイエズド、 フ セソユーズヌイ・ナウチノ−イスレドワ ーチェルキー・インスチツート・ゲネキ チ・イ・セレクツイー・プロムイシュレ ンヌイフ・ミクロオルガニズモフ内 (72)発明者 エフゲニー・モイセーウィッチ・クルゲ ス ソビエト連邦、113545、１ モスクワ １ ドロジュニー プロイエズド、 フ セソユーズヌイ・ナウチノ−イスレドワ ーチェルキー・インスチツート・ゲネキ チ・イ・セレクツイー・プロムイシュレ ンヌイフ・ミクロオルガニズモフ内 審査官 坂崎 恵美子 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/20 C12P 13/04 C12P 13/06 C12P 13/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】(1)生産しようとするアミノ酸に対応する
アミノアシルt-RNA合成酵素遺伝子の変異であって、当
該変異を有する変異株に生育のために当該アミノ酸の添
加を必要とするアミノ酸要求性の表現形を与え、当該ア
ミノ酸の生合成経路が遮断された他の変異株が生育のた
めに要求する量以上の当該アミノ酸の添加を生育のため
に必要とする第一の変異、及び(2)当該アミノ酸要求性
の表現形を相補する変異であって、当該アミノ酸に対応
するアミノアシルt-RNA合成酵素遺伝子以外のアミノ酸
の生産に係わる遺伝子上にある第二の変異を有し、並び
に当該アミノ酸の生産能を有する微生物。 - 【請求項２】第二の変異が導入された微生物が、アミノ
アシルt-RNA合成酵素遺伝子の第一の変異を有する変異
株を更に変異処理し、対応アミノ酸無添加もしくは低濃
度添加培地に生育する復帰変異株を選ぶことにより、細
胞内関連アミノ酸生成濃度が増大した変異株である請求
項1記載の微生物。 - 【請求項３】生産しようとするアミノ酸がイソロイシン
又はバリンである請求項1記載の微生物。 - 【請求項４】微生物が大腸菌である請求項1記載の微生
物。 - 【請求項５】請求項1記載の微生物を培地に培養し、該
培地に生産しようとするアミノ酸を蓄積させることを特
徴とする当該アミノ酸の製造法。 - 【請求項６】生産しようとするアミノ酸がイソロイシン
又はバリンである請求項5記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19374991A JP3237134B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | アミノ酸生産能を有する微生物及び当該微生物を用いるアミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19374991A JP3237134B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | アミノ酸生産能を有する微生物及び当該微生物を用いるアミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04330275A JPH04330275A (ja) | 1992-11-18 |
| JP3237134B2 true JP3237134B2 (ja) | 2001-12-10 |
Family
ID=16313176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19374991A Expired - Fee Related JP3237134B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | アミノ酸生産能を有する微生物及び当該微生物を用いるアミノ酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3237134B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69535674T2 (de) | 1994-08-30 | 2009-01-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur herstellung von l-valin und l-leucin |
| JP3966583B2 (ja) * | 1997-06-23 | 2007-08-29 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP4245746B2 (ja) | 1999-09-20 | 2009-04-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
| CA2319283A1 (en) | 1999-09-20 | 2001-03-20 | Kuniki Kino | Method for producing l-amino acids by fermentation |
-
1991
- 1991-04-30 JP JP19374991A patent/JP3237134B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04330275A (ja) | 1992-11-18 |
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