EP1574582A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien Download PDF

Info

Publication number
EP1574582A1
EP1574582A1 EP05003969A EP05003969A EP1574582A1 EP 1574582 A1 EP1574582 A1 EP 1574582A1 EP 05003969 A EP05003969 A EP 05003969A EP 05003969 A EP05003969 A EP 05003969A EP 1574582 A1 EP1574582 A1 EP 1574582A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
coding
tipa
bacteria
lysine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05003969A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Brigitte Dr. Bathe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa GmbH filed Critical Degussa GmbH
Publication of EP1574582A1 publication Critical patent/EP1574582A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • L-amino acids in particular L-lysine
  • L-lysine can be found in US Pat Human medicine and in the pharmaceutical industry, in the Food industry and especially in the Animal nutrition application.
  • the protein concentration can also be detected by Western blot hybridization (et Sambrook al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.) Having a specific for the protein to antibodies and subsequent optical evaluation with appropriate software for concentration determination (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647).
  • the activity of DNA-binding proteins can be measured by DNA band-shift assays (also referred to as gel retardation) (Wilson et al., (2001) Journal of Bacteriology 183: 2151-2155).
  • antisense technique Another method for specific reduction of Gene expression is the antisense technique, being short Oligodeoxy nucleotides or longer synthesis vectors antisense RNA are brought into the target cells.
  • the Antisense RNA may be there at complementary sections bind specific mRNAs and reduce their stability or block the translatability.
  • Srivastava et al. Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366-4371).
  • Mutations are transitions, transversions, Insertions and deletions into consideration. In dependence of the effect of amino acid exchange on the Enzyme activity is mediated by missense mutations ("missense mutations ”) or non-nonsense mutations spoken. Insertions or deletions of at least lead to a base pair in a gene Frame shift mutations, in the consequence of which incorrect amino acids are incorporated or the Translation aborts prematurely. Deletions of several Codons typically result in a complete one Failure of enzyme activity.
  • genes of C. glutamicum too mutate is that of Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991)) method of gene disruption ("gene disruption”) and gene exchange (“gene replacement ").
  • Plasmid vector cloned in a host typically E. coli
  • a host typically E. coli
  • vectors come from pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB or pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994).
  • the measures of reinforcement in particular Overexpression, is the activity or concentration of the corresponding protein generally by at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, at most up to 1000% or 2000% based on the wild-type protein or the activity or concentration of the protein in the initial microorganism increases.
  • endogenous genes are generally prefers.
  • endogenous genes or “endogenous Nucleotide sequences” are understood as those in the population a kind of existing genes or Nucleotide sequences.
  • the culture medium to be used must be suitable meet the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various Microorganisms are described in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).
  • nitrogen source organic nitrogen-containing Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • phosphorus source can phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used.
  • the culture medium must continue to salts of metals contained as e.g. Magnesium sulfate or iron sulfate, the necessary for growth. Finally, you can essential growth substances such as amino acids and vitamins in addition to the substances mentioned above.
  • the culture medium may also contain suitable precursors be added.
  • the stated feedstocks can be used for Culture added in the form of a unique approach or fed in a suitable manner during the cultivation become.
  • to Foam processing control can use anti-foaming agents e.g. Fatty acid polyglycol esters are used.
  • to Maintaining the stability of plasmids can the Medium suitable selective substances such. Antibiotics are added.
  • To aerobic conditions maintain oxygen or oxygen Gas mixtures such as e.g. Air in the culture entered.
  • the temperature of the culture is usually at 20 ° C to 45 ° C, and preferably at 25 ° C to 40 ° C.
  • the Culture is continued until a maximum of desired product has formed. This goal will be usually within 10 hours to 160 hours reached.
  • the amplified DNA fragment is cloned with TOPO TA Kit from Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Catalog number K4500-01) into the vector pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio / Technology 9: 657-663).
  • Plasmid DNA is isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction with the restriction enzyme EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis (0.8%).
  • the plasmid is called pCR2.1tipAint and is shown in FIG.
  • the vector pCR2.1tipAint mentioned in Example 1 is electroporated into Corynebacterium glutamicum DSM 5715 according to the electroporation method of Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)).
  • the strain DSM 5715 is an AEC-resistant lysine producer, the strain is described in EP-B-0435132.
  • the vector pCR2.1tipAint can not self-replicate in DSM5715 and is only retained in the cell if it has integrated into the chromosome of DSM 5715.
  • the selection of clones with integrated into the chromosome pCR2.1tipAint is carried out by plating out the electroporation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2 nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.), which has been supplemented with 15 mg / l kanamycin.
  • DSM5715 A Selected Kanamycin Resistant Clone Encoding the In Example 1 called plasmid pCR2.1tipAint within the chromosomal tipA gene from DSM5715 has been inserted named DSM5715 :: pCR2.1tipAint.
  • the pH is adjusted to pH 7.4 adjusted
  • kanamycin 25 mg / l
  • the preculture is incubated for 16 hours at 33 ° C at 240 rpm on the shaker. From this preculture, a major culture is seeded such that the initial OD (660 nm) of the major culture is 0.1 OD.
  • the medium MM is used for the main culture.
  • CSL, MOPS and saline are adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions are added and the dry autoclaved CaCO 3 is added.
  • the cultivation takes place in 10 ml volume in 100 ml Erlenmeyer flask with harassment. It will be kanamycin (25 mg / l) added. The cultivation takes place at 33 ° C and 80% Humidity.
  • the OD becomes at a measuring wavelength of 660 nm with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Kunststoff).
  • the amount of lysine formed is with a Amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by ion exchange chromatography and post-column derivatization with ninhydrin detection certainly .
  • FIG. 1 Map of the plasmid pCR2.1tipAint.
  • the base pair numbers are Approximate values that are within the reproducibility of Measurements are obtained.

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, bei dem man folgende Schritte durchführt:
  • a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneforme Bakterien, in denen man zumindest das für den Transkriptionsregulator TipA kodierende Gen abschwächt,
  • b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
  • c) Isolierung der L-Aminosäure,
    • und gegebenenfalls Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt, oder Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

    Description

    Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das tipA-Gen kodierend für den Transkriptionsregulator TipA abgeschwächt ist.
    Stand der Technik
    L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
    Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
    Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z.B. Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren.
    Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-Aminosäure-Produktion untersucht.
    Aufgabe der Erfindung
    Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.
    Beschreibung der Erfindung
    Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man zumindest die für den Transkriptionsregulator TipA kodierende Nukleotidsequenz abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.
    Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, in dem folgende Schritte durchführt werden:
  • a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für den Transkriptionsregulator TipA kodierende Nukleotidsequenz abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird.
  • b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und
  • c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.
    • Die eingesetzten coryneformen Bakterien produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung des für den Transkriptionsregulator TipA kodierenden tipA-Gens L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin.
    Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Abschwächung des für den Transkriptionsregulator TipA kodierenden tipA-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin produzieren.
    Transkriptionsregulatoren sind solche Proteine, die durch eine spezifische Proteinstruktur, genannt Helix-Turn-Helix-Motiv, an DNA binden können und so die Transkription anderer Gene entweder verstärken oder abschwächen können. Es wurde gefunden, dass die Funktion des Transkriptionsregulators TipA aus Corynebacterium glutamicum die Repression von Genen, die an L-Aminosäurebiosynthesen, insbesondere an der L-Lysinbiosynthese beteiligt sind, bewirkt. Die Abschwächung des Transkriptionsregulators TipA verbessert die L-Lysinproduktion in den entsprechenden coryneformen Bakterien.
    Die Nukleotidsequenz des für den Transkriptionsregulator TipA von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung EP1108790 als Sequenz Nr. 2871 sowie als Sequenz Nr. 7068 entnommen werden.
    Die Nukleotidsequenz ist ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter der Accession Number AX122955 und unter der Accession Number AX127152 hinterlegt.
    Die in der angegebenen Textstelle beschriebene Sequenz kodierend für den Transkriptionsregulator TipA kann erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des Transkriptionsregulators TipA verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Kodes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.
    Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.
    Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z.B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
    Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
    Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
    Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
    Die Herabsetzung der Proteinkonzentration ist über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise.
    Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111:2630-2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology 183:2151-2155). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
    Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
    Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
  • Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
  • Corynebacterium melassecola ATCC17965
  • Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
  • Brevibacterium flavum ATCC14067
  • Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
  • Brevibacterium divaricatum ATCC14020
    • und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
    • Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
    • Brevibacterium flavum FERM-P 1708
    • Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
    • Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
    • Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
    • Corynebacterium glutamicum DSM 5715.
    Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des für den Transkriptionsregulator TipA kodierenden Gens oder die regulatorischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.
    Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pätek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
    Eine weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxyukleotide oder Vektoren zur Synthese längerer antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA kann dort an komplementäre Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet der Fachmann bei Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 - 4371).
    Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs,Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
    Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
    Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").
    Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
    Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z.B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915 - 927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.
    In das für den Transkriptionsregulator TipA kodierende Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.
    Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des für den Transkriptionsregulator TipA kodierenden Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
    Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
    Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
    Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt. Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
    So kann für die Herstellung von L-Lysin neben der Abschwächung des für den Transkriptionsregulator TipA kodierenden Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
    • das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No.P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
    • gleichzeitig das für das Lysin-Export-Protein kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
    • das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
    • das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (EP-A-1083225),
    • das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661, WO 01/70995),
    • das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998); EP-A-1038969),
    • das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 19959328.0, DSM 13115; EP-A-1111062),
    • das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
    • das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
    • das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
    verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
    Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des für den Transkriptionsregulator TipA kodierenden Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
    • das für ein Katabolit-Kontroll-Protein A kodierende Gen ccpA1 (EP1311685),
    • das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DSM 13047, EP-A-1094111),
    • das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (DSM 12969, EP-A-1087015, WO 01/07626),
    • das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DSM 13114, EP-A-1096013),
    • das für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodierende Gen fda (Mol. Microbiol. 3 (11), 1625-1637 (1989); ACCESSION Number X17313),
    • das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DSM 13113, EP-A-1106693),
    abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.
    Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des für den Transkriptionsregulator TipA kodierenden Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
    Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
    Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
    Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z.B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z.B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
    Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
    Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
    Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z.B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
    Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.
    Folgender Mikroorganismus wird als Reinkultur am 15. Februar 2002 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
    • Escherichia coli Top10/pCR2.1tipAint als DSM 14816.
    Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
    Beispiel 1 Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des Gens tipA
    Aus dem Stamm ATCC 13032 wird nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert.
    Aufgrund der aus für C. glutamicum bekannten Sequenz des Gens tipA werden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt:
    Figure 00150001
    Figure 00150002
    Die dargestellten Primer werden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) mit der Taq-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim (Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA Polymerase, Product No. 1 146 165) die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation eines 482 bp großen internen Fragmentes des tipA-Gens. Das so amplifizierte Produkt wird in einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch geprüft.
    Das amplifizierte DNA-Fragment wird mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9:657-663) ligiert.
    Anschließend wird der E. coli Stamm TOP10 mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol.I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist. Plasmid-DNA wird aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wird pCR2.1tipAint genannt und ist in Figur 1 dargestellt.
    Folgender Mikroorganismus wird als Reinkultur am 15. Februar 2002 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
    • Escherichia coli Top10/pCR2.1tipAint als DSM 14816.
    Beispiel 2 Integrationsmutagenese des tipA-Gens in dem Stamm DSM 5715
    Der in Beispiel 1 genannte Vektor pCR2.1tipAint wird nach der Elektroporationsmethode von Tauch et al.(FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten Lysin-Produzenten, der Stamm ist in der EP-B-0435132 beschrieben. Der Vektor pCR2.1tipAint kann in DSM5715 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1tipAint erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist.
    Ein ausgewählter Kanamycin-resistenter Klon, der das in Beispiel 1 genannte Plasmid pCR2.1tipAint innerhalb des chromosomalen tipA-Gens von DSM5715 inseriert hat, wurde als DSM5715::pCR2.1tipAint bezeichnet.
    Beispiel 3 Herstellung von Lysin
    Der in Beispiel 2 erhaltene C. glutamicum Stamm DSM5715::pCR2.1tipAint wird in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
    Dazu wird der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin (25 mg/l) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wird eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wird das Vollmedium CgIII verwendet.
    Medium Cg III
    NaCl 2,5 g/l
    Bacto-Pepton 10 g/l
    Bacto-Yeast-Extrakt 10 g/l
    Glucose (getrennt autoklaviert) 2% (w/v)
    Der pH-Wert wird auf pH 7.4
    eingestellt
    Diesem wird Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wird 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wird eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD beträgt. Für die Hauptkultur wird das Medium MM verwendet.
    Medium MM
    CSL (Corn Steep Liquor) 5 g/l
    MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) 20 g/l
    Glucose (getrennt autoklaviert) 50g/l
    Salze:
    (NH4)2SO4) 25 g/l
    KH2PO4 0,1 g/l
    MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l
    CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l
    FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l
    MnSO4 * H2O 5,0mg/l
    Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/l
    Thiamin * HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/l
    Leucin (sterilfiltriert) 0,1 g/l
    CaCO3 25 g/l
    CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
    Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wird Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgt bei 33°C und 80% Luftfeuchtigkeit.
    Nach 72 Stunden wird die OD bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wird mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt .
    In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
    Stamm OD
    (660 nm)    		 Lysin-HCl
    g/l
    DSM5715 8,2 13,6
    DSM5715::pCR2.1tipAint 10,5 15,1
    Kurze Beschreibung der Figur:
    Figur 1: Karte des Plasmids pCR2.1tipAint.
    Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
    Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
    KmR:
    Kanamycin Resistenz-Gen
    EcoRI:
    Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
    tipAint:
    internes Fragment des tipA-Gens
    ColE1:
    Replikationsursprung des Plasmides ColE1
    Figure 00210001

    Claims (11)

    1. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation coryneformer Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen man die für den Transkriptionsregulator TipA kodierende Nukleotidsequenz (tipA) abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.
    2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass man L-Lysin herstellt.
    3. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt,
      a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das für den Transkriptionsregulator TipA kodierende Gen abschwächt,
      b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
      c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder Biomasse in Anteilen oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.
    4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.
    5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.
    6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Expression des Polynukleotids, das für den Transkriptionsregulator TipA kodiert, verringert.
    7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die regulatorischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymproteins) verringert, für das die Transkriptionsregulator TipA Nukleotidsequenz (tipA) kodiert.
    8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
      8.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
      8.2 das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
      8.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
      8.4 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
      8.5 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
      8.6 das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
      8.7 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1,
      8.8 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi,
      8.9 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,
      8.10 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
      verstärkt insbesondere überexprimiert.
    9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
      9.1 das für ein Katabolit-Kontroll-Protein A kodierende Gen ccpA1,
      9.2 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
      9.3 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen,
      9.4 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB,
      9.5 das für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodierende Gen fda, oder
      9.6 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2,
      abschwächt.
    10. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.
    11. Coryneforme Bakterien, in denen zumindest das für den Transkriptionsregulator TipA kodierende Gen abgeschwächt vorliegt.
    EP05003969A 2004-03-09 2005-02-24 Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien Withdrawn EP1574582A1 (de)

    Applications Claiming Priority (2)

    Application Number Priority Date Filing Date Title
    DE102004011248 2004-03-09
    DE102004011248A DE102004011248A1 (de) 2004-03-09 2004-03-09 Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien

    Publications (1)

    Publication Number Publication Date
    EP1574582A1 true EP1574582A1 (de) 2005-09-14

    Family

    ID=34813614

    Family Applications (1)

    Application Number Title Priority Date Filing Date
    EP05003969A Withdrawn EP1574582A1 (de) 2004-03-09 2005-02-24 Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien

    Country Status (5)

    Country Link
    US (1) US20050221454A1 (de)
    EP (1) EP1574582A1 (de)
    CN (1) CN1680564A (de)
    BR (1) BRPI0500729A (de)
    DE (1) DE102004011248A1 (de)

    Cited By (1)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    US7629142B2 (en) * 2004-01-30 2009-12-08 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing microorganism and method for producing L-amino acid

    Families Citing this family (9)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    KR100789272B1 (ko) 2005-12-03 2008-01-02 씨제이 주식회사 Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
    KR100838038B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
    ES2383473T3 (es) * 2007-11-20 2012-06-21 Dsm Ip Assets B.V. Producción de ácido dicarboxílico en eucariotas
    US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
    EP3404101A3 (de) * 2011-12-21 2018-12-26 Cj Cheiljedang Corporation Verfahren zur herstellung von l-lysin mit mikroorganismen mit fähigkeit zur herstellung von l-lysin
    US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
    US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
    EP4194545A1 (de) * 2020-08-07 2023-06-14 Ningxia Eppen Biotech Co. Ltd Rekombinanter stamm zur herstellung von l-aminosäure und herstellungsverfahren dafür und verwendung davon
    CN112063571B (zh) * 2020-08-14 2022-05-06 廊坊梅花生物技术开发有限公司 高产l-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用

    Citations (3)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    WO2002018596A1 (en) * 2000-08-31 2002-03-07 Degussa Ag Citb gene from corynebacteria and use thereof in synthesis of l-amino acids
    DE10117816A1 (de) * 2001-04-10 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
    DE10126164A1 (de) * 2001-05-30 2002-12-05 Degussa Für das metD-gen kodierende Nukleotidsequenzen

    Family Cites Families (7)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    US20020028490A1 (en) * 1999-03-19 2002-03-07 Douwe Molenaar Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria
    JP4526710B2 (ja) * 1999-04-19 2010-08-18 協和発酵バイオ株式会社 新規な脱感作型アスパルトキナーゼ
    US6872553B2 (en) * 1999-10-20 2005-03-29 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the pck gene
    DE19950409A1 (de) * 1999-10-20 2001-04-26 Degussa Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen
    DE19959327A1 (de) * 1999-12-09 2001-06-13 Degussa Neue für das zwa2-Gen codierende Nukleotidsequenzen
    DE19959328A1 (de) * 1999-12-09 2001-06-13 Degussa Neue für das zwa1-Gen codierende Nukleotidsequenzen
    US7049106B2 (en) * 2001-04-10 2006-05-23 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria with an attenuated mqo gene

    Patent Citations (3)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    WO2002018596A1 (en) * 2000-08-31 2002-03-07 Degussa Ag Citb gene from corynebacteria and use thereof in synthesis of l-amino acids
    DE10117816A1 (de) * 2001-04-10 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
    DE10126164A1 (de) * 2001-05-30 2002-12-05 Degussa Für das metD-gen kodierende Nukleotidsequenzen

    Non-Patent Citations (1)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Title
    ANONYMOUS: "Neues Zulaufverfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin mit coryneformen Bakterien", RESEARCH DISCLOSURE, KENNETH MASON PUBLICATIONS, WESTBOURNE, GB, vol. 431, no. 10, March 2000 (2000-03-01), XP007125671, ISSN: 0374-4353 *

    Cited By (2)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    US7629142B2 (en) * 2004-01-30 2009-12-08 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing microorganism and method for producing L-amino acid
    US8383363B1 (en) 2004-01-30 2013-02-26 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing microorganism and method for producing L-amino acid

    Also Published As

    Publication number Publication date
    CN1680564A (zh) 2005-10-12
    US20050221454A1 (en) 2005-10-06
    BRPI0500729A (pt) 2006-04-18
    DE102004011248A1 (de) 2005-09-22

    Similar Documents

    Publication Publication Date Title
    EP1574582A1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
    EP1103611A1 (de) Für die Gene sucC und sucD kodierende Nukleotidsequenzen
    DE102004013503A1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
    DE10112992A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
    DE60312592T2 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung Coryneformer Bakterien die ein attenuiertes Malat Enzym-gen enthalten
    DE10117816A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
    DE10144493A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coyneformer Bakterien
    DE10039044A1 (de) Neue für das IysR1-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE60224197T2 (de) Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren mittels koryneformen bakterien
    DE10110760A1 (de) Neue für das otsA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE10162386A1 (de) Für das rpsL-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE10039043A1 (de) Neue für das luxR-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE10039049A1 (de) Neue für das IysR3-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE10162650A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
    DE10163167A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren und Verwendung coryneformer Bakterien
    DE60127422T2 (de) Für das citB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE60132215T2 (de) Nuleotidsequenzen die für das cita-gen kodieren
    DE60127972T2 (de) Nukleotidsequenzen die für das dep34-gen kodieren
    DE60105034T2 (de) Nukleotid sequenzen kodierend für das lysr2 gen
    DE10136987A1 (de) Für das clpC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE10112098A1 (de) Neue für das chrA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE10112105A1 (de) Neue für das luxS-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE10109022A1 (de) Neue für das chrS-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
    DE10110344A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
    DE10113011A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellun von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneforme Bakterien

    Legal Events

    Date Code Title Description
    PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

    Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

    17P Request for examination filed

    Effective date: 20050224

    AK Designated contracting states

    Kind code of ref document: A1

    Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR

    AX Request for extension of the european patent

    Extension state: AL BA HR LV MK YU

    AKX Designation fees paid

    Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR

    RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

    Owner name: DEGUSSA GMBH

    RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

    Owner name: EVONIK DEGUSSA GMBH

    17Q First examination report despatched

    Effective date: 20071025

    STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

    Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

    RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

    Owner name: EVONIK DEGUSSA GMBH

    18D Application deemed to be withdrawn

    Effective date: 20080305