Aufgabe der
Erfindung
Es
war Aufgabe dieser Erfindung, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen
Herstellung von L-Threonin bereitzustellen.
Beschreibung
der Erfindung
Gegenstand
der Erfindung ist ein Fermentationsverfahren, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man
- a) ein L-Threonin produzierendes
Bakterium der Familie Enterobacteriaceae in mindestens einem ersten Nährmedium
inokuliert und kultiviert,
- b) anschließend
mindestens ein weiteres Nährmedium
oder mehrere weitere Nährmedien
in einem oder mehreren Zufütterungsströmen der
Kultur kontinuierlich zuführt,
wobei das weitere Nährmedium
oder die weiteren Nährmedien
mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle
und mindestens eine Phosphorquelle enthalten, unter Bedingungen,
die die Bildung von L-Threonin erlauben, und gleichzeitig der Kultur
Kulturbrühe
mit mindestens einem oder mehreren Entnahmeströmen entnimmt, der oder die
im wesentlichen dem Zufütterungsstrom
oder der Summe der Zufütterungsströme entspricht/entsprechen,
wobei
- c) die Konzentration der Kohlenstoffquelle(n) während der
kontinuierlichen Kultivierung bei maximal 30 g/l eingestellt wird.
Erfindungsgemäß kann die
Anlagenleistung eines L-Threonin produzierenden Fermenters dadurch gesteigert
werden, dass man in dem oben beschriebenen ersten Schritt a) nach
dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch) kultiviert,
wobei bei Verwendung des Zulaufverfahrens mindestens ein Zusatz-Nährmedium
eingesetzt wird. In dem beschriebenen anschließenden Schritt b) werden mindestens
ein weiteres Nährmedium
oder mehrere weitere Nährmedien
in einem oder mehreren Zufütterungsströmen der Kultur
kontinuierlich zugeführt
und gleichzeitig wird der Kultur Kulturbrühe mit mindestens einem oder
mehreren Entnahmeströmen
entnommen, der oder die im wesentlichen dem Zufütterungsstrom oder der Summe
der Zufütterungsströme entspricht/entsprechen.
Unter
dem Begriff Anlagenleistung versteht man, dass in einer Anlage (plant)
wie z. B. einem Fermenter die Masse bzw. Menge eines Produktes z.
B. L-Threonin mit einer bestimmten Ausbeute und mit einer bestimmten
Geschwindigkeit bzw. Produktivität
oder Raum-Zeit-Ausbeute hergestellt wird. Diese Parameter bestimmen
weitgehend die Kosten bzw. die Wirtschaftlichkeit eines Verfahrens.
Unter
einer Kulturbrühe
versteht man die durch die Kultivierung eines Mikroorganismus – im Falle
der vorliegenden Erfindung ein L-Threonin produzierendes Bakterium – in einem
Nährmedium
unter Verwendung eines Fermenters oder Kulturgefäßes entstandene Suspension
eines Mikroorganismus.
Während des
Schrittes a) wird das Bakterium in mindestens einem ersten Nährmedium
inokuliert und nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren
(fed batch) kultiviert. Bei Verwendung des Zulaufverfahrens wird
nach mehr als 0 bis maximal 10 Stunden, vorzugsweise nach 1 bis
10 Stunden, bevorzugt nach 2 bis 10 Stunden und besonders bevorzugt
nach 3 bis 7 Stunden ein Zusatz-Nährmedium zugeführt.
Das
erste Nährmedium
enthält
als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus
der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat, Laktose,
Galaktose, Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose, Essigsäure, Ethanol
und Methanol in den Konzentrationen von 1 bis 100 g/kg oder 1 bis
50 g/kg, bevorzugt von 10 bis 45 g/kg, besonders bevorzugt von 20
bis 40 g/kg. Unter Stärkehydrolysat
versteht man erfindungsgemäß das Hydrolysat
von Stärke
aus Mais, Getreide, Kartoffeln oder Tapioka.
Als
Stickstoffquelle im erste Nährmedium
können
organische, Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und
Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat
Kaliumnitrat, Kaliumnatriumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln
oder als Mischung in den Konzentrationen von 1 bis 40 g/kg, bevorzugt
von 10 bis 30 g/kg, besonders bevorzugt von 10 bis 25 g/kg, ganz besonders
bevorzugt 1 bis 30 g/kg oder 1 bis 25 g/kg verwendet werden.
Als
Phosphorquelle im ersten Nährmedium
können
Phosphorsäure,
Alkali- oder Erdalkalisalze der Phosphorsäure, insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat
oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natriumhaltigen
Salze, Polymere der Phosphorsäure
oder das Hexaphosphorsäureester
des Inosits, auch Phytinsäure
genannt oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze, in den Konzentrationen
von 0,1 bis 5 g/kg, bevorzugt von 0,3 bis 3 g/kg, besonders bevorzugt
von 0,5 bis 1,5 g/kg verwendet werden. Das erste Nährmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Diese Substanzen liegen in den Konzentrationen
von 0,003 bis 3 g/kg vor. Schließlich werden essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
(z.B. Homoserin) und Vitamine (z.B. Thiamin) zusätzlich zu den oben genannten
Stoffen eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z.B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden.
Das
Zusatz-Nährmedium,
welches in einem Zulaufverfahren (fed batch) angewandt wird, enthält im Allgemeinen
lediglich als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen
ausgewählt
aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat,
Laktose, Galaktose, Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose,
Essigsäure,
Ethanol und Methanol in den Konzentrationen von 300 bis 700 g/kg,
bevorzugt von 400 bis 650 g/kg, und gegebenenfalls eine anorganische
Stickstoffquelle wie z.B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat
oder Kaliumnatriumnitrat. Alternativ können diese und andere Komponenten
auch separat zugefüttert
werden.
Es
wurde gefunden, dass bei der kontinuierlichen Kultivierung gemäß Schritt
b) die Bestandteile des weiteren Nährmediums in Form eines einzigen
weiteren Nährmediums
sowie in einer Vielzahl von weiteren Nährmedien der Kultur zugeführt werden
können.
Erfindungsgemäß wird das
weitere Nährmedium
beziehungsweise werden die weiteren Nährmedien in mindestens einem
(1) Zufütterungsstrom
oder in einer Vielzahl an Zufütterungsströmen mindestens
2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 7 oder 2 bis 5 Zufütterungsströmen der Kultur zugeführt.
Der
Begriff „kontinuierlich" bedeutet, dass der
Zufütterungsstrom
bzw. die Zufütterungsströme im wesentlichen
ununterbrochen, das heißt
mit höchstens
kurzen, einzelnen Pausen der Kultur hinzugefügt wird/werden. Die einzelnen
Unterbrechungen oder Pausen betragen bis zu maximal 0,5, 1, 2 oder
3 Stunden. Die Summe der einzelnen Unterbrechungen bzw. Pausen bei
der kontinuierlichen Kultivierung gemäß Schritt b) beträgt maximal
10%, 8%, 6%, 4%, 2% oder 1% der Gesamtzeit der kontinuierlichen
Kultivierung gemäß Schritt
b).
Das
weitere Nährmedium
bzw. die weiteren Nährmedien
enthält/enthalten
als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus
der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat,
Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose, Essigsäure, Ethanol
und Methanol in den Konzentrationen von 20 bis 700 g/kg, bevorzugt
von 50 bis 650 g/kg.
Weiterhin
enthält
das weitere Nährmedium
bzw. enthalten die weiteren Nährmedien
eine Stickstoffquelle bestehend aus organischen, Stickstoff-haltigen
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt,
Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische
Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat und/oder Kaliumnitrat oder Kaliumnatriumnitrat.
Die Stickstoffquellen können
einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 5 bis 50 g/kg,
bevorzugt von 10 bis 40 g/kg, verwendet werden.
Weiterhin
enthält
das weitere Nährmedium
bzw. enthalten die weiteren Nährmedien
eine Phosphorquelle bestehend aus Phosphorsäure oder den Alkali- oder Erdalkalisalze
der Phosphorsäure,
insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat
oder die entsprechenden Natriumhaltigen Salze, Polymere der Phosphorsäure oder
das Hexaphosphorsäureester
des Inosits, auch Phytinsäure
genannt bzw. die entsprechenden Alkali- oder Erdalkalisalze. Die
Phosphorquellen können
einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 0,3 bis 3 g/kg,
bevorzugt von 0,5 bis 2 g/kg verwendet werden. Das weitere Nährmedium bzw.
die weiteren Nährmedien
muss/müssen
weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder
Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind, in den Konzentrationen von 0,003 bis
3 g/kg, bevorzugt in den Konzentrationen von 0,008 bis 2 g/kg. Schließlich werden
essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren (z.B. Homoserin) und Vitamine
(z.B. Thiamin) zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden.
Bei
Verwendung eines einzigen weiteren Nährmediums wird dieses typischerweise
in einem Zufütterungsstrom
der Kultur zugeführt.
Bei Verwendung einer Vielzahl weiterer Nährmedien werden diese in einer entsprechenden
Vielzahl an Zufütterungsströmen zugeführt. Bei
der Verwendung einer Vielzahl weiterer Nährmedien ist zu beachten, dass
diese jeweils nur eine der beschriebenen Kohlenstoff-, Stickstoff-,
oder Phosphorquellen enthalten können,
aber auch eine Mischung von den beschriebenen Kohlenstoff-, Stickstoff-,
oder Phosphorquellen.
Erfindungsgemäß wird das
zugeführte
weitere Nährmedium
oder die zugeführten
weiteren Nährmedien
so eingestellt, das ein Phosphor zu Kohlenstoffverhältnis (P/C
Verhältnis)
von maximal 4; von maximal 3; von maximal 2; von maximal 1,5; von
maximal 1; von maximal 0,7; von maximal 0,5; maximal 0,48; maximal 0,46;
maximal 0,44; maximal 0,42; maximal 0,40; maximal 0,38; maximal
0,36; maximal 0,34; maximal 0,32; maximal 0,30 mmol Phosphor/mol
Kohlenstoff besteht.
Der
Zufütterungsstrom
oder die Summe der Zufütterungsströme in dem
erfindungsgemäßen Verfahren
werden mit einer Geschwindigkeit entsprechend einer mittleren Verweilzeit
von kleiner als 30 Stunden, bevorzugt kleiner als 25, ganz besonders
bevorzugt kleiner als 20 Stunden hinzugeführt. Dabei ist die mittlere Verweilzeit
(residence time) die theoretische Zeit, die Teilchen in einer kontinuierlich
betriebenen Kultur verbleiben. Die mittlere Verweilzeit wird beschrieben
durch das Verhältnis
des Flüssigkeitsvolumens
des Reaktors und der Durchflussmenge (Biotechnologie, H. Weide,
J. Páca
und W. A. Knorre, Gustav Fischer Verlag Jena, 1991).
Starkes
Wachstum zu Beginn der Kultivierung gemäß Schritt (a) ist normalerweise
eine logarithmische Wachstumsphase. Der logarithmischen Wachstumsphase
folgt im Allgemeinen eine Phase von geringerem Zellwachstum als
in der logarithmischen Phase.
Beginnt
das erfindungsgemäße Verfahren
in Schritt a) mit einem Satzverfahren so wird/werden nach > (größer) 0 bis
20 Stunden, 1 bis 20 Stunden, nach 1 bis 10 Stunden, 2 bis 10 Stunden
oder 3 bis 7 Stunden bezogen auf den Beginn des Satzverfahrens ein
weiteres Nährmedium
oder weitere Nährmedien
in einem oder mehreren Zufütterungsströmen der
Kultur zugeführt.
Der Beginn der Entnahme der Kulturbrühe mit einem oder mehreren
Entnahmeströmen
erfolgt mit dem Beginn der Zuführung
des weiteren Nährmediums
bzw. der weiteren Nährmedien
oder zeitlich versetzt, d.h. vor oder nach Beginn der Zuführung des
weiteren Nährmediums oder
der weiteren Nährmedien.
Falls der Beginn der Zufütterung
und der Beginn der Entnahme zeitlich versetzt erfolgen, beträgt die entsprechende
Zeitdifferenz im Allgemeinen maximal 5 Stunden, 3 Stunden, 2 Stunden oder
1 Stunde.
Beginnt
das erfindungsgemäße Verfahren
in Schritt a) mit einem Zulaufverfahren so wird/werden nach > (größer) 0 bis
80 Stunden, 1 bis 80 Stunden, nach 1 bis 60 Stunden, 5 bis 50 Stunden,
6 bis 45 Stunden, oder 8 bis 40 Stunden bezogen auf den Beginn des
Zulaufverfahren ein weiteres Nährmedium
oder weitere Nährmedien
in einem oder mehreren Zufütterungsströmen der
Kultur zugeführt.
Der Beginn der Entnahme der Kulturbrühe mit einem oder mehreren
Entnahmeströmen
erfolgt mit dem Beginn der Zuführung
des weiteren Nährmediums
bzw. der weiteren Nährmedien
oder zeitlich versetzt, d.h, vor oder nach Beginn der Zuführung des
weiteren Nährmediums.
Falls der Beginn der Zufütterung
und der. Beginn der Entnahme zeitlich versetzt erfolgen, beträgt die entsprechende
Zeitdifferenz im Allgemeinen maximal 5 Stunden, maximal 3 Stunden,
maximal 2 Stunden oder maximal 1 Stunde.
Nach > (größer) 0 bis
100 Stunden, 1 bis 85 Stunden, 2 bis 80 Stunden, 3 bis 75 Stunden,
5 bis 72 Stunden, 10 bis 72 Stunden, 10 bis 60 Stunden, oder 15
bis 48 Stunden bezogen auf den Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens
gemäß Schritt
(a) entspricht der Entnahmestrom oder die Summe der Entnahmeströme im wesentlichen
dem Zufütterungsstrom
oder der Summe der Zufütterungsströme und der
Zustand der kontinuierlichen Kultivierung gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist erreicht. Im wesentlichen bedeutet hier, dass die Geschwindigkeit
des Entnahmestroms oder der Entnahmeströme 80%–120%, 90%–110% oder 95%–105% des
Zufütterungsstroms
oder der Summe der Zufütterungsströme entspricht.
Die Entnahme kann durch Abpumpen und oder durch Ablassen der Kulturbrühe technisch
realisiert werden.
Erfindungsgemäß wird die
Konzentration der Kohlenstoffquelle mindestens während der kontinuierlichen
Kultivierung gemäß Schritt
(b) im Allgemeinen bei maximal 30 g/l, maximal 20 g/l, maximal 10
g/l, bevorzugt bei maximal 5 g/l, besonders bevorzugt maximal 2
g/l eingestellt. Diese Konzentration wird mindestens während 75%,
bevorzugt mindestens während
85%, besonders bevorzugt mindestens während 95% der Zeit der Kultivierung
gemäß Schritt
(b) aufrechterhalten. Dabei wird die Konzentration der Kohlenstoffquelle
anhand von Methoden bestimmt, die Stand der Technik sind. β-D-Glukose
wird z.B. in einem Glukoseanalysator YSI 02700 Select der Firma
Yellow Springs Instruments (Yellow Springs, Ohio, USA) bestimmt.
Gegebenenfalls
kann die entnommene Kulturbrühe
mit Sauerstoff oder einem sauerstoffhaltigen Gas versehen werden
bis die Konzentration der Kohlenstoffquelle unter 2 g/l, unter 1
g/l oder unter 0,5 g/l sinkt.
In
einem erfindungsgemäßen Verfahren
beträgt
die Ausbeute mindestens 31 %, mindestens 33 %, mindestens 35 %,
mindestens 37 %, mindestens 38 %, mindestens 40 %, mindestens 42
%, mindestens 44 %, mindestens 46 % oder mindestens 48 %. Dabei
ist die Ausbeute definiert als das Verhältnis von der in einer Kultivierung
gesamt gebildeten Menge an L-Threonin zu der Gesamtmenge der eingesetzten
oder verbrauchten Kohlenstoffquelle.
In
einem erfindungsgemäßen Verfahren
wird L-Threonin mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von mindestens 1,5
bis 2,5 g/l pro Std., von mindestens 2,5 bis 3,5 g/l pro Std., von
mindestens 2,5 bis mehr als 3,5 g/l pro Std., von mindestens 3,5
bis 5,0 g/l pro Std., von mindestens 3,5 bis mehr als 5,0 g/l pro
Std., oder von mindestens 5,0 bis 8,0 g/l oder mehr pro Std. gebildet.
Dabei ist die Raum-Zeit- Ausbeute
definiert als das Verhältnis
von der in einer Kultivierung gesamt gebildeten Threoninmenge zu
dem Volumen der Kultur über
den gesamten Zeitraum der Kultivierung gesehen. Die Raum-Zeit-Ausbeute
wird auch volumetrische Produktivität genannt.
Naturgemäß wird bei
einem Fermentationsverfahren wie dem erfindungsgemäßen das
Produkt mit einer bestimmten Ausbeute und mit einer bestimmten Raum-Zeit-Ausbeute
(volumetrische Produktivität)
hergestellt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann L-Threonin
mit einer Ausbeute von mindestens 31 Gew.-% und einer Raum-Zeit-Ausbeute
von mindestens 1,5 bis 2,5 g/l pro Std. hergestellt werden. Weitere
Kopplungen von Ausbeute mit Raum-Zeit-Ausbeute wie beispielsweise
eine Ausbeute von mindestens 37 % und eine Raum-Zeit-Ausbeute von
mindestens 2,5 g/l pro. Std. ergeben sich zwanglos aus den obigen
Ausführungen.
Während der
Kultivierung wird die Temperatur in einem Bereich von 29 bis 42°C, vorzugsweise
von 33 bis 40°C,
eingestellt. Die Kultivierung kann bei Normaldruck oder gegebenenfalls
bei Überdruck,
vorzugsweise bei 0 bis 1,5 bar Überdruck
durchgeführt
werden. Der Sauerstoffpartialdruck wird auf 5 bis 50%, vorzugsweise ca.
20%, Luftsättigung
geregelt. Dabei wird die Kultur gerührt und mit Sauerstoff versorgt.
Die Regelung des pH-Wertes auf pH ca. 6 bis 8, vorzugsweise 6,5
bis 7,5 kann mit 25%igem Ammoniakwasser erfolgen.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird mindestens ca. 72 Stunden vorzugsweise 100 bis Z 300, besonders
bevorzugt 200 bis ≥ 300
Stunden betrieben. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Volumen
der Kultur mindestens ein halbes Mal, mindestens 1 Mal, mindestens
2 Mal, mindestens 3 Mal, mindestens 4 Mal, mindestens 6 Mal, mindestens
8 Mal, mindestens 10 Mal, mindestens 12 Mal ausgetauscht.
Aus
der entnommenen Kulturbrühe
kann das L-Threonin gewonnen, gesammelt oder konzentriert und gegebenenfalls
gereinigt werden.
Es
ist ebenfalls möglich
aus der entnommenen Kulturbrühe
(= Fermentationsbrühe)
ein Produkt herzustellen, indem man die in der Kulturbrühe enthaltene
Biomasse des Bakteriums vollständig
(100) oder nahezu vollständig
d.h. mehr als oder größer als
(>) 90%, > 95%, > 97%, > 99% entfernt und die übrigen Bestandteile
der Fermentationsbrühe
weitgehend d.h. zu 30%–100%,
40%–100%,
50%–100%,
60%–100%, 70%–100%, 80%–100%, oder
90%–100%,
bevorzugt größer gleich
(≥) 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, ≥ 90% oder ≥ 95% oder
auch vollständig
(100%) im Produkt belässt.
Zur
Entfernung oder Abtrennung der Biomasse werden Separationsmethoden
wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration, Dekantieren, Flockung
oder eine Kombination hieraus eingesetzt.
Die
erhaltene Brühe
wird anschließend
mit bekannten Methoden wie beispielsweise mit Hilfe eines Rotationsverdampfers,
Dünnschichtverdampfers,
Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, durch Nanofiltration oder
einer Kombination hieraus eingedickt beziehungsweise konzentriert.
Diese
aufkonzentrierte Brühe
wird anschließend
durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation
oder durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise rieselfähigen, feinteiligen
Pulver aufgearbeitet. Dieses rieselfähige, feinteilige Pulver kann
dann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein
grobkörniges,
gut rieselfähiges,
lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Das Wasser wird
hierbei insgesamt zu mehr als 90% entfernt, sodass der Wassergehalt
im Produkt kleiner als 10%, kleiner als 5% beträgt.
Die
angegebenen Verfahrensschritte müssen
nicht notwendigerweise in der hier aufgeführten Reihenfolge durchgeführt sondern
können
gegebenenfalls in technisch sinnvoller Weise kombiniert werden.
Die
Analyse von L-Threonin und anderen Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie
mit anschließender
Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical
Chemistry 30: 1190–1206
(1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen,
so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979))
beschrieben.
Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind L-Threonin
produzierende Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus
den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia geeignet.
Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der
Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und
bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens
zu nennen.
Die
Bakterien enthalten mindestens eine Kopie eines thrA-Gens oder Allels,
das für
eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase
I kodiert. In der Literatur wird in diesem Zusammenhang auch von „feed back" resistenten oder
auch von desensibilisierten Varianten gesprochen. Derartige Bakterien sind
typischerweise resistent gegen das Threoninanalogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV)
(Shiio und Nakamori, Agricultural and Biological Chemistry 33 (8),
1152–1160
(1969)). Biochemische Untersuchungen zu „feed back" resistenten Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase
I Varianten sind beispielsweise bei Cohen et al. (Biochemical and
Biophysical Research Communications 19(4), 546–550 (1965)) und bei Omori
et al. (Journal of Bacteriology 175(3), 785–794 (1993)) beschrieben. Gegebenenfalls
wird die Threonin-insensitive Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase I überexprimiert.
Methoden
der Überexpression
sind im Stand der Technik hinlänglich – beispielsweise
bei Makrides et al. (Microbiological Reviews 60 (3), 512–538 (1996)) – beschrieben.
Durch Verwendung von Vektoren wird die Kopienzahl um mindestens
eine (1) Kopie erhöht.
Als Vektoren können
Plasmide wie beispielsweise in der
US 5,538,873 beschrieben
verwendet werden. Als Vektoren können
ebenfalls Phagen, beispielsweise der Phage Mu, wie in der
EP 0 332 448 beschrieben,
oder der Phage lambda (λ)
verwendet werden. Eine Erhöhung
der Kopienzahl kann auch dadurch erzielt werden, dass eine weitere
Kopie in eine weitere Stelle des Chromosoms – beispielsweise in die attsite
des Phagen λ (Yu
und Court, Gene 223, 77–81
(1998)) – eingebaut
wird. In der
US 5,939,307 wird
beschrieben, dass durch Einbau von Expressionskassetten oder Promotoren
wie beispielsweise tac-Promotor, trp-Promotor, lpp-Promotor oder
P
L-Promotor und P
R-Promotor
des Phagen λ stromaufwärts des
chromosomalen Threoninoperons eine Erhöhung der Expression erzielt
werden konnte. In gleicher Weise können die Promotoren des Phagen
T7, die gear-box-Promotoren oder der nar-Promotor verwendet werden.
Derartige Expressionskassetten oder Promotoren können auch verwendet werden
um, wie in der
EP 0 593 792 beschrieben,
plasmidgebundene Gene zu überexprimieren.
Durch Verwendung des lacI
Q-Allels lässt sich
wiederum die Expression plasmidgebundener Gene kontrollieren (Glascock
und Weickert, Gene 223, 221–231
(1998)). Durch Entfernung des Attenuators des Threonin-Operons (Park
et al., Biotechnology Letters 24, 1815–1819 (2002)) oder durch Verwendung
der thr79-20 Mutation (Gardner, Proceedings of the National Academy
of Sciences, USA 76(4), 1706–1710
(1979)) oder durch Mutation des für die Threonyl-t-RNA-Synthetase kodierenden
thrS-Gens wie bei Johnson et al. (Journal of Bacteriology 129(1),
66–70
(1977) beschrieben kann ebenfalls eine Überexpression erzielt werden.
Durch die beschriebenen Maßnahmen
wird die intrazelluläre
Konzentration der jeweiligen Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase I Proteinvariante
um mindestens 10% im Vergleich zum Ausgangsstamm erhöht.
Ein
geeignetes thrA-Allel ist in der
US
4,278,765 beschrieben und in Form des Stammes MG442 bei der
Russischen Nationalsammlung für
industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) unter der
Zugangsnummer CMIM B-1628 erhältlich.
Andere geeignete thrA-Allele sind in der WO 00/09660 und WO 00/09661
beschrieben und bei dem Korean Culture Centre of Microorganisms
(KCCM, Seoul, Korea) unter den Zugangsnummern KCCM 10132 und KCCM
10133 erhältlich.
Ein weiteres geeignetes thrA-Allel ist in dem Stamm H-4581 vorhanden,
der in der
US 4,996,147 beschrieben
und unter der Zugangsnummer Ferm BP-1411 beim National Institute
of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-1 Higashi, Tsukuba
Ibaraki, Japan) erhältlich
ist. Schließlich
sind weitere thrA-Allele in der
US
3,580,810 beschrieben, welche in Form der bei der ATCC
hinterlegten Stämme
ATCC 21277 und ATCC 21278 erhältlich
sind. Ein weiteres Allel ist in der
US
3,622,453 beschrieben und in Form des Stammes KY8284 unter
der Zugangsnummer ATCC 21272 bei der ATCC erhältlich. Darüber hinaus ist in der WO 02/064808
ein weiteres thrA-Allel
beschrieben und in Form von Stamm pGmTN-PPC12 unter der Zugangsnummer
KCCM 10236 bei der KCCM hinterlegt.
Gegebenenfalls
können
thrA-Allele, die für „feed back" resistente Aspartatkinase
I-Homoserindehydrogenase I Varianten kodieren, mit den hinlänglich bekannten
Methoden der konventionellen Mutagenese von Zellen unter Verwendung
von mutagenen Stoffen beispielsweise N-methyl-N'-vitro-N-nitroso-guanidin (MNNG) oder Ethylmethansulfonat
(EMS) oder mutagenen Strahlen beispielsweise W-Strahlen und anschließender Selektion
von Threoninanaloga (beispielsweise AHV) resistenten Varianten isoliert
werden. Derartige Mutagenesemethoden sind beispielsweise bei Shiio
und Nakamori (Agricultural and Biological Chemistry 33 (8), 1152–1160 (1969))
oder bei Saint-Girons und Margerita (Molecular and General Genetics
162, 101–107 (1978))
oder in dem bekannten Handbuch von J. H. Miller (A Short Course
In Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York, USA, 1992) insbesondere auf den Seiten 135 bis 156 beschrieben.
Shiio und Nakamori behandeln beispielsweise eine Zellsuspension
von Escherichia coli für
ca. 15 Minuten mit 0,5 mg/ml MNNG in einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer
von pH 7 bei Raumtemperatur (d. h. im Allgemeinen ca. 16 bis 26°C) zur Erzeugung von
Mutationen. Miller empfiehlt beispielsweise eine Behandlung für 5 bis
60 Minuten mit 30 μl
EMS pro 2 ml Zellsuspension in 0,1 M TRIS-Puffer bei pH 7,5 bei
einer Temperatur von 37°C.
Diese Mutagenesebedingungen können
in naheliegender Weise abgeändert
werden. Die Selektion von AHV-resistenten Mutanten erfolgt auf Minimalagar,
der typischerweise 2 bis 10 mM AHV enthält. Die entsprechenden Allele
können
anschließend
kloniert und einer Sequenzbestimmung und die von diesen Allelen
kodierten Proteinvarianten einer Aktivitätsbestimmung unterzogen werden.
Gegebenenfalls können
die erzeugten Mutanten auch direkt verwendet werden. Das Wort „direkt" bedeutet, dass die
erzeugte Mutante für
die Herstellung von L-Threonin in einem erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden kann oder dass an dieser Mutante weitere Veränderungen zur
Erhöhung
der Leistungseigenschaften, wie beispielsweise Abschwächung des
Threoninabbaus oder Überexpression
des Threoninoperons durchgeführt
werden können.
In
glricher Weise können
auch Methoden der in-vitro Mutagenese verwendet werden wie sie beispielsweise
in dem bekannten Handbuch von Sambrook et al. (Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989) beschrieben sind. Entsprechende
Methoden sind auch kommerziell in Form sogenannter „kits" wie beispielsweise
der von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3–4 (1996)) beschriebene „QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit" der
Firma Stratagene (La Jolla, USA) verfügbar.
Diese
Mutagenesemethoden können
naturgemäß auch auf
andere Gene, Allele oder Stämme
beziehungsweise Fragestellungen und Aufgaben, wie beispielsweise
der Erzeugung und Isolierung von Mutanten, die gegenüber L-Threonin
resistent sind, angewendet werden.
Bevorzugt
werden solche thrA-Allele, die für
Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase I Varianten kodieren, die
in Gegenwart von 10 mM L-Threonin mindestens 40%, mindestens 45%,
mindestens 50%, mindestens 55% oder mindestens 60%, der Homoserin-Dehydrogenase
Aktivität
und/oder die in Gegenwart von 1 mM L-Threonin mindestens 60%, mindestens
70%, mindestens 75% oder mindestens 80%, der Homoserin-Dehydrogenase Aktivität im Vergleich
zur Aktivität
in Abwesenheit von L-Threonin aufweisen. Gegebenenfalls beträgt die Aspartatkinase-Aktivität der genannten
Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase I Varianten in Gegenwart
von 10 mM L-Threonin mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens
70%, mindestens 75% bis oder mindestens 80% der Aktivität in Abwesenheit
von L-Threonin.
Darüber hinaus
sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die ein
Stopkodon ausgewählt
aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen
und einen t-RNA-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe opal-Suppressor,
ochre-Suppressor und amber-Suppressor,
bevorzugt amber-Suppressor enthalten. Die amber-Mutation liegt vorzugsweise
an der Position 33 entsprechend der Aminosäuresequenz des RpoS-Genproduktes.
Als amber-Suppressor wird vorzugsweise supE eingesetzt. Diese Bakterien
sind in PCT/EP02/02055 beschrieben. Ein Stamm, der die beschriebene
Mutation im rpoS-Gen und den Suppressor supE enthält, ist
unter der Zugangsnummer DSM 15189 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland) erhältlich.
Die
Nukleotidsequenz des rpoS-Gens kann dem Stand der Technik entnommen
werden. Die Nukleotidsequenz des rpoS-Gens entsprechend der Accession No.
AE000358 ist als SEQ ID NO. 1 dargestellt. Die Aminosäuresequenz
des dazugehörigen
RpoS-Genproduktes bzw. Proteins ist in der SEQ ID NO. 2 dargestellt.
Die Nukleotidsequenz eines rpoS-Allels, das ein Stopkodon vom Typ
amber an der Stelle der Nukleotidsequenz entsprechend Position 33
der Aminosäuresequenz
des RpoS-Genproduktes bzw. Proteins, entsprechend SEQ ID NO. 1 bzw.
SEQ ID NO. 2, enthält,
ist in SEQ ID NO. 3 wiedergegeben. Der Suppressor supE ist im Stand
der Technik beschrieben und als SEQ ID NO. 4 dargestellt.
Darüber hinaus
sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die nicht
in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin abzubauen
bzw. als Stickstoffquelle zu verwerten. Unter aeroben Kulturbedingungen
versteht man solche, bei denen der Sauerstoffpartialdruck in der
Fermentationskultur während
90%, bevorzugt 95%, ganz besonders bevorzugt 99% der Fermentationsdauer
größer (>) 0% beträgt. Ein derartiger
Stamm ist beispielsweise der von Okamoto (Bioscience, Biotechnology
and Biochemistry 61(11), 1877–1882
(1997)) beschriebene Stamm KY10935. Stämme, die nicht in der Lage
sind Threonin unter Stickstoffabspaltung abzubauen, besitzen im
Allgemeinen eine abgeschwächte
vom tdh-Gen kodierte Threonin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.103). Das
Enzym wurde von Aronson et al. (The Journal of Biological Chemistry 264(9),
5226–5232
(1989)) beschrieben. Abgeschwächte
tdh-Gene sind beispielsweise bei Ravnikar und Somerville (Journal
of Bacteriology, 1986, 168(1), 434– 436), in der
US 5,705,371 , in der WO 02/26993 und
bei Komatsubara (Bioprocess Technology 19, 467–484 (1994)) beschrieben.
Ein
geeignetes tdh-Allel ist in der
US
5,538,873 beschrieben und in Form des Stammes B-3996 unter der
Zugangsnummer 1876 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle
Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) erhältlich. Ein weiteres tdh-Allel
ist in der
US 5,939,307 beschrieben
und in Form des Stammes kat-13 unter der Zugangsnummer NRRL B-21593
bei der Agriculture Research Service Patent Culture Collection (Peoria,
Illinois, USA) erhältlich.
Schließlich
ist ein tdh-Allel in der WO 02/26993 beschrieben und in Form des
Stammes TH21.97 unter der Zugangsnummer NRRL B-30318 bei der NRRL
hinterlegt. Das für
eine defekte Threonin Dehydrogenase kodierende Allel tdh-1::cat1212
ist beim E. coli Genetic Stock Center (New Haven, Conn., USA) unter
der Zugangsnummer CGSC 6945 erhältlich.
Darüber hinaus
sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die eine
mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit („leaky"-Phänotyp)
besitzen, welche durch Gabe von L-Isoleucin in einer Konzentration von
mindestens 10, 20 oder 50 mg/l oder L-Threonin in einer Konzentration
von mindestens 50, 100 oder 500 mg/l kompensierbar ist.
Unter
Bedürftigkeit
bzw. Auxotrophie versteht man im Allgemeinen die Tatsache, dass
ein Stamm infolge einer Mutation eine Wildtypfunktion beispielsweise
eine Enzymaktivität
vollständig
verloren hat und zum Wachstum die Zugabe eines Supplementes beispielsweise
eine Aminosäure
benötigt.
Von partieller Bedürftigkeit
oder partieller Auxotrophie spricht man dann, wenn infolge einer
Mutation eine Wildtypfunktion beispielsweise die Aktivität eines
Enzyms aus dem Biosyntheseweg einer Aminosäure beeinträchtigt beziehungsweise abgeschwächt aber
nicht vollständig
ausgeschaltet ist. Stämme
mit partieller Bedürftigkeit
besitzen in Abwesenheit des Supplementes typischerweise eine im
Vergleich zum Wildtyp reduzierte, d.h, größer (>) 0% und kleiner (<) 90%, 50%, 25% oder 10% Wachstumsgeschwindigkeit.
In der Literatur wird dieser Zusammenhang auch als „leaky"-Phänotyp oder „leakyness" bezeichnet (Griffiths
et al.: An Introduction to Genetic Analysis. 6th edition,
1996, Freeman and Company, New York, USA).
Ein
Stamm mit einer derartigen partiellen Isoleucin-Bedürftigkeit
ist beispielsweise in der WO 01/14525 beschrieben und in Form des
Stammes DSM9906 unter der Zugangsnummer KCCM 10168 bei der KCCM
hinterlegt. Threonin ausscheidende bzw. produzierende Stämme mit
einer Isoleucin-Bedürftigkeit
besitzen im Allgemeinen eine abgeschwächte vom ilvA-Gen kodierte
Threonin-Deaminase (E.C. Nummer 4.3.1.19). Die Threonin-Deaminase
ist auch unter dem Namen Threonin-Dehydratase bekannt. Ein abgeschwächtes ilvA-Gen,
das eine partielle Isoleucin-Auxotrophie
bewirkt, ist beispielsweise in der
US
4,278,765 beschrieben und in Form des Stammes MG442, hinterlegt
unter der Zugangsnummer B-1682, bei der VKPM erhältlich.
Ein
weiteres abgeschwächtes
ilvA-Gen ist beispielsweise in der WO 00/09660 beschrieben und in Form
des Stammes DSM 9807, hinterlegt unter der Zugangsnummer KCCM-10132,
bei der KCCM erhältlich. Weitere
abgeschwächte
ilvA-Gene sind bei Komatsubara (Bioprocess Technology 19, 467–484 (1994))
beschrieben.
Die
Aminosäuresequenz
einer geeigneten und neuen Threonin-Deaminase besteht beispielsweise in der
Sequenz von SEQ ID NO. 6 wobei an Position 286 jede Aminosäure außer Glutaminsäure enthalten
sein kann. Bevorzugt wird der Austausch Glutaminsäure gegen
Lysin (E286K).
Mit
dem Begriff „Aminosäure" sind insbesondere
die proteinogenen L-Aminosäuren
einschließlich
ihrer Salze, ausgewählt
aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin,
L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin,
L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin
und L-Arginin gemeint.
In
SEQ ID NO. 8 ist die Aminosäuresequenz
einer Threonin-Deaminase
angegeben, die an Position 286 die Aminosäure Lysin enthält; die
dazugehörige
Nukleotidsequenz ist als SEQ ID NO. 7 dargestellt. Diese enthält an Position
856 die Nukleobase Adenin.
Eine
andere geeignete Threonin-Deaminase ist die von Lee et al. (Journal
of Bacteriology 185 (18), 5442–5451
(2003)) beschriebene Variante, bei der an Position 97 Serin gegen
Phenylalanin (S97F) ausgetauscht ist. Weitere geeignete Threonin-Deaminasen
sind die von Fischer und Eisenstein (Journal of Bacteriology 175
(20), 6605–6613
(1993)) beschriebenen Varianten, welche mindestens einen der Aminosäureaustausche
ausgewählt
aus der Gruppe: Austausch von Asparagin an Position 46 gegen Asparaginsäure (N46D), Austausch
von Alanin an Position 66 gegen Valin (A66v), Austausch von Prolin
an Position 156 gegen Serin (P156S), Austausch von Glycin an Position
248 gegen Cystein (G248C) und Austausch von Asparaginsäure an Position
266 gegen Tyrosin (D266Y) besitzen.
Durch
Insertions- oder Deletions-Mutagenese von mindestens einem Basenpaar
beziehungsweise Nukleotid oder durch Insertion oder Deletion von
mindestens einem Kodon in der Kodierregion oder durch Einbau eines
Stopkodons durch Transitions- oder Transversions-Mutagenese in die
Kodierregion des ilvA-Gens lassen sich Allele isolieren, bei denen
die Expression des ilvA-Gens im Allgemeinen vollständig ausgeschaltet ist.
Diese Methode ist auch auf andere Gene, Allele oder offene Leserahmen
wie beispielsweise das für
die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen übertragbar.
Darüber hinaus
sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die in ihrem
Wachstum resistent gegenüber
der Hemmung durch L-Threonin und/oder L-Homoserin sind. Threonin-resistente
Stämme
und deren Herstellung sind beispielsweise bei Astaurova et al. (Prikladnaya
Biokhimia Microbiologiya (1985), 21(5), 485 als englische Übersetzung:
Applied Biochemistry and Microbiology (1986), 21, 485–490)) beschrieben. Die
von Austaurova beschrieben Mutante ist gegenüber 40 mg/ml L-Threonin resistent.
Weiterhin ist beispielsweise in der
US
5,175,107 der Stamm 472T23 beschrieben, der in Gegenwart
von 5 mg/ml L-Threonin wachsen kann und gleichzeitig resistent gegen
L-Homoserin ist. Der Stamm 472T232 ist unter der Zugangsnummer BKIIM
B-2307 bei der VKPM und unter der Nummer ATCC 9801 bei der ATCC
erhältlich.
Weiterhin ist in der WO 00/09660 der Stamm DSM 9807 beschrieben,
der auf einem festen Nährboden
wachsen kann, welcher 7% L-Threonin enthält. Der Stamm DSM 9807 ist
unter der Zugangsnummer KCCM-10132 bei der KCCM erhältlich.
Schließlich
ist in der WO 01/14525 der Stamm DSM 9906 beschrieben, der in einem
Medium wachsen kann, das 60% bis 70% einer L-Threonin-Fermentationsmutterlauge
(L-threonine fermentation mother liquid) enthält. Der Stamm DSM 9906 ist
unter der Zugangsnummer KCCM-10168 bei der KCCM erhältlich.
Es
ist bekannt siehe
EP
0994 190 A2 und Livshits et al. (Research in Microbiology
154, 123–135 (2003)),
dass durch Verstärkung
des rhtA-Gens Resistenz gegenüber
L-Threonin und L-Homoserin hervorgerufen wird. Die Verstärkung kann
durch Erhöhung
der Kopienzahl des Gens oder durch Einsatz der rhtA23-Mutation erzielt
werden.
In
der
EP 0 994 190 A2 wird
beschrieben, dass die Verstärkung
des rhtB-Gens Resistenz gegenüber L-Homoserin
und L-Threonin, insbesondere gegen L-Homoserin bewirkt und die Threoninproduktion
verbessert. Durch Überexpression
des RhtB-Genproduktes in einem als N99 bezeichneten Stamm konnte
die minimale Hemmkonzentration von 250 μg/ml auf 30000 μg/ml gesteigert
werden.
In
der
EP 1 013 765 A1 wird
beschrieben, dass eine Verstärkung
des rhtC-Gens Resistenz gegenüber L-Threonin
hervorruft und die Threoninproduktion verbessert. Als resistent
gegenüber
L-Threonin wird ein Stamm bezeichnet, der in Gegenwart einer Konzentration
von mindestens 30 mg/ml L-Threonin auf einem Minimalagar wachsen
kann. Es wird weiterhin beschrieben, dass eine Verstärkung des
rhtB-Gens Resistenz
gegenüber
L-Homoserin bewirkt und die Threoninproduktion verbessert. Als resistent
gegenüber
L-Homoserin wird
ein Stamm bezeichnet, der in Gegenwart einer Konzentration von mindestens
5 mg/ml L-Homoserin auf einem Minimalagar wachsen kann. In der genannten
Patentanmeldung werden Stämme
beschrieben, die resistent gegenüber
10 mg/ml L-Homoserin und resistent gegenüber 50 mg/ml L-Threonin sind.
In der
US 4,996,147 wird
der Stamm H-4581 beschrieben, der gegen 15 g/l Homoserin resistent
ist. Der Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411 beim
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
erhältlich.
In
der
EP 1 016 710 A2 wird
beschrieben, dass eine Verstärkung
des offenen Leserahmen bzw. Gens yfiK oder yeaS Resistenz gegenüber L-Threonin
und L-Homoserin bewirkt. Durch Überexpression
des YfiK-Genproduktes in einem als TG1 bezeichneten Stamm konnte
die minimale Hemmkonzentration bezüglich L-Homoserin von 500 μg/ml auf
1000 μg/ml
und bezüglich
L-Threonin von 30000 μg/ml
auf 40000 μg/ml
gesteigert werden. Durch Überexpression
des YeaS-Genproduktes
konnte die minimale Hemmkonzentration bezüglich L-Homoserin von 500 μg/ml auf
1000 μg/ml
und bezüglich
L-Threonin von 30000 μg/ml
auf 50000 μg/ml gesteigert
werden. In der genannten Patentanmeldung wird weiterhin gezeigt,
dass durch Überexpression
des YfiK-Genproduktes
die Threoninproduktion verbessert wird.
Gemäß diesen
technischen Anleitungen werden Stämme hergestellt die in Gegenwart
von ≥ (mindestens) ≥ 5 g/l, ≥ 10, ≥ 20 g/l, ≥ 30 g/l, ≥ 40 g/l, ≥ 50 g/l, ≥ 60 g/l und ≥ 70 g/l L-Threonin
wachsen können,
d. h. gegenüber
L-Threonin resistent
sind, und für
die Herstellung von L-Threonin
in einem erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet sind.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind insbesondere Stämme
geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:
- a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase
I, welche gegebenenfalls überexprimiert
vorliegt, und
- b) ein Stopkodon ausgewählt
aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen
und einen t-RNA-Suppressor
ausgewählt
aus der Gruppe opal-Suppressor,
ochre-Suppressor und amber-Suppressor, bevorzugt amber-Suppressor.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind außerdem
insbesondere Stämme
geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:
- a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase
I, welche gegebenenfalls überexprimiert
vorliegt,
- b) nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin
abzubauen, bevorzugt durch Abschwächung der Threonin-Dehydrogenase,
- c) eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit, und
- d) Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind ganz besonders Stämme
geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:
- a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I-Homoserindehydrogenase
I, welche gegebenenfalls überexprimiert
vorliegt,
- b) ein Stopkodon ausgewählt
aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen
und einen t-RNA-Suppressor
ausgewählt
aus der Gruppe opal-Suppressor,
ochre-Suppressor und amber-Suppressor, bevorzugt amber-Suppressor,
- c) nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin
abzubauen, bevorzugt durch Abschwächung der Threonin-Dehydrogenase,
- d) eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit, und
- e) Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin.
Darüber hinaus
können
die für
das erfindungsgemäße Verfahren
eingesetzten Bakterien weiterhin eines oder mehrere der folgenden
Merkmale aufweisen:
- • Abschwächung der vom pckA-Gen kodierten
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase) wie beispielsweise
in der WO 02/29080 beschrieben,
- • Abschwächung der
vom pgi-Gen kodierten Phoshoglucose-Isomerase (Froman et al. Molecular and
General Genetics 217(1): 126–31
(1989)).
- • Abschwächung des
vom offenen Leserahmens ytfP kodierten YtfP-Genproduktes wie beispielsweise
in der WO 02/29080 beschrieben,
- • Abschwächung des
vom offenen Leserahmen yjfA kodierten YjfA-Genproduktes wie beispielsweise
in der WO 02/29080 beschrieben,
- • Abschwächung der
vom poxB-Gen kodierten Pruvat-Oxidase wie beispielsweise in der
WO 02/36797 beschrieben,
- • Abschwächung des
vom offenen Leserahmen yjgF kodierten YjgF-Genproduktes wie beispielsweise
in der PCT/EP03/14271 beschrieben. Der yjgF-Orf von Escherichia
coli ist von Wasinger VC. und Humphery-Smith I. (FEMS Microbiology
Letters 169(2): 375–382
(1998)), Volz K. (Protein Science 8(11): 2428–2437 (1999)) und Parsons et
al. (Biochemistry 42(1): 80–89
(2003)) beschrieben worden. Die dazugehörigen Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen
sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000495 in öffentlichen
Datenbanken verfügbar.
Der besseren Übersichtlichkeit
halber sind diese als SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10 dargestellt.
- • Verstärkung der
von den Genen pntA und pntB kodierten Transhydrogenase wie beispielsweise
in der EP 0 733 712
A1 beschrieben,
- • Verstärkung der
von dem pps-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Synthase wie beispielsweise
in der EP 0 877 090
A1 beschrieben,
- • Verstärkung der
vom ppc-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Carboxylase wie beispielsweise
in der EP 0 723 011
A1 beschrieben, und
- • Verstärkung des
vom rseB-Gen kodierten Regulators RseB wie beispielsweise in der EP 1382685 beschrieben.
Der Regulator RseB ist von Missiakas et al. (Molecular Microbiology
24(2), 355–371
(1997)), De Las Penas et al. (Molecular Microbiology 24(2): 373–385 (1997))
und Collinet et al. (Journal of Biological Chemistry 275(43): 33898–33904 (2000))
beschrieben worden. Die dazugehörigen
Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen
sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000343 in öffentlichen
Datenbanken verfügbar.
- • Verstärkung des
vom galP-Gen kodierten Galaktose-Proton Symporter's (= Galaktose-Permease)
wie beispielsweise in der DE
10314618 .0 beschrieben. Das galP-Gen und seine Funktion
sind von Macpherson et al. (The Journal of Biological Chemistry
258(7) 4390–4396
(1983)) und Venter et al. (The Biochemical Journal 363(Pt 2): 243–252 (2002))
beschrieben worden. Die dazugehörigen
Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen
sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000377 in öffentlichen
Datenbanken verfügbar.
- • Fähigkeit
Saccharose als Kohlenstoffquelle verwenden zu können, Genetische Determinanten
zur Saccharoseverwertung sind im Stand der Technik beispielsweise
in der FR-A-2559781, bei Debabov (In: Proceedings of the IV International
Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms 1982. Kodansha
Ltd, Tokyo, Japan, p 254–258),
Smith and Parsell (Journal of General Microbiology 87, 129–140 (1975))
und Livshits et al. (In: Conference on Metabolic Bacterial Plasmids.
Tartusk University Press, Tallin, Estland (1982), p 132–134 und
144–146)
und in der US 5,705,371 beschrieben.
Die genetischen Determinanten zur Saccharoseverwertung des von Smith
und Parsell beschriebenen Stammes H155 wurden durch Konjugation
in eine gegen Nalidixinsäure
resistente Mutante von Escherichia coli K-12 überführt und die entsprechende Transkonjugante
am 16. März
2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(Braunschweig, Deutschland) als DSM 16293 hinterlegt. Genetische
Determinanten zur Saccharoseverwertung sind ebenfalls in dem in
der US 5,631,157 beschriebenen
Stamm 472T23 enthalten, der bei der ATCC unter Bezeichnung ATCC
9801 erhältlich
ist. Eine weitere genetische Determinante zur Saccharoseverwertung
wurde von Bockmann et al. (Molecular and General Genetics 235, 22–32 (1992))
beschrieben und ist unter der Bezeichnung csc-System bekannt.
- • Verstärkung des
vom offenen Leserahmen yedA kodierten YedA-Genproduktes wie beispielsweise
in der WO 03/044191 beschrieben.
- • Wachstum
in Gegenwart mindestens 0,1 bis 0,5 mM oder mindestens 0,5 bis 1
mM Borrelidin (Borrelidinresistenz) wie in US 5,939,307 beschrieben. Der gegen
Borrelidin resistente Stamm kat-13 ist unter der Zugangsnummer NRRL
B-21593 bei der NRRL erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 2 bis 2,5 g/l oder mindestens 2,5 bis
3 g/l Diaminobernsteinsäure (Diaminobernsteinsäure Resistenz)
wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen Diaminobernsteinsäure resistente
Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM
erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 30 bis 40 mM oder mindestens 40 bis
50 mM α-Methylserin (α-Methylserin
Resistenz) wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen α-Methylserin resistente
Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM
erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von höchstens
30 mM oder höchstens
40 mM oder höchstens
50 mM Fluorobrenztraubensäure
(Fluorobrenztraubensäure
Sensitivität)
wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen Fluorobrenztraubensäure sensitive
Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM
erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 210 mM oder mindestens 240 mM oder mindestens
270 mM oder mindestens 300 mM L-Glutaminsäure (Glutaminsäure Resistenz)
wie in WO 00/09660 beschrieben. Der gegen Glutaminsäure resistente
Stamm DSM 9807 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10132 bei der KCCM
erhältlich.
- • Eine
mindestens partielle Bedürftigkeit
für Methionin.
Ein Stamm mit einer mindestens partiellen Methionin Bedürftigkeit
ist beispielsweise der in der US
5,017,483 beschriebene Stamm H-4257, der unter der Zugangsnummer
FERM BP-984 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich
ist. Durch Zugabe von mindestens 25, 50 oder 100 mg/l L-Methionin
ist die Bedürftigkeit
kompensierbar.
- • Eine
mindestens partielle Bedürftigkeit
für m-Diaminopimelinsäure. Ein
Stamm mit einer mindestens partiellen m-Diaminopimelinsäure Bedürftigkeit
ist beispielsweise der in der US
5,017,483 beschriebene Stamm H-4257, der unter der Zugangsnummer
FERM BP-984 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich
ist. Durch Zugabe von mindestens 25, 50 oder 100 mg/l m-Diaminopimelinsäure ist
die Bedürftigkeit
kompensierbar.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 100 mg/l Rifampicin (Rifampicin Resistenz)
wie in US 4,996,147 beschrieben.
Der gegen Rifampicin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer
FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 15 g/l L-Lysin (Lysin Resistenz) wie
in US 4,996,147 beschrieben.
Der gegen L-Lysin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer
FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 15 g/l Methionin (Methionin Resistenz)
wie in US 4,996,147 beschrieben.
Der
gegen Methionin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer
FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 15 g/l L-Asparaginsäure (Asparaginsäure Resistenz)
wie in US 4,996,147 beschrieben.
Der gegen L-Asparaginsäure
resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411
beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
erhältlich.
- • Verstärkung der
vom pyc-Gen kodierten Pyruvat-Carboxylase.
Geeignete pyc-Gene bzw. Allele sind beispielsweise die von Corynebacterium
glutamicum (WO 99/18228, WO 00/39305 und WO 02/31158), Rhizobium
etli ( US 6,455,284 ),
Bacillus subtilis ( EP 1092776 ).
Gegebenfalls kann auch das pyc-Gen von weiteren Mikrorganismen verwendet
werden, die endogen eine Pyruvat-Carboxylase enthalten, wie beispielsweise
Methanobacterium thermoautotrophicum oder Pseudomonas fluorescens.
Bei
Verwendung Saccharose-haltiger Nährmedien
werden die Stämme
mit genetischen Determinanten zur Saccharoseverwertung ausgerüstet.
Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem
Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden,
indem man beispielsweise die Kopienzahl des offenen Leserahmens, Gens
oder Allels bzw. der offenen Leserahmen, Gene oder Allele um mindestens
eine (1) Kopie erhöht,
einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen
kombiniert.
Bei
den Maßnahmen
der Verstärkung
und auch bei den Maßnahmen
der Abschwächung
wird die Verwendung endogener Gene, Allele oder offener Leserahmen
im Allgemeinen bevorzugt. Unter „endogenen Genen" oder „endogenen
Nukleotidsequenzen" versteht
man die in der Population einer Art vorhandenen Gene oder offene
Leserahmen oder Allele beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
Bei
Verwendung von Plasmiden zur Erhöhung
der Kopienzahl werden diese gegebenenfalls stabilisiert durch einen
oder mehreren der genetischen Orte (Loci) ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus dem parB Locus des Plasmides R1 beschrieben von Rasmussen et
al. (Molecular and General Genetics 209 (1), 122–128 (1987)), Gerdes et al.
(Molecular Microbiology 4 (11), 1807–1818 (1990)) und Thistedt
und Gerdes (Journal of Molecular Biology 223 (1), 41–54 (1992)),
dem flm Locus des F Plasmids beschrieben von Loh et al. (Gene 66
(2), 259–268
(1988)), dem par Locus des Plasmids pSC101 beschrieben von Miller
et al. (Gene 24 (2–3),
309–315
(1983), dem cer Locus des Plasmids ColE1 beschrieben von Leung et
al. (DNA 4 (5), 351–355
(1985), dem par Locus des Plasmids RK2 beschrieben von Sobecky et
al. (Journal of Bacteriology 178 (7), 2086–2093 (1996)) und Roberts and
Helinsky (Journal of Bacteriology 174 (24), 8119–8132 (1992)), dem par Locus
des Plasmids RP4 beschrieben von Eberl et al. (Molecular Microbiology
12 (1), 131–141 (1994))
and dem parA Locus des Plasmids R1 beschrieben von Gerdes and Molin
(Journal of Molecular Biology 190 (3), 269–279 (1986)), Dam and Gerdes
(Journal of Molecular Biology 236 (5), 1289–1298 (1994)) and Jensen et
al (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95 (15),
8550–8555
(1998).
Durch
die Maßnahmen
der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins oder Enzyms im Allgemeinen
um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500, maximal bis 1000 oder 2000 bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise
der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Zur
Erzielung einer Verstärkung
können
beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen oder
funktionellen Eigenschaften der Enzyme oder Proteine erhöht werden.
Gegebenenfalls können beide
Maßnahmen
kombiniert werden.
So
kann beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene um mindestens
eine (1) erhöht
werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet,
mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die
stromaufwärts
des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren
ist es zusätzlich
möglich,
die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion
zu steigern. Durch Maßnahmen
zur Verlängerung
der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls
die Enzymaktivität
verstärkt.
Die Gene oder Genkonstrukte können
entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen
oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Veränderung
der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Der
Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration
eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus,
die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor oder einen offenen Leserahmen oder ein
Gen bzw. Allel verwendet, das für
ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer niedrigen Aktivität kodiert
bzw. das entsprechende Enzym bzw. Protein oder Gen inaktiviert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen
kombiniert.
Durch
die Maßnahmen
der Abschwächung
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins oder Enzyms im Allgemeinen
auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%, 0 bis 5% oder 0
bis 1% oder 0 bis 0,1% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins,
beziehungsweise der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
Zur
Erzielung einer Abschwächung
können
beispielsweise die Expression der Gene oder offenen Leserahmen oder
die katalytischen oder funktionellen Eigenschaften der Enzyme oder
Proteine herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls
können
beide Maßnahmen
kombiniert werden.
Die
Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch
genetische Veränderung
(Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch
Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression
sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise
bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191–195 (1998)),
bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15: 58–64 (1999)),
Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159–164 (2000))
und in bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch
von Knippers („Molekulare
Genetik", 6. Auflage,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von
Winnacker („Gene
und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
Mutationen,
die zu einer Veränderung
beziehungsweise Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von
Enzymproteinen führen,
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:
8611–8617
(1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 95: 5511–5515 (1998)), Wente und Schachmann
(Journal of Biological Chemistry 266: 20833–20839 (1991)) genannt. Zusammenfassende
Darstellungen können
bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Als
Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und
Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in
Betracht. In Abhängigkeit
von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches
auf die Enzymaktivität
wird von Fehlsinnmutationen („missense
mutations") oder
Nichtsinnmutationen („nonsense
mutations") gesprochen.
Die Fehlsinnmutation führt
zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen
eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht-konservativen
Aminosäureaustausch
handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins
beeinträchtigt
und auf einen Wert von 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%,
0 bis 5% 0 bis 1% oder 0 bis 0,1% reduziert. Die Nichtsinnmutation
führt zu
einem Stop-Kodon im Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen
Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar in einem Gen führen
zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass
falsche Aminosäuren
eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht
als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies
ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation.
Deletionen
von mindestens einem (1) oder mehreren Kodonen führen typischerweise ebenfalls
zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität
beziehungsweise Funktion.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
geeignete Stämme
sind unter anderem der in der
US
5,175,107 beschriebene Stamm BKIIM B-3996, der in der WO
00/09660 beschriebene Stamm KCCM-10132 und Isoleucin bedürftige Mutanten
des in der WO 98/04715 beschriebenen Stammes kat-13 geeignet. Gegebenenfalls können Stämme mit
den genannten Maßnahmen,
insbesondere durch Einbau eines Stopkodons in das rpoS-Gen, beispielsweise
eines amber-Kodons an die Stelle entsprechend Position 33 der Aminosäuresequenz
des RpoS-Proteins
und gleichzeitigem Einbau eines korrespondierenden t-RNA-Suppressors
beispielsweise supE an das erfindungsgemäße Verfahren adaptiert werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
geeignete Stämme
können
auch dadurch identifiziert werden, dass man die Nukleotidsequenz
des rpoS-Gens in einem L-Threonin ausscheidenden Stamm von Escherichia coli
bestimmt. Hierzu wird das rpoS-Gen kloniert oder mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
amplifiziert und die Nukleotidsequenz bestimmt. Enthält das rpoS-Gen
ein Stopkodon, so wird in einem zweiten Schritt geprüft, ob er
ebenfalls einen korrespondierenden t-RNA-Suppressor enthält. Gegebenenfalls
wird der auf diese Weise identifizierte Stamm mit den oben beschriebenen
Eigenschaften wie beispielsweise Überexpression des thrA-Allels,
Abschwächung
des unter aeroben Kulturbedingungen stattfindenden Threoninabbaus,
Einführung
einer mindestens partiellen Isoleucin-Bedürftigkeit
bewirkenden Mutation in das ilvA-Gen oder Wachstum in Gegenwart
von mindestens 5 g/l Threonin oder mit einer oder mehreren der weiterhin
aufgeführten
Eigenschaften versehen.
Die
genannten Eigenschaften beziehungsweise Merkmale können durch
Transformation, Transduktion oder Konjugation in gewünschte Stämme übertragen
werden.
Bei
der Methode der Transformation wird isoliertes genetisches Material
typischerweise DNA in einen Empfängerstamm
eingeführt.
Bei Bakterien der Familie Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia
coli wird die DNA dazu in vitro in Plasmid- oder Phagen-DNA eingebaut
und diese dann in den Empfängerstamm überführt. Die
entsprechenden Methoden und Arbeitsvorschriften sind im Stand der
Technik hinlänglich
bekannt und beispielsweise im Handbuch von J. Sambrook (Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) ausführlich beschrieben.
Mit
Hilfe der Methode des Gen- bzw. Allelaustauschs unter Verwendung
konditional replizierender Plasmide können definierte Mutationen
in geeignete Stämme
transferiert werden. Bei einer definierten Mutation ist mindestens
die Position im Chromosom, vorzugsweise die exakte Position der
Veränderung
der Nukleobase(n) und die Art der Änderung (Substitution, d.h.
Transition oder Transversion, Insertion oder Deletion) bekannt.
Gegebenenfalls wird die entsprechende DNA zunächst mit gebräuchlichen
Methoden sequenziert. Eine gebräuchliche
Methode zur Erzielung eines Gen- bzw. eines Allelaustauschs ist
die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989))
beschriebene, bei der das temperatursensitiv replizierende pSC101-Derivat
pMAK705 verwendet wird. Mit dieser Methode können Allele vom Plasmid in
das Chromosom überführt werden.
In gleicher Weise können
chromosomale Allele auf das Plasmid überführt werden. Andere im Stand
der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal
of Bacteriology 181: 7143–7148
(1999)), die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182: 842–847 (2000))
oder die in der WO 01/77345 beschriebene Methode können gleichfalls
benutzt werden.
Diese
Methode kann unter anderem eingesetzt werden, um rpoS-Allele, die
beispielsweise Stop-Kodons enthalten, Suppressorgene wie beispielsweise
supE, abgeschwächte
tdh-Allele, die
beispielsweise Deletionen enthalten, abgeschwächte ilvA-Allele, thrA-Allele,
die für „feed back" resistente Aspartatkinase
I – Homoserindehydrogenase
I Varianten kodieren, die rhtA23-Mutation, abgeschwächte pck-Allele, abgeschwächte Allele
des ytfP-ORF's,
abgeschwächte
yjfA-ORF's, abgeschwächte poxB-Allele,
abgeschwächte
yjgF-ORF's in gewünschte Stämme einzufügen.
Bei
der Methode der Transduktion wird ein genetisches Merkmal von einem
Donorstamm unter Verwendung eines Bacteriophagen in einen Empfängerstamm übertragen.
Diese Methode gehört
zum Stand der Technik und ist in Lehrbüchern wie beispielsweise dem
von E. A. Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th ed.,
Springer Verlag, New York, USA, 2000) beschrieben.
Bei
Escherichia coli wird typischerweise der Bacteriophage P1 für die generalisierte
Transduktion (generalized transduktion) (Lennox, Virology 1, 190–206 (1955)
verwendet. Eine Zusammenfassung über
die Methode der generalisierten Transduktion gibt der Aufsatz „Generalized
Transduktion" von
M. Masters, der im Lehrbuch von F. C. Neidhard (Escherichia coli
and Salmonella Cellular and Molecular Biology, 2nd ed., ASM Press,
Washington, DC, USA, 1996) enthalten ist. Praktische Anleitungen
sind beispielsweise im Handbuch von J. H. Miller (A Short Course
In Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York, USA, 1992) oder dem Handbuch von P. Gerhardt „Manual
of Methods for General Bacteriology" (American Society for Microbiology,
Washington, DC, USA, 1981) enthalten.
Mit
Hilfe der Transduktion lassen sich Resistenz vermittelnde oder andere
dominante genetische Eigenschaften wie beispielsweise Antibiotika-Resistenz
(zum Beispiel Kanamycin-Resistenz, Chloramphenicol-Resistenz, Rifampicin-Resistenz oder Borrelidin-Resistenz),
Resistenz gegen Antimetabolite (zum Beispiel α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure-Resistenz, α-Methyl-Serin-Resistenz
oder Diaminobernsteinsäure-Resistenz),
Resistenz gegen Metabolite (zum Beispiel Threonin-Resistenz, Homoserin-Resistenz, Glutaminsäure-Resistenz,
Methionin-Resistenz, Lysin-Resistenz oder Asparaginsäure-Resistenz)
oder auch die Fähigkeit zur
Saccharose-Verwertung in geeignete Empfängerstämme übertragen.
Die
Methode der Transduktion ist ebenfalls geeignet um sogenannte nicht
selektierbare genetische Eigenschaften wie beispielsweise Aminosäure-Auxotrophien
bzw. Bedürftigkeiten
(zum Beispiel Isoleucin-Bedürftigkeit,
Methionin-Bedürftigkeit
oder m-Diaminopimelinsäure-Bedürftigkeit),
Vitamin-Bedürftigkeiten
oder Sensitivität
gegen Antimetabolite (zum Beispiel Fluorobrenztraubensäure-Sensitivität) in Empfängerstämme einzuführen. Hierzu
verwendet man E. coli Stämme,
die in einem Abstand von ungefähr
einer Minute auf dem Chromosom das Transposon Tn10 oder Tn10kan
enthalten. Diese Stämme
sind unter dem Begriff „Singer
Kollektion" oder „Singer/Gross
Kollektion" bekannt
(Singer et al., Microbiological Reviews 53, 1–24, 1989). Diese Stämme sind
beim E. coli Genetic Stock Center der Universität Yale (New Haven, CT, USA)
allgemein verfügbar.
Weitere Angaben findet man in dem Aufsatz von M. K. B. Berlyn et
al. "Linkage Map
of Escherichia coli K-12, Edition 9", der im Lehrbuch von F. C. Neidhard
(Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology,
2nd ed., ASM Press, Washington, DC, USA, 1996) enthalten ist. In ähnlicher
Weise lassen sich nicht direkt selektierbare genetische-Eigenschaften
(zum Beispiel Fluorobrenztraubensäure-Sensitivität, Suppressormutationen) und
auch solche, deren Mutationsort nicht bekannt ist, in verschiedene
Stämme übertragen. Anleitungen
hierzu findet man unter anderem in dem Lehrbuch von J. Scaife et
al. (Genetics of Bacteria, Academic Press, London, UK, 1985), in
dem oben erwähnten
Aufsatz von M. Masters und in dem oben erwähnten Handbuch von J. H. Miller.
Das mit dem Transposon Tn10 eingeführte Tetrazyklin-Resistenzgen
kann gegebenenfalls mit der von Bochner et al. (Journal of Bacteriology
143, 926–933
(1980)) beschriebenen Methode wieder entfernt werden.
Bei
der Methode Konjugation wird genetisches Material durch Zell-Zell
Kontakt von einem Donor in einen Empfänger übertragen. Der konjugative
Transfer des F-Faktors (F: feritility), der konjugative Gentransfer unter
Verwendung von Hfr-Stämmen
(Hfr: high frequency of recombination) und Stämmen, die einen F'-Faktor (F': F prime) tragen,
gehören
zu den klassischen Verfahren der Genetik. Zusammenfassende Darstellungen findet
man unter anderem in dem Standardwerk von F. C. Neidhard (Escherichia
coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, 2nd ed., ASM
Press, Washington, DC, USA, 1996). Praktische Anleitungen sind beispielsweise
im Handbuch von J. H. Miller (A Short Course In Bacterial Genetics.
A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related
Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1992)
oder dem Handbuch von P. Gerhardt „Manual of Methods for General
Bacteriology" (American
Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) enthalten.
F-, F' und Hfr-Stämme sind
beim E. coli Genetic Stock Center der Universität Yale (New Haven, CT, USA)
allgemein verfügbar.
Die
Methode der Konjugation wurde beispielsweise eingesetzt, um die
von Thèze
und Saint-Girons (Journal of Bacteriology 118, 990–998 (1974))
beschriebene Mutation thrC1010 in den Stamm MG442 (Debabov, Advances
in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, 113–136 (2003) zu transferieren.
Im Stand der Technik beispielsweise bei Schmid et al. (Journal of
Bacteriology 151, 68–76
(1982)) oder Smith und Parsell (Journal of General Microbiology
87, 129–140
(1975)) und Livshits et al. (In: Conference on Metabolic Bacterial Plasmids.
Tartusk University Press, Tallin, Estland (1982), p 132–134 und
144–146)
sind konjugative Plasmide beschrieben, die die Fähigkeit zur Saccharoseverwertung
tragen. So berichtet Debabov (In: Proceedings of the IVth International
Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms 1982. Kodansha
Ltd, Tokyo, Japan, p 254–258)
von der Konstruktion Threonin produzierender Stämme, in die mit Hilfe der Konjugation
die Fähigkeit
zur Saccharoseverwertung eingebaut wurde.