DE60207685T2 - Verfahren zur herstellung von l-threonin - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Produktion von L-Threonin, die Mikroorganismen involviert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin mit hoher Ausbeute, bei dem eine oder mehrere zusätzliche Kopien des Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gens und das Threonin-Operon in eine besondere Stelle der chromosomalen DNA eines Mikroorganismus insertiert werden, während sein eigenes ppc-Gen und Threonin-Operon bleiben, um die Expression des ppc-Gens, das für ein Enzym zur Umwandlung von Phosphoenolpyruvat in Oxaloacetat, das eine Threoninbiosynthesevorstufe ist, codiert, zu verstärken, und die Expression von Genen, die für Enzyme codieren, welche im Syntheseweg von Threonin aus Oxaloacetat beteiligt sind, z.B. AsparatokinaseI-Homoserindehydrogenase (thrA), Homoserinkinase (thrB) und Threoninsynthase (thrC).
  • Stand der Technik
  • L-Threonin, eine essentielle Aminosäure, wird in großem Umfang als Additiv für Tierfutter und Lebensmittel und als Fluide und synthetische Materialien zur medizinischen und pharmazeutischen Verwendung eingesetzt. L-Threonin wird durch Fermentation unter Verwendung synthetischer Mutanten produziert, die sich vom Wildtyp-Typ von Escherichia Coli, Corynebacterium, Serratia und Providencia ableiten. Von diesen Variantenstämmen ist bekannt, dass sie Aminosäureanaloga, gegenüber Pharmazeutika resistente Mutanten und gegen synthetische Pharmazeutika resistente Mutanten, die für Diaminopimelinsäure, Methionin, Lysin oder Isoleucin auxotroph gemacht wurden, umfassen (japanische Offenlegungsschrift Nr. hei 2-219582, Appl., Microbiolo. Biotechnol., 29, 550–553 (1988) und koreanische Patentpublikation Nr. 92-8365).
  • Ein allgemeiner Ansatz zur Erhöhung des Expressionslevels eines bestimmten Gens verwendet ein Plasmid, das eine höhere Kopienzahl bei einem Organismus ergibt, um so die Zahl von Genen in dem Mikroorganismus zu erhöhen (Sambrook et al., Molecular cloning, Zweite Ausgabe, 1989, 1.3–1.5). Ein Targetgen wird in ein Plasmid integriert und der Wirtsorganismus wird mit dem rekombinanten Plasmid transformiert, um eine Erhöhung bei der Zahl der Gene in dem Wirtsorganismus entsprechend der Kopienzahl in dem Plasmid zu bewirken. Ein Teilerfolg bei diesem Ansatztyp zur Verbesserung der Threoninproduktivität ist im U.S. Patent Nr. 5,538,873 beschrieben. Allerdings überexprimieren die meisten Technologien, die solche rekombinanten Plasmide einsetzen, ein bestimmtes Gen, was für den Wirtsmikroorganismus unerwünscht ist, und verursachen ein Problem der Plasmidinstabilität, so dass das Plasmid während einer Kultivierung des rekombinanten Stamms verloren geht.
  • Unter Hinwendung zu diesem Problem wurden Ansätze unter Zusatz von Antibiotika zu Kulturmedien oder die Verwendung eines Expressions-regulatorischen Plasmids vorgeschlagen (Sambrook et al., Molecular cloning, Zweite Ausgabe, 1989, 1.5–1.6 & 1.9–1.11). Bei der Ver wendung des Expressions-regulatorischen Plasmids zum Erhalt eines bestimmten Produktes wird eine Zellkultivierung unter Nicht-Expressionsbedingungen in der Wachstumsphase durchgeführt, um eine Belastung für den Wirtsorganismus zu reduzieren, und nach dem vollständigen Wachstum des Mikroorganismus wird eine temporäre Expression induziert. Allerdings zielen die meisten Expressions-regulatorischen Plasmide auf die Proteinsynthese ab. Die Herstellung von Primärmetaboliten steht in enger Verbindung mit dem Wachstum von Mikroorganismen, so dass es schwierig ist die Ausbeute der Primärmetaboliten in der Wachstumsstufe zu erhöhen, ohne dass Zielgene exprimiert werden. Die Produktion von Threonin, einem Primärmetaboliten, ist ein solcher Fall.
  • Als eine Anstrengung, diesen Nachteil zu kompensieren, wurde ein besonderes Threoninbiosynthesegen in eine chromosomale DNA eingebaut, um Threonin zu produzieren (U.S. Patent Nr. 5,939,307). Allerdings ersetzt dieser Ansatz ein chromosomales Gen durch ein mit einem induzierbaren Promotor substituiertes Gen, wobei kaum erwartet wird, dass die Expression des Threonin-Operongens deutlich erhöht wird.
  • Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung anders als bei dem herkömmlichen Substitutionsverfahren ein zusätzliches ppc-Gen und ein Threonin-Operon an eine bestimmte Stelle (lacZ-Gen) der chromosomalen DNA insertiert, während das ursprüngliche chromosomale Gen eines Wirtsorganismus erhalten bleibt, und haben festgestellt, dass dies duale Effekte als Resultat des ursprünglichen chromosomalen Gens und des insertierten ppc-Gens und Threonin-Operons bereitstellt. Die gängigsten gentechnologischen Techniken, die zur Erhöhung der Threoninausbeute angewendet werden, konzentrieren sich auf den Biosyntheseweg, der von Oxaloacetat ausgeht. Dagegen involviert die vorliegende Erfindung auch ppc, das ein Oxaloacetat-Inducer-Enzym ist, das in der vorangehenden Stufe wirkt, wie auch die Threoninbiosyntheseenzyme, um den Kohlenstofffluss von Phosphoenolpyruvat in den Oxaloacetatsyntheseweg zweckdienlich zu lenken. Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch eine Insertion von zwei oder mehr Genkopien, wenn dies erforderlich ist.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines L-Threonin-Herstellungsverfahrens mit hoher Ausbeute, das die Probleme der Plasmidinstabilität und der Inhibierung von mikrobiellem Wachstum, die mit rekombinantes Plasmid tragenden Stämmen entstehen, eliminiert und gleichzeitig die Expression des Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gens und des Threonin-Operons erhöht. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung eines Mikroorganismus gelöst, wobei eine Kopie oder mehrere Kopien von jedem, dem Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen und dem Threonin-Operon, zusätzlich in eine besondere Stelle der chromosomalen DNA des Mikroorganismus integriert werden, während sein eigenes Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen und sein eigenes Threonin-Operon bleiben.
  • Erfindungsgemäß werden durch Einbau von zwei oder mehr Kopien des ppc-Gens und des Threonin-Operons in die chromosomale DNA die Level der Expression des ppc-Gens, das für ein Enzym zur Umwandlung von Phosphoenolpyruvat in eine Threoninsynthesevorstufe, Oxaloacetat, codiert, und die Gene für Enzyme, die in die Threoninsynthese aus Oxaloacetat eingreifen, z.B. thrA (Aspartokinase-1-Homoserindehydrogenase), thrB (Homoserinkinase) und thrC (Threoninsynthase) erhöht.
  • Erfindungsgemäß kann ein beliebiger Mikroorganismus, der zur Produktion von L-Threonin fähig ist, einschließlich Escherichia Coli, Corynebacterium, Serratia und Providencia, verwendet werden, allerdings ist Escherichia Coli bevorzugter.
  • Es ist bevorzugt, dass das ppc-Gen und das Threonin-Operon, die zusätzlich in den Mikroorganismus insertiert werden, von einem Mikroorganismus stammen (synthetische Mutante), der gegenüber Threoninanaloga, Lysinanaloga, Isoleucinanaloga und Methioninanaloga resistent ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können das ppc-Gen und das Threonin-Operon zusätzlich in eine beliebige Stelle der chromosomalen DNA, außer in das ursprüngliche Threonin-Operon, vorzugsweise aber in die lacZ-Genstelle insertiert werden.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren zur L-Threonin-Produktion ist es vorteilhaft, dass ein aus dem Chromosom eines L-Threonin-produzierenden E. coli-Stamms, TF4076 (KFCC 10718), durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten wird, und ein Threonin-Operon, das aus demselben Chromosom cloniert wird, in das Chromosom des E. coli-Wirtsstamms TF4076 insertiert werden.
  • 1. Threonin-Operon und Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen
  • Das Threonin-Operon und das Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gen, die verwendet werden, wurden aus dem Chromosom von TF4075 (Eingangsnummer: KFCC10718, koreanische Patentanmeldung Nr. 90-22965) cloniert. Dieser Stamm ist für Methionin auxotroph und gegenüber Threoninanaloga (AHV: α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure), Lysinanaloga (AEC: S-(2-Aminoethyl)-L-cystein), Isoleucinanaloga (α-Aminobuttersäure) und Methioninanaloga (Ethionin) resistent.
  • 2. Integrationsvektor
  • pBRINT-TsGm, ein Plasmidvektor zur Verwendung bei der chromosomalen Integration, wurde verwendet (Sylvie Le Beatriz et al., 1998, pBRINT-Ts: A plasmid family with a temperature-sensitive replicon, designed for chromosomal integration into the lacZ gene of Escherichia coli; Gene., 223, S. 213–219). Dieser Vektor hat Temperaturempfindlichkeit; er integriert bei Kultivierung bei 37°C die clonierten Gene eines Plasmids in eine Stelle des lacZ-Gens der chromosomalen DNA, wohingegen die restlichen Plasmide in Plasma verloren gehen, wenn die Kultivierungstemperatur auf 44°C erhöht wird.
  • 3. Rekombinanter Vektor
  • Das ppc-Gen, das durch Polymerasekettenreaktion (PCR) aus dem Chromosom von TF4076 abgeleitet ist, und das Threonin-Operon, das von einem Vektor abgeleitet ist, der mit dem Threonin-Operon cloniert wurde, pAT94 (koreanische Patentanmeldung Nr. 92-24732), wurden in BamHI- und EcoRI-Stellen von pBRINT-TsGm cloniert, um einen rekombinanten Plasmidvektor, pGmTN-PPC, zu konstruieren. Der Stamm TF4076 wurde mit dem rekombinanten Plasmidvektor transformiert und dann bei 37°C kultiviert, um eine Integration des clonierten ppc-Gens und des Threonin-Operons in die Stelle des lacZ-Gens der chromosomalen DNA zu induzieren. Dann wurde die Kultivierung bei 44°C fortgesetzt, um die verbleibenden Plasmide im Wirtsstamm zu entfernen.
  • 4. Screeningverfahren
  • Kolonien, die gegenüber Gentamycin resistent und gegenüber Carbenicillin empfindlich sind, und weiß, nicht blau, in einem festen Medium, das X-gal und IPTG enthält, aussehen, wurden visuell auf rekombinante Stämme durchgemustert. Dieses Screeningsverfahren basiert auf dem Prinzip, dass eine Integration des ppc-Gens und des Threonin-Operons in das lacZ-Gen der chromosomalen DNA das lacZ-Gen inaktiviert, wobei es seine Fähigkeit, den Chromophor X-gal zu zersetzen, verliert.
  • Diese selektierten rekombinanten Stämme wurden bezüglich der Threoninproduktivität mit dem Wirtsstamm verglichen. Das Resultat war, dass der Wirtsstamm 20 g/l Threonin in 48 Stunden produzierte, wohingegen pGmTN-PPC (Eingangsnr.: KCCM-10236), einer der rekombinanten Stämme mit dem ppc-Gen und dem Threonin-Operon in die chromosomale DNA integriert, eine äußerst hohe Threoninproduktivität mit 27,0 g/l bei einer Ausbeute von etwa 35% (siehe Beispiel 4) zeigt. Der pGmTN-PPC-Stamm produziert 102 g/l Threonin durch Fermentation in einem 5 l-Fermentator, und zwar mit einer höheren Ausbeute von 35,4% als der Wirtsstamm (siehe Beispiel 5).
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Verfahren der Klonierung des Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gens; und
  • 2 zeigt die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids pGmTN-PPC, das mit dem ppc-Gen und dem Threonin-Operon cloniert wurde.
  • Bester Modus zur Durchführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter anhand der folgenden Beispiele beschrieben. Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sind nicht dazu bestimmt, den Rahmen der Erfindung zu begrenzen.
  • Beispiel 1: Klonierung des Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gens
  • In 1 ist das Verfahren zur Klonierung des Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gens dargestellt. Das ppc-Gen wurde aus einem Threonin-produzierenden Stamm, TF4076, erhalten. Chromosomale DNA wurde isoliert, mit dem Restriktionsenzym Sal I verdaut und einer Elektrophorese unterworfen, um selektiv 4–5 kb DNA-Fragmente zu isolieren. Das ppc-Gen wurde unter Verwendung der isolierten DNA-Fragmente als Matrizen und unter Verwendung von Primer 1 (5'-aggaattcttccgcagcatttgacgtcac-3') und Primer 2 (5'-aggaagcttttagccggtattacgcatacc-3') amplifiziert. Das amplifizierte Produkt wurde mit EcoR I und Hind III verdaut und erneut einer Elektrophorese unterworfen, um schließlich ein 2,8 kb ppc-Genfragment zu isolieren. Ein 7,6 kb pBRINT-TsGm, eine Art von pBRINT-Ts-Vektoren, von der National University of Mexico, wurde zur Klonierung verwendet (Sylvie Le Beatriz et al., 1998, pBRINT-Ts: A plasmid family with a temperature-sensitive replicon, designed for chromosomal integration into the lacZ gene of Escherichia coli; Gene., 223, S. 213–219). pBRINT-TsGm wurde mit denselben Restriktionsenzymen, EcoR I und Hind III, zweifach verdaut und mit dem isolierten ppc-Genfragment durch T4-DNA-Ligase ligiert. Der E. coli-Stamm DH5α wurde durch Elektroporation mit der ligierten DNA transformiert und auf festem LB-Medium [Hefeextrakt 5 g/l; Bactotrypton 10 g/l; Natriumchlorid 10 g/l; Bactoagar 1,7%, pH 7,0], das Antibiotika, 50 mg/l Carbenicillin und 5 mg/l Gentamycin, enthielt, kultiviert. Als Nächstes wurden Einzelkolonien gesammelt. Einzelkolonien wurden auf LB-Medium, das dieselben Antibiotika enthielt, kultiviert, um Plasmide aus den gewachsenen Stämmen zu isolieren. Die Größe jedes Plasmids wurde zunächst identifiziert und es wurde zweifach mit EcoR I und Hind III verdaut, um ein 2,8 kb DNA-Fragment zu isolieren. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden identifiziert, um die Konstruktion des rekombinanten Plasmids pGmPPC (10,7 kb), das das ppc-Gen enthält, zu vervollständigen.
  • Beispiel 2: Chromosomaler DNA-Integrationsvektor mit Threonin-Operon und ppc-Gen
  • Der rekombinante Plasmidvektor pAT94 (koreanische Patentanmeldung Nr. 92-24732), der durch Klonieren mit der chromosomalen DNA von TF4076 konstruiert worden war, wurde für das Threonin-Operon verwendet und das rekombinante Plasmid pGmPPC von Beispiel 1 wurde für das das ppc-Gen eingesetzt. pBRINT-TsGm, eine Art von pBRINT-Ts-Vektor, von der National University of Mexico, wurde als chromosomaler DNA-Integrationsvektor verwendet (Sylvie Le Beatriz et al., 1998, pBRINT-Ts: A plasmid family with a temperature-sensitive replicon, designed for chromosomal integration into the lacZ gene of Escherichia coli; Gene., 223, S. 213–219). Ein Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Plasmids ist in 2 dargestellt. pAT94 wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und BamH I zweifach verdaut und 6,4 kb Threonin-Operon-DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese aus dem doppelten Verdau isoliert. pGmPPC wurde zweifach mit Hind III und EcoR I verdaut, um 2,8 kb ppc-Gen-Fragmente zu isolieren. pBRINT-TsGm-Plasmidvektor wurde mit EcoR I und BamH I verdaut und vollständig verdaute DNA-Fragmente wurden durch dasselbe Verfahren isoliert. Der resultierende Plasmidvektorverdau, isolierte Threonin-Operon-DNA-Fragmente und ppc-Gen-Fragmente wurden vermischt und durch T4-DNA-Ligase ligiert. Der E. coli-Stamm DH5α wurde durch Elektroporation mit dem ligierten Produkt transformiert und auf festem LB-Medium [Hefeextrakt 5 g/l; Bactotrypton 10 g/l; Natriumchlorid 10 g/l; Bactoagar 1,7%; pH 7,0], das Antibiotika, 50 mg/l Carbenicillin und 5 mg/l Gentamycin enthielt, kultiviert. Als Nächstes wurden Einzelkolonien gesammelt. Einzelkolonien wurden auf LB-Medium, das dieselben Antibiotika enthielt, kultiviert, um Plasmide aus den gewachsenen Stämmen zu isolieren. Die Größe jedes Plasmids wurde zunächst identifiziert und es wurde ein doppelter Verdaut mit EcoR I und BamH I durchgeführt, um 9,2 kb- und 7,9 kb-DNA-Fragmente zu isolieren. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden identifiziert, um dadurch eine Konstruktion eines rekombinanten Plasmids, pGmTN-PPC (17,1 kb) zu vervollständigen, das das Threonin-Operon und das ppc-Gen enthielt.
  • Beispiel 3: Screening eines Stamms mit integriertem chromosomalen rekombinanten Plasmid
  • TF4076, ein Threonin-produzierender Stamm, wurde mit dem rekombinanten Plasmid pGmTN-PPC, das aus dem E. coli-Stamm DH5α isoliert worden war, transformiert, auf festem LB-Medium [Hefeextrakt 5 g/l; Bactotrypton 10 g/l; Natriumchlorid 10 g/l; Bactoagar 1,7%; pH 7,0], das 5 mg/l Gentamycin enthielt, kultiviert und bei 30°C 60 Stunden kultiviert. Jede Einzelkolonie wurde in 0,5 ml LB inokuliert und für 4 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein Aliquot der Kultur wurde in 10 ml LB transferiert, für 6 Stunden bei 30°C inkubiert und dann über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine 10–3-10–6-Verdünnung der Kultur wurde auf festes LB-Medium, das 5 mg/l Gentamycin enthielt, geimpft. Zu dieser Zeit wurden aus 12 μl IPTG (0,1M) und 60 μl X-gal (2%) auf das feste LB-Medium inokuliert. Nach 24 Stunden Inkubation bei 44°C wurden die rekombinanten Stämme nach weißen Kolonien, die gegenüber Carbenicillin empfindlich sind, durchgemustert, die nicht auf dem festen LB-Medium wachsen können, das 15 mg/l Carbenicillin enthält. Die durchgemusterten rekombinanten Stämme bestätigten das Vorliegen der erwarteten Plasmide, in denen das ppc-Gen und das Threonin-Operon in die lacZ-Gen-Stelle der chromosomalen DNA jedes Stamms integriert waren.
  • Beispiel 4: Vergleich der Threoninproduktivität bei Flaschenkultivierung rekombinanter Stämme
  • Dreißig Einzelkolonien der rekombinanten Stämme, mit rekombinanten Plasmiden in ihr Chromsom integriert, wurden auf Threoninproduktivitätsvergleiche unter Verwendung von Threonin-Titer-Medien in Erlenmeyer-Kolben durchgemustert. Die Zusammensetzung des Threonin-Titer-Mediums, das in jedem Fall verwendet wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Kolonien wurden auf festem LB-Medium über Nacht in einem 32°C-Inkubator kultiviert. 20 ml des Titer-Mediums wurden mit einer Schleifenfüllung jeder Kultur inokuliert und bei 32°C, 250 UpM, für 48 Stunden inkubiert. Die Resultate der Analyse sind in Tabelle 2 gezeigt. Alle dreißig Kolonien rekombinanter Stämme zeigen ausgezeichnete Produktivität einschließlich acht Kolonien, die 26 g/l oder mehr Threonin produzierten; im Vergleich dazu produzierte der Wirtsstamm TF4076 20 g/l Threonin. Der rekombinante Stamm, der die höchste Threoninproduktivität mit 27 g/l bei einer 35% höheren Ausbeute als der Wirtsstamm zeigte, wurde „pGmTN- PPC12" genannt. Der Stamm pGmTN-PPC12 wurde am 5. Januar 2001 bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC) hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer KCCM 10236.
  • Tabelle 1. Zusammensetzung des Threonin-Titer-Mediums
    Figure 00070001
  • Tabelle 2. Resultate des Kolben-Titer-Tests auf rekombinante Stämme
    Figure 00070002
  • Beispiel 5: Vergleich der Threoninproduktivität unter Verwendung eines Fermentators
  • Die Threoninproduktivität in einem Fermentator wurde zwischen dem rekombinanten Stamm pGmTN-PPC12, der wegen seines höchsten Threonin-Titers aus Beispiel 4 selektiert worden war, und dem Wirtsstamm TF4076 verglichen. Die Anfangs-Mediumzusammensetzung, die verwendet wurde, ist in Tabelle 3 gezeigt. LB-Medium, das außerdem pro Liter 10 g Glucose und 0,1 g L-Methionin enthielt, wurde für eine Impfkultur verwendet und ein Anfangsvolumen der Inokulation in einen Fermentator wurde bei 3–5 Vol.-% einer Zielanfangskultur bestimmt. Glucose wurde jedes Mal bei einer Endkonzentration von 5 Gew.-%, 6-mal insgesamt, zusammen mit KH2PO4 mit 1 Gew.-% zugesetzt. Hier wurde jede Glucosezugabe durch Glucosedeletion bestimmt. Das Anfangsvolumen der Kultur war 1,5 l und das Endvolumen der Kultur war 3,0 l. Die Gesamtkonzentration an Glucose, die während der Fermentation zugesetzt wurde, war 250 g/l. Während Fermentationen wurde das Medium mit 700–1000 UpM gerührt, die Temperatur wurde bei 32°C kontrolliert und der pH wurde mit 25–28%igem Ammoniakwasser auf 7,0 eingestellt. Die Luftströmungsgeschwindigkeit wurde auf 0,1 VVm eingestellt. Die Resultate sind in Tabelle 4 gezeigt. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, produziert der Wirtsstamm TF4076 75,3 g/l Threonin bei einer Ausbeute von 30,1%, bezogen auf den Glucoseverbrauch. Dagegen pro duziert der rekombinante Stamm pGmTN-PPC12 102 g/l Threonin bei einer Ausbeute von 40,8%, was 35,4% über dem Wert des Wirtsstamms TF4076 liegt.
  • Außerdem wurde bei dem Wirtsstamm ein ähnliches Fermentationsmuster wie bei dem rekombinanten Stamm ohne Verringerung des Zuckerverbrauchs während der Fermentation beobachtet, was oft bei rekombinanten Stämmen durch Wachstumsinhibierung auftritt.
  • Tabelle 3. Zusammensetzung des Anfangsmediums in einem 5 l-Fermentator
    Figure 00080001
  • Tabelle 4. Resultate der fermentativen Produktion von Threonin durch rekombinante Stämme
    Figure 00080002
  • Wie oben beschrieben wurde, werden erfindungsgemäß zwei oder mehrere ppc-Gene und Threonin-Operone in die chromosomale DNA eingeschlossen, um dadurch die Expression des ppc-Gens, welches für ein Enzym zur Umwandlung von Phosphoenolpyruvat in eine Threonin-Biosynthesevorstufe, Oxaloacetat, codiert, und der Gene, die für Enzyme codieren, welche im Syntheseweg von Threonin aus Oxaloacetat involviert sind, einschließlich thrA (AsparatokinaseI-Homoserin-Dehydrogenase), thrB (Homoserinkinase) und thrC (Threoninsynthase), zu verstärken. Die vorliegende Erfindung kann die Produktivität für L-Threonin gegenüber dem Wirtsstamm deutlich verbessern, nämlich um 35%.

Claims (7)

  1. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung eines Mikroorganismus, wobei eine Kopie oder mehrere Kopien von jedem, dem Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen und dem Threonin-Operon, zusätzlich in eine besondere Stelle der chromosomalen DNA des Mikroorganismus integriert werden, während sein eigenes Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen und sein eigenes Threonin-Operon bleiben.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen und das Threonin-Operon, die zusätzlich integriert werden sollen, von einem Mikroorganismus stammen, der gegenüber Threoninanaloga, Lysinanaloga, Isoleucinanaloga und Methioninanaloga resistent ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen und das Threonin-Operon zusätzlich in die lacZ-Gen-Stelle der chromosomalen DNA integriert werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen, das aus dem Chromosom eines Threoninproduzierenden E. coli-Stamms, TF4076, Eingangsnummer KFCC 10718, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten wurde, und das Threonin-Operon, das aus dem E. coli-Stamm cloniert wurde, in das Chromosom des Wirtsstamms E. coli TF4076 eingebaut werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus mit rekombinantem Plasmid pGmTN-PPC von 2 konstruiert wird.
  7. Escherichia-coli-Stamm pGmTN-PPC12 mit der Eingangsnummer KCCM 10236, der zur L-Threonin-Produktion fähig ist.
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