DE10354024A1

DE10354024A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Methylotrophen

Info

Publication number: DE10354024A1
Application number: DE10354024A
Authority: DE
Inventors: Yoshiya Kawasaki Gunji; Hisashi Kawasaki Yasueda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2003-11-19
Publication date: 2004-06-09
Also published as: FR2847265B1; US20040142435A1; FR2847265A1; JP2004166595A; US7217543B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, umfassend das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure in einem Medium, wobei die L-Aminosäure in dem Medium akkumuliert wird, und Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium, wobei der Mikroorganismus ein Methanol-verwertendes Bakterium umfasst, welches den Entner-Doudoroff-Weg aufweist, bei dem die 6-Phosphogluconatdehydratase-Aktivität und/oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase-Aktivität verstärkt ist.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure sowie ein dafür verwendetes Bakterium. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Methan-verwertendes Bakterium mit verbesserter Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure unter Verwendung des Bakteriums.

Herkömmlicherweise werden L-Aminosäuren wie L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Threonin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin und L-Phenylalanin durch Fermentation unter Verwendung von Coryneform-Bakterien hergestellt, die zur Gattung Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium gehören (Amino Acid Fermentation, The Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], S. 195–215, 1986). Weiterhin können auch Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Streptomyces, Penicillium (US-Patent Nr. 3,220,929), Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Aerobacter, Candida (US-Patent Nr. 3,563,857), Escherichia (japanische Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 5-244970) und Ähnliche in der Produktion von L-Aminosäuren verwendet werden.

Um die Produktivität dieser Mikroorganismen zu verbessern, sind aus der Natur isolierte Bakterienstämme oder künstliche Mutanten der Bakterienstämme verwendet worden. Weiterhin sind verschiedene Verfahren zur Erhöhung der, L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit durch Verstärkung vor L-Aminosäure-Biosyntheseenzymen unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken offenbart worden (US-Patente 4,278,765, 4,346,170 und 6,040,160).

Methanol ist ein in der Fermentation häufig verwendetes Ausgangsmaterial, welches preisgünstig und weithin und leicht erhältlich ist. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation von Methanol sind bekannt, wobei Mikroorganismen verwendet werden, die zu der Gattung Achromobacter oder Pseudomonas (japanische Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 45-25273), Protaminobacter (japanische Patentoffenlegung (Kokoku) Nr. 49-125590), Protaminobacter oder Methanomonas (japanische Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 50-25790), Microcyclus (japanische Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 52-18886), Methylobacillus (japanische Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 4-91793), Bacillus (japanische Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 3-505284) und Ähnlichen gehören. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bis heute Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Methylophilus-Bakterien entwickelt, wobei Züchtungsverfahren unter Verwendung künstlicher Mutagenese und rekombinanter DNA verwendet wurden (japanische Patentanmeldung Nr. 11-368097).

Es sind auch Verfahren zur Erhöhung der L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit durch Einführen von Genen bekannt, die für glycolytische Enzyme wie Glucose-6-phosphatisomerase (internationale Patentveröffentlichung Nr. 01/02542 (WO 01/02542 A1)), für Fructophosphotransferase (internationale Patentveröffentlichung Nr. 01/48146 (WO 01/48146 A1)) und Enolase (internationale Patentveröffentlichung Nr. 01/02543 (WO 01/02543 A1)) codieren.

Viele Methanol-verwertende Bakterien, einschließlich Enterobakterien, weisen den Entner-Doudoroff-Weg als einen ihrer Methanolstoffwechselwege auf. Dieser Weg beinhaltet 6-Phosphogluconatdehydratase (im Folgenden als „EDD" abgekürzt), welche eine Reaktion zur Herstellung von 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat aus 6-Phosphogluconsäure katalysiert, und 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase (im Folgenden als „EDA" abgekürzt), welche 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat spaltet, um Glycerinaldehyd-3-phosphat und Brenztraubensäure zu erzeugen. Für EDD und EDA codierende Gene sind aus Escherichia coli, Zymomonas mobilis und so weiter kloniert worden, und deren Nukleotidsequenzen sind angegeben worden (Mol. Microbiol. 5, 2901–2911, J. Bacteriol. 172 (12), 7227–7240 (1990)). Die Nukleotidsequenzen des für EDD codierenden Gens (edd) sowie des für EDA codierenden Gens (eda) aus Escherichia coli sind als GenBank-Zugangsnummer L20897 registriert. Weiterhin ist die Nukleotidsequenz des eda-Gens aus Zymomonas mobilis als GenBank-Zugangsnummer X58364 registriert, und die Nukleotidsequenz des edd-Gens ist als GenBank-Zugangsnummer M60615 M37982 in der Datenbank registriert.

Es besteht eindeutig ein Bedürfnis in der Technik nach effizienten, kostengünstigen und produktiven Verfahren zur Gewinnung von Aminosäuren sowohl für landwirtschaftliche als auch Ernährungsverwendungen. Der Zusammenhang zwischen dem Entner-Doudoroff-Weg und der Produktivität von L-Aminosäuren ist zuvor nicht beschrieben worden. Die vorliegende Erfindung beschreibt diesen Zusammenhang und ein Verfahren, dies auszunutzen.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, dieses Bedürfnis in der Technik zu erfüllen und ein Verfahren zur Verbesserung der Produktivität von L-Aminosäuren in Bakterien unter Verwendung eines einzigartigen und neuen Ansatzes bereitzustellen.

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure bereitzustellen, umfassend das Kultivieren eines Mikroorganismus mit einer Fähigkeit, eine L-Aminosäure in einem Medium zu produzieren, wobei die L-Aminosäure in dem Medium angehäuft bzw. akkumuliert wird, und Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium, worin der Mikroorganismus ein Methanol-verwertendes Bakterium ist, welches den Entner-Doudoroff-Weg aufweist, und so modifiziert ist, dass die 6-Phosphogluconatdehydratase-Aktivität und/oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase-Aktivität verstärkt sind, und die L-Aminosäure aus L-Aminosäuren ausgewählt ist, welche durch einen Biosyntheseweg hergestellt werden, bei dem Brenztraubensäure als Zwischenprodukt verwertet bzw. verwendet wird.

Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, das oben beschriebene Verfahren bereitzustellen, worin das Methanol-verwertende Bakterium ein Bakterium umfasst, das zur Gattung Methylophilus gehört.

Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, das oben beschriebene Verfahren bereitzustellen, worin die 6-Phosphogluconatdehydratase-Aktivität und/oder 2-Keto-3-deoxy-6-phosphoglucönataldolase-Aktivität verstärkt wird, indem die Kopienzahl eines für 6-Phosphogluconatdehydratase und/oder 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase codierenden Gens verstärkt wird, oder eine Expressionsregulationssequenz des Gens so modifiziert wird, dass die Expression des Gens in einer Zelle des Bakteriums verstärkt werden sollte.

Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, das oben beschriebene Verfahren bereitzustellen, worin die L-Aminosäure aus L-Lysin, L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin ausgewählt ist.

Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Methanol-verwertendes Bakterium bereitzustellen, welches den Entner-Doudoroff-Weg aufweist, wobei das Bakterium so modifiziert ist, dass die 6-Phosphogluconatdehydratase-Aktivität und/oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase-Aktivität verstärkt ist, und es die Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure über einen Biosyntheseweg aufweist, bei dem Brenztraubensäure als Zwischenprodukt verwendet wird.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird hier eine L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit eines Mikroorganismus beschrieben, welcher den Entner-Doudoroff-Weg aufweist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt Konstruktionen eines Plasmids pRStac mit dem tac-Promoter sowie die Plasmide pRSlysE und pRSlysE24, bestehend aus dem Plasmid pRStac, in welches das lysE-Gen oder lysE24-Gen insertiert ist.

2 zeigt die Konstruktion eines Plasmids pRSlysEdapA, welches das lysE24-Gen und dapA*-Gen aufweist.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung richteten unter den Stoffwechselwegen zur Synthese von Brenztraubensäure aus Zuckerphosphatverbindungen ihre Aufmerksamkeit auf den Entner-Doudoroff-Weg (im Folgenden „ED-Weg"). Als Hauptstoffwechselwege von Methanol zu Brenztraubensäure, welche als Ausgangsmaterial zur Synthese von L-Aminosäuren wie L-Lysin in Gram-negativen, strikt Methanol-verwertenden Bakterien dienen, kommen der Embden-Meyerhof-Parnas-Weg (im Folgenden auch als „EMP-Weg" bezeichnet) und der Entner-Doudoroff in Betracht.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung verstärkten zunächst die enzymatischen Aktivitäten von Phosphofructokinase, Phosphoglyceratkinase etc., um die Zufuhr an Brenztraubensäure zu erhöhen. Wenn jedoch eine Verstärkung der enzymatischen Aktivität versucht wurde, konnten die Gene der entsprechenden Enzyme nicht in Zellen der Methanol-verwertenden Zielbakterien eingeführt werden, oder die Produktionsmenge des Endprodukts, L-Lysin, wurde selbst bei einer Einführung nicht beeinflusst. Daher wurden Forschungen durchgeführt, um den Durchlauf bzw. Durchfluss von an dem ED-Weg beteiligten Metaboliten zu verstärken.

Es wurden zwei Verfahren in Betracht gezogen, um die Zufuhr von Brenztraubensäure unter Verwendung des ED-Wegs zu erhöhen, nämlich (1) Ausschalten oder Abschwächen von Genen der Glucose-6-phosphatdehydrogenase etc., und (2) Verstärken des Entner-Doudoroff-Wegs. Obwohl man von beiden Verfahren gleichermaßen erwarten kann, dass sie eine Verbesserung hinsichtlich der Brenztraubensäuremenge gewährleisten, ist Verfahren (2) auf den Stoffwechsel der Brenztraubensäure- und Ribulosemonophosphat-Wege gerichtet, und wie diese durch Steuerung der Aktivitätsgrade ausbalanciert werden könnten. Es ist auch möglich, Ribulose-5-phosphat zuzuführen, welches ein Zwischenprodukt des Ribulosemonophosphat-Wegs ist, sowie Nukleinsäuren, welches Derivate der Zwischenprodukte sind. Als ein Ergebnis dieser Forschungen wurde gefunden, dass die L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit von Methanol-verwertenden Bakterien durch Verstärkung des Entner-Doudoroff-Wegs verbessert werden konnte, und die vorliegende Erfindung wurde so fertiggestellt.

<1> Bakterium der vorliegenden Erfindung

Das für die vorliegende Erfindung verwendete Methanol-verwertende Bakterium ist ein Methanol-verwertendes Bakterium, welches eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure und den Entner-Doudoroff-Weg aufweist.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure" bedeutet die Fähigkeit, eine Akkumulierung bzw. Anhäufung der L-Aminosäure in einem Medium zu bewirken, wenn das Bakterium der vorliegenden Erfindung in dem Medium kultiviert wird. Diese Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure kann eine Eigenschaft eines Wildtyp-Stamms des Methanol-verwertenden Bakteriums oder eine durch Züchten verliehene oder verstärkte Eigenschaft sein. L-Aminosäuren, auf welche die vorliegende Erfindung anwendbar ist, sind L-Aminosäuren, die über einen Biosyntheseweg unter Verwendung von Brenztraubensäure als Zwischenprodukt hergestellt werden. Spezifische Beispiele beinhalten L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Threonin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Serin, L-Alanin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin usw.

Wie in dem Beispielabschnitt gezeigt ist, zeigte ein Bakterium, bei dem der Entner-Doudoroff-Weg durch Erhöhung der Aktivitäten von EDD und EDA verstärkt war, eine vermehrte Produktion von L-Valin. Da L-Valin aus Brenztraubensäure erzeugt wird, weist eine Erhöhung der Produktion von L-Valin auf eine Erhöhung der Menge an zugeführter Brenztraubensäure hin. Es wird daher erwartet, dass das Bakterium mit dem verstärkten Entner-Doudoroff-Weg eine erhöhte Fähigkeit zur Produktion jeder L-Aminosäure aufweist, welche über einen Biosyntheseweg unter Verwertung von Brenztraubensäure als Zwischenprodukt hergestellt wird.

Spezifische Beispiele der Methanol-verwertenden Bakterien mit dem Entner-Doudoroff-Weg beinhalten Bakterien, die zu den Gattungen Methylophilus, Methylobacillus usw. gehören. Ob ein Bakterium den Entner-Doudoroff-Weg aufweist oder nicht, kann beispielsweise durch Vermischen einer Suspension aufgebrochener Zellen mit Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, 6- Phosphogluconsäure und Acetylpyridinadenindinukleotid und Detektieren von Glycerinaldehyd-3-phosphat, welches aus 6-Phosphogluconsäure als Substrat produziert wird, durch Messen der Absorptionszunahme bei 365 nm bestimmt werden. Ein Bakterium, von dem bekannt ist, dass es Glycerinaldehyd-3-phosphat produziert, weist den Entner-Doudoroff-Weg auf.

In der vorliegenden Erfindung bedeutet Methanol-verwertendes Bakterium, das heißt Methylotroph, ein Bakterium, welches sich unter Verbrauch von Methanol als Hauptkohlenstoffquelle vermehren kann, und in welchem eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure durch Modifikation zur Verstärkung der EDD- und/oder EDA-Aktivität verstärkt, ist oder dem diese Fähigkeit verliehen wurde. Spezifische Beispiele beinhalten Methylophilus-Bakterien wie Methylophilus methylotrophus und Methylobacillus-Bakterien wie Methylobacillus glycogenes und Methylobacillus flagellatum.

Spezifische Beispiele für Methylophilus-Bakterien beinhalten den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) und so weiter. Der Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) ist erhältlich von der National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse: NCIMB Lts., Torry Research Station; 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).

Weiterhin beinhalten Beispiele für Methylobacillus glycogenes den T-11-Stamm (NCIMB 11375), ATCC 21276-Stamm, ATCC 21371-Stamm, ATR80-Stamm (beschrieben in Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, S. 67–72 (1994)), A513-Stamm (beschrieben in in Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, S. 67–72 (1994)) usw. Der Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375-Stamm ist erhält lich von der National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom). Beispiele für Methylobacillus flagellatum beinhalten den KT-Stamm (beschrieben in Arch. Microbiol., 149, S. 441–446 (1988)) usw.

Das Methanol-verwertende Bakterium der vorliegenden Erfindung ist ein Bakterium, welches eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure sowie den oben erwähnten Entner-Doudoroff-Weg aufweist, und welches so modifiziert wurde, dass die EDD- und/oder EDA-Aktivität verstärkt ist. Das Bakterium der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Methanol-verwertendes Bakterium, welches so modifiziert wurde, dass die Aktivitäten sowohl von EDD als auch von EDA verstärkt sind.

Der Ausdruck „so modifiziert, dass die EDD- oder EDA-Aktivität verstärkt ist" bedeutet, dass die EDD- oder EDA-Aktivität pro Zelle gegenüber der eines Methanol-verwertenden Bakteriums vom Wildtyp erhöht wurde. Beispielsweise sind solche umfasst, bei denen die Anzahl der EDD- oder EDA-Moleküle pro Zelle erhöht ist, und solche, bei denen die spezifische Aktivität von EDD oder EDA pro EDD- oder EDA-Molekül erhöht ist usw. Weiterhin sollte das Methanol-verwertende Bakterium vom Wildtyp mit einem Methanol-verwertenden Bakterium verglichen werden, das nicht irgendeiner Manipulation zur Verstärkung der EDD- oder EDA-Aktivität unterzogen wurde.

Die Verstärkung der EDD- und/oder EDA-Aktivität in einem Bakterium kann erreicht werden, indem die Kopienzahl eines für EDD und/oder EDA codierenden Gens erhöht wird. Beispiels weise kann eine rekombinante DNA hergestellt werden, indem ein für EDD und/oder EDR codierendes Genfragment mit einem Vektor ligiert wird, der in einem Zielbakterium funktioniert, vorzugsweise einem Vektor mit vielfacher Kopienzahl, und kann zur Transformation in das Bakterium eingeführt werden. Wenn sowohl die Aktivitäten von EDD und EDA verstärkt werden sollen, können das für EDD codierende Genfragment und das für EDA codierende Genfragment separat in verschiedene Vektoren einbezogen. werden, sie werden jedoch bevorzugt in den gleichen Vektor einbezogen. Die rekombinante DNA kann in ein Bakterium mit einer L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit eingeführt. werden. Alternativ kann die rekombinante DNA in ein Wildtyp-Bakterium eingeführt werden, um einen transformierten Stamm zu erhalten, und dem transformierten Stamm kann dann die L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit verliehen werden.

Jedes der aus Bakterien, die den Entner-Doudoroff-Weg aufweisen, stammenden Gene kann als das Gen, welches EDD codiert und als das Gen, welches EDA codiert, verwendet werden. Insbesondere sind aus Escherichia-Bakterien stammende Gene durch die vorliegende Erfindung umfasst. Es wurde berichtet, dass das aus Escherichia coli abgeleitete, für EDD codierende Gen (edd) und das für EDA codierende Gen (eda), ein Operon bilden (J. Bacteriol., 174 (14): 4838–46, Juli 1992). Im Folgenden wird das für EDD codierende Gen als edd bezeichnet, und das für EDA codierende Gen wird als eda bezeichnet. Weiterhin ist auch von solchen Genen aus Bakterien der Gattung Zymomonas berichtet worden, und das edd-Gen und das eda-Gen können mittels PCR (Polymerase Kettenreaktion, siehe White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989;) erhalten werden, wobei Primer verwendet werden, die auf Grundlage der Sequenzen solcher Gene hergestellt werden, oder durch Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die auf Grundlage der zuvor erwähnten Gensequenzen hergestellt wurde. Beispielsweise kann ein Operonfragment, welches die edd- und eda-Gene von Escherichia coli enthält, mittels PCR unter Verwendung der Primer edd-F (SEQ ID NO: 11) und eda-R (SEQ ID NO: 12) erhalten werden. Das edd-Gen und eda-Gen anderer Mikroorganismen kann auf ähnliche Weise erhalten werden. Die Hybridisierungsbedingung wird beispielhaft durch eine Bedingung angegeben, bei welcher ein Waschen bei einer Salzkonzen-tration durchgeführt wird, entsprechend 1 × SSC, 0,1 × SDS, bevorzugt 0,1 × SSC, 0,1 % SDS, bei 60°C.

Das verwendete edd-Gen und eda-Gen sind weiterhin nicht auf Wildtyp-Gene beschränkt, sondern die vorliegende Erfindung umfasst auch Mutanten oder künstlich modifizierte Gene, welche für Genprodukte codieren, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Ähnlichem einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen, solange die Funktionen der codierten EDD und EDA nicht vermindert werden. Obwohl die Anzahl der hier genannten „mehreren" Aminosäuren in Abhängigkeit der Position oder des Typs der Aminosäurereste in einer dreidimensionalen Struktur eines Proteins variiert, kann sie insbesondere 2 bis 60, bevorzugt 2 bis 40, bevorzugter 2 bis 20, betragen. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung als DNA, die für ein im Wesentlichen zu den zuvor genannten EDD und/oder EDA identisches Protein codiert, eine solche DNA, die mit Nukleotidsequenzen eines bekannten edd- oder eda-Gens hybridisierbar ist (zum Beispiel GenBank Zugang L20897, X58364, M60615, M37982) oder eine Sonde, die aus diesen Nukleotidsequenzen unter stringenten Bedingungen herstellbar ist und für ein Protein mit einer ähnlichen Aktivität zu der von EDD oder EDA codiert.

„Stringente Bedingungen" bedeuten Bedingungen, unter welchen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, diese Bedingung unter Verwendung numerischer Werte klar auszudrücken. Die stringenten Bedingungen beinhalten jedoch beispielsweise eine Bedingung, unter welcher DNA mit hoher Homologie, beispielsweise DNA mit einer Homologie von 70 % oder mehr, bevorzugt 80 % oder mehr, bevorzugter 90 oder mehr, am bevorzugtesten 95 % oder mehr, miteinander hybridisieren, DNA mit einer niedrigeren Homologie als oben jedoch nicht miteinander hybridisieren. Alternativ werden stringente Bedingungen durch Bedingungen ausgedrückt, unter welchen DNA miteinander bei einer Salzkonzentration, die typischen Waschbedingungen der Southern-Hybridisierung entspricht, hybridisieren, d.h. 1 × SSC, 0,1 % SDS, bevorzugt 0,1 × SSC, 0,1 % SDS, bei 60°C.

Chromosomale DNA kann aus einem Bakterium als DNA-Donor beispielsweise durch das Verfahren von Saito und Miura (siehe H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, herausgegeben von der Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, S. 97–98, Baifukan, 1992) und Ähnliche hergestellt werden.

Wenn eine rekombinante DNA durch Ligation der mittels PCR amplifizierten edd- und/oder eda-Gene mit einer Vektor-DNA, die in einer Zelle von Escherichia coli oder Ähnlichem autonom replizierbar ist, hergestellt wird und in Escherichia coli eingeführt wird, werden die nachfolgenden Vorgänge leichter. Beispiele der in der Escherichia coli Zelle autonom replizierbaren Vektoren beinhalten pMW219, pSTV28, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHS398, RSF1010, pBR322, pACYC184 und so weiter.

Um eine wie oben beschrieben hergestellte rekombinante DNA in ein Methylophilus-Bakterium einzuführen, kann jedes Verfahren verwendet werden, solange es eine ausreichende Transformationseffizienz gewährleistet. Beispielsweise kann die Elektroporation verwendet werden (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)).

Die Kopienzahl des edd- und/oder eda-Gens kann auch erhöht werden, indem ermöglicht wird, dass viele Kopien dieser Gene in der chromosomalen DNA eines Bakteriums existieren. Um vielfache Kopien des edd- und/oder eda-Gens in die chromosomale DNA eines Bakteriums einzuführen, wird eine homologe Rekombination unter Verwendung einer Sequenz durchgeführt, deren vielfache Kopien in der chromosomalen DNA als Ziel existieren. Als Sequenzen, von denen vielfache Kopien in der chromosomalen DNA existieren, kann eine repetitive DNA oder ein invertierter Repeat, der an einem Ende eines transponiblen Elements vorliegt, verwendet werden. Weiterhin ist es auch möglich, wie in der japanischen Patentoffenlegung Nr. 2-109985 offenbart ist, das edd- und/oder eda-Gen in ein Transposon einzubeziehen und zu ermöglichen, dass dieses zur Einführung vielfacher Kopien der Gene in die chromosomale DNA transferiert wird.

Neben den zuvor erwähnten Genamplifizierungsverfahren kann die Verstärkung der EDD- und/oder EDA-Aktivitäten auch erreicht werden, indem eine Expressionsregulationssequenz, wie beispielsweise ein Promoter des edd- und/oder eda-Gens in der chromosomalen DNA oder einem Plasmid, durch eine stärkere ausgetauscht wird. Beispielsweise sind der lac-Promoter, trp-Promoter, trc-Promoter und so weiter als starke Promoter bekannt. Weiterhin kann der Promoter, wie in der internationalen Patentveröffentlichung WO00/18935, offenbart ist, durch Einführung einer Substitution mehrerer Nukleotide in den Promoterbereich des edd- und/oder eda-Gens modifiziert werden, damit er stärker wird. Die Substitution oder Modifikation dieser Promoter verstärkt die Expression des edd- und/oder eda-Gens, und somit werden die Aktivitäten von EDD und/oder EDA verstärkt. Eine Modifikation dieser Expressionsregulationssequenzen kann mit einer Erhöhung der Kopienzahl des edd- und/oder eda-Gens kombiniert werden.

Die Verstärkung der Aktivitäten von EDD und EDA kann bestätigt werden, indem eine Suspension aufgebrochener Zellen mit Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase und 6-Phosphogluconsäure vermischt wird, und das aus 6-Phosphogluconsäure als Substrat hergestellte Glycerinaldehyd-3-phosphat gemessen wird. In dieser Reaktion kann die EDD-Aktivität durch Quantifizieren von 6-Phosphogluconsäure, welche nach der Reaktion verbleibt, unter Verwendung von 6-Phosphogluconatdehydrogenase gemessen werden, oder durch Quantifizieren von Brenztraubensäure, die in Gegenwart überschüssiger 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase produziert wird, wobei Lactatdehydrogenase verwendet wird. Die 6-Phosphogluconsäure oder Brenztraubensäure kann als Erhöhung von NADH in der Dehydrogenasereaktion quantifiziert werden. Weiterhin kann die EDA-Aktivität auch durch Detektion von aus 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat als Substrat erzeugter Brenztraubensäure unter Verwendung von Lactatdehydrogenase gemessen werden.

<2> Methanol-verwertendes Bakterium der vorliegenden Erfindung

Das Bakterium der vorliegenden Erfindung ist ein Methanol-verwertendes Bakterium, welches so modifiziert ist, dass die EDD- und/oder EDA-Aktivität verstärkt sind, und weist eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure über einen Biosyntheseweg auf, bei dem Brenztraubensäure ein Zwischenprodukt ist. Beispiele der umfassten L-Aminosäuren beinhalten L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Threonin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Serin, L-Alanin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin und so weiter.

Das Bakterium der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden, indem ein Methanol-verwertendes Bakterium mit einer Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure so modifiziert wird, dass die EDD- und/oder EDA-Aktivität verstärkt wird. Das Methanol-verwertende Bakterium der vorliegenden Erfindung kann auch erhalten werden, indem einem Methanol-assimilierenden Bakterium, das so modifiziert wurde, dass die EDD und/oder EDA-Aktivität verstärkt sind, eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure verliehen wird. Weiterhin kann das Methanol-verwertende Bakterium der vorliegenden Erfindung ein Bakterium sein, dem eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure aufgrund einer solchen Modifikation verliehen wurde, dass die EDD- und/oder EDA-Aktivität verbessert sein sollten.

Ein Methanol-verwertendes Bakterium mit einer L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit kann erhalten werden, indem einem Wildtyp-Stamm eines Methanol-verwertenden Bakteriums eine L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit verliehen wird. Um eine L- Aminosäure-Produktionsfähigkeit zu verleihen, können Verfahren eingesetzt werden, die üblicherweise zum Züchten von Coryneform-Bakterien, Escherichia-Bakterien usw. verwendet werden, beispielsweise der Erwerb bzw. die Beschaffung auxotropher mutierten Stämme, Analogon-resistenter Stämme oder von Stämmen mit mutierter Stoffwechselregulierung, die Bildung rekombinanter Stämme, in welchen ein L-Aminosäure-Biosynthesesystemenzym verstärkt ist (siehe „Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1. Auflage, veröffentlicht am 30. Mai 1986, S. 77–100) usw. Beim Züchten der L-Aminosäure produzierenden Bakterien können die Eigenschaften der Auxotrophie, Analogon-Resistenz, Mutation der Stoffwechselregulierung usw. einzeln verliehen werden, oder zwei oder mehrere hiervon können in Kombination verliehen werden. Die Biosynthesesystemenzyme können einzeln verstärkt werden, oder zwei oder mehrere hiervon können in Kombination verstärkt werden. Weiterhin kann das Versehen mit Eigenschaften, einschließlich Auxotrophie, Analogon-Resistenz, Mutation der Stoffwechselregulierung usw. mit der Verstärkung des Biosynthesesystemenzyms kombiniert werden.

Zum Beispiel können L-Lysin-erzeugende Bakterien als Mutantenstämme gezüchtet werden, welche eine Auxotrophie für L-Homoserin oder L-Threonin und L-Methionin aufweisen (japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 48-28078 und 56-6499), Mutantenstämme, die eine Auxotrophie für Inositol oder Essigsäure aufweisen (japanische Patentoffenlegungen Nrn. 55-9784 und 56-8692), oder Mutantenstämme die resistent gegen Oxalysin, Lysinhydroxamat, S-(2-Aminoethyl)-cystein, γ-Methyllysin, α-Chlorcaprolactam, DL-α-Amino-ε-caprolactam, α- Aminolauryllactam, ein Asparaginsäure-Analogon, ein Sulfa-Arzneimittel, ein Chinoid oder N-Lauroylleucin sind.

Im Folgenden wird ein Verfahren zur Verleihung oder Verstärkung einer Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure durch Verstärkung der Expression eines Gens für ein Enzym in einem L-Aminosäurebiosynthesesystem beschrieben.

Eine L-Lysin-Produktionsfähigkeit kann beispielsweise verliehen werden, indem die Aktivitäten von Dihydrodipicolinatsynthase und Aspartokinase verstärkt werden.

Die Aktivitäten von Dihydrodipicolinatsynthase und Aspartokinase in einem Methanol-verwertenden Bakterium können verstärkt werden, indem der Methanol-verwertende Bakterienwirt mit einer rekombinanten DNA transformiert wird, welche durch Ligieren eines Dihydrodipicolinatsynthase codierenden Genfragments und eines Aspartokinase codierenden Genfragments mit einem Vektor, der in dem Methanol-verwertenden Bakterium funktioniert, vorzugsweise einem Vektor mit hoher Kopienzahl, hergestellt wird. Als ein Ergebnis der Erhöhung der Kopienzahl des Dihydrodipicolinatsynthase codierenden Gens und des Aspartokinase codierenden Gens in Zellen des transformierten Stamms können die Aktivitäten dieser Enzyme verstärkt werden. Im Folgenden werden Dihydrodipicolinatsynthase, Aspartokinase und Aspartokinase III auch jeweils als DDPS, AK und AKIII bezeichnet.

Jeder Mikroorganismus kann als Mikroorganismus zur Bereitstellung eines Gens, das DDPS codiert, und eines Gens, das AK codiert, verwendet werden, solange der Mikroorganismus eine DDPS-Aktivität und AK-Aktivität in einem Methanol-verwer tenden Bakterium exprimieren kann. Solche Mikroorganismen können Wildtyp-Stämme oder daraus abgeleitete mutierte Stämme sein. Insbesondere beinhalten Beispiele solcher Mikroorganismen den E. coli (Escherichia coli) K-12-Stamm und den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) und so weiter. Da Nukleotidsequenzen für das aus Escherichia-Bakterien stammende, DDPS codierende Gen (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)) und das aus Escherichia-Bakterien stammende, AKIII codierende Gen (lysC, Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. und Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)) bekannt sind, können diese Gene durch PCR unter Verwendung von Primern erhalten werden, die auf Grundlage der Nukleotidsequenzen dieser Gene und chromosomaler DNA von Mikroorganismen wie E. coli K-12 als Templat synthetisiert werden. Als spezifische Beispiele werden die aus E. coli abgeleiteten dapA und lysC unten beschrieben. Die für die vorliegende Erfindung verwendeten Gene sind jedoch nicht auf diese beschränkt.

In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass DDPS und AK keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegen. Es ist bekannt, dass aus E. coli stammende Wildtyp-DDPS einer Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, und dass aus E. coli stammende Wildtyp-AKIII einer Suppression und Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt. Daher codieren dapA und lysC, welche in ein Methanol-verwertendes Bakterium eingeführt werden, bevorzugt DDPS und AKIII mit einer Mutation, welche jeweils die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausschaltet. Im Folgenden kann die DDPS, welche eine Mutation aufweist, welche die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausschaltet, auch als „mutierte DDPS" bezeichnet werden, und eine DNA, welche die mutierte DDPS codiert, kann auch als „mutiertes dapA" oder „dapA*" bezeichnet werden. Die von E. coli abgeleitete AKIII, welche eine Mutation aufweist, die die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausschaltet, kann auch als „mutierte AKIII" bezeichnet werden, und die DNA, welche die mutierte AKIII codiert, kann auch als „mutiertes lysC" bezeichnet werden.

Es ist in der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise erforderlich, dass DDPS und AK mutiert werden. Es ist bekannt, dass die von Corynebacterium-Bakterien stammende DDPS keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt.

Eine aus E. coli stammende Nukleotidsequenz von Wildtyp-dapA ist beispielhaft in SEQ ID NO: 13 gezeigt, und die durch diese Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz der Wildtyp-DDPS ist beispielhaft in SEQ ID NO: 14 gezeigt.

Die DNA, welche die mutierte DDPS codiert, die keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, kann eine DNA sein, die DDPS mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 codiert, wobei jedoch der Histidinrest an Position 118 durch einen Tyrosinrest substituiert ist. Weiterhin kann die DNA, welche die mutierte AKIII codiert, die keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, eine DNA sein, die AKIII codiert, wobei der Threoninrest an Position 352 durch einen Isoleucinrest substituiert ist (US-Patent 6,040,160).

Das zum Genklonieren verwendete Plasmid kann irgendein Plasmid sein, solange es sich in Mikroorganismen wie Escherichia-Bakterien replizieren kann, und beinhaltet pBR322, pTWV228, pMW119, pUC19 usw., ist jedoch nicht hierauf beschränkt.

Der in Methanol-verwertenden Bakterien funktionierende Vektor ist beispielsweise ein Plasmid, welches sich in Methanol-verwertenden Bakterien autonom replizieren kann. Insbesondere sind RSF1010, welches ein Vektor mit breitem Wirtsspektrum ist, sowie Derivate hiervon, z.B. pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16, 161–167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) usw. umfasst.

Um eine rekombinante DNA durch Ligation von dapA und lysC an einen Vektor, der in einem Methanol-verwertenden Bakterium funktioniert, herzustellen, wird der Vektor mit einem für die Enden eines DNA-Fragments, welches dapA und lysC enthält, geeigneten Restriktionsenzym verdaut. Die Ligation wird üblicherweise unter Verwendung einer Ligase wie T4-DNA-Ligase durchgeführt. dapA und lysC können in getrennte Vektoren oder den gleichen Vektor einbezogen werden.

Ein Plasmid mit breitem Wirtsspektrum RSFD80 ist bekannt (WO95/16042) und kann in der vorliegenden Erfindung als das Plasmid mit einem mutierten dapA, das für eine mutierte DDPS codiert, und einem mutierten lysC, das für eine mutierte AKIII codiert, verwendet werden. Der mit diesem Plasmid transformierte E. coli JM109-Stamm wurde als AJ12396 bezeichnet und beim National Institute of Bioscience of Advanced Industrial Science and Technology am 28. Oktober 1993 hinterlegt, wobei eine Zugangsnummer FERM P-13936 erhalten wurde. Dann wurde die Hinterlegung am 1. November 1994 in eine internationalen Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags umgewandelt, wobei eine Zugangsnummer FERM BP-4859 erhalten wurde. RSFD80 kann aus dem AJ12396-Stamm unter Verwendung bekannter Verfahren erhalten werden.

Das in RSFD80 enthaltene mutierte dapA weist eine Sequenz auf, die im Wesentlichen aus einer Nukleotidsequenz des in SEQ ID NO: 13 gezeigten Wildtyp-dapA besteht, wobei C mit der Nukleotidnummer 623 zu T verändert ist. Als Ergebnis weist die codierte mutierte DDPS eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 auf, ausgenommen dass der Histidinrest an Position 118 zu einem Tyrosinrest verändert ist. Weiterhin weist das in RSFD80 enthaltene mutierte lysC eine Nukleotidsequenz von Wildtyp-lysC auf, in welcher der Nukleotidrest C an Position 1638 zu T verändert ist (US-Patent 6,040,160). Als Ergebnis weist die codierte mutierte AKIII eine Sequenz auf, bei der der Threoninrest an Position 352 durch einen Isoleucinrest substituiert ist.

Jedes Verfahren kann verwendet werden, um die wie oben beschrieben hergestellte rekombinante DNA in ein Methanol-verwertendes Bakterium einzuführen, solange eine ausreichende Transfor-mationseffizienz gewährleistet wird. Beispielsweise kann die Elektroporation verwendet werden (Canadian Journal of Micro-biology, 43, 197 (1997)).

Die DDPS-Aktivität und AK-Aktivität kann auch verstärkt werden, indem ermöglicht wird, dass vielfache Kopien von dapA und lysC auf chromosomaler DNA eines Methanol-verwertenden Bakteriums existieren. Um vielfache Kopien von dapA und lysC in chromosomale DNA eines Methanol-verwertenden Bakteriums einzuführen, wird eine homologe Rekombination unter Verwendung einer Sequenz durchgeführt, die auf chromosomaler DNA in vielfacher Kopienzahl vorliegt, als Ziel. Eine repetitive DNA oder ein invertierter Repeat, der am Ende eines transponiblen Elements vorliegt, kann als Sequenz verwendet werden, die in vielfacher Kopienzahl auf chromosomaler DNA vorliegt. Alternativ können vielfache Kopien von dapA und/oder lysC in die chromosomale DNA eingeführt werden, indem diese in ein Transposon einbezogen werden und dieses transferiert wird, wie in der japanischen Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 2-109985 offenbart ist. Bei beiden Verfahren werden die Aktivitäten von DDPS und AK als Ergebnis der erhöhten Kopienzahlen von dapA und lysC in transformierten Stämmen verstärkt.

Neben der obigen Genamplifizierung kann das gewünschte Gen verstärkt werden, indem eine Expressionskontrollsequenz, wie Promoter von dapA und lysC, durch stärkere ausgetauscht werden (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 1-215280). Als solche starke Promoter sind z.B. der lac-Promoter, trp-Promoter, trc-Promoter, tac-Promoter, PR-Promoter und PL Promoter von Lambdaphagen, der tet-Promoter, amyE-Promoter, spac-Promoter usw. bekannt. Die Substitution dieser Promoter verstärkt die Expression des gewünschten Gens, womit die Aktivität des durch das gewünschte Genprodukt codierten Enzyms verstärkt wird. Die Verstärkung der Expressionskontrollsequenz kann mit einer Erhöhung der Kopienzahl des gewünschten Gens kombiniert werden.

Um eine rekombinante DNA durch Ligieren eines Genfragments und eines Vektors herzustellen, wird der Vektor mit einem dem Terminus des Genfragments entsprechenden Restriktionsenzym verdaut. Die Ligation wird üblicherweise durch eine Ligase wie T4 DNA-Ligase durchgeführt. Als Verfahren zur Verdauung, Ligation und Weiterem von DNA, Herstellung chromosomaler DNA, PCR, Herstellung von Plasmid-DNA, Transformation, Konstruk tion von Oligonukleotiden, die als Primer verwendet werden, usw. können dem Fachmann bekannte übliche Verfahren eingesetzt werden. Solche Verfahren sind in Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., „Molecular Cloning A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) usw. beschrieben.

Zusätzlich zur Verstärkung von DDPS und AK können auch andere Enzyme, die an der L-Lysin-Biosynthese beteiligt sind, verstärkt werden. Solche Enzyme beinhalten Enzyme des Diaminopimelatwegs, wie Dihydrodipicolinatreductase, Diaminopimelatdecarboxylase, Diaminopimelatdehydrogenase (siehe WO96/40934 hinsichtlich sämtlicher voranstehender Enzyme), Phosphoenolpyruvatcarboxylase (japanische Patentoffenlegung Nr. 60-87788), Aspartataminotransferase (japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-102028), Diaminopimelatepimerase und Aspartatsemialdehyddehydrogenase, Enzyme des Aminoadipatwegs wie Homoaconitathydratase usw.

Aspartokinase, Aspartstsemialdehyddehydrogenase, Dihydrodipicolinatsynthase, Dihydrodipicolinatreductase und Diaminopimelatdecarboxylase, abgeleitet von Methylophilus methylotrophus als Methanol-verwertendes Bakterium, sind in WO 00/61723 beschrieben.

Weiterhin können die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung eine verminderte Aktivität eines Enzyms aufweisen, welches eine Reaktion zur Bildung einer anderen Verbindung als L-Lysin durch Abzweigung vom Biosyntheseweg für L-Lysin katalysiert, oder ihnen kann ein solches Enzym fehlen. Illustrative Beispiele des Enzyms, welches eine Reaktion der Bildung einer anderen Verbindung als L-Lysin durch Abzweigung vom Biosyntheseweg für L-Lysin katalysiert, beinhalten Homoserindehydrogenase (siehe WO95/23864).

Die zuvor erwähnten Verfahren zur Verstärkung der Aktivitäten von Enzymen, die an der L-Lysinbiosynthese beteiligt sind, können ähnlich für andere L-Aminosäuren verwendet werden. Das Methanol-verwertende Bakterium der vorliegenden Erfindung kann einen Wildtyp-Phänotyp aufweisen, abgesehen davon, dass es so modifiziert ist, dass die EDD- und/oder EDA-Aktivität verstärkt ist, solange es eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure aufweist.

Weiterhin kann auch eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure verbessert werden, indem die Aktivität eines an der extrazellulären Sekretion der L-Aminosäure beteiligten Proteins verstärkt wird. Beispielsweise ist als ein an der extrazellulären Sekretion von L-Lysin beteiligtes Protein das durch das lysE-Gen codierte LysE-Protein bekannt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten, dass obwohl ein aus Brevibacterium-Bakterien stammendes Wildtyp-lysE in Methylophilus-Bakterien oder Methylobacillus-Bakterien überhaupt nicht funktionierte, dieses so modifiziert werden kann, dass es in einem Methylotroph funktioniert. Beispiele solcher Varianten des LysE-Proteins beinhalten LysE24, und sind im Beispielabschnitt beschrieben.

Das durch das lysE-Gen codierte LysE-Protein weist sechs hydrophobe Helixbereiche auf. Es wird angenommen, dass einige dieser hydrophoben Bereiche Transmembrandomänen sind. Es wird weiterhin angenommen, dass ein Bereich zwischen den dritten und vierten Bereichen vom N-Terminus hydrophil ist und eine Loop-Struktur aufweist. In der vorliegenden Erfindung wird dieser hydrophile Bereich ein Loop-Bereich genannt. Die Nukleotidsequenz von Wildtyp-lysE und die Aminosäuresequenz des LysE-Proteins von Brevibacterium lactofermentum sind in SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigt. In dieser Aminosäuresequenz entsprechen hydrophobe Helixbereiche den Aminosäurenummern 5 bis 20, 37 bis 58, 67 bis 93, 146 bis 168, 181 bis 203 und 211 bis 232. Der Loop-Bereich entspricht den Aminosäurenummern 94 bis 145.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung ermittelten, dass das lysE-Gen bei Exprimierung in einem Methanol-verwertenden Bakterium letal war, jedoch eine DNA, die eine Variante des LysE-Proteins ohne den Loop-Bereich codierte oder im Wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices bestand, die Sekretion von L-Lysin und/oder L-Arginin zur Außenseite einer Zelle des Methanol-verwertenden Bakteriums förderte. lysE24 codiert ein solches mutiertes LysE-Protein, das den Wildtyp-Loop-Bereich nicht aufweist, oder ein mutiertes LysE-Protein, das im Wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices besteht.

Das zuvor erwähnte mutierte LysE ist nicht besonders eingeschränkt, solange es ein oder mehrere hydrophobe Helices aufweist und die extrazelluläre Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder beider dieser L-Aminosäuren bei Einführung in ein Methanol-verwertendes Bakterium fördert. Insbesondere ist eine DNA umfasst, die für ein mutiertes LysE codiert, welches alle der ersten bis sechsten hydrophoben Helices ab dem N-Terminus aufweist. Noch spezifischer ist eine DNA umfasst, die für ein Peptid codiert, welches die ersten bis dritten hydro-phoben Helices ab dem N-Terminus enthält, sowie ein Peptid, das die vierten bis sechsten hydrophoben Helices ab dem N-Terminus enthält. Das zuvor erwähnte lysE24 ist ein Beispiel des mutierten lysE, das ein Peptid codiert, welches die ersten bis dritten hydrophoben Helices enthält, sowie ein Peptid, das die vierten bis sechsten hydrophoben Helices enthält. Das lysE24-Gen resultiert aus der Einführung eines Stoppcodons stromabwärts des für die dritte hydrophobe Helix codierenden Bereichs. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten, dass wenn der Bereich stromabwärts dieses Stoppcodons deletiert war, der das lysE24-Gen enthaltende Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm nicht zu einer Akkumulierung von L-Lysin im Medium führte. Es wurde daher gefolgert, dass ein Peptid, das die ersten bis dritten hydrophoben Helices enthält, und ein Peptid, das die vierten bis sechsten hydrophoben Helices enthält, separat translatiert werden und in einem Methanol-verwertenden Bakterium funktionieren. Unabhängig davon wird, wenn das lysE24-Gen in ein Methanol-verwertendes Bakterium eingeführt wird, die erzeugte Menge an L-Lysin oder L-Arginin zunehmen.

Jeder Mikroorganismus kann als Ursprungsmikroorganismus für eine DNA verwendet werden, die ein an der Sekretion von L-Lysin zur Außenseite einer Zelle beteiligtes Protein codiert, d.h. das lysE-Gen oder ein homologes Gen hiervon, solange der gewählte Mikroorganismus Varianten der Gene aufweist, welche die L-Lysin-Sekretionsaktivität in einem Methanol-verwertenden Bakterium exprimieren können. Insbesondere sind Beispiele solcher Mikroorganismen Coryneform-Bakterien wie Corynebacterium glutamicum und Brevibacterium lactofermentum, Escherichia-Bakterien wie Escherichia coli, Pseudomonas-Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium-Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis und so weiter, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.

Wenn die Expression des Aminosäuresekretionsgens in einem Methanol-verwertenden Bakterium verstärkt ist, kann eine rekombinante DNA hergestellt werden, indem deren Genfragment an einen Vektor ligiert wird, der in Methanol-verwertenden Bakterien funktioniert, bevorzugt einen Vektor mit hoher Kopienzahl, und in das Methanol-verwertende Bakterium transformiert wird. Alternativ kann das Gen in ein Transposon einbezogen und in ein Chromosom eingeführt werden. Weiterhin ist es auch möglich, einen Promoter stromaufwärts von dem Gen, welches eine starke Transkription in einem Methanol-verwertenden Bakterium induziert, zu ligieren.

<3> Herstellung von L-Aminosäuren

Eine L-Aminosäure kann hergestellt werden, indem ein Methanol-verwertendes Bakterium mit einer Fähigkeit zur Produktion der L-Aminosäure, das wie oben beschrieben erhalten wurde, in einem Medium kultiviert wird, wobei die L-Aminosäure in der Kultur produziert und akkumuliert wird, und die L-Aminosäure aus der Kultur gewonnen wird.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus kann durch ein Verfahren kultiviert werden, das typischerweise zur Kultivierung eines Methanol-verwertenden Mikroorganismus verwendet wird. Das für die vorliegende Erfindung verwendete Medium kann entweder ein natürliches oder ein synthetisches Medium sein, solange es eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere Spurenmengen organischer Bestandteile, wenn erforderlich, enthält.

Wenn Methanol als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, können L-Lysin oder L-Arginin bei geringen Kosten hergestellt werden. Wenn Methanol als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, wird es einem Medium in einem Anteil von 0,001 bis 30 zugegeben. Als Stickstoffquelle wird Ammoniumsulfat oder Ähnliches verwendet, indem dieses dem Medium zugegeben wird. Abgesehen davon können geringe Mengen der Spurenmengenbestandteile wie Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat und so weiter zugegeben werden.

Die Kultur wird unter aeroben Bedingungen unter Schütteln, Belüften durch Rühren oder Ähnliches bei einem pH von 5 bis 9. und einer Temperatur von 20 bis 45°C durchgeführt und ist üblicherweise nach 24 bis 120 Stunden beendet.

Die Gewinnung von L-Lysin oder L-Arginin aus der Kultur kann typischerweise durch eine Kombination bekannter Verfahren erreicht werden, wie beispielsweise durch Verwendung eines Ionenaustauschharzes, durch Fällung und andere bekannte Verfahren.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlicher mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben.
Die in den folgenden Beispielen verwendeten Reagenzien wurden von Wako Pure Chemicals oder Nacalai Tesque erhalten, wenn nicht anders angegeben. Die Zusammensetzungen der in jedem Beispiel verwendeten Medien sind unten gezeigt. Der pH wurde bei sämtlichen Medien mit NaOH oder HCl eingestellt. LB-Medium:

Trypton-Pepton (Difco) 10 g/l

Hefeextrakt (Difco) 5 g/l

NaCl 10 g/l

pH 7,0
Diese wurden bei 120°C für 20 Minuten dampfsterilisiert. LB-Agarmedium: LB-Medium

Bacto-Agar 15 g/l

Diese wurden bei 120°C für 20 Minuten dampfsterilisiert. SEII-Medium:

K₂HPO₄	1,9 g/l
NaH₂PO₄	1,56 g/l
MgSO₄ · 7H₂O	0,2 g/l
(NH₄)₂SO₄	5 g/l
CuSO₄ · 5H₂0	5 μg/l
MnSO₄ · 5H₂O	25 μg/l
ZnSO₄ · 7H₂O	23 μg/l
CaCl₂ · 2H₂O	72 mg/l
FeCl₃ · 6H₂O	9, 7 mg/l
CaCO₃ (Kanto Kagaku)	30 g/l
Methanol	2 % (Vol/Vol)
pH	7,0

Andere Bestandteile als Methanol wurden einer Dampfsterilisation bei 121°C für 15 Minuten unterzogen, und Methanol wurde zugegeben, nachdem das Medium ausreichend abgekühlt war. SEII-Agarmedium:

K₂HPO₄	1,9 g/l
NaH₂PO₄	1,56 g/l
MgSO₄ · 7H₂O	0,2 g/l
(NH₄)₂SO₄	5 g/l
CuSO₄ · 5H₂O	5 μg/l
MnSO₄ · 5H₂O	25 μg/l
ZnSO₄ · 7H₂O	23 μg/l
CaCl₂ · 2H₂O	72 mg/l
FeCl₃ · 6H₂O	9,7 mg/l
Methanol	0,5 % (Vol/Vol)
pH	7,0
Bacto-Agar (Difco)	15 g/l

Andere Bestandteile als Methanol wurden einer Dampfsterilisation bei 121°C für 15 Minuten unterzogen, und Methanol wurde zugegeben, nachdem das Medium ausreichend abgekühlt war.
Beispiel 1
<1> Klonieren von Genen von Enzymen, welche den Entner-Doudoroff-Weg konstituieren
Das edd- und eda-Gen, die für die Enzyme EDD und EDA codieren, einen Teil des Entner-Doudoroff-Wegs, sind aus Escherichia coli, Zymomonas mobilis und so weiter kloniert worden. Da bekannt ist, dass Escherichia coli-Gene in dem Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm exprimierbar sind, wurde entschieden, das edd- und eda-Gen aus Escherichia coli zu klonieren und diese in einem Methylophilus-Bakterium zu exprimieren.
(1) Konstruktion eines Plasmids pMW-EDDA
edd und eda bilden in Escherichia coli ein Operon (J. Bacteriol., 174 (14): 4638–46, Juli 1992); wobei es möglich ist, dieses unter Verwendung bekannter Verfahren zu erhalten. Demgemäß wurden edd-F (SEQ ID NO: 11) und eda-R (SEQ ID NO: 12) als Primer konstruiert, welche gleichzeitig sowohl das eda- und edd-Gen amplifizieren, wenn mittels PCR unter Verwendung chromosomaler DNA des E. coli W3110-Stamms als Templat ein DNA-Fragment amplifiziert wird, welches beide Gene enthält. Eine PCR wurde unter Verwendung von Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) durchgeführt, und bestand aus einer Reaktion bei 94°C für 1 Minute, gefolgt von Reaktionen bei 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 3 Minuten, was für 30 Zyklen wiederholt wurde.
Anschließend wurde das erhaltene amplifizierte Fragment mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI vollständig verdaut, mit dem vollständig mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI verdauten Plasmid pMW219 ligiert, und zur Transformation von Escherichia coli JM109 (bezogen von Takara Shuzo) verwendet. Die erhaltenen Kolonien von Transformanten wurden in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Kanamycin enthielt, und bei 37°C für 8 Stunden unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei das Zielplasmid erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde als pMW-EDDA bezeichnet.
(2) Konstruktion eines Plasmids zur Verwendung zur Einführung von edd und eda in ein Methylophilus-Bakterium, pRSedda
Um edd und eda in ein Methylophilus-Bakterium einzuführen, wurde ein bekanntes Plasmid pRS verwendet, um das pRSedda-Plasmid zu konstruieren. pRS ist ein Plasmid, welches das Vektorsegment des pVIC40-Plasmids aufweist (internationale Patentveröffentlichung WO90/04636, internationale Patentveröffentlichung in Japanisch (Kohyo) Nr. 3-501682) und wird aus pVIC40 erhalten, indem ein DNA-Bereich deletiert wird, der das in dem Plasmid enthaltene Threoninoperon codiert. Das Plasmid pVIC40 stammt aus einem Plasmid eines Vektors mit einem breiten Wirtsspektrum pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161–167), welches ein Derivat von RSF1010 ist.
Insbesondere wurde pRS wie folgt konstruiert. Das pVIC40-Plasmid wurde mit EcoRI verdaut und zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von ungefähr 8 Kilobasenpaaren (im Folgenden als „kbp" abgekürzt), welches die Vektorseite enthielt, wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, Takara Shuzo) gewonnen. Das wie oben beschrieben hergestellte Vektorbereichfragment des pVIC40-Plasmids wurde unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) selbst-ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf das LB-Agarmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, aufge-bracht und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agar-medium erschienenen Kolonien wurden jeweils in das LB-Flüssigmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe bzw. -lösung durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRS erhalten wurde.
Dann wurde ein den tac-Promoter aufweisendes Plasmid pRStac gemäß dem in 1 gezeigten Schema aus pRS konstruiert. Das pRStac-Plasmid wurde wie folgt konstruiert. Der pRS-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI verdaut, einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von 8 Kilobasenpaaren wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, Takara Shuzo) gewonnen. Der tac-Promoterbereich wurde mittels PCR amplifiziert, wobei das pKK223-3-Plasmid (Expressionsvektor, Pharmacia) als Templat sowie die in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigten Primer verwendet wurden (ein Zyklus, bestehend aus Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 60 Sekunden, wurde für 30 Zyklen wiederholt). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Das den amplifizierten tac-Promoter enthaltende DNA-Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und anschließend an den Restriktionsenzymstellen, die zuvor in den Primern angelegt wurden, d.h. an den EcoRI- und EcoT22I-Stellen, verdaut. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit einer Phenol/Chloroform-Lösung versetzt und damit vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel getrennt. Ein DNA-Fragment von ungefähr 0,15 kbp wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 gewonnen.
Das Verdauungsprodukt des pRS-Vektors und das tac-Promoterbereichfragment, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium, welches 20 mg/l, Streptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRStac erhalten wurde. Ein Plasmid, bei dem die Transkriptionsrichtungen des Streptomycinresistenzgens auf dem pRS-Vektor und des tac-Promoters zueinander identisch waren, wurde als pRStac ausgewählt. Das pRStac-Plasmid ist ein Plasmid, das aus pRS besteht, in welches der tac-Promoter als ein Mittel zur Exprimierung der Gene insertiert wurde.
Dann wurde das oben erwähnte pRStac mit Sse8387I (Takara Shuzo) und SapI (New England Biolabs) verdaut, einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 8,0 kbp erhalten wurde. Dann wurde das oben erwähnte, in (1) konstruierte pMW-EDDA mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI verdaut, mit einer Phenol/Chloroform-Lösung versetzt und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert war, wurde die obere Schicht gewonnen, und DNA wurden mittels Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel, aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 2,9 kbp erhalten wurde.
Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektors und das wie oben beschrieben hergestellte edd- und eda-Genbereichfragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei das Zielplasmid erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde als pRSedda bezeichnet. In pRSedda waren die edd- und eda-Gene so positioniert, dass deren Transkriptionsrichtungen die gleichen sein sollten wie die des tac-Promoters.
<2> Konstruktion eines L-Lysin-produzierenden Bakteriums aus einem Methylophilus-Bakterium
Um den Einfluss des PRSedda-Plasmids auf die L-Lysin-Produktion zu untersuchen, wurde das Plasmid pBBR-lysEdapA konstruiert, welches mit einem aus pRS abgeleiteten Vektor koexistieren kann, und eine Amplifizierung von Genen ermöglicht, die für ein Protein mit L-Lysin-Sekretionsaktivität und das DDPS-Enzym codieren.
(1) Konstruktion von pRSlysE
Ein lysE-Gen, welches ein homologes Gen des die Sekretion von L-Lysin erleichternden Gens ist, das für Corynebacterium glutamicum R127 bekannt ist (Vrljic M., Sahm H., Eggerling L., Molecular Microbiology 22: 815–826 (1996)), wurde aus einem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stamm kloniert, und es wurde versucht, dieses in einem Methylophilus-Bakterium zu exprimieren.
Das wie oben beschrieben erhaltene pRStac wurde mit Sse8387I (Takara Shuzo) und SapI (New England Biolabs) verdaut, einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 9,0 kbp erhalten wurde.
Das lysE-Genfragment wurde mittels PCR unter Verwendung eines Chromosoms, das aus dem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stamm (ATCC13869) extrahiert wurde, als Templat, und den in SEQ ID NO: 5 und 6 gezeigten Primern amplifiziert (Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 90 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Um eine Expression des lysE-Gens in einem Methylophilus-Bakterium möglich zu machen, wurden in der obigen Amplifizierung die Primer so ausgelegt, dass Nukleotide von 9 bis 15 bp ab dem Translationsinitiierungscodon des lysE-Gens durch eine Sequenz ausgetauscht sein sollten, von der bekannt ist, dass sie in einem Methylophilus-Bakterium funktioniert (Wyborn, N.R., Mills, J., Williamis, S.G. und Jones, C.W., Euro. J. Biochem., 240, 314–322 (1996)). Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mit den Restriktionsenzymen Sse8387I und SapI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und aus einem 0,8 Agarosegel gewonnen.
Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektors und das wie oben beschrieben hergestellte lysE-Genbereichfragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei pRSlysE erhalten wurde (1). In pRSlysE war das lysE-Gen so positioniert, dass dessen Transkriptionsrichtung die gleiche sein sollte wie die des tac-Promoters.
(2) Einführung von pRSlysE in ein Methylophilus-Bakterium
Das wie oben beschrieben erhaltene pRSlysE wurde mittels Elektroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) eingeführt. Weiterhin. wurde pRS auch als Kontrolle auf die gleiche Weise wie für pRSlysE in den AS1-Stamm eingeführt. Als Ergebnis wurden mehrere Tausend Kolonien pro 1 μg DNA bei Verwendung von pRS als Kontrolle erhalten, wohingegen nur einige Kolonien mit pRSlysE erhalten wurden.
Wenn Plasmide aus transformierten Stämmen extrahiert wurden, von denen angenommen wurde, dass diese pRSlysE enthielten, und deren Nukleotidsequenzen untersucht wurden, wurde bei allen untersuchten Plasmiden eine spontane Mutation in einem lysE-codierenden Bereich beobachtet, und in einigen Fällen wurde eine Nonsense-Mutation bzw. Nichtsinn-Mutation als Mutation gefunden, wodurch ein eine Aminosäure codierendes Codon durch ein Stoppcodon ausgetauscht war, was die Translation terminierte. In anderen Plasmiden wurde eine Deletion in dem lysE-Gen beobachtet. In jedem Fall wurde angenommen, dass die Funktion von lysE verloren gegangen war.
Wie oben beschrieben ist, war die Einführungshäufigkeit von pRSlysE, welches die gesamte Länge des lysE-Gens trug, in Methylophilus methylotrophus extrem gering, und nur Plasmide mit einem mutierten lysE-Gen, bei dem die Mutation die Funktion ausschaltete, konnten eingeführt werden. Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen insgesamt wurde angenommen, dass die Einführung des lysE-Gens in Methylophilus methylotrophus letal war. Dies zeigt, dass das lysE-Gen nicht universell zur Sekretion von L-Lysin in heterogenen Bakterien funktionieren kann.
Der Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm, welcher pRSlysE mit einer Mutation enthielt, wurde auf eine SEII-Platte aufgebracht, welche 50 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Dann wurden die Zellen auf ungefähr 10 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt, in ein SEII-Produktionsmedium (20 ml), welches 50 mg/l Streptomycin enthielt, eingeimpft, und unter Schütteln 34 Stunden bei 37°C kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die L-Lysin-Konzentration in dem Kulturüberstand wurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysators (Nihon Bunko, Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie) bestimmt. Als Ergebnis wurde im Wesentlichen kein Stamm erhalten, in welchem die Sekretion von L-Lysin verstärkt war, trotz Einführung des mutierten lysE-Gens.
(3) Gewinnung eines Gens, welches eine L-Lysin-Sekretionsaktivität in Methylophilus-Bakterien bereitstellt
Wie in dem vorangehenden Abschnitt beschrieben ist, wurde vermutet, dass das bekannte lysE-Gen in Methylophilus-Bakterien letal war und zu vielen mutierten, nicht funktionierenden Genen führte.
Während der Analyse der meisten mit einer Mutation eingeführten pRSlysE wurde jedoch ein mutiertes lysE-Gen erhalten, das in Methylophilus-Bakterien funktionierte.
Dieses mutierte lysE-Gen wurde als lysE24-Gen bezeichnet. Wenn die Nukleotidsequenz des lysE24-Gens analysiert wurde, wurde gefunden, dass diese Mutation nicht eine Mutation war, die zu einer Aminosäuresubstitution führte, sondern eine Nonsense-Mutation, durch welche ein Stoppcodon um das Zentrum des Translationsbereichs von lysE herum eingeführt wurde.
Das Ergebnis der Nukleotidsequenzbestimmung von lysE24 ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt. Zum Vergleich ist die Nukleotidsequenz von Wildtyp-lysE aus Brevibacterium lactofermentum in SEQ ID NO: 7 gezeigt. In lysE24 war T (Thymin) nach G (Guanin) an der 355. Position insertiert, was zu der in SEQ ID NO: 9 gezeigten Sequenz führte. Das lysE24 enthaltende Plasmid wurde als pRSlysE24 bezeichnet (1).
Der mit pRSlysE24 transformierte E. coli JM109-Stamm wurde als AJ13830 bezeichnet, und dieser Stamm wurde bei der unabhängigen Verwaltungsgesellschaft National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, am 4. Juni 2001 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM P-18369. Dann wurde die Hinterlegung am 13. Mai 2002 in eine internationale Hinter legung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags umgewandelt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-8040.
Es wurde gefunden, dass wenn das lysE24-Gen in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm eingeführt wurde, L-Lysin in dem Medium akkumuliert wurde. Es wurde vermutet, dass dies durch die Verstärkung der Sekretion von L-Lysin bewirkt wurde.
(4) Konstruktion eines Plasmids pRSdapA, welches ein dapA*-Gen aufweist
Es wurde ein Plasmid mit einem Gen (dapA*) hergestellt, das eine Dihydrodipicolinatsynthase codiert, die nicht einer Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterlag, als ein L-Lysin-Biosynthesesystemenzymgen.
pRStac wurde mit Sse8387I und XbaI verdaut, zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert war, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 9 kbp gewonnen wurde.
Das bekannte Plasmid RSFD80 (siehe WO90/16042), welches das dapA*-Genfragment enthielt, wurde als Templat verwendet, um dapA* über PCR unter Verwendung der in SEQ ID NO: 3 und 4 gezeigten Primer zu amplifizieren (Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 60 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Das erhaltene dapA*-Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mit den Restriktionsenzymen Sse8387I und XbaI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 0,1 kbp gewonnen wurde.
Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektors und das wie oben beschrieben hergestellte dapA*-Genbereichfragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde zur Transformation von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) verwendet. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und für 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei ein pRSdapA-Plasmid erhalten wurde. In dem pRSdapA-Plasmid war das dapA*-Gen so positioniert, dass dessen Transkriptionsrichtung die gleiche sein sollte wie die des tac-Promoters.
(5) Konstruktion eines Plasmids, das lysE24 und dapA* aufweist
Um die Wirkung einer Kombination von lysE24 und dapA* zu bewerten, wurde ein Plasmid, das aus dem mit dem dapA*-Gen insertierten pRSlysE-Plasmid bestand, in dem in 2 gezeigten Schema konstruiert. Das oben in (3) hergestellte pRSlysE24 wurde mit dem Restriktionsenzym SapI verdaut, und Enden des Produkts wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) mit einem glatten Ende versehen. Weiterhin wurde das oben in (4) hergestellte Plasmid pRSdapA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SapI verdaut, und ein Fragment von ungefähr 1 kbp, welches den tac-Promoter und den dapA*-Bereich enthielt, wurde auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt und unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo) gewonnen. Dieses Fragment wurde wie oben beschrieben mit einem glatten Ende versehen und unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) an das zuvor erwähnte Verdauungsprodukt von pRSlysE24 ligiert.
Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei das pRSlysEdapA-Plasmid erhalten wurde. In diesem Plasmid waren das lysE24-Gen und das dapA*-Gen so positioniert, dass deren Transkriptionsrichtungen zueinander identisch sein sollten.
Der mit dem pRSlysEdapA-Plasmid transformierte Stamm E. coli JM109 wurde als AJ13832 bezeichnet, und dieser Stamm wurde bei der unabhängigen Verwaltungsgesellschaft National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary am 4. Juni 2001 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM P-18371. Dann wurde die Hinterlegung am 13. Mai 2002 in eine internationale Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags umgewandelt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-8042.
(6) Konstruktion eines Plasmids, das mit einem pRS-Vektor koexistenzfähig ist, pBBR-lysEdapA
Anschließend wurde aus pRSlysEdapA pBBR-lysEdapA hergestellt.
Es ist bekannt, dass das pBBR1-Plasmid sich in dem Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm replizieren kann und mit dem pRS-Vektor koexistieren kann (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997); MoBiTec GmbH, Lotzestrasse 22a, 37083 Göttingen, Deutschland, es kann von Funakoshi bezogen werden). Zunächst wurde pBBR1 mit DraI verdaut und zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert war, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 5,3 kbp erhalten wurde.
Dann wurde das oben erwähnte, in Abschnitt (5) konstruierte Plasmid pRSlysEdapA mit EcoRI und BglII verdaut und zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden mittels Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 2,0 kbp gewonnen wurde, welches die lysE24- und dapA-Gene enthielt.
Das pBBR1-Vektor-Verdauungsprodukt und das wie oben beschrieben hergestellte DNA-Fragment, welches die lysE24- und dapA-Genbereiche enthielt, wurden unter Verwendung eines DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Kanamycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei pBBR-lysEdapA erhalten wurde.
Das wie oben beschrieben erhaltene pBBR-lysEdapA-Plasmid wurde durch Elektroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm eingeführt. Weiterhin wurde pBBR1 als Kontrolle auch auf die gleiche Weise wie für pBBR-lysEdapA in den AS1-Stamm eingeführt.
<3> HErstellung von L-Lysin unter Verwendung eines Stamms mit verstärktem Entner-Doudoroff-Weg
Die L-Lysin-Produktionsfähigkeit wurde durch Einführen des pRSedda-Plasmids in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm, der das wie oben beschrieben erhaltene pBBR-lysEdapA-Plasmid enthielt (auch mit der Abkürzung AS1/pBBR-lysEdapA bezeichnet) mittels Elektroporation bewertet. Der erhaltene transformierte Stamm (im Folgenden auch als „AS1/pBBR-lysEdapA/pRSedda" bezeichnet) und der Methylophilus methylotrophus AS1/pBBR-lysEdapA-Stamm, in den das pRS-Plasmid eingeführt war (im Folgenden auch als „AS1/pBBR-lysEdapA/pRS" bezeichnet) als Kontrolle wurden hinsichtlich der intrazellulären L-Aminosäure-Konzentrationen und der L-Aminosäurekonzentrationen im Kulturüberstand untersucht.
Jeder transformierte Stamm wurde über Nacht bei 37°C auf einer SEII-Platte kultiviert, die 50 g/l Streptomycin und 50 mg/l Kanamycin enthielt. Dann wurden die Zellen von ungefähr 10 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt, in ein SEII-Produktionsmedium (20 ml), das 50 mg/l Streptomycin und 50 mg/l Kanamycin enthielt, eingeimpft, und bei 37°C für 48 Stunden unter Schütteln kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen mittels Zentrifugation aus einem Teil der Kulturlösung entfernt, und die L-Aminosäurekonzentrationen im Kulturüberstand wurden unter Verwendung eines Aminosäureanalysators (Nikon Bunko, Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. AS1/pBBR-lysEdapA/PRSedda akkumulierte L-Lysin im Medium mit einer höheren Konzentration im Vergleich zu AS1/pBBR-lysEdapA/pRS, woran ersichtlich ist, dass die L-Lysinproduktivität durch Verstärkung der edd- und eda-Gene verbessert war.
Tabelle 1
Wie oben beschrieben ist, zeigen diese Ergebnisse, dass die L-Lysin-Produktivität durch Verstärkung der Expression der Gene des Entner-Doudoroff-Wegs verbessert werden kann.
<4> Herstellung von L-Valin unter Verwendung eines Stamms mit verstärktem Entner-Doudoroff-Weg
Wie oben beschrieben erhaltenes pRSedda wurde mittels Elektroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) in den Wildtyp-Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm eingeführt. Weiterhin wurde auch pRS auf die gleiche Weise als Kontrolle in den AS1-Stamm eingeführt.
Der erhaltene transformierte Stamm (im Folgenden auch als „AS1/pRSedda" bezeichnet) und der Methylophilus methylotrophus-Stamm, in den das pRS-Plasmid eingeführt war (im Folgenden auch als „AS1/pRS" bezeichnet) als Kontrolle wurden auf die intrazellulären L-Aminosäurekonzentrationen und die L-Aminosäurekonzentrationen im Kulturüberstand untersucht.
Jeder transformierte Stamm wurde über Nacht bei 37°C auf einer SEII-Platte kultiviert, die 50 mg/l Streptomycin enthielt. Dann wurden die Zellen von ungefähr 10 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt, in das SEII-Produktionsmedium (20 ml), das 50 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft, und bei 37°C für 48 Stunden unter Schütteln kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugation aus einem Teil der Kulturlösung entfernt, und die L-Aminosäurekonzentrationen im Kulturüberstand wurden unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. L-Valin wurde in dem Medium, das AS1/pRSedda enthielt, mit einer höheren Konzentration im Vergleich zu AS1/pRS akkumuliert, woran ersichtlich ist, dass die L-Valin-Produktivität durch Verstärkung der edd- und eda-Gene verbessert war.
Tabelle 2
Wie oben beschrieben ist, zeigen diese Ergebnisse, dass die L-Valin-Produktionsfähigkeit durch Verstärkung der Expression der Gene des Entner-Doudoroff-Wegs verbessert werden kann.
<5> Untersuchung der Fähigkeit, mit dem Stamm mit verstärktem Entner-Doudoroff-Weg andere L-Aminosäuren herzustellen
AS1/pRSedda und AS1/pRS wurden jeweils über Nacht bei 37°C auf einer SEII-Platte kultiviert, die 50 mg/l Streptomycin enthielt. Dann wurden die Zellen von ungefähr 10 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt, in das SEII-Produktionsmedium (20 ml), das 50 mg/l Streptomycin enthielt, eingeimpft, und bei 37°C für 48 Stunden unter Schütteln kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugation aus einem Teil der Kulturlösung entfernt, und die L-Aminosäurekonzentrationen in dem Kulturüberstand wurden unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Sämtliche L-Aminosäuren akkumulierten in dem Medium, das AS1/pRSedda enthielt, mit höheren Konzentrationen im Vergleich zu AS1/pRS, woran ersichtlich ist, dass die Produktivitäten verschiedener L-Aminosäuren durch Verstärkung der Expression der edd- und eda-Gene verbessert waren. Insbesondere waren außer L-Valin in dem obigen Abschnitt (4) die Produktivitäten von L-Leucin und L-Isoleucin merklich verbessert.
Tabelle 3
Wie oben beschrieben ist, wurde gezeigt, dass die Produktivitäten der verschiedenen L-Aminosäuren durch Verstärkung der Expression der Gene des Entner-Doudoroff-Wegs verbessert werden konnten.
Obwohl die Erfindung ausführlich mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen hiervon beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, dass verschiedene Änderungen vorgenommen werden können und Äquivalente eingesetzt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Jedes der zuvor erwähnten Dokumente, einschließlich des ausländischen Prioritätsdokuments JP 2002336346 wird in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme hier auf genommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, umfassend: a) Kultivieren eines Mikroorganismus mit einer Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure in einem Medium, wobei die L-Aminosäure in dem Medium akkumuliert wird, und b) Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium, wobei der Mikroorganismus ein Methanol-verwertendes Bakterium ist, welches den Entner-Doudoroff-Weg aufweist, und so modifiziert ist, dass die 6-Phosphogluconatdehydratase-Aktivität und/oder oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase-Aktivität verstärkt ist/sind, und wobei die L-Aminosäure aus L-Aminosäuren ausgewählt ist, die durch einen Biosyntheseweg hergestellt werden, bei dem Brenztraubensäure als Zwischenprodukt verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Methanol-verwertende Bakterium ein Bakterium umfasst, das zur Gattung Methylophilus gehört.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die 6-Phosphogluconatdehydratase-Aktivität und/oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase-Aktivität verstärkt ist/sind durch: a) eine Erhöhung der Kopienzahl eines für 6-Phosphogluconatdehydratase und/oder 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase codierenden Gens; oder b) Modifizieren einer Expressionsregulationssequenz des Gens, so dass die Expression des Gens in dem Bakterium verstärkt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die L-Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus L-Lysin, L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin besteht.
Methanol-verwertendes Bakterium, welches den Entner-Doudoroff-Weg aufweist, wobei das Bakterium so modifiziert ist, dass die 6-Phosphogluconatdehydratase-Aktivität und/oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase-Aktivität verstärkt ist/sind, und es eine Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure über einen Biosyntheseweg aufweist, bei dem Brenztraubensäure als Zwischenprodukt verwendet wird.
Verfahren zur Produktion einer L-Aminosäure, welche ein Produkt eines Biosynthesewegs ist, bei dem Brenztraubensäure als Zwischenprodukt verwendet wird, umfassend: a) Kultivieren eines Methanol-verwertenden Bakteriums, welches den Entner-Doudoroff-Weg aufweist, in einem Medium; wobei das Bakterium die Fähigkeit zur Sekretion einer L-Aminosäure in ein Medium aufweist, b) Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium, wobei das Bakterium so modifiziert ist, dass die Aktivität der 6-Phosphogluconatdehydratase-Aktivität und/oder 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolase verstärkt ist.