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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Produktion von L-Threonin,
die Mikroorganismen involviert. Die vorliegende Erfindung bezieht
sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin mit
hoher Ausbeute, bei dem eine oder mehrere zusätzliche Kopien des Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gens
und das Threonin-Operon in eine besondere Stelle der chromosomalen
DNA eines Mikroorganismus insertiert werden, während sein eigenes ppc-Gen
und Threonin-Operon bleiben, um die Expression des ppc-Gens, das
für ein
Enzym zur Umwandlung von Phosphoenolpyruvat in Oxaloacetat, das
eine Threoninbiosynthesevorstufe ist, codiert, zu verstärken, und
die Expression von Genen, die für
Enzyme codieren, welche im Syntheseweg von Threonin aus Oxaloacetat
beteiligt sind, z.B. AsparatokinaseI-Homoserindehydrogenase (thrA),
Homoserinkinase (thrB) und Threoninsynthase (thrC).
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Stand der Technik
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L-Threonin,
eine essentielle Aminosäure,
wird in großem
Umfang als Additiv für
Tierfutter und Lebensmittel und als Fluide und synthetische Materialien
zur medizinischen und pharmazeutischen Verwendung eingesetzt. L-Threonin
wird durch Fermentation unter Verwendung synthetischer Mutanten
produziert, die sich vom Wildtyp-Typ von Escherichia Coli, Corynebacterium,
Serratia und Providencia ableiten. Von diesen Variantenstämmen ist
bekannt, dass sie Aminosäureanaloga,
gegenüber
Pharmazeutika resistente Mutanten und gegen synthetische Pharmazeutika
resistente Mutanten, die für
Diaminopimelinsäure,
Methionin, Lysin oder Isoleucin auxotroph gemacht wurden, umfassen
(japanische Offenlegungsschrift Nr. hei 2-219582, Appl., Microbiolo.
Biotechnol., 29, 550–553
(1988) und koreanische Patentpublikation Nr. 92-8365).
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Ein
allgemeiner Ansatz zur Erhöhung
des Expressionslevels eines bestimmten Gens verwendet ein Plasmid,
das eine höhere
Kopienzahl bei einem Organismus ergibt, um so die Zahl von Genen
in dem Mikroorganismus zu erhöhen
(Sambrook et al., Molecular cloning, Zweite Ausgabe, 1989, 1.3–1.5). Ein
Targetgen wird in ein Plasmid integriert und der Wirtsorganismus
wird mit dem rekombinanten Plasmid transformiert, um eine Erhöhung bei
der Zahl der Gene in dem Wirtsorganismus entsprechend der Kopienzahl
in dem Plasmid zu bewirken. Ein Teilerfolg bei diesem Ansatztyp
zur Verbesserung der Threoninproduktivität ist im U.S. Patent Nr. 5,538,873
beschrieben. Allerdings überexprimieren
die meisten Technologien, die solche rekombinanten Plasmide einsetzen,
ein bestimmtes Gen, was für
den Wirtsmikroorganismus unerwünscht
ist, und verursachen ein Problem der Plasmidinstabilität, so dass
das Plasmid während
einer Kultivierung des rekombinanten Stamms verloren geht.
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Unter
Hinwendung zu diesem Problem wurden Ansätze unter Zusatz von Antibiotika
zu Kulturmedien oder die Verwendung eines Expressions-regulatorischen
Plasmids vorgeschlagen (Sambrook et al., Molecular cloning, Zweite
Ausgabe, 1989, 1.5–1.6 & 1.9–1.11).
Bei der Ver wendung des Expressions-regulatorischen Plasmids zum
Erhalt eines bestimmten Produktes wird eine Zellkultivierung unter
Nicht-Expressionsbedingungen in der Wachstumsphase durchgeführt, um
eine Belastung für
den Wirtsorganismus zu reduzieren, und nach dem vollständigen Wachstum
des Mikroorganismus wird eine temporäre Expression induziert. Allerdings zielen
die meisten Expressions-regulatorischen Plasmide auf die Proteinsynthese
ab. Die Herstellung von Primärmetaboliten
steht in enger Verbindung mit dem Wachstum von Mikroorganismen,
so dass es schwierig ist die Ausbeute der Primärmetaboliten in der Wachstumsstufe
zu erhöhen,
ohne dass Zielgene exprimiert werden. Die Produktion von Threonin,
einem Primärmetaboliten,
ist ein solcher Fall.
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Als
eine Anstrengung, diesen Nachteil zu kompensieren, wurde ein besonderes
Threoninbiosynthesegen in eine chromosomale DNA eingebaut, um Threonin
zu produzieren (U.S. Patent Nr. 5,939,307). Allerdings ersetzt dieser
Ansatz ein chromosomales Gen durch ein mit einem induzierbaren Promotor
substituiertes Gen, wobei kaum erwartet wird, dass die Expression
des Threonin-Operongens deutlich erhöht wird.
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Daher
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung anders als bei dem
herkömmlichen
Substitutionsverfahren ein zusätzliches
ppc-Gen und ein Threonin-Operon an eine bestimmte Stelle (lacZ-Gen)
der chromosomalen DNA insertiert, während das ursprüngliche
chromosomale Gen eines Wirtsorganismus erhalten bleibt, und haben
festgestellt, dass dies duale Effekte als Resultat des ursprünglichen
chromosomalen Gens und des insertierten ppc-Gens und Threonin-Operons bereitstellt.
Die gängigsten
gentechnologischen Techniken, die zur Erhöhung der Threoninausbeute angewendet
werden, konzentrieren sich auf den Biosyntheseweg, der von Oxaloacetat
ausgeht. Dagegen involviert die vorliegende Erfindung auch ppc,
das ein Oxaloacetat-Inducer-Enzym
ist, das in der vorangehenden Stufe wirkt, wie auch die Threoninbiosyntheseenzyme, um
den Kohlenstofffluss von Phosphoenolpyruvat in den Oxaloacetatsyntheseweg
zweckdienlich zu lenken. Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch
eine Insertion von zwei oder mehr Genkopien, wenn dies erforderlich
ist.
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Offenbarung der Erfindung
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Um
die oben beschriebenen Probleme zu lösen, besteht eine Aufgabe der
vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines L-Threonin-Herstellungsverfahrens
mit hoher Ausbeute, das die Probleme der Plasmidinstabilität und der
Inhibierung von mikrobiellem Wachstum, die mit rekombinantes Plasmid
tragenden Stämmen
entstehen, eliminiert und gleichzeitig die Expression des Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gens
und des Threonin-Operons erhöht.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren
zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung eines Mikroorganismus
gelöst,
wobei eine Kopie oder mehrere Kopien von jedem, dem Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen
und dem Threonin-Operon, zusätzlich
in eine besondere Stelle der chromosomalen DNA des Mikroorganismus
integriert werden, während sein
eigenes Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen und sein eigenes Threonin-Operon bleiben.
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Erfindungsgemäß werden
durch Einbau von zwei oder mehr Kopien des ppc-Gens und des Threonin-Operons
in die chromosomale DNA die Level der Expression des ppc-Gens, das
für ein
Enzym zur Umwandlung von Phosphoenolpyruvat in eine Threoninsynthesevorstufe,
Oxaloacetat, codiert, und die Gene für Enzyme, die in die Threoninsynthese
aus Oxaloacetat eingreifen, z.B. thrA (Aspartokinase-1-Homoserindehydrogenase),
thrB (Homoserinkinase) und thrC (Threoninsynthase) erhöht.
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Erfindungsgemäß kann ein
beliebiger Mikroorganismus, der zur Produktion von L-Threonin fähig ist, einschließlich Escherichia
Coli, Corynebacterium, Serratia und Providencia, verwendet werden,
allerdings ist Escherichia Coli bevorzugter.
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Es
ist bevorzugt, dass das ppc-Gen und das Threonin-Operon, die zusätzlich in
den Mikroorganismus insertiert werden, von einem Mikroorganismus
stammen (synthetische Mutante), der gegenüber Threoninanaloga, Lysinanaloga,
Isoleucinanaloga und Methioninanaloga resistent ist.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können
das ppc-Gen und das Threonin-Operon zusätzlich in eine beliebige Stelle
der chromosomalen DNA, außer
in das ursprüngliche
Threonin-Operon,
vorzugsweise aber in die lacZ-Genstelle insertiert werden.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren
zur L-Threonin-Produktion ist es vorteilhaft, dass ein aus dem Chromosom
eines L-Threonin-produzierenden E. coli-Stamms, TF4076 (KFCC 10718),
durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten wird, und ein Threonin-Operon,
das aus demselben Chromosom cloniert wird, in das Chromosom des
E. coli-Wirtsstamms TF4076 insertiert werden.
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1. Threonin-Operon und
Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen
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Das
Threonin-Operon und das Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gen,
die verwendet werden, wurden aus dem Chromosom von TF4075 (Eingangsnummer:
KFCC10718, koreanische Patentanmeldung Nr. 90-22965) cloniert. Dieser
Stamm ist für
Methionin auxotroph und gegenüber
Threoninanaloga (AHV: α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure), Lysinanaloga
(AEC: S-(2-Aminoethyl)-L-cystein),
Isoleucinanaloga (α-Aminobuttersäure) und
Methioninanaloga (Ethionin) resistent.
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2. Integrationsvektor
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pBRINT-TsGm,
ein Plasmidvektor zur Verwendung bei der chromosomalen Integration,
wurde verwendet (Sylvie Le Beatriz et al., 1998, pBRINT-Ts: A plasmid
family with a temperature-sensitive replicon, designed for chromosomal
integration into the lacZ gene of Escherichia coli; Gene., 223,
S. 213–219).
Dieser Vektor hat Temperaturempfindlichkeit; er integriert bei Kultivierung
bei 37°C
die clonierten Gene eines Plasmids in eine Stelle des lacZ-Gens
der chromosomalen DNA, wohingegen die restlichen Plasmide in Plasma
verloren gehen, wenn die Kultivierungstemperatur auf 44°C erhöht wird.
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3. Rekombinanter
Vektor
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Das
ppc-Gen, das durch Polymerasekettenreaktion (PCR) aus dem Chromosom
von TF4076 abgeleitet ist, und das Threonin-Operon, das von einem
Vektor abgeleitet ist, der mit dem Threonin-Operon cloniert wurde,
pAT94 (koreanische Patentanmeldung Nr. 92-24732), wurden in BamHI-
und EcoRI-Stellen von pBRINT-TsGm cloniert, um einen rekombinanten
Plasmidvektor, pGmTN-PPC, zu konstruieren. Der Stamm TF4076 wurde
mit dem rekombinanten Plasmidvektor transformiert und dann bei 37°C kultiviert,
um eine Integration des clonierten ppc-Gens und des Threonin-Operons
in die Stelle des lacZ-Gens der chromosomalen DNA zu induzieren.
Dann wurde die Kultivierung bei 44°C fortgesetzt, um die verbleibenden
Plasmide im Wirtsstamm zu entfernen.
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4. Screeningverfahren
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Kolonien,
die gegenüber
Gentamycin resistent und gegenüber
Carbenicillin empfindlich sind, und weiß, nicht blau, in einem festen
Medium, das X-gal und IPTG enthält,
aussehen, wurden visuell auf rekombinante Stämme durchgemustert. Dieses
Screeningsverfahren basiert auf dem Prinzip, dass eine Integration des
ppc-Gens und des Threonin-Operons in das lacZ-Gen der chromosomalen
DNA das lacZ-Gen inaktiviert, wobei es seine Fähigkeit, den Chromophor X-gal zu zersetzen,
verliert.
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Diese
selektierten rekombinanten Stämme
wurden bezüglich
der Threoninproduktivität
mit dem Wirtsstamm verglichen. Das Resultat war, dass der Wirtsstamm
20 g/l Threonin in 48 Stunden produzierte, wohingegen pGmTN-PPC
(Eingangsnr.: KCCM-10236), einer der rekombinanten Stämme mit
dem ppc-Gen und dem Threonin-Operon in die chromosomale DNA integriert,
eine äußerst hohe
Threoninproduktivität
mit 27,0 g/l bei einer Ausbeute von etwa 35% (siehe Beispiel 4)
zeigt. Der pGmTN-PPC-Stamm produziert 102 g/l Threonin durch Fermentation
in einem 5 l-Fermentator, und zwar mit einer höheren Ausbeute von 35,4% als
der Wirtsstamm (siehe Beispiel 5).
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
ein Verfahren der Klonierung des Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gens; und
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2 zeigt
die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids pGmTN-PPC, das mit
dem ppc-Gen und dem Threonin-Operon cloniert wurde.
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Bester Modus zur Durchführung der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird nun detaillierter anhand der folgenden
Beispiele beschrieben. Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung
und sind nicht dazu bestimmt, den Rahmen der Erfindung zu begrenzen.
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Beispiel 1: Klonierung
des Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gens
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In 1 ist
das Verfahren zur Klonierung des Phosphoenolpyruvatcarboxylase(ppc)-Gens dargestellt. Das
ppc-Gen wurde aus einem Threonin-produzierenden Stamm, TF4076, erhalten.
Chromosomale DNA wurde isoliert, mit dem Restriktionsenzym Sal I
verdaut und einer Elektrophorese unterworfen, um selektiv 4–5 kb DNA-Fragmente
zu isolieren. Das ppc-Gen wurde unter Verwendung der isolierten
DNA-Fragmente als Matrizen und unter Verwendung von Primer 1 (5'-aggaattcttccgcagcatttgacgtcac-3') und Primer 2 (5'-aggaagcttttagccggtattacgcatacc-3') amplifiziert. Das
amplifizierte Produkt wurde mit EcoR I und Hind III verdaut und
erneut einer Elektrophorese unterworfen, um schließlich ein
2,8 kb ppc-Genfragment zu isolieren. Ein 7,6 kb pBRINT-TsGm, eine
Art von pBRINT-Ts-Vektoren, von der National University of Mexico,
wurde zur Klonierung verwendet (Sylvie Le Beatriz et al., 1998,
pBRINT-Ts: A plasmid family with a temperature-sensitive replicon, designed
for chromosomal integration into the lacZ gene of Escherichia coli;
Gene., 223, S. 213–219). pBRINT-TsGm
wurde mit denselben Restriktionsenzymen, EcoR I und Hind III, zweifach
verdaut und mit dem isolierten ppc-Genfragment durch T4-DNA-Ligase
ligiert. Der E. coli-Stamm DH5α wurde
durch Elektroporation mit der ligierten DNA transformiert und auf
festem LB-Medium
[Hefeextrakt 5 g/l; Bactotrypton 10 g/l; Natriumchlorid 10 g/l;
Bactoagar 1,7%, pH 7,0], das Antibiotika, 50 mg/l Carbenicillin
und 5 mg/l Gentamycin, enthielt, kultiviert. Als Nächstes wurden
Einzelkolonien gesammelt. Einzelkolonien wurden auf LB-Medium, das
dieselben Antibiotika enthielt, kultiviert, um Plasmide aus den
gewachsenen Stämmen
zu isolieren. Die Größe jedes Plasmids
wurde zunächst
identifiziert und es wurde zweifach mit EcoR I und Hind III verdaut,
um ein 2,8 kb DNA-Fragment zu isolieren. Die resultierenden DNA-Fragmente
wurden identifiziert, um die Konstruktion des rekombinanten Plasmids
pGmPPC (10,7 kb), das das ppc-Gen enthält, zu vervollständigen.
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Beispiel 2: Chromosomaler
DNA-Integrationsvektor mit Threonin-Operon und ppc-Gen
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Der
rekombinante Plasmidvektor pAT94 (koreanische Patentanmeldung Nr.
92-24732), der durch Klonieren mit der chromosomalen DNA von TF4076
konstruiert worden war, wurde für
das Threonin-Operon verwendet und das rekombinante Plasmid pGmPPC
von Beispiel 1 wurde für
das das ppc-Gen eingesetzt. pBRINT-TsGm, eine Art von pBRINT-Ts-Vektor,
von der National University of Mexico, wurde als chromosomaler DNA-Integrationsvektor
verwendet (Sylvie Le Beatriz et al., 1998, pBRINT-Ts: A plasmid
family with a temperature-sensitive replicon, designed for chromosomal
integration into the lacZ gene of Escherichia coli; Gene., 223,
S. 213–219).
Ein Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Plasmids ist
in 2 dargestellt. pAT94 wurde mit den Restriktionsenzymen
Hind III und BamH I zweifach verdaut und 6,4 kb Threonin-Operon-DNA-Fragmente
wurden durch Elektrophorese aus dem doppelten Verdau isoliert. pGmPPC
wurde zweifach mit Hind III und EcoR I verdaut, um 2,8 kb ppc-Gen-Fragmente zu isolieren.
pBRINT-TsGm-Plasmidvektor wurde mit EcoR I und BamH I verdaut und
vollständig
verdaute DNA-Fragmente wurden durch dasselbe Verfahren isoliert.
Der resultierende Plasmidvektorverdau, isolierte Threonin-Operon-DNA-Fragmente
und ppc-Gen-Fragmente
wurden vermischt und durch T4-DNA-Ligase ligiert. Der E. coli-Stamm
DH5α wurde
durch Elektroporation mit dem ligierten Produkt transformiert und
auf festem LB-Medium [Hefeextrakt 5 g/l; Bactotrypton 10 g/l; Natriumchlorid
10 g/l; Bactoagar 1,7%; pH 7,0], das Antibiotika, 50 mg/l Carbenicillin
und 5 mg/l Gentamycin enthielt, kultiviert. Als Nächstes wurden
Einzelkolonien gesammelt. Einzelkolonien wurden auf LB-Medium, das
dieselben Antibiotika enthielt, kultiviert, um Plasmide aus den
gewachsenen Stämmen
zu isolieren. Die Größe jedes
Plasmids wurde zunächst
identifiziert und es wurde ein doppelter Verdaut mit EcoR I und
BamH I durchgeführt,
um 9,2 kb- und 7,9 kb-DNA-Fragmente zu isolieren. Die resultierenden
DNA-Fragmente wurden identifiziert, um dadurch eine Konstruktion
eines rekombinanten Plasmids, pGmTN-PPC (17,1 kb) zu vervollständigen,
das das Threonin-Operon und das ppc-Gen enthielt.
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Beispiel 3: Screening
eines Stamms mit integriertem chromosomalen rekombinanten Plasmid
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TF4076,
ein Threonin-produzierender Stamm, wurde mit dem rekombinanten Plasmid
pGmTN-PPC, das aus dem E. coli-Stamm DH5α isoliert worden war, transformiert,
auf festem LB-Medium [Hefeextrakt 5 g/l; Bactotrypton 10 g/l; Natriumchlorid
10 g/l; Bactoagar 1,7%; pH 7,0], das 5 mg/l Gentamycin enthielt,
kultiviert und bei 30°C
60 Stunden kultiviert. Jede Einzelkolonie wurde in 0,5 ml LB inokuliert
und für
4 Stunden bei 30°C inkubiert.
Ein Aliquot der Kultur wurde in 10 ml LB transferiert, für 6 Stunden
bei 30°C
inkubiert und dann über Nacht
bei 37°C
inkubiert. Eine 10–3-10–6-Verdünnung der
Kultur wurde auf festes LB-Medium, das 5 mg/l Gentamycin enthielt,
geimpft. Zu dieser Zeit wurden aus 12 μl IPTG (0,1M) und 60 μl X-gal (2%)
auf das feste LB-Medium inokuliert. Nach 24 Stunden Inkubation bei
44°C wurden
die rekombinanten Stämme
nach weißen Kolonien,
die gegenüber
Carbenicillin empfindlich sind, durchgemustert, die nicht auf dem
festen LB-Medium wachsen können,
das 15 mg/l Carbenicillin enthält.
Die durchgemusterten rekombinanten Stämme bestätigten das Vorliegen der erwarteten
Plasmide, in denen das ppc-Gen und das Threonin-Operon in die lacZ-Gen-Stelle
der chromosomalen DNA jedes Stamms integriert waren.
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Beispiel 4: Vergleich
der Threoninproduktivität
bei Flaschenkultivierung rekombinanter Stämme
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Dreißig Einzelkolonien
der rekombinanten Stämme,
mit rekombinanten Plasmiden in ihr Chromsom integriert, wurden auf
Threoninproduktivitätsvergleiche
unter Verwendung von Threonin-Titer-Medien in Erlenmeyer-Kolben
durchgemustert. Die Zusammensetzung des Threonin-Titer-Mediums,
das in jedem Fall verwendet wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt. Die
Kolonien wurden auf festem LB-Medium über Nacht in einem 32°C-Inkubator
kultiviert. 20 ml des Titer-Mediums wurden mit einer Schleifenfüllung jeder
Kultur inokuliert und bei 32°C,
250 UpM, für
48 Stunden inkubiert. Die Resultate der Analyse sind in Tabelle
2 gezeigt. Alle dreißig Kolonien
rekombinanter Stämme
zeigen ausgezeichnete Produktivität einschließlich acht Kolonien, die 26
g/l oder mehr Threonin produzierten; im Vergleich dazu produzierte
der Wirtsstamm TF4076 20 g/l Threonin. Der rekombinante Stamm, der
die höchste
Threoninproduktivität
mit 27 g/l bei einer 35% höheren
Ausbeute als der Wirtsstamm zeigte, wurde „pGmTN- PPC12" genannt. Der Stamm pGmTN-PPC12 wurde
am 5. Januar 2001 bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC)
hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer KCCM 10236.
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Tabelle
1. Zusammensetzung des Threonin-Titer-Mediums
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Tabelle
2. Resultate des Kolben-Titer-Tests auf rekombinante Stämme
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Beispiel 5: Vergleich
der Threoninproduktivität
unter Verwendung eines Fermentators
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Die
Threoninproduktivität
in einem Fermentator wurde zwischen dem rekombinanten Stamm pGmTN-PPC12,
der wegen seines höchsten
Threonin-Titers aus Beispiel 4 selektiert worden war, und dem Wirtsstamm
TF4076 verglichen. Die Anfangs-Mediumzusammensetzung, die verwendet
wurde, ist in Tabelle 3 gezeigt. LB-Medium, das außerdem pro
Liter 10 g Glucose und 0,1 g L-Methionin enthielt, wurde für eine Impfkultur
verwendet und ein Anfangsvolumen der Inokulation in einen Fermentator
wurde bei 3–5
Vol.-% einer Zielanfangskultur bestimmt. Glucose wurde jedes Mal
bei einer Endkonzentration von 5 Gew.-%, 6-mal insgesamt, zusammen
mit KH2PO4 mit 1
Gew.-% zugesetzt. Hier wurde jede Glucosezugabe durch Glucosedeletion bestimmt.
Das Anfangsvolumen der Kultur war 1,5 l und das Endvolumen der Kultur
war 3,0 l. Die Gesamtkonzentration an Glucose, die während der
Fermentation zugesetzt wurde, war 250 g/l. Während Fermentationen wurde
das Medium mit 700–1000
UpM gerührt,
die Temperatur wurde bei 32°C
kontrolliert und der pH wurde mit 25–28%igem Ammoniakwasser auf
7,0 eingestellt. Die Luftströmungsgeschwindigkeit
wurde auf 0,1 VVm eingestellt. Die Resultate sind in Tabelle 4 gezeigt.
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, produziert der Wirtsstamm TF4076 75,3
g/l Threonin bei einer Ausbeute von 30,1%, bezogen auf den Glucoseverbrauch.
Dagegen pro duziert der rekombinante Stamm pGmTN-PPC12 102 g/l Threonin
bei einer Ausbeute von 40,8%, was 35,4% über dem Wert des Wirtsstamms
TF4076 liegt.
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Außerdem wurde
bei dem Wirtsstamm ein ähnliches
Fermentationsmuster wie bei dem rekombinanten Stamm ohne Verringerung
des Zuckerverbrauchs während
der Fermentation beobachtet, was oft bei rekombinanten Stämmen durch
Wachstumsinhibierung auftritt.
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Tabelle
3. Zusammensetzung des Anfangsmediums in einem 5 l-Fermentator
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Tabelle
4. Resultate der fermentativen Produktion von Threonin durch rekombinante
Stämme
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Wie
oben beschrieben wurde, werden erfindungsgemäß zwei oder mehrere ppc-Gene
und Threonin-Operone in die chromosomale DNA eingeschlossen, um
dadurch die Expression des ppc-Gens, welches für ein Enzym zur Umwandlung
von Phosphoenolpyruvat in eine Threonin-Biosynthesevorstufe, Oxaloacetat, codiert,
und der Gene, die für
Enzyme codieren, welche im Syntheseweg von Threonin aus Oxaloacetat
involviert sind, einschließlich
thrA (AsparatokinaseI-Homoserin-Dehydrogenase), thrB (Homoserinkinase)
und thrC (Threoninsynthase), zu verstärken. Die vorliegende Erfindung
kann die Produktivität
für L-Threonin
gegenüber dem
Wirtsstamm deutlich verbessern, nämlich um 35%.