JPH04330275A - アミノ酸生産能を有する微生物及び当該微生物を用いるアミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は発酵工業に関し、更に詳
しくはアミノ酸生産株の育種方法、それによって育種さ
れた菌株及びそれら菌株を用いるアミノ酸の製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物が生産するアミノ酸は、農畜産で
の飼料及び食品産業での添加物、医療での栄養製剤、化
学合成及び薬品工業での試薬、等の用途に広く使用され
ている。既知の技術としては、種々の変異原を使用した
Ｌ−リジン（Ｌｙｓ），Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ），Ｌ
−イソロイシン（Ｉｌｅ），Ｌ−バリン（Ｖａｌ）等の
生産株の育種方法が知られている。これらの変異株は、
代謝制御における遺伝的な解除を既に受けており、この
ために、これらの変異株は対応するアミノ酸を培地中に
放出し、蓄積する。これらの変異株は、伝統的な方法、
すなわち栄養要求変異株或はアミノ酸アナログ非感受性
変異株として育種される。

【０００３】アミノ酸を生産する栄養要求変異株は対応
アミノ酸生合成の側路をブロックするか或は阻害因子と
してのアミノ酸の生成をブロックする事で得られる。例
えばＶａｌ生産バントテン酸要求大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ
）変異株（Ｍａａｓ　　Ｗ．Ｋ．，　　Ｖｏｇｅｌ　　
Ｈ．Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖ．６５，ｐ．
３８８，１９５３）、　　Ｌｙｓ生産ホモセリン要求コ
リネバグテリウム　　グルタミカス（Ｃｏｒｙｎｅ．　
　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）変異株（Ｎａｋａｙａｍａ　
　ｅｔａｌ．，　　Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，　　ｖ．７，　　ｐ．４１，　　１９６１
）、およびＶａｌ生産Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，または　　ホモ
セリン要求アルスロバクター　　パラフィネウス（Ａｒ
ｔｈｒｏ．　　ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）及びコリネバ
クテリウム　　ハイドロカーボクラスタス（Ｃｏｒｙｎ
ｅ．　　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｃｌａｓｔｕｓ）変異株
（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．，　　Ｎｏ．３，７００５５６）が
知られている。

【０００４】アミノ酸アナログ非感受性変異株のアミノ
酸の生産はアミノ酸生合成酵素活性のネガティブ・フィ
ードバック阻害、もしくは酵素蛋白生成の制御が解除さ
れているために起こる。Ｌｙｓ生産アミノエチルシステ
イン非感受性　　ブレビバクテリウム属変異株（Ｓａｎ
ｏ　　Ｋ．，Ｓｈｉｉｏ　　Ｉ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖ．１６　　ｐ３７３，１
９７０．　　Ｓｈｉｉｏ　　ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，ｖ．６８，ｐ７０１，１９７０）、　　Ｔｈ
ｒ生産　　アミノハイドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）非感受
性Ｅ．ｃｏｌｉ変異株（Ｓｈｉｉｏ　　Ｉ．，Ｎａｋａ
ｍｏｒｉ　　Ｓ．，　　Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，ｖ．３３，ｐ１１５２，１９６９）、　　同ブレビバ
クテリウム　　属変異株（Ｓｈｉｉｏ　　Ｉ．，Ｎａｋ
ａｍｏｒｉ　　Ｓ．，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
ｖ．３４，ｐ４４８，１９７０）、Ｉｌｅ生産ＡＨＶ非
感受性ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム
属変異株（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．，　　Ｎｏ．３，　　７６
７５２９）、Ｖａｌ生産２−チアゾールアラニン非感受
性ブレビバクテリウム及びコリネバクテリウム属変異株
（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．，　　Ｎｏ．３，８９３８８８）、
Ｉｌｅ生産イソロイシン　　ハイドロキサメート非感受
性セラチア　　マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　　
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（Ｋｉｓｕｍｉ　　ｅｔ　　ａ
ｌ．，　　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　　ｖ．１１０
，ｐ．７６１，　　１９７２）が知られている。

【０００５】アミノ酸の生産性が改善されたものとして
、アミノ酸アナログ非感受性変異と栄養要求性変異を組
み合わせたものが知られている（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．，　
　Ｎｏ．３，　　８９３８８８）が、これらは栄養要求
性であるため、その栄養物質含有培地でしか生育出来ず
、産業上更に改善が望まれる。

【０００６】また、組換えＤＮＡ技術の応用として、遺
伝子供与生物のアミノ酸合成遺伝子含有染色体ＤＮＡフ
ラグメントを分離し、これをｉｎ　　ｖｉｔｒｏで多コ
ピープラスミドＤＮＡと組み合わせて得たハイブリッド
ＤＮＡを高アミノ酸生産性株に導入する方法（Ｕ．Ｓ．
Ｐａｔ．，　　Ｎｏ．４，　　２７８７６５；　　４，
　　３９１９０７）を基本とするアミノ酸生産株の調製
法がある。 本法によると、染色体ＤＮＡフラグメントを分離し、変
異させて、アミノ酸生合成の調節を消去している。一般
論として、組換えＤＮＡの受容株は、合目的に作られた
株、もしくは、ＤＮＡ供与株そのものが用いられる。然
しながら、上述の種々の方法では、これまでのところ、
ＩｌｅまたはＶａｌ生産Ｅ．ｃｏｌｉ優秀株を育種する
ことが出来なかったのである。それ故、アミノ酸生産株
の新育種方法の開発が依然として要求されているわけで
ある。

【０００７】さて現在までのところ、我々が関心を持っ
て研究し、成果をあげたアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵
素遺伝子を変異せしめることを特徴とした対応するアミ
ノ酸の高生産性株は、知られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】アミノアシルｔ−ＲＮ
Ａ合成酵素、即ちアミノ酸の活性化酵素は、素材である
アミノ酸から蛋白質を合成する場合の必須因子であり、
活性化されたアミノ酸の合成、つまり、　　アミノ酸の
対応ｔ−ＲＮＡへの結合を触媒する。　　多くの場合、
ひとつのアミノ酸に対し一種のアミノアシルｔ−ＲＮＡ
合成酵素しか存在しないので完全失活は致命的であり、
条件づき変異しか起り得ないと思われる。

【０００９】アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素が変化し
た変異株について、以下の報告がある。 １．Ｒｏｔｈ　　Ｊ．Ｒ．，　　ａｎｄ　　Ａｍｅｓ　
　Ｂ．Ｎ．，　　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　　ｖ．２
２，　　ｐ．３２５，　　１９６６． ２．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ　　Ｆ．Ｃ．，　　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．　　Ｒｅｖ．，　　ｖ．３０，　　ｐ．７０
１，　　１９６６． ３．Ｆｏｌｋ　　Ｗ．Ｒ．，　　ａｎｄ　　Ｂｅｒｇ　
　Ｐ．Ｊ．，　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　　ｖ．１０
２，　　ｐ．１９３，　　１９７０． ４．Ｉａｃｃａｒｉｎｏ　　Ｍ．，　　ａｎｄ　　Ｂｅ
ｒｇ　　Ｐ．Ｊ．，　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　　ｖ
．１０５，　　ｐ．５２７，　　１９７１． ５．Ｊｏｈｎｓｏｎ　　Ｅ．Ｍ．　　ｅｔ　　ａｌ．，
　　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖ．１２９，　　ｐ．
６６，　　１９７９．

【００１０】アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変異にお
いて栄養要求性を示す場合があるが、これは、通常の栄
養要求変異株ではない。というのは、アミノ酸生合成能
が損なわれているのではなく、アミノ酸を蛋白合成へ利
用する能力が低下しているからである。一方、この種の
栄養要求性変異は、対応アミノ酸の生合成を増強する変
異、すなわち対応アミノ酸の細胞内濃度を増大させる更
なる変異により抑制されて、表現上は栄養非要求性とな
ることが報告されている（上記文献１，　　４−５）。 然しながら、この栄養要求性を示すアミノアシルｔ−Ｒ
ＮＡ合成酵素変異に基づいて、育種されたアミノ酸生産
株、及びその育種方法については未だ知られていないの
である。当然アミノ酸の過剰生産をもたらすこれら変異
の役割についても解析されていない。本発明はアミノア
シルｔ−ＲＮＡ合成酵素遺伝子に変異を施すことにより
、最終的には栄養要求性を付加することなく、アミノ酸
生産能の増強した菌株を育種すること、更に詳しくは、
Ｉｌｅ及びＶａｌ生産Ｅ．ｃｏｌｉ株の育種方法とそれ
により得られた変異株によるＩｌｅ及びＶａｌの発酵生
産の方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、後に詳
述する様に、本発明に基づいて、培地への通常量以上の
対応アミノ酸の添加により生育が回復される栄養要求性
を発現するアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変異と、当
該アミノ酸の生合成阻害が解除された変異を結びつける
ことにより、当該アミノ酸生産能が増強された生産株を
育種する方法を開発することにより達成された。即ち、
生産しようとするアミノ酸に対応するアミノアシルｔ−
ＲＮＡ合成酵素遺伝子の変異であって、生育のために該
アミノ酸の生合成経路が遮断された変異株の該アミノ酸
の要求量以上の該アミノ酸の培地への添加を必要とする
アミノ酸要求性変異と、該アミノ酸生合成の代謝制御変
異とからなるアミノ酸生産菌の育種方法であり、該アミ
ノ酸生合成の代謝調節変異株をアミノアシルｔ−ＲＮＡ
合成酵素遺伝子の変異株より復帰変異法を用いて得られ
る育種方法に関する。更にはこれら方法により得られた
変異株によるアミノ酸の発酵生産に関わり、更に詳しく
は大腸菌によるＩｌｅ及びＶａｌの製造方法に関する。

【００１２】栄養要求性を示すアミノアシルｔ−ＲＮＡ
合成酵素変異は、対応アミノ酸への該酵素の基質親和性
を数倍減少（すなわちＫｍを増加）させた（上記文献　
　３−４）。それ故、細胞内の活性化アミノ酸（対応ア
ミノアシルｔ−ＲＮＡ）生成が減少する。この状況下で
は、もし当該アミノ酸の生合成に関与する構造遺伝子の
発現が、アテニュエーションによる制御機構をもってい
るものであれば、転写は著しく増大する。この制御機構
は、Ｅ．ｃｏｌｉなど数種の細菌の多数のアミノ酸オペ
ロンに存在していることが知られている（Ｋｏｌｔｅｒ
　　Ｒ．，　　Ｙａｎｏｆｓｋｙ　　Ｃ．，　　Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，　　ｖ．１６，ｐ．１１３，
　　１９８２；　　　　Ｍａｔｓｕｉ　　Ｋ．　　ｅｔ
　　ａｌ．，　　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ
．，　　ｖ．１４，　　ｐ．１０１１３，　　１９８６
；　　Ｓｈｉｍｏｔｓｕ　　Ｈ．　　ｅｔ　　ａｌ．，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　　ｖ．１６６，ｐ．４６
１，　　１９８６；　　Ｋｕｒｏｄａ　　Ｍ．Ｉ．　　
ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　　ｖ．
１６７，　　ｐ．７９２，　　１９８６）。

【００１３】更に、アミノアシルｔ−ＲＮＡ生成の減少
は、細胞内グアノシン−４−リン酸（ｐｐＧｐｐ）濃度
を増大させ、これがアミノ酸オペロンの転写の始動を活
性化することが知られている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ　　Ｊ
．Ｃ．　　ｅｔ　　　　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　　ｖ．７２，　　ｐ．３８
９，　　１９７５；Ｃａｓｈｅｌ　　Ｍ．，　　ａｎｄ
　　Ｒｕｄｄ　　Ｋ．Ｅ．　　Ｉｎ：Ｅｓｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　　ｃｏｌｉ　　ａｎｄ　　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ　　ａ
ｎｄ　　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏ
ｌ．１２，　　Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ　　Ｆ．Ｃ．，　　
ｅｄ．），　　ｐ．１４１０，ＡＳＭ，　　Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ，　　１９８７）．これらの事実を結合する
と、対応するアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変異によ
って当該アミノ酸の過剰生産の可能性が生まれる。そし
て、この可能性は、当該アミノ酸の生合成酵素活性阻害
などの調節を解除することで実現されると考えられる。

【００１４】アミノ酸の過剰生産の目的の実現のために
必要なアミノ酸生合成酵素遺伝子の高度発現は対応アミ
ノ酸を培地に通常量添加してもアミノ酸の要求性が充分
には抑制されない、アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素変
異によってのみ可能となる。これらの変異は、対応アミ
ノ酸非要求性の親株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジンで処理する様な伝統的変異誘導法に
より誘導され得るであろう。目的変異株のスクリーニン
グは、対応アミノ酸高濃度（３−１０ｍｇ／ｍｌ）添加
培地で緩慢に生育し、無添加培地もしくは通常量の対応
アミノ酸添加培地には生育しない栄養要求株を選ぶこと
により行われる。このスクリーニング法でによってアミ
ノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性低下変異株のみが得ら
れる、というのは、対応アミノ酸生合成経路をブロック
された変異株の生育は培地へのアミノ酸の低濃度（０．
００５−０．０５ｍｇ／ｍｌ）添加で回復され得るから
である。

【００１５】この変異株を更に変異処理し、対応アミノ
酸無添加もしくは低濃度添加培地に生育する復帰変異株
を選ぶことにより、細胞内関連アミノ酸生成濃度が増大
した変異株を得ることが出来る。ここで言う復帰変異株
とは、当初起こった変異が原形に復するような変異が起
こったものではなく、他の遺伝子などＤＮＡ上の別の場
所に生じた変異が、当初の変異による傷害を修復したと
いう場合の復帰変異株をいい、擬復帰変異株とも言われ
るものである。この方法によって、アミノ酸の大量生産
に係わる多種類の遺伝子レベルでの変異を誘導すること
ができ、変異株の選択を繰り返すことによりアミノ酸高
生産株が得られるのである。復帰変異株が、なおアミノ
アシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性の低下の状態にあること
は、アテニュエーションの除去などそのアミノ酸の高生
産性に役だっているわけである。以上の様にして、有用
なアミノ酸生産株を育種することができる。　　更に言
えば、アナログ非感受性変異などの既知の変異と、上述
のアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性低下変異と、も
しくは更に（擬）復帰変異をも加えた上で、これらの変
異を形質転換法、形質導入法、接合法、あるいは、プロ
トプラスト融合法等で組み合わせてアミノ酸生産性を向
上せしめることが可能である。変異を集合する手段とし
て、組換えＤＮＡ技法を適用することも可能である。本
発明によって、エシェリヒア（Ｅｓｈｅ−ｒｉｃｈｉａ
）属細菌人工変異株を使用する既知の方法よりも高収率
でＶａｌ及びＩｌｅを生産する変異株が育種されたので
ある。

【００１６】以上、本発明について説明したが、実施例
において更に詳細に説明する。

【００１７】

【実施例】

【００１８】

【実施例１】 １、高濃度Ｉｌｅ要求性変異株の採取

【００１９】Ｅ．ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　Ｗ３３５０株
をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
で処理し、Ｉｌｅ　　１０ｍｇ／ｍｌ存在下、３７℃、
２４時間振とう培養した。細胞を洗い、グルコース０．
２％含有最少培地に懸濁し、３７℃でインキュベートし
た。吸光度　　５９０ｎｍ（Ａ５９０）の濁度で測定し
て２倍に生育した時点で、ペニシリン　　Ｇ　　を２０
００　　ｕｎｉｔｓ／ｍｌになるように添加し、３７゜
Ｃ、３時間インキュベート後、細胞を洗い、グルコース
　　０．２％及び　　Ｉｌｅ　　１０ｍｇ／ｍｌ含有最
少寒天培地にスプレッドした。その後常法により、Ｉｌ
ｅ高濃度含有培地生育可能Ｉｌｅ要求変異株を採取した
。この様にして、それぞれ独立にＩｌｅＳ２，　　Ｉｌ
ｅＳ１７，　　及び、　　ＩｌｅＳ３２の３株を分離し
た。表１に、種々のＩｌｅ濃度の最少培地にて１８時間
培養したＩｌｅ要求変異株の生育度（５９０　　ｎｍ　
　における吸光度、　　Ａ５９０）を示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】一般的な、アミノ酸生合成経路がブロック
されたタイプのＩｌｅ要求変異株ＶＬ３３０（ｉｌｖＡ
、　　スレオニン　　デアミナーゼ遺伝子）は、Ｉｌｅ
０．０５ｍｇ／ｍｌ含有培地で、最大生育に達している
。変異株ＩｌｅＳ２，ＩｌｅＳ１７，　　ＩｌｅＳ３２
は、生育に、遥かに高濃度のＩｌｅを要求している。更
に、変異株ＩｌｅＳ１７は、Ｉｌｅ　　５ｍｇ／ｍｌ含
有培地においても、なお、不充分な生育を示している。

【００２２】遺伝解析の結果、ＩｌｅＳシリーズのＩｌ
ｅ要求性変異は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上、スレオニンオ
ペロンとロイシンオペロンの間で、イソロイシルｔ−Ｒ
ＮＡ合成酵素遺伝子のある場所にマッピングされた。さ
らに常法により測定したＩｌｅＳ２及びＩｌｅＳ１７の
イソロイシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性は、各々、親株Ｅ
．ｃｏｌｉ　　Ｗ３３５０株の活性の４３％及び３７％
と低い値を示した。

【００２３】２、高Ｖａｌ要求性変異株の採取

【００２
４】Ｗ３３５０株から誘導したＥ．ｃｏｌｉ　　ＶＬ１
５０２（ＶａｌＲ，　　ｐｙｒＢ：：Ｔｎ５）、をＮ−
メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理し
、Ｖａｌ　　１０ｍｇ／ｍｌ存在下、３７℃、３０時間
通気培養した。ついで既述のペニシリン濃縮を２回施し
た後、Ｖａｌ要求変異株を採取した。調べたコロニーの
約２０％が、Ｖａｌ要求性であった。この様にして、そ
れぞれ独立の９株のＶａｌＳシリーズ変異株を分離した
。表２に、種々のＶａｌ濃度の最少培地にて２０時間培
養した３株のＶａｌＳシリーズ変異株の生育度（５９０
　　ｎｍ　　での吸光度、　　Ａ５９０）を示す。

【００２５】

【表２】

【００２６】ＶａｌＳシリーズＶａｌ要求性変異は、す
べて、ｐｙｒＢ：：Ｔｎ５をマーカーとするＰ１ファー
ジ形質導入で、高頻度（８２−９６％）に形質導入され
た。本結果は、ＶａｌＳ変異がマップされている同じ遺
伝子位置に，Ｖａｌ要求性変異が存在することを示して
いる。数種のＶａｌＳ変異株につき、常法によりバリル
ｔ−ＲＮＡ合成酵素活性を測定したところ、その数値は
減少しており、ＶａｌＳ５２株のバリルｔ−ＲＮＡ合成
酵素活性は親株の１６％にしか過ぎなかった。この様に
して、上述の方法を用いることにより、アミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素活性が低下した変異株を容易に得るこ
とができる。

【００２７】３、ＩｌｅＳ１７変異株中のグアノシン−
４−リン酸（ｐｐＧｐｐ）濃度の測定

【００２８】対応アミノ酸飢餓培養の期間、ＩｌｅＳ変
異株、及び、ＶａｌＳ変異株では、対応アミノアシルｔ
−ＲＮＡ合成酵素活性が弱いために、イソロイシルｔ−
ＲＮＡ濃度、或は、バリルｔ−ＲＮＡ濃度が減少するも
のと考えられる。その結果、ｐｐＧｐｐ生成が増加して
いるに違いない。それ故、Ｉｌｅ含有最少培地で生育し
た親株Ｗ３３５０と変異株ＩｌｅＳ１７の細胞内ｐｐＧ
ｐｐ濃度を常法により測定した。

【００２９】

【表３】

【００３０】表３の結果の中で、変異株ＩｌｅＳ１７の
ｐｐＧｐｐ濃度は、同一条件で生育した親株Ｗ３３５０
のｐｐＧｐｐ濃度の４倍である。更に、ｐｐＧｐｐ濃度
は、生育培地のＩｌｅ濃度に依存している、すなわち、
Ｉｌｅ濃度が高くなるにつれて、ＩｌｅＳ１７細胞中の
ｐｐＧｐｐ濃度は低くなった。

【００３１】４、ＩｌｅＳシリーズ変異株のスレオニン
　　デアミナーゼ活性の測定

【００３２】Ｅ．ｃｏｌｉ株のＩｌｅ及びＶａｌ生産は
、ｉｌｖ−オペロンの発現量に依存するに違いない。 ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの作用発現に対するＩｌｅＳ
変異の効果を測定するために、Ｉｌｅ低濃度（０．０１
または０．０５ｍｇ／ｍｌ）添加、及び、高濃度（５．
２ｍｇ／ｍｌ）添加培地で生育させたＩｌｅＳシリーズ
変異株について、スレオニン　　デアミナーゼ（ｉｌｖ
Ａ）活性を、常法を用いて測定した（表４）。

【００３３】

【表４】

【００３４】表４に示した結果の中で、スレオニン　　
デアミナーゼ活性は、いずれのＩｌｅ添加濃度において
も、ＩｌｅＳシリーズ変異株の方が、親株Ｗ３３５０よ
り高かった。また、Ｉｌｅ　　５．２０ｍｇ／ｍｌ添加
培地で、変異株ＩｌｅＳ１７が最大のスレオニン　　デ
アミナーゼ活性（親株Ｗ３３５０の１４培）を示してい
る。

【００３５】

【実施例２】 １、ＩｌｅＳシリーズ変異株よりのＩｌｅ生産性復帰変
異株の採取

【００３６】ＩｌｅＳ２、　　ＩｌｅＳ１７　　ａｎｄ
　　ＩｌｅＳ３２をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン処理し、グルコース　　０．２％添加
　　またはグルコース　　０．２％　　と　　Ｔｈｒ　
　３ｍｇ／ｍｌ添加最小培地プレートにスプレッドし、
４８〜７２時間培養した。出現した復帰変異株について
、培地へのＩｌｅ分泌能、及びＩｌｅ要求（ｉｌｖＡ）
変異株を用いるハロー生成能（表５）を調べた。

【００３７】

【表５】

【００３８】この様にして、ＩｌｅＳシリーズ変異株を
用いることによりＩｌｅ生産性変異株が、容易に得られ
る。

【００３９】Ｉｌｅ生産性復帰変異株について、スレオ
ニン　　デアミナーゼ活性、及び最終生産物Ｉｌｅによ
る当該活性阻害を測定した。殆どのＩｌｅ生産性復帰変
異株のスレオニンデアミナーゼは、１ｍＭ　　Ｉｌｅに
よって阻害されなかった。更に、Ｉｌｅ生産復帰変異株
Ｒｅｖ７４３４（ＩｌｅＳ２からの誘導株）のスレオニ
ンデアミナーゼは、最終生産物に対し全く非感受性であ
った。Ｒｅｖ７４３４株についての遺伝解析、及びＤＮ
Ａシーケンス分析の結果、その最終生産物による阻害の
完全な解除の変異は、スレオニン　　デアミナーゼをコ
ードしているｉｌｖＡ遺伝子内で起こっていることがわ
かった（ｉｌｖＡ　　ｍｕｔａｔｉｏｎ）。

【００４０】２、ＶａｌＲ，　　ｉｌｖＡ７４３４，及
びｉｌｅＳ１７変異をもつＩｌｅ生産株の育種

【００４
１】Ｒｅｖ７４３４株は他のＥ．ｃｏｌｉ　　Ｋ１２株
と同じく、ｉｌｖＧＭＥＤＡ　　オペロンの発現を減少
させる作用を示す変異をｉｌｖＧ遺伝子に受けている。 この損傷を除くために、Ｒｅｖ７４３４株からＶａｌ耐
性変異株を、グルコース　　０．２％　　及び　　Ｖａ
ｌ　　１ｍｇ／ｍｌ添加寒天培地にスプレッドすること
により採取した。この様にして、ｉｌｖＧＭＥＤＡ　　
オペロンに存在するＶａｌ耐性関与遺伝子においてあら
たに変異が起こったＶａｌＲ株ＶＬ１８８６を得た。Ｖ
Ｌ１８８６株で増殖させたファージＰ１を用いて、ＶＬ
３３４株（ｔｈｒＣｉｌｖＡ）へ形質導入した。グルコ
ース　　０．２％　　及び　　Ｔｈｒ　　０．０５ｍｇ
／ｍｌ添加最少培地でＩｌｅ＋　　形質導入株を採取し
た。その９０％以上が、Ｖａｌ耐性株で、Ｉｌｅによる
スレオニン　　デアミナーゼ阻害に対し非感受性であっ
た。この様にして、ＶＬ１８８７（ｔｈｒＣ　　ｉｌｖ
Ａ７４３４　　ｖａｌＲ）を得た。次いでＩｌｅＳ１７
で増殖させたファージＰ１をＶＬ１８８７株への形質導
入に使用した。グルコース添加最少培地にて、Ｔｈｒ＋
形質導入株を採取した。その５０％が緩慢な生育を示し
、Ｉｌｅ添加により生育が促進された。これらの株は、
いずれも、ＩｌｅＳ変異を受けとった形質導入株であっ
た。この様にして、ｖａｌＲ，ｉｌｖＡ７４３４，及び
ＩｌｅＳ１７変異を同時にもっている変異株ＶＬ１８９
２株を得た。この株は、Ｉｌｅ非感受性スレオニン　　
デアミナーゼを有し、活性もＲｅｖ７４３４の場合より
６−１０倍高い値を示した。ハロー形成法により、ＶＬ
１８９２株のＩｌｅ生産性が明かになった。

【００４２】３、低コピープラスミドを用いることによ
るｉｌｖ−オペロンを有するＩｌｅ生産株の育種

【００
４３】ＡＢ１２０６株は低コピープラスミドＦ’１４を
宿し、Ｆ’１４上にはｉｌｖ−オペロンの染色体フラグ
メントが存在し、同時に対応する染色体上の遺伝子を欠
損している。ＶＬ１８８６で増殖させたファージＰ１を
、ＡＢ１２０６株の形質導入に使用した。グルコース　
　０．２％　　及び　　Ｖａｌ　　１ｍｇ／ｍｌ添加最
少培地で形質導入株を採取した。この様にしてｖａｌＲ
変異、及びｉｌｖ７４３４変異（常法によるスレオニン
　　デアミナーゼ活性測定で立証された）をもっている
Ｆ’１４プラスミドを有する株ＫＸ１３９を得た。この
プラスミドは、接合によって、多種類のＥ．ｃｏｌｉ株
中に、具体的には、ＩｌｅＳ１７に、移行され得る。然
しながら、ｒｅｃＡ＋株中では、高頻度の染色体への挿
入が原因で、このＦ’１４プラスミドは不安定である。 それ故、ｒｅｃＡ変異を、ＮＫ６６５９（Ｈｆｒ　　Ｋ
Ｌ１６　　ｓｒｌ：：Ｔｎ１０　　ｒｅｃＡ）株から通
常の接合法を用いて導入した。組換え株は、テトラサイ
クリン　　０．０１ｍｇ／ｍｌ添加　　Ｌ−ｂｒｏｔｈ
寒天培地上で採取し、当該株中、ＵＶ感受性ＩｌｅＳ株
を選択した。 この様にして、遺伝子型がｉｌｅＳ１７　　ｒｅｃＡを
有する変異株ＫＸ１４０を採取した。接合により、ＫＸ
１４０細胞中に、プラスミドＦ’１４（ｖａｌＲｉｌｖ
Ａ７４３４）を挿入してＫＸ１４１株を育種した。ハロ
ー形成法により、当該株のＩｌｅ生産性が示された。

【００４４】４、Ｉｌｅ新生産菌株を用いたＩｌｅ生産

【００４５】Ｅ．ｃｏｌｉ　　ＶＬ１８９２株　　及び
　　ＫＸ１４１株を、Ｍ９寒天培地で培養したのち、５
０ｍｌのＬ−ブロス（ペプトン　　１０ｇ／ｌ，酵母エ
キス　　５ｇ／ｌ，グルコース　　１ｇ／ｌ及び塩化ナ
トリウム　　５ｇ／ｌ，　　ｐＨ７．２）含有エーレン
マイヤーフラスコに、白金耳にて接種した。フラスコを
、回転シェーカーに架けて、２００　　ｒ．ｐ．ｍ．、
３７℃，１８時間培養し、シード培養液を得た。グルコ
ース　　３０ｇ／ｌ，　　硫酸アンモニウム　　５ｇ／
ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　
０．４ｇ／ｌ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．０２ｇ／
ｌ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　　０．０２ｇ／ｌ，酵母エ
キス　　０．２ｇ／ｌ，及びＴｈｒ　　１ｇ／ｌ含有メ
イン培地を調製した。３００ｍｌの培地を、５００ｍｌ
容ジャーファーメンターに注入し、１２１℃，１５分殺
菌した。３０ｍｌの上記のシード培養液を接種し、９０
０ｒ．ｐ．ｍ．回転、１：１／ｍｉｎ通気して　　培養
した。培養ｐＨを約７．２に、ｐＨモニター指示により
、自動的に、　　１０％−Ｔｈｒ，　　６０％−グルコ
ース，及び２５％−ＮＨ４ＯＨ（１０：７：１）混合液
をフィードすることにより、制御した。 ４６時間培養後のＶＬ１８９２株培養液、及び、ＫＸ１
４１培養液中のＩｌｅ蓄積濃度は、それぞれ、８−１３
ｇ／ｌ，および、１１−１７．８ｇ／ｌであった。　　
ＫＸ１４１株はブタペスト条約で認められているソ連の
Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ
　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓ　　ｉｎ　　ＶＮＩＩＧＥＮＥＮＴＩＫＡにＶＫ
ＰＭ　　Ｂ−４７８１として寄託されている。

【００４６】

【実施例３】 １、Ｖａｌ生産ＩｌｅＳ３２　　ＶａｌＲ復帰変異株の
採取

【００４７】Ｖａｌ生産株採取のため、ＩｌｅＳ及び　
　ＶａｌＲ（ｉｌｖＧ）の変異を受けた菌株の育種を試
みた。　　先ずＶａｌＲ（ｉｌｖＧ）変異により、Ｅ．
ｃｏｌｉＫ１２株が本来欠損している、Ｖａｌ生合成路
のキイ酵素のひとつであるＶａｌ非感受性アセトヒドロ
キシ酸合成酵素ＩＩを回復させた。ファージＰ１媒介の
形質導入によって、Ｃ６００　　ＶａｌＲ（Ｖａｌ　　
１ｍｇ／ｍｌに耐性）株からＶａｌＲ変異形質を、また
、ＩｌｅＳ３２株からｉｌｅＳ３２変異を、ＶＬ３３４
（ｔｈｒＣ　　ｉｌｖＡ）株の染色体中に導入した。グ
ルコース　　０．２％及びＶａｌ　　２ｍｇ／ｍｌ含有
Ｍ９寒天培地で、ｖａｌＲ形質導入株を採取し、またＩ
ｌｅ　　２ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９寒天培地で、Ｔｈｒ＋，
ＩｌｅＳ形質導入株を採取した。

【００４８】この様にして、ＩｌｅＳ３２　　ＶａｌＲ
株を育種した。次いで、当該株のＩｌｅ非要求性復帰変
異株を、Ｉｌｅ無含有Ｍ９培地にプレートすることによ
り選択した。本プレートに生育したコロニーについて、
Ｉｌｅ　　０．０５ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９最少寒天培地で
のＩｌｅ及びＶａｌ要求性のＥ．ｃｏｌｉを用いてハロ
ー形成能を調べた。この様にして、Ｖａｌを分泌するＲ
ｅｖ８３５，　　Ｒｅｖ８３９　　ａｎｄ　　Ｒｅｖ８
７４を採取した。ファージＰ１による形質導入によって
、これら復帰変異株が、他のＥ．ｃｏｌｉ株に移行させ
得るｉｌｅＳ変異を保持していることが判った。

【００４９】２、栄養要求復帰変異株を用いるＶａｌ生
産

【００５０】採取した変異株のＶａｌ生産能を試験管培
養で調べた。発酵培地組成は、グルコース　　５０ｇ／
ｌ，硫酸アンモニウム　　１０ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４　
　１ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．４ｇ／ｌ，
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．０２ｇ／ｌ，ＭｎＳＯ４
・５Ｈ２Ｏ　　０．０２ｇ／ｌ，及びＣａＣｏ３（別殺
菌）　　２０ｇ／ｌ，ｐＨ７．２であった。２０ｍｌ容
試験管に、３ｍｌの培地を注入し、被検株菌体を一白金
耳接種し、３７℃、４６時間培養した。　　表６に、発
酵ブロス上澄液中の、Ｖａｌ含量を示す。

【００５１】

【表６】

【００５２】３、Ｖａｌ高生産有用株の育種

【００５３
】Ｖａｌ生産株を改良するために、またＶａｌ生産に対
しｉｌｅＳ変異が果たす役割を明らかにするために、Ｒ
ｅｖ８７４株をもとに、ＩｌｅＳ＋株及びＩｌｅＳ−株
を採取した。ＤＮＡ供与株ＮＫ６０６６（ｔｈｒ：：Ｔ
ｎ９）細胞に増殖させたファージＰ１を用い、Ｒｅｖ８
７４株の染色体中に　　ｔｈｒ：：Ｔｎ９を形質導入し
た。クロラムフェニコール　　１０μｇ／ｍｌ含有Ｌ−
ブロス寒天培地にて、形質導入株を採取した。 それらの中から、Ｉｌｅ無添加最少培地で迅速に生育す
る（ＩｌｅＳ＋）Ｔｈｒ要求株ＶＬ１９６６を得た。当
該株の細胞を、ＩｌｅＳ１７株で増殖させたファージＰ
１を用いて形質導入した。形質導入株は、グルコース　
　０．２％及びＩｌｅ　　２ｍｇ／ｍｌ含有Ｍ９最少培
地にて選択した。Ｔｈｒ＋形質導入株中から、ＶＬ１９
６８（ＩｌｅＳ＋）、及び、ＶＬ１９７０（ＩｌｅＳ１
７）の二株を得た。この二株とＲｅｖ８７４のＶａｌ生
産性を、前述の培養法を用いて調べた。生産性は、培養
液の吸光度に対するＶａｌ蓄積濃度の比率で計算した。 結果を、表７に示した。

【００５４】

【表７】

【００５５】表７から、ｉｌｅＳ変異が、Ｅ．ｃｏｌｉ
　　Ｖａｌ生産株のＶａｌ生産性を著しく増大すること
が判る。また、培地へのＩｌｅ添加で、僅かにしか生育
が回復されないｉｌｅＳ１７変異が、Ｖａｌ生産性をよ
り大幅に高めることが判る。Ｖａｌ生産改良株ＶＬ１９
７０が、Ｖａｌ生産に効果があるｉｌｖオペロンと、イ
ソロイシルｔ−ＲＮＡ合成酵素活性が低下したｉｌｅＳ
１７変異とを、組み合わせることにより育種出来たので
ある。

【００５６】４、Ｅ．ｃｏｌｉ新株ＶＬ１９７０を用い
るＶａｌ生産

【００５７】Ｅ．ｃｏｌｉ　　ＶＬ１９７０株を、シー
ド培地を注入したエーレンマイヤーフラスコにて３７℃
，１８時間，３００ｒ．ｐ．ｍ．で、回転培養した。シ
ード培地として、グルコース　　１％含有Ｍ９最少培地
を用いた。メイン培地として、グルコース　　３０ｇ／
ｌ，硫酸アンモニウム　　５ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４　　
２ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．４ｇ／ｌ，Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．０２ｇ／ｌ，ＭｎＳＯ４・
５Ｈ２Ｏ　　０．０２ｇ／ｌ，塩化ナトリウム　　０．
６ｇ／ｌ，及び酵母エキス　　０．２５ｇ／ｌ，ｐＨ７
．２、組成の培地を調製した。３００ｍｌのメイン培地
を５００ｍｌ容ジャー・ファーメンターに注入し、１２
１℃，１５分殺菌した。３０ｍｌの上記組成のシード培
養液を接種し、３７℃，９００ｒ．ｐ．ｍ．回転、１：
１／ｍｉｎ通気して、培養した。培養ｐＨを、約７．２
に、ｐＨ−モニター指示により、自動的に、５０％　　
ｇｌｕｃｏｓｅ及び２５％−ＮＨ４ＯＨ（６：１）混合
液をフィードすることにより制御した。４６時間培養し
たブロス中のＶａｌ濃度は、８．２−１０．６ｇ／ｌで
あり、組換えＤＮＡ法で育種したＥ．ｃｏｌｉの場合の
７倍であった。　　ＶＬ１９７０株はブタペスト条約で
認められているソ連のＡｌｌ−Ｕｎｉｏｎ　　Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　　ｉｎ　　ＶＮＩＩＧＥ
ＮＥＴＩＫＡにＶＫＰＭ　　Ｂ−４４１１として寄託さ
れている。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生産しようとするアミノ酸に対応するアミ
   ノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素遺伝子の変異であって、生
   育のために該アミノ酸の生合成経路が遮断された変異株
   の該アミノ酸の要求量以上の該アミノ酸の培地への添加
   を必要とするアミノ酸要求性変異と、該アミノ酸生合成
   の代謝制御変異とから成る、アミノ酸生産菌の育種方法
   。
2. 【請求項２】代謝制御変異株が、アミノアシルｔ−ＲＮ
   Ａ合成酵素遺伝子の変異株より復帰変異法を用いて得ら
   れるものである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】請求項１記載の方法により得られたイソロ
   イシン生産株。
4. 【請求項４】請求項１記載の方法により得られたバリン
   生産株。
5. 【請求項５】変異株が大腸菌である請求項３又は４記載
   の変異株。
6. 【請求項６】請求項３記載の変異株を栄養液体培地で培
   養し、培地中からＬ−イソロイシンを回収することを特
   徴とするＬ−イソロイシンの製造方法。
7. 【請求項７】請求項４記載の変異株を栄養液体培地で培
   養し、培地中からＬ−バリンを回収することを特徴とす
   るＬ−バリンの製造方法。