DE10117816A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer BakterienInfo
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- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, bei dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das mqo-Gen abschwächt, DOLLAR A b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolierung der L-Aminosäure, DOLLAR A und gegebenenfalls Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt, oder Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.
Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen
das mqo-Gen, das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase
kodiert, abgeschwächt ist.
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der
großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel
Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die
Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die
Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die
Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel
Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie zum Beispiel
das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph
für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-
Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-
Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium
glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-
Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-
Aminosäure-Produktion untersucht.
In der EP-A-1038969 wird beschrieben, daß durch de
Verstärkung, insbesondere Überexpression, des mqo-Gens eine
Verbesserung der fermentativen L-Aminosäure-Herstellung
erzielt werden kann.
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue
Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen
Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, mit
coryneformen Bakterien bereitzustellen.
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt,
sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich
ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-
Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-
Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-
Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan
und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.
Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind
damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie
z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, unter
Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man
zumindest die für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase
kodierende Nukleotidsequenz (mqo-Gen) abschwächt,
insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau
exprimiert.
Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren in dem folgende
Schritte durchführt werden:
- a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Nukleotidsequenz abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird;
- b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und
- c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder ihren Gesamtmengen im Endprodukt vrebleiben.
Die eingesetzten Stämme produzieren bevorzugt bereits vor
der Abschwächung des mqo-Gens L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
Der Begriff "Abschwächung" bzw. "Abschwächen" beschreibt in
diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder
Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose,
Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder
aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um
Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung
Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium
ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu
nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist,
L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum ATCC 21513
Corynebacterium glutamicum ATCC 21544
Corynebacterium glutamicum ATCC 21543
Corynebacterium glutamicum DSM 4697 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum ATCC 21513
Corynebacterium glutamicum ATCC 21544
Corynebacterium glutamicum ATCC 21543
Corynebacterium glutamicum DSM 4697 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.
Es wurde im Gegensatz zum Stand der Technik (EP-A-1038969)
gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Abschwächung des
mqo-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren produzieren.
Die Nukleotidsequenz des mqo-Gens von Corynebacterium
glutamicum wurde von Molenar et al (European Journal of
Biochemistry 254, 395-403 (1998)) publiziert und kann
ebenfalls der Genbank unter der Accession Number AJ 22 4946
entnommen werden. Die Nukleotidsequenz ist ebenfalls in SEQ
ID No. 1 und die Aminosäuresequenz des Proteins in SEQ ID
No. 2 dargestellt.
Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Sequenzen
kodierend für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase können
erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele
der Malat-Chinon-Oxidoreduktase verwendet werden, die sich
aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch
funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations")
ergeben.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die
Expression des mqo-Gens oder die katalytischen
Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder
ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen
kombiniert.
Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder
durch genetische Veränderung (Mutation) der
Signalstrukturen der Genexpression verringert werden.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise
Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und
Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in
der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und
Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996))
und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene
und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al.
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762
(1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus
Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen
Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des
Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense
mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations")
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in
deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die
Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge einer
Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies
ebenfalls im allgemeinen zu einem vorzeitigen Abbruch der
Translation.
Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu
einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen
zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der
Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Gegenstand der Erfindung ist das in SEQ ID No. 3
dargestellte Allel 672 des mqo-Gens, welches anstelle des
Nukleotids Guanin an Position 672 der DNA-Sequenz (Siehe
SEQ ID No. 1) das Nukleotid Adenin trägt, was zu einem
Austausch des für die Aminosäure Tryptophan-224 (Siehe SEQ
ID No. 2) kodierenden TGG-Kodons gegen ein opal (TGA) Stop-
Kodon führt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin das in SEQ ID No. 4
dargestellte Allel 1230 des mqo-Gens, welches anstelle des
Nukleotids Guanin an Position 672 der DNA-Sequenz (Siehe
SEQ ID No. 1) das Nukleotid Adenin trägt, was zu einem
Austausch des für die Aminosäure Tryptophan-224 (Siehe SEQ
ID No. 2) kodierenden tgg-Kodons zu einem opal Stop-Kodon
führt und welches zusätzlich einen Nukleotidaustausch an
Position 1230 von Cytosin zu Thymin trägt.
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C, glutamicum zu
mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung
("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene
replacement").
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler
Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen
Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als
Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob
(Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder
pK19mobsacE (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174:
5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI,
USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al.,
Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder
pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das
zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird
anschließend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode
der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))
beschrieben. Methoden zur Transformation sind
beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-
Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens
durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei
unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-
Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von
Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C.
glutamicum verwendet.
Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement")
wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder
Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro
hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen
für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und
dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation
in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration
bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten
zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses
im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau
der Mutation bzw. des Allels.
Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et
al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das
pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion
auszuschalten. Von Schäfer et al. (Gene 145: 69-73 (1994))
wurde beispielsweise diese Methode verwendet, um eine
Deletion in die hom-thrB-Genregion einzubauen. In gleicher
Weise wurde von Schäfer et al. (Journal of Bacteriology
176: 7309-7319 (1994)) eine Deletion in die cgl-Genregion
von C. glutamicum eingeführt.
In das mqo-Gen kann auf diese Weise eine Deletion,
Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des mqo-Gens
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus,
des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und
gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken,
insbesondere überzuexprimieren.
Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in
diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären
Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem
Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert
werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens
bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen
oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw.
Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
So kann für die Herstellung von L-Lysin zusätzlich zu der
Abschwächung des mqo-Gens eines oder mehrere der Gene
ausgewählt aus der Gruppe
- - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - gleichzeitig das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- - gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
- - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), und
- - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur
Abschwächung des mqo-Gens gleichzeitig eines oder mehrere
der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- - das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396, 478, DSM 12969),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 1.99 51 975.7, DSM 13114),
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)
abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.
Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren,
vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des mqo-Gens
unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta,
Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind
ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivie rungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA,
1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie
z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B.
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische
Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten
wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des
gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird
normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden
erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem
Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei
Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit
anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie
kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)
beschrieben.
Claims (14)
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dadurch
gekennzeichnet, daß man folgende Schritte
durchführt,
- a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das mqo-Gen abschwächt,
- b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder ihren Gesamtmengen im Endprodukt vrebleiben.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des
Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure
verstärkt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest
teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der
gewünschten L-Aminosäure verringern.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Expression des
(der)Polynukleotides (e), das (die) für das mqo-Gen
kodiert, verringert.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man die katalytischen
Eigenschaften des Polypeptids (Enzymproteins)
verringert, für das das Polynukleotid mqo kodiert.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man für die
Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 6.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
- 2. 6.2 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
- 3. 6.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
- 4. 6.4 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
- 5. 6.5 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
- 6. 6.6 gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
- 7. 6.7 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1,
- 8. 6.8 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi, und
- 9. 6.9 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 7.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
- 2. 7.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen,
- 3. 7.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB, oder
- 4. 7.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2
8. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium
glutamicum einsetzt.
9. Coryneforme Bakterien, in denen zumindest das mqo-Gen
in abgeschwächter Form vorliegt.
10. Coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, dass die Abschwächung durch eine
Deletions-, Inversions-, Transitions- oder
Transversions-Mutation erfolgt.
11. Coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch
gekennzeichnet, dass das mqo-Gen ein Stop-Kodon
enthält.
12. Coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, dass sich das Stop-Kodon, insbesondere
vom Typ opal, entsprechend der Position 224 der
Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 befindet.
13. Coryneforme Bakterien gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie
das mqo-Allel gemäß SEQ ID No. 3 enthalten.
14. Coryneforme Bakterien gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie
das mqo-Allel gemäß SEQ ID No. 4 enthalten.
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