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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von
L-Lysin unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen ein oder
mehrere Gene, ausgewählt
aus der Gruppe otsB-Gen, treY-Gen, treZ-Gen, abgeschwächt sind.
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Stand der Technik
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L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin und L-Glutaminsäure,
finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie,
in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
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Es
ist bekannt, dass Aminosäuren
durch Fermentation von Stämmen
coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum
hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung wird ständig an
der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können
fermentationstechnische Massnahmen wie zum Beispiel Rührung und
Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien
wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie
oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus
selbst betreffen.
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Zur
Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden
Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet.
Auf diese Weise erhält
man Stämme,
die resistent gegen Antimetabolite wie zum Beispiel das Lysin-Analogon
S-(2-Aminoethyl)-cystein
oder auxotroph für
regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren.
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Seit
einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik
zur Stammverbesserung L-Aminosäure produzierender
Stämme
von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert
und die Auswirkung auf die L-Aminosäure-Produktion untersucht.
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Aufgabe der Erfindung
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Die
Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin mit coryneformen
Bakterien bereitzustellen.
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Beschreibung der Erfindung
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Werden
im folgenden L-Aminosäuren
oder Aminosäuren
erwähnt,
sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschliesslich ihrer
Salze, ausgewählt
aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glycin, L-Alanin,
L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin,
L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt sind L-Lysin
und L-Glutaminsäure.
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Wenn
im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht
nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid
oder Lysin-Sulfat
gemeint.
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Werden
im folgenden L-Glutaminsäure
oder Glutaminsäure
erwähnt,
sind damit auch die Salze wie z. B. Glut aminsäure-Hydrochlorid oder Glutaminsäure-Sulfat
gemeint.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von
L-Lysin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man
zumindest die für
die Trehalose-Phosphatase kodierende Nukleotidsequenz und/oder die
für die
Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
kodierende Nukleotidsequenz und/oder die für die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierende Nukleotidsequenz abschwächt, insbesondere ausschaltet
oder auf niedrigem Niveau exprimiert.
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Gegenstand
dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
von L-Aminosäuren,
in dem folgende Schritte durchgeführt werden:
- a)
Fermentation der L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien,
in denen zumindest die für
die Trehalose-Phosphatase kodierende Nukleotidsequenz und/oder die
für die
Maltooligosyl-Trehalose-Synthase kodierende Nukleotidsequenz und/oder
die für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase kodierende Nukleotidsequenz
abgeschwächt,
insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert
ist;
- b) Anreicherung des L-Lysins im Medium oder in den Zellen der
Bakterien;
- c) Isolierung des L-Lysins, wobei gegebenenfalls Bestandteile
der Fermentationsbrühe
und/oder der Biomasse in teilweise oder insgesamt im Endprodukt
verbleiben.
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Die
eingesetzten Stämme
produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung des für die Trehalose-Phosphatase
kodierenden otsB-Gens und/oder des für die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
kodierenden treY-Gens und/oder des für die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierenden treZ-Gens L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin und L-Glutaminsäure.
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Der
Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende
DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor
verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende
Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Massnahmen
kombiniert.
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Durch
die Massnahmen der Abschwächung
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration
des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus,
herabgesenkt.
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Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind,
können
Aminosäuren
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose
oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter
coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium. Bei
der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium
glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
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Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium
thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und
daraus hergestellte L-Aminosäuren
produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie
beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium
lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P
6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium
glutamicum DSM 5715.
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Es
wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Abschwächung des
für die
Trehalose-Phosphatase (EC: 3.1.3.12) kodierenden otsB-Gens und/oder
des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase kodierenden treY-Gens und/oder
des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierenden treZ-Gens in verbesserter Weise L-Lysin produzieren.
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Die
Nukleotidsequenz des für
die Trehalose-Phosphatase von Corynebacterium glutamicum kodierenden
Gens kann der Patentanmeldung
WO
01/00843 unter dem Identification Code RXA00347 als SEQ
ID No. 1139 entnommen werden.
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Die
Nukleotidsequenz des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung
WO 01/00843 unter dem Identification
Code FRXA01239 als SEQ ID No. 1143 entnommen werden.
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Die
Nukleotidsequenz des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung
WO 01/00843 unter dem Identification
Code RXA02645 als SEQ ID No. 1145 entnommen werden.
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Ebenfalls
sind die Nukleotidsequenzen in der Genbank unter der Accession Number
AX064857, AX064861 bzw. AX064863 hinterlegt.
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Die
beanspruchten Nukleotidsequenzen der für die Trehalose-Phosphatase,
für die
Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
und für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierenden Gene, dargestellt in den SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3
bzw. SEQ ID No. 5, sind gegenüber
den aus dem Stand der Technik bekannten Sequenzen um jeweils bevorzugt
bis zu 700 Hasenpaare vor dem Startkodon und hinter dem Stopkodon
des Gens verlängert.
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Die
Verlängerungen
gegenüber
der aus dem Stand der Technik bekannten Sequenz bestehen in der SEQ
ID No. 1 aus den Basenpaaren 1 bis 500 bzw. 1392 bis 1977.
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In
SEQ ID No. 3 bestehen die Verlängerungen
gegenüber
der aus dem Stand der Technik bekannten Sequenz aus den Basenpaaren
1 bis 500 bzw. 3057 bis 3636.
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In
SEQ ID No. 5 bestehen die Verlängerungen
gegenüber
der aus dem Stand der Technik bekannten Sequenz aus den Basenpaaren
1 bis 500 bzw. 2454 bis 3033.
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Die
Aminosäuresequenzen
der dazugehörigen
Genprodukte sind in SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 bzw. SEQ ID No. 6
dargestellt.
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Es
wurde gefunden, dass mit Hilfe der so bereitgestellten verlängerten
Sequenzen an sich bekannte Verfahren zur Abschwächung besonders erfolgreich
eingesetzt werden können.
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Eine
solches Verfahren ist die Methode des Genaustausches ("gene replacement"). Dabei wird eine Mutation
wie z. B. eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch in dem
interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel
wird wiederum in einen für
C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschliessend
durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und
eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen
bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw.
des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise in
EP: 00110021.3 verwendet, um das
secG-Gen von C. glutamicum auszuschalten.
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Die
Verlängerung
der eingesetzten Sequenzen ist nicht auf 600 Basenpaare vor dem
Startkodon und hinter dem Stopkodon beschränkt. Sie liegt bevorzugt im
Bereich von 300 bis 700 Basenpaaren, kann aber auch bis zu 800 Basenpaaren
betragen. Die Verlängerungen
können
auch unterschiedliche Mengen an Basenpaaren enthalten.
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Die
in den angegebenen Textstellen beschriebenen Sequenzen kodierend
für die
Trehalose-Phosphatase, die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase bzw.
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase können erfindungsgemäss verwendet
werden. Weiterhin können
Allele der Trehalose-Phosphatase, der Maltooligosyl-Trehalose-Synthase bzw. der
Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase verwendet werden, die sich
aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale
Sinnmutationen ("sense
mutations") ergeben.
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Zur
Erzielung einer Abschwächung
können
entweder die Expression des für
die Trehalose-Phosphatase kodierenden Gens und/oder die Expression
des für
die die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase kodierenden Gens und/oder
die Expression des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierenden Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte
herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide
Massnahmen kombiniert.
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Die
Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische
Veränderung
(Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene,
Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen,
das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann
z. B. in der Patentanmeldung
WO 96/15246 ,
bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)),
bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998),
bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)),
bei Pátek
et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker
("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Deutschland, 1990).
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Mutationen,
die zu einer Veränderung
bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen
führen,
sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:
8611–8617
(1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61: 1760–1762
(1997)) und Möckel
("Die Threonindehydratase
aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation
und Struktur des Enzyms",
Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-2906, ISSN 09442952, Jülich, Deutschland,
1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Als
Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und
Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit
von der Wirkung des Aminosäureaustausches
auf die Enzymaktivität
wird von Fehlsinnmutationen ("missense
mutations") oder
Nichtsinnmutationen ("nonsense
mutations") gesprochen.
Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem
Gen führen
zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge
falsche Aminosäuren
eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen
von mehreren Kodonen führen
typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität.
Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum
Stand der Technik und können
bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker
("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Eine
gebräuchliche
Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer
und Pühler (Bio/Technology
9, 84–87
(1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").
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Bei
der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion
des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in
einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren
kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784–791 (1983)),
pK18mob oder pK19mob (Schäfer
et al., Gene 145, 69–73
(1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology
174: 5462–65
(1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994).
Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84;
US-Patent 5,487,993 ), pCR
®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534–541
(1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510–4516)
in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion
des Gens enthält,
wird anschliessend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten
Stamm von C. glutamicum überführt. Die
Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden
zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied
Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067–1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994))
beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird
die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen
und man erhält
zwei unvollständige
Allele, denen jeweils das 3'-
bzw. das 5'-Ende
fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al.
(Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575–580 (1994)) zur Ausschaltung
des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
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Bei
der Methode des Genaustausches ("gene
replacement") wird
eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch
in dem interessierenden Gen in-vitro
hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum
nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschliessend durch
Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und
eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen
bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw.
des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch
et al. (Microbiology 144, 915–927
(1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion
auszuschalten.
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In
das für
die Trehalose-Phosphatase kodierende Gen und/oder das für die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
kodierende Gen und/oder das für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierende Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder
ein Basenaustausch eingebaut werden.
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Zusätzlich kann
es für
die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich
zur Abschwächung
des für
die Trehalose-Phosphatase kodierenden Gens und/oder des für die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
kodierenden Gens und/oder des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierenden Gens eines oder mehrere der Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus,
des Aminosäure-Exports
und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
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Der
Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus,
die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor
oder ein Gen verwendet, das für
ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert
und gegebenenfalls diese Massnahmen kombiniert.
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Durch
die Massnahmen der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins
beziehungsweise der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
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So
kann für
die Produktion von L-Lysin neben der Abschwächung des für die Trehalose-Phosphatase kodierenden
Gens und/oder des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
kodierenden Gens und/oder des für die
Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase kodierenden Gens eines
oder mehrere der Gene ausgewählt aus
der Gruppe
- – das für eine feed-back resistente
Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512, EP-B-0387527 ; EP-A-0699759 ; WO 00/63388 ),
- – das
für die
Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA ( EP-B 0 197 335 ),
- – das
für die
Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns
(1992). Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
- – gleichzeitig
das für
die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc ( DE-A-198 31 609 ),
- – das
für die
Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al.,
European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
- – das
für die
Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf ( JP-A-09224661 ),
- – gleichzeitig
das für
den Lysin-Export kodierende Gen lysE ( DE-A-195 48 222 ),
- – das
für das
Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 ( DE:
199 59 328.0 , DSM 13115)
- – das
für die
Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076–6086)
und
- – das
für die
3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology. 174: 6076–6086),
verstärkt, insbesondere überexprimiert
werden.
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Weiterhin
kann es für
die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des
für die
Trehalose-Phosphatase kodierenden Gens und/oder des für die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
kodierenden Gens und/oder des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierenden Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- – das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
kodierende Gen pck ( DE 199 50
409.1 , DSM 13047),
- – das
für die
Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi ( US 09/396,478 , DSM 12969),
- – das
für die
Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB ( DE:
199 51 975.7 , DSM 13114),
- – das
für das
Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 ( DE:
199 59 327.2 , DSM 13113),
- – das
für die
Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom ( EP-A-0131171 ) und
- – das
für die
Homoserin-Kinase kodierende Gen thrB (Peoples, O. W., et al., Molecular
Microbiology 2 (1988): 63–72)
abzuschwächen, insbesondere
deren Expression zu verringern.
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Schliesslich
kann es für
die Produktion von Lysin, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des
für die
Trehalose-Phosphatase kodierenden Gens und/oder des für die Maltooligosyl-Trehalose-Synthase
kodierenden Gens und/oder des für
die Maltooligosyl-Trehalose-Trehalohydrolase
kodierenden Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding
of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982)
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Die
erfindungsgemäss
hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung
und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im
fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives
Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
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Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch "Manual of
Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
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Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette wie z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl
und Kokosfett, Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie
z. B. Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Stickstoffquelle können
organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Schliesslich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter
Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur können
basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können
dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise
bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten
Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
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Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie
bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben
durch Anionenaustauschchromatographie mit anschliessender Ninhydrin
Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed Phase HPLC
erfolgen, so wie z. B. bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry
(1979) 51: 1167–1174)
beschrieben.
-
Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
-
Beispiel 1
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Herstellung von Integrationsvektoren für die Integrationsmutagenese
der Gene otsB, treY und treZ
-
Aus
dem Stamm ATCC 13032 wird nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology
140: 1817–1828
(1994)) chromosomale DNA isoliert.
-
Aufgrund
der für
C. glutamicum bekannten Sequenz (
WO
01/00843 ) der Gene otsB, treY und treZ werden die folgenden
Oligonukleotide für
die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt:
-
Die
dargestellten Primer werden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg,
Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von
Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic
Press) mit der Tag-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim (Deutschland,
Produktbeschreibung Taq DNA Polymerase, Product No. 1 146 165) die
PCR Reaktion durchgeführt.
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
ermöglichen
die Primer die Amplifikation eines 463 bp grossen internen Fragmentes des
otsB-Gens, eines 530 bp grossen internen Fragmentes des treY-Gens
und eines 530 bp grossen internen Fragmentes des treZ-Gens. Die so amplifizierten
Produkte werden in einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch geprüft.
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Die
amplifizierten DNA Fragment werden mit dem TOPO TA Cloning Kit der
Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer
K4500-01) jeweils in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991)
Bio/Technology 9: 657–663)
ligiert.
-
Anschliessend
wird der E. coli Stamm TOP10 mit den Ligationsansätzen (Hanahan,
In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford,
Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden
Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf
LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert
worden ist. Plasmid-DNA wird aus jeweils einer Transformante mit
Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und
durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschliessende
Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Die Plasmide werden pCR2.1otsBint,
pCR2.1treYint und pCR2.1treZint genannt und sind in 1, 2 und 3 dargestellt.
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Folgende
Mikroorganismen werden als Reinkultur am 24. April 2001 bei der
Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäss Budapester
Vertrag hinterlegt:
- – Escherichia coli Top10/pCR2.1otsBint
als DSM 14259,
- – Escherichia
coli Top10/pCR2.1treYint als DSM 14260,
- – Escherichia
coli Top10/pCR2.1treZint als DSM 14261.
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Beispiel 2
-
Integrationsmutagenese des otsB-Gens in
dem Stamm DSM 5715
-
Der
in Beispiel 1 genannte Vektor pCR2.1otsBint wird nach der Elektroporationsmethode
von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994))
in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm
DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten Lysin-Produzenten.
Der Vektor pCR2.1otsBint kann in DSM5715 nicht selbständig replizieren
und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom
von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom
integriertem pCR2.1otsBint erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes
auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert
worden ist.
-
Für den Nachweis
der Integration wird das otsBint-Fragment
nach der Methode "The
DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer
markiert. Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wird nach
der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994))
isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen EcoRI, SalI und
PstI geschnitten. Die entstehenden Fragmente werden mittels der Agarosegel-Elektrophorese
aufgetrennt und mit dem Dig-Hybridisierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert.
Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2.1otsBint hat innerhalb des
chromosomalen otsB-Gens ins Chromosom von DSM5715 inseriert. Der
Stamm wird als DSM5715::pCR2.1otsBint bezeichnet.
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Beispiel 3
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Integrationsmutagenese des treY-Gens in
dem Stamm DSM 5715
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Der
in Beispiel 1 genannte Vektor pCR2.1treYint wird nach der Elektroporationsmethode
von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994))
in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm
DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten Lysin-Produzenten.
Der Vektor pCR2.1treYint kann in DSM5715 nicht selbständig replizieren
und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom
von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom
integriertem pCR2.1treYint erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes
auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert
worden ist.
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Für den Nachweis
der Integration wird das treYint-Fragment
nach der Methode "The
DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer
markiert. Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wird nach
der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994))
isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI und
PstI geschnitten. Die entstehenden Fragmente werden mittels der
Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig- Hybridisierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert.
Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2.1treYint hat innerhalb des
chromosomalen treY-Gens ins Chromosom von DSM5715 inseriert. Der
Stamm wird als DSM5715::pCR2.1treYint bezeichnet.
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Beispiel 4
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Integrationsmutagenese des treZ-Gens in
dem Stamm DSM 5715
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Der
in Beispiel 1 genannte. Vektor pCR2.1treZint wird nach der Elektroporationsmethode
von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994))
in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm
DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten Lysin-Produzenten.
Der Vektor pCR2.1treZint kann in DSM5715 nicht selbständig replizieren
und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom
von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom
integriertem pCR2.1treZint erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes
auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N. Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist.
-
Für den Nachweis
der Integration wird das treZint-Fragment
nach der Methode "The
DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer
markiert. Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wird nach
der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994))
isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen EcoRI, EcoRV und
PstI geschnitten. Die entstehenden Fragmente werden mittels der
Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybridisierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert.
Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2.1treZint hat innerhalb des
chromosomalen treZ-Gens ins Chromosom von DSM5715 inseriert. Der
Stamm wird als DSM5715::pCR2.1treZint bezeichnet.
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Beispiel 5
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Herstellung von Lysin
-
Die
in Beispiel 2, Beispiel 3 und Beispiel 4 erhaltenen C. glutamicum
Stämme DSM5715::pCR2.1otsBint,
DSM5715::pCR2.1treYint und DSM5715::pCR2.1treZint werden in einem
zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der
Lysingehalt im Kulturüberstand
bestimmt.
-
Dazu
werden die Stämme
zunächst
auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar
mit Kanamycin (25 mg/l) für
24 Stunden bei 33°C
inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wird je eine Vorkultur
angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium
für die
Vorkultur wird das Vollmedium CgIII verwendet. Medium
CgIII
NaCl | 2,5
g/l |
Bacto-Pepton | 10
g/l |
Bacto-Yeast-Extrakt | 10
g/l |
Glucose
(getrennt autoklaviert) | 2%
(w/v) |
-
Der
pH-Wert wird auf pH 7,4 eingestellt
-
Diesem
wird Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkulturen werden 16 Stunden
bei 33°C
bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von diesen Vorkulturen wird je eine Hauptkultur angeimpft,
so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkulturen 0,1 CD beträgt. Für die Hauptkultur
wird das Medium MM verwendet. Medium
MM
CSL
(Corn Steep liquor) | 5
g/l |
MOPS
(Morpholinopropansulfonsäure) | 20
g/l |
Glucose
(getrennt autoklaviert) | 50
g/l |
Salze:
(NH4)2SO4 | 25
g/l |
KH2PO4 | 0,1 g/l |
MgSO4·7
H2O | 1,0
g/l |
CaCl2·2
H2O | 10
mg/l |
FeSO4·7
H2O | 10
mg/l |
MnSO4·H2O | 5,0
mg/l |
Biotin
(sterilfiltriert) | 0,3
mg/l |
Thiamin
HCl (sterilfiltriert) | 0,2
mg/l |
Leucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
CaCO3 | 25 g/l |
-
CSL,
MOPS und die Salzlösung
werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschliessend
werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
-
Die
Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in 100 ml Erlenmeyerkolben
mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung
erfolgt bei 33°C
und 80% Luftfeuchtigkeit.
-
Nach
72 Stunden wird die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek
1000 (Reckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete
Lysinmenge wird jeweils mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrindetektion bestimmt.
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In
Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 1
Stamm | CD
(660 nm) | Lysin-HCl
g/l |
DSM5715 | 7,3 | 12,48 |
DSM5715::pCR2.1otsBint | 7,5 | 13,45 |
DSM5715::pCR2.1treYint | 7,5 | 13,13 |
DSM5715::pCR2.1treZint | 8,1 | 13,84 |
-
Kurze Beschreibung der Figuren:
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1:
Karte des Plasmids pCR2.1otsBint,
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2:
Karte des Plasmids pCR2.1treYint,
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3:
Karte des Plasmids pCR2.1treZint.
-
Die
verwendeten Abkürzungen
und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung.
- KmR:
- Kanamycin Resistenz-Gen
- BamHI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms KpnI
- EcoRI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms EcoRI
- EcoRV:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms EcoRV
- PstI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms PstI
- SalI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms SalI
- otsBint:
- internes Fragment
des otsB-Gens
- treYint:
- internes Fragment
des treY-Gens
- treZint:
- internes Fragment
des treZ-Gens
- ColE1:
- Replikationsursprung
des Plasmides ColE1
SEQUENZPROTOKOLL