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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung heller und thermisch
stabiler, granulierter Tierfuttermitteladditive auf Fermentationsbrühebasis mit
einem hohen Gehalt an L-Lysin und verlustarmer Verfahren zur Herstellung
aus durch Fermentation erhaltenen Brühen unter Verwendung ausgewählter coryneformer
Bakterien.
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Stand der Technik
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Tierfuttermittel
werden mit einzelnen Aminosäuren
entsprechend dem Bedarf der Tiere supplementiert. Zur Supplementierung
von Tierfuttermitteln, z. B. mit L-Lysin, wird bisher weit überwiegend
das L-Lysin-monohydrochlorid mit einem L-Lysin-Gehalt von ca. 80
% eingesetzt. Da das L-Lysin
durch Fermentation hergestellt wird, muß es zur Herstellung des Monohydrochlorids
zunächst
einmal von allen übrigen
Bestandteilen der rohen Fermentationsbrühe in aufwendigen Verfahrensschritten
abgetrennt, dann in das Monohydrochlorid umgewandelt und letzteres zur
Kristallisation gebracht werden. Dabei fallen eine große Anzahl
von Nebenprodukten und die zur Aufarbeitung notwendigen Reagentien
als Abfall an. Da eine hohe Reinheit des Tierfuttermittelsupplements nicht
immer notwendig ist und zudem in den Nebenprodukten der Fermentation
oft noch nutritiv wirksame Wertstoffe enthalten sind, hat es daher
in der Vergangenheit nicht an Versuchen gefehlt, die aufwendige
Herstellung von Futter-Aminosäuren,
insbesondere von reinem L-Lysin-Monohydrochlorid zu vermeiden und
die rohe Fermentationsbrühe
kostengünstiger
in ein festes Tierfuttermittel zu überführen.
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Als
gravierender Nachteil hat sich die komplexe Zusammensetzung solcher
Medien erwiesen, denn diese sind generell nur schlecht zu trocknen, dann
hygroskopisch, praktisch nicht rieselfähig, verklumpungsgefährdet, und
für die
technisch anspruchsvolle Verarbeitung in Mischfutterwerken nicht geeignet.
Dies trifft vor allem auf L-Lysin enthaltende Fermentationsprodukte
zu. Die einfache Entwässerung
der rohen Fermentationsbrühe
durch Sprühtrocknung
führte
zu einem staubigen, stark hygroskopischen und nach kurzer Lagerzeit
klumpigen Konzentrat, das in dieser Form nicht als Tierfuttermittel
eingesetzt werden kann.
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Die
EP 0 533 039 betrifft Verfahren
zur Herstellung eines Aminosäure-Tierfuttermittelsupplements
auf Fermentationsbrühebasis,
wobei das Supplement direkt durch Sprühtrocknung aus der Fermentationsbrühe gewonnen
werden kann. Hierzu wird bei einer Variante ein Teil der Biomasse
vor der Sprühtrocknung
abgetrennt. Durch eine sehr saubere Führung der Fermentation, d.
h. bei Erhalt einer an organischen Substanzen rückstandsarmen Fermentationsbrühe, kann
die Brühe
sogar ohne die Biomasse und ohne zusätzlichen Trägerhilfsstoff zu einem handhabbaren
Granulat getrocknet werden.
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Ca.
20 Gew.-% L-Lysin enthaltende feste Konzentrate sind aus der
GB 1 439 121 bekannt, in der
auch L-Lysin-haltige Fermentationsbrühen mit einem pH-Wert von 4,5
und einem Bisulfitgehalt beschrieben werden.
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In
der
EP 0 615 693 wird
ein Verfahren zur Herstellung eines Tierfuttermittel-Additives auf
Fermentationsbrühe-Basis offenbart,
bei dem man die Fermentationsbrühe,
ggf. nach Entfernung eines Teils der Inhaltsstoffe, zu einem Feinkorn,
das zu mind. 70 Gew.-% eine maximale Partikelgröße von 100 µm hat, sprühtrocknet, und dass man dieses Feinkorn
in einer zweiten Stufe zu einem Granulat aufbaut, das zu mind. 30
Gew.-% das Feinkorn enthält.
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Gemäß
GB 1 439 728 wird ein L-Lysin
enthaltendes Konzentrat aus einer Fermentationsbrühe hergestellt,
die man vor der Aufkonzentration mit HCl auf einen pH von ca. 6,4
ansäuert
und der man zur Stabilisierung Bisulfit zusetzt.
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Nach
der Eindampfung wird weiter auf einen pH-Wert von 4,0 angesäuert und
das gewünschte Produkt
durch Sprühtrocknung
erhalten.
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Dort
wurde gefunden, dass die Menge der Gegenionen für das Lysin wie z. B. die der
Sulfationen verringert werden kann, indem man während der Fermentation entstehendes
Kohlendioxid als Gegenion benutzt. Insgesamt wird ein Anionen/Lysin-Verhältnis von
0,68 bis 0,95 beansprucht.
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Die
Verringerung der Gegenionen wie z. B. Sulfat im L-Lysin enthaltenden
Produkt soll zu einer Verbesserung der hygroskopischen Eigenschaften und
der Verbackungsneigung führen.
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Weiterhin
wird ständig
an der Verbesserung der Leistungseigenschaften der L-Lysin ausscheidenden
coryneformen Bakterien gearbeitet, um kostengünstig L-Lysinhaltige Fermentationsbrühen herzustellen,
aus denen die gewünschten
L-Lysin-haltigen Produkte hergestellt werden können.
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Aufgabe der Erfindung
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Aufgabe
der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung
eines L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs mit verbesserten
Eigenschaften unter Verwendung ausgewählter coryneformer Bakterien.
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Beschreibung der Erfindung
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines L-Lysin enthaltenden
Futtermitteladditivs dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte
durchführt
- a) Fermentation eines isolierten L-Lysin produzierenden
coryneformen Bakteriums, bevorzugt der Gattung Corynebacterium,
ganz besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum in einem
wässrigen
Nährmedium
unter aeroben Bedingungen für
eine bestimmte Zeit, wobei man nach Abschluss der Fermentation,
- b) gegebenenfalls das Sulfat/L-Lysin-Verhältnis bestimmt,
- c) anschließend
gegebenenfalls Ammoniumsulfat zusetzt,
- d) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,9 bis 5,2 absenkt,
wobei man durch die Zugabe der Sulfat-haltigen Verbindung(n) in
den Schritten c) und d) ein Sulfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2 in der
Brühe einstellt,
- e) das so erhaltene Gemisch aufkonzentriert, trocknet und dabei
bevorzugt granuliert und ein Produkt mit einem L-Lysin-Gehalt von
10 bis 70 Gew.-% (bestimmt als Lysinbase, bezogen auf die Gesamtmenge)
erhält,
und
- f) wobei das isolierte coryneforme Bakterium eine Nukleotidsequenz,
bevorzugt im Chromosom, enthält,
die für
eine Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, und wobei das isolierte
coryneforme Bakterium eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen,
bevorzugt im Chromosom, enthält,
ausgewählt
aus der Gruppe:
- g) Nukleotidsequenz, die für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase kodiert, welches eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu ≥ 95 % identisch
ist mit SEQ ID NO:6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen
L-Valin enthält,
- h) Nukleotidsequenz, die für
ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
Aktivität
kodiert, welches eine Aminosäuresequenz
besitzt, die zu ≥ 95
% identisch ist mit SEQ ID NO:12 und an Position 321 jede proteinogene
Aminosäure ausgenommen
Glycin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen
L-Serin enthält,
- i) Nukleotidsequenz, die für
eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert,
welche eine Aminosäuresequenz
besitzt, die zu ≥ 95
%, identisch ist mit SEQ ID NO:18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche
ausgewählt
aus der Gruppe: an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene
Aminosäure ausgenommen
L-Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Prolin und an Position 261 der Aminosäuresequenz
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Tyrosin, enthält,
und
- j) Nukleotidsequenz, die für
ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase
Aktivität
kodiert, welches eine Aminosäuresequenz
besitzt, die zu ≥ 95 %,
identisch ist mit SEQ ID NO:24 und an Position 111 jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Alanin, enthält.
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Die
OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kann ebenfalls
als OpcA-Polypeptid, OpcA-Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
oder als OpcA-Polypeptid Untereinheit bezeichnet werden. In der
EP 1 108 790 (siehe SEQ
ID NO:1744 in Tabelle 1) wird das OpcA-Polypeptid auch als „glucose
6-phosphate dehydrogenase assembly Protein" bezeichnet.
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Bei
den isolierten coryneformen Bakterien handelt es sich bevorzugt
um solche der Gattung Corynebacterium. Besonders bevorzugt sind
Stämme, die
auf folgenden Arten beruhen:
Corynebacterium efficiens, wie
zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum,
wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium thermoaminogenes
wie zum Beispiel der Stamm FERN BP-1539, und
Corynebacterium
ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,
wobei die
Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.
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Einige
Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik
auch unter anderen Artbezeichnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium lilium DSM20137
Corynebacterium
melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
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Angaben
zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien
findet man unter anderem bei Seiler (
Journal of General
Microbiology 129, 1433-1477 (1983), Kämpfer und Kroppenstedt (
Canadian
Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)),
Liebl
et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260
(1991) und in der
US-A-5,250,434 .
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Stämme mit
der Bezeichnung „ATCC" können von
der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen
werden. Stämme
mit der Bezeichnung „DSM" können von
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERN" können vom
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
(RIST, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)
bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes
(FERN BP-1539) ist in der
US-A
5,250,434 beschrieben. Stämme mit der Bezeichnung „NRRL" können von
der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS,
Peoria, Illinois, US) bezogen werden.
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Das
Chromosom von Corynebacterium glutamicum wurde vor einiger Zeit
vollständig
sequenziert (Kalinowski et al., Journal of Biotechnology
104, 5-25 (2003)). Das Chromosom von Corynebacterium efficiens
wurde ebenfalls bereits sequenziert (Nishio et al., Genome
Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)).
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Entsprechende
Sequenzangaben können den öffentlichen
Datenbanken entnommen werden. Geeignete Datenbanken sind beispielsweise
die Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL,
Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK), die Datenbank des National
Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
die des Swiss Institute of Bioinformatics (Swissprot, Genève, Switzerland),
die Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC,
USA) und die DNA Data Bank of Japan (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540,
Japan).
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Zusammenfassende
Darstellungen zur Genetik, zum Stoffwechsel und zur technischen
Bedeutung von Corynebacterium findet man in den Aufsätzen von
Ikeda, von Pfefferle et al. und von Mueller und Huebner im Buch „Microbial
Production of L-Amino Acids" (Advances
in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlin,
Deutschland, Herausgeber: T. Scheper), in der Spezialausgabe „A New
Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" des Journal of Biotechnology (Band
104 (1-3), 2003,
Herausgeber: A. Pühler
und T. Tauch) und im „Handbook of Corynebacterium
glutamicum" (Herausgeber:
L. Eggeling und M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA,
2005).
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Mit
dem Begriff „isoliertes
coryneformes Bakterium" sind
durch klassische Mutageneseverfahren erzeugte Mutanten, durch Rekombinationstechniken hergestellte
Bakterien und solche Bakterien gemeint, zu deren Herstellung beide
Verfahren eingesetzt wurden.
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Unter
proteinogenen Aminosäuren
versteht man die Aminosäuren
in der L-Form, die in natürlichen
Proteinen, das heißt
in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen
vorkommen.
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Hierzu
gehören
insbesondere L-Asparaginsäure,
L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Alanin,
L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin,
L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin
und L-Arginin und deren Salze.
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Die
Begriffe Protein und Polypeptid sind gegenseitig austauschbar.
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Unter
einer Lysin insensitive Aspartatkinase versteht man ein Polypeptid
bzw. Protein mit Aspartatkinase-Aktivität (EC Nr 2.7.2.4), die im Vergleich zur
Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen
von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC (Aminoethylcystein)
und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Derartige
Aspartatkinasen werden auch als „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte
Aspartatkinasen bezeichnet. Die für diese desensibilisierten
Aspartatkinasen bzw. Aspartatkinasevarianten kodierenden Nukleotidsequenzen werden
auch als lysCFBR-Allele bezeichnet. Informationen
zu zahlreichen lysCFBR-Allelen sind in den öffentlichen
Datenbanken verfügbar.
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Die
Kodierregion des Wildtyp lysC-Gens von Corynebacterium glutamicum
entsprechend der Zugangsnummer AX756575 der NCBI Datenbank ist in SEQ
ID NO:1 und das von diesem Gen kodierte Polypeptid in SEQ ID NO:2
dargestellt. In der SEQ ID NO:3 sind außerdem die stromaufwärts des
5'-Endes und stromabwärts des
3'-Endes der Kodierregion
gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:4 entspricht SEQ
ID NO:2.
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Die
für die
Massnahmen der Erfindung eingesetzten coryneformen Bakterien verfügen bevorzugt über ein
lysC-Allel, das
für eine
Aspartatkinasevariante kodiert, welche die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:2 besitzt, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche
ausgewählt
aus der Gruppe:
lysC A279T (Austausch von L-Alanin an Position
279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2 gegen L-Threonin;
siehe
US 5,688,671 und
Zugangsnummern E06825, E06826, E08178 und I74588 bis I74597),
lysC
A279V (Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID NO:2
gegen L-Valin, siehe
JP 6-261766 und
Zugangsnummer E08179),
lysC L297Q (Austausch von L-Leucin an
Position 297 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:2
gegen L-Glutamin; siehe SEQ ID NO:31,
lysC S301F (Austausch
von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID NO:2
gegen L-Phenylalanin; siehe
US
6,844,176 und Zugangsnummer E08180),
lysC S301Y (Austausch
von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID NO:2
gegen L-Tyrosin, siehe
Kalinowski et al. (Molecular and
General Genetics 224, 317-324 (1990)) und Zugangsnummer
X57226),
lysC T308I (Austausch von L-Threonin an Position 308
des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 2 gegen L-Isoleucin;
siehe
JP 6-261766 und
Zugangsnummer E08181)
lysC T311I (Austausch von L-Threonin
an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID
NO:2 gegen L-Isoleucin; siehe
WO
00/63388 und
US 6,893,848 ),
lysC
S317A (Austausch von L-Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID NO:2
gegen L-Alanin; siehe
US 5,688,671 und
Zugangsnummer I74589),
lysC R320G (Austausch von L-Arginin
an Position 320 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID
NO:2 gegen Glycin; siehe
Jetten et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 43, 76-82 (995)) und Zugangsnummer L27125),
lysC
G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID NO:2
gegen L-Asparaginsäure;
siehe
Jetten et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
43, 76-82 (995)) und Zugangsnummer L16848),
lysC T380I
(Austausch von L-Threonin an Position 380 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID
NO:2 gegen L-Isoleucin; siehe
WO
01/49854 und Zugangsnummer AX192358), und
lysC S381F
(Austausch von L-Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID NO:2
gegen L-Phenylalanin; siehe
EP
0435132 )
umfasst.
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Es
ist bekannt, dass konservative Aminosäureaustausche die Enzymaktivität nur unwesentlich verändern. Dementsprechend
kann die in den verwendeten isolierten coryneformen Bakterien enthaltene
Aspartatkinasevariante, zusätzlich
zu den angegebenen Aminosäureseaustauschen
einen (1) oder mehrere konservative Aminosäureaustausch(e) enthalten.
Bevorzugt enthält
das Polypeptid höchstens zwei
(2), höchstens
drei (3), höchstens
vier (4) oder höchstens
fünf (5)
konservative Aminosäureaustausche.
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Bei
den aromatischen Aminosäuren
spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan
und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben
Aminosäuren spricht
man von konservativen Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin und Valin
gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht
man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und Asparagin gegeneinander
ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen
Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht
werden. Bei den sauren Aminosäuren
spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und
Glutaminsäure
gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden
Aminosäuren
spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin
gegeneinander ausgetauscht werden.
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Durch
die genannten konservativen Aminosäureaustausche wird die enzymatische
Aktivität
der genannten Aspartatkinasevarianten im wesentlichen nicht berührt. „Im wesentlichen
nicht berührt" bedeutet, dass sich
die enzymatische Aktivität
der genannten Aspartatkinasevarianten durch den konservativen Aminosäureaustausch
um maximal 10 %, maximal 7,5 %, maximal 5 %, maximal 2,5 % oder
maximal 1 % erhöht
oder verringert.
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Stämme, welche
die für
die Massnahmen der Erfindung bevorzugten Aspartatkinasevarianten
enthalten, können
- a) von den öffentlich
zugänglichen
Stammsammlungen bezogen werden, oder
- b) durch Rekombinationstechniken ausgehend von den Nukleotidsequenzen
bekannter Aspartatkinase-Allele erzeugt werden, oder
- c) durch in-vitro Mutagenesetechniken oder durch chemische Synthese
gefolgt von Rekombinationstechniken erzeugt werden, oder
- d) durch klassische Mutageneseverfahren, gegebenenfalls gefolgt
von Selektion auf AEC haltigen Agarplatten und Sequenzierung des
lysC Gens erhalten und identifiziert werden.
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Ausführungen
zu a):
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Eine
Mutante von Corynebacterium glutamicum, die die Aminosäureaustausche
lysC A279T und lysC S381F in der Aspartatkinase enthält, ist
beispielsweise unter der Bezeichnung NRRL B-11474 (
US 4,275,157 ) bei der ARS Patent Culture
Collection hinterlegt.
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Eine
Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch
lysC A279T in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der
Bezeichnung FERN P-1987
(
US 5,688,671 ) beim National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology hinterlegt.
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Eine
Mutante von Corynebacterium glutamicum, die die Aminosäureaustausche
lysC S301Y in der Aspartatkinase enthält, ist in der
EP 0387527 mit der Bezeichnung DM58-1
beschrieben und in Form des Stammes DM58-1/pDM6 als DSM4697 (
EP 0358940 ) bei der DSM
hinterlegt.
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Eine
Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch
lysC T311I in der Aspartatkinase enthält, ist in der
PCT/EP2005/012417 beschrieben und
als DSM 16833 bei der DSM hinterlegt.
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Eine
Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch
lysC S317A in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter der
Bezeichnung FERM P- 6464
(
JP 58-170487 ) beim
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
hinterlegt.
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Eine
Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch
lysC T380I in der Aspartatkinase enthält, ist beispielsweise unter
der Bezeichnung ATCC21529 bei der ATCC hinterlegt.
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Eine
Mutante von Corynebacterium glutamicum, die den Aminosäureaustausch
lysC S381F in der Aspartatkinase enthält ist unter der Bezeichnung MH20-22B
(Menkel et al. Applied and Environmental Microbiology 55,
684-688 (1989))) bekannt. Dieser Stamm ist unter der Bezeichnung
DSM 16835 bei der DSMZ hinterlegt.
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Ausführungen
zu b):
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Rekombinationstechniken
zum Einbau von identifizierten Mutationen in das Chromosom coryneformer
Bakterien sind unter dem Begriff „Allel-Austausch" (gene replacement)
bekannt.
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Angaben
zu Nukleotidsequenzen von lysCFBR-Allelen
können
den angegebenen Veröffentlichungen
und den in öffentlichen
Datenbanken zugänglichen
Sequenzangaben entnommen werden.
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Bei
dem Verfahren des Allelaustausches wird ein DNA-Fragment, welches die interessierende Mutation
enthält,
in den gewünschten
Stamm eines coryneformen Bakteriums überführt und die Mutation durch
wenigstens zwei Rekombinationsereignisse beziehungsweise „cross
over"-Ereignisse in das Chromosom
des gewünschten
Stammes inkorporiert, beziehungsweise die im betreffenden Stamm vorhandene
Sequenz eines Gens gegen die mutierte Sequenz ausgetauscht.
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Die
gewünschten
Allele können
aus den hinterlegten Stämmen
mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion oder direkt aus hinterlegter
Plasmid DNA gewonnen werden. So ist DNA des lysC
FBR-Allels,
das für
die Aspartatkinasevariante mit dem Aminosäureaustausch lysC T311I kodiert
in Form des Stammes FERM BP-6689 (
US
6,893,848 ) verfügbar.
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Dieses
Verfahren ist unter anderem bei Schwarzer und Pühler (
Bio/Technology
9, 84-87 (1991)), bei Schäfer
et al. (Gene 145, 69-73 (1994)), in der
EP 1108790 ,
WO 02/070685 und
WO 03/014362 beschrieben. In der
US 6,844,176 ist der Einbau
von lysC S301F in Corynebacteriun glutamicum DM1636 beschrieben.
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Der
erfolgte Einbau der erwünschten
Mutation bzw. Nukleotidabfolge kann durch Sequenzierung oder auch
mit Hilfe der „Fluorescence
Ressonance Energy Transfer"-Methode
(FREI) durch Schmelzkurvenanalyse (Lay et al., Clinical
Chemistry, 43:2262-2267 (1997)) nachgewiesen werden.
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Ausführungen
zu c):
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Da
die Nukleotidsequenz des Wildtyps coryneformer Bakterien bekannt
ist und die DNA der Bakterien einfach zu isolieren ist, können auch
in-vitro Methoden zur Herstellung der gewünschten lysCFBR-Allele
verwendet werden. Hierzu können
beispielsweise mutagene Oligonukleotide (T.A. Brown: Gentechnologie
fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993)
oder die Methode von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3-4
(1996)) unter Verwendung des "Quik Change Site-directed Mutagenesis
Kit" von Stratagene
(La Jolla, California, USA) eingesetzt werden.
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Weiterhin
kann die DNA der gewünschten
lysCFBR-Allele durch chemische Synthese,
beispielsweise mit der Phoshoramidit-Methode (Beaucage et al., Tetrahedon
Letters 22, 1859-1862 (1981) hergestellt werden.
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Die
erhaltenen Allele können
wiederum durch das oben beschrieben Verfahren des Allelaustauschs
in das Chromosom coryneformer Bakterien eingebaut werden.
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Ausführungen
zu d):
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Zur
Herstellung von Mutanten können
klassische in-vivo Mutageneseverfahren mit Zellpopulationen coryneformer Bakterien
unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin
(MNNG), Ethylmethansulfonat (EMS), 5-Bromuracil oder ultraviolettes
Licht verwendet werden. Mutagenesemethoden sind beispielsweise im
Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al.
(Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA,
1981) oder bei Tosaka et al. (Agricultural and
Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) oder bei Konicek
et al (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)) beschrieben.
Typische Mutagenesen unter Verwendung von MNNG umfassen Konzentrationen
von 50 bis 500 mg/l oder auch höhere
Konzentrationen bis zu maximal 1 g/l, eine Inkubationszeit von 1
bis 30 Minuten bei einem pH von 5,5 bis 7,5. Unter diesen Bedingungen
wird die Zahl der lebensfähigen
Zellen um einen Anteil von ca. 50 % bis 90 % oder ca. 50 % bis 99
% oder ca. 50 % bis 99,9 % oder mehr reduziert.
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Zur
Identifizierung von Stämmen,
welche die gewünschte
Aspartatkinase-Variante enthalten, werden der mutagenisierten Zellpopulation
Mutanten entnommen. Anschließend
wird das lysC-Gen der Mutanten mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
amplifiziert, die Nukleotidsequenz des lysC-Gens dieser Mutanten
bestimmt und aus der erhaltenen Nukleotidsequenz die Aminosäuresequenz der
kodierten Aspartatkinasevariante bestimmt.
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Für die Polymerase-Kettenreaktion
werden vorteilhafterweise Primer ausgewählt, die an den stromaufwärts des
lysC-Gens gelegenen DNA-Abschnitt und an den stromabwärts des
komplementären
Stranges des lysC-Gens gelegenen DNA-Abschnitts binden (siehe SEQ ID NO:3).
Gegebenenfalls können
auch Primer ausgewählt
werden, die innerhalb der Kodierregion des lysC-Gens binden.
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Gegebenenfalls
wird die mutagenisierte Zellpopulation vorher einer Selektion auf
Minimalagar unterworfen, der mit AEC oder Mischungen von AEC und
L-Threonin supplementiert worden ist. Bei dieser Vorgehensweise
werden die entsprechenden gegenüber
AEC resistenten Stämme
für das
weitere Auswahlverfahren verwendet. Weiterhin kann die Aktivität der Aspartatkinase
charakterisiert werden. Es ist außerdem möglich, die Stämme durch
Fermentation in einem geeignetem Medium zu charakterisieren. Anleitungen
hierzu finden sich beispielsweise in der
US 6,893,848 . Bei Verwendungen von
geeigneten Roboteranlagen, wie beispielsweise bei
Zimmermann
et al. (VDI Berichte Nr. 1841, VDI-Verlag, Düsseldorf, Deutschland 2004,
439-443) oder
Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik
77 (4), 426-428 (2005)) beschrieben, können zahlreiche Mutanten in kurzer
Zeit untersucht werden.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren
werden ganz besonders isolierte coryneforme Bakterien bevorzugt,
deren Aspartatkinasevarianten einen oder mehrere der Aminosäureaustausche
ausgewählt
aus der Gruppe lysC A279T, lysC L297Q, lysC S317A, lysC T380I und
lysC S381F enthalten.
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In
der SEQ ID NO:31 ist die Kodierregion eines lysC-Allels beschrieben,
das für
eine Aspartatkinasevariante kodiert, die an Position 279 L-Threonin (lysC
A279T) und an Position 317 L-Alanin (lysC S317A) enthält. SEQ
ID NO:32 zeigt die Aminosäuresequenz
des Polypeptids.
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In
der SEQ ID NO:33 ist die Kodierregion eines lysC-Allels beschrieben,
das für
eine Aspartatkinasevariante kodiert, die an Position 297 L-Glutamin (lysC
L297Q) und an Position 317 L-Alanin (lysC S317A) enthält. SEQ
ID NO:34 zeigt die Aminosäuresequenz
des Polypeptids.
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Gegenstand
der Erfindung ist ebenfalls ein isoliertes Polynukleotid, das für eine Aspartatkinasevariante
kodiert, die an Position 297 von SEQ ID NO:2 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Leucin,
bevorzugt L-Glutamin und gegebenenfalls einen oder mehrere der Aminosäureaustausche
ausgewählt
aus der Gruppe lysC A279T, lysC A279V, lysC S301F, lysC S301Y, lysC
T308I, lysC T311I, lysC S317A, lysC R320G, lysC G345D, lysC T380I,
lysC S381F, und lysC S317A enthält.
Gegenstand der Erfindung sind auch Vektoren die das Polynukleotid enthalten.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin coryneforme Bakterien, bevorzugt
der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium
glutamicum die das Polynukleotid enthalten und in denen es gegebenenfalls überexprimiert ist.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Verfahren zur Herstellung
von L-Lysin oder L-Lysin enthaltenen Futtermitteladditiven durch
Fermentation der genannten Bakterien in einem geeignetem Nährmedium
wobei sich in den Zellen der Bakterien oder im Nährmedium L-Lysin akkumuliert.
Das gebildete L-Lysin wird anschließend gesammelt und gegebenenfalls
isoliert oder zusammen mit dem grössten Teil (> 50 %) der Biomasse
durch Wasserentzug zu einem festen Produkt weiterverarbeitet.
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Die
für das
erfindungsgemäße Verfahren verwendeten
isolierten coryneformen Bakterien enthalten darüber hinaus eine oder mehrere,
bevorzugt mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens drei und
ganz besonders bevorzugt vier der Nukleotidsequenzen, ausgewählt aus
der Gruppe:
- 1. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Aktivität
kodiert, welches eine Aminosäuresequenz
besitzt, die zu ≥ 95
%, bevorzugt zu ≥ 97
%, ≥ 98 %
oder ≥ 99
% und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist mit SEQ ID
NO:6 und an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin,
bevorzugt L-Methionin, enthält;
- 2. Nukleotidsequenz, die für
ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
Aktivität
kodiert, welches eine Aminosäuresequenz
besitzt, die zu ≥ 95
%, bevorzugt zu 97 %, ≥ 98
% oder ≥ 99
% und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist mit SEQ ID
NO:12 und an Position 321 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen
Glycin, bevorzugt L-Serin und gegebenenfalls an Position 8 jede proteinogene
Aminosäure ausgenommen
L-Serin, bevorzugt L-Threonin enthält;
- 3. Nukleotidsequenz, die für
eine OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert,
welche eine Aminosäuresequenz
besitzt, die zu ≥ 95
%, bevorzugt zu 97 %, ≥ 98
% oder ≥ 99
% und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist mit SEQ ID
NO:18 und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der
Gruppe:
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position
219 der Aminosäuresequenz
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position
233 der Aminosäuresequenz
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position
261 der Aminosäuresequenz
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin
enthält; und
- 4. Nukleotidsequenz, die für
ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase
Aktivität
kodiert, welches eine Aminosäuresequenz
besitzt, die zu ≥ 95
%, bevorzugt zu 97 %, ≥ 98
% oder ≥ 99
% und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist mit SEQ ID
NO:24 und an Position 111 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Serin,
bevorzugt L-Phenylalanin oder L-Alanin, und gegebenenfalls an Position
201 jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Alanin, bevorzugt L-Serin, enthält.
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Insbesondere
ist die Nukleotidsequenz, die für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität kodiert,
welche die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:6 besitzt, wobei diese an Position 329 L-Methionin
anstelle L-Valin enthält,
zu ≥ 90 %
oder ≥ 95
%, bevorzugt zu ≥ 97
% oder ≥ 98
% identisch mit SEQ ID NO:5. In SEQ ID NO:9 ist ein Beispiel für eine derartige
Nukleotidsequenz dargestellt.
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Insbesondere
ist die Nukleotidsequenz, die für
ein Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert,
welche die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:12 besitzt, wobei diese an Position 321 L-Serin anstelle
Glycin und gegebenenfalls an Position 8 L-Threonin anstelle L-Serin
enthält,
zu ≥ 90 %
oder ≥ 95
%, bevorzugt zu ≥ 97
% oder ≥ 98 %
identisch mit SEQ ID NO:11. In SEQ ID NO:15 ist ein Beispiel für eine derartige
Nukleotidsequenz dargestellt.
-
Insbesondere
ist die Nukleotidsequenz, die für
eine OpcA-Untereinheit
der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, welche die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:18 besitzt, wobei diese einen oder mehrere der Aminosäureaustausche
ausgewählt
aus der Gruppe an Position 107 L-Histidin anstelle L-Tyrosin, an
Position 219 L-Asparagin anstelle L-Lysin, an Position 233 L-Serin anstelle
L-Prolin und an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin enthält, zu 90
% oder ≥ 95
%, bevorzugt zu ≥ 97
% oder ≥ 98
% identisch ist mit SEQ ID NO:17. In SEQ ID NO:21 ist ein Beispiel
für eine
derartige Nukleotidsequenz dargestellt.
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Insbesondere
ist die Nukleotidsequenz, die für
ein Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase Aktivität kodiert,
welche die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:24 besitzt, wobei diese an Position 111 L-Phenylalanin
oder L-Alanin anstelle
L-Serin und gegebenenfalls an Position 201 L-Alanin anstelle L-Serin
enthält,
zu ≥ 90 %
oder ≥ 95
%, bevorzugt zu ≥ 97
% oder ≥ 98
% identisch mit SEQ ID NO:23.
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In
SEQ ID NO:27 und 29 sind Beispiele für derartige Nukleotidsequenzen
dargestellt.
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Isolierte
coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die
für ein
Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, welches den
angegebenen Aminosäureaustausch
an Position 329 besitzt, sind in der
PCT/EP2005/012417 beschrieben.
In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM16834 beschrieben,
welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase
Variante kodiert, welche an der Position 329 anstelle L-Valin die
Aminosäure
L-Methionin enthält.
Dieser Aminosäureaustausch
wird auch als gnd V329M bezeichnet.
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In
SEQ ID NO:5 ist die Kodierregion des 6-Phosphogluconat Dehydrogenase
Gens des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das
6-Phosphogluconat Dehydrogenase Gen wird allgemein auch als gnd-Gen
bezeichnet. In SEQ ID NO:6 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids
wiedergegeben. In SEQ ID NO:7 sind zusätzlich zur Kodierregion die
stromaufwärts
und stromabwärts
gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:8 ist identisch
mit SEQ ID NO:6. In SEQ ID NO:9 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des
in der Mutante DSM16834 vorhandenen gnd-Allels wiedergegeben. In SEQ ID NO:10
ist die Aminosäuresequenz
der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante angegeben.
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Isolierte
coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die
für ein
Polypeptid mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Aktivität kodiert,
welches den angegebenen Aminosäureaustausch
an Position 321 und gegebenenfalls den an Position 8 enthält, sind
in der
PCT/EP2006/060851 beschrieben.
In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM17119 beschrieben,
welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
Variante kodiert, welche an der Position 321 anstelle Glycin die
Aminosäure
L-Serin und gegebenenfalls an Position 8 anstelle L-Threonin die
Aminosäure
L-Serin enthält.
Der Aminosäureaustausch
an Position 321 wird auch als zwf G321S und der an Position 8 als
zwf S8T bezeichnet.
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In
SEQ ID NO:11 ist die Kodierregion des Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Gens des Wildtyps
von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
Gen wird allgemein auch als zwf-Gen bezeichnet. In SEQ ID NO:12
ist die Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO:13 sind zusätzlich zur
Kodierregion die stromaufwärts
und stromabwärts
gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:14 ist identisch
mit SEQ ID NO:12. In SEQ ID NO:15 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion
des in der Mutante DSM17119 vorhandenen zwf-Allels wiedergegeben.
In SEQ ID NO:16 ist die Aminosäuresequenz
der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante angegeben.
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Isolierte
coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die
für eine
OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
kodiert, welche die angegebenen Aminosäureaustausche an einer oder
mehrerer der Positionen 107, 219, 233 und 261 der Aminosäuresequenz
besitzt, sind in der
DE
10 2005 023 829 beschrieben. In dieser Patentanmeldung
wird die Mutante DSM 17223 beschrieben, die für ein OpcA-Polypeptid kodiert
welche an Position 107 L-Histidin
anstelle L-Tyrosin, an Position 219 L-Asparagin anstelle L-Lysin,
an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin und an Position 261 L-Histidin
anstelle L-Tyrosin enthält.
Diese Aminosäureaustausche
werden auch als opcA Y107H, opcA K219N, opcA P233S und opcA Y261H
bezeichnet.
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In
SEQ ID NO:17 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des OpcA-Polypeptids
des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Gen
das für
das OpcA-Polypeptid kodiert wird allgemein auch als opcA-Gen bezeichnet.
In SEQ ID NO:18 ist die Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids wiedergegeben. In SEQ ID NO:19 sind zusätzlich zur
Kodierregion die stromaufwärts
und stromabwärts
gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:20 ist identisch
mit SEQ ID NO:18. In SEQ ID NO:21 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion
des in der Mutante DSM17223 vorhandenen opcA-Allels wiedergegeben.
In SEQ ID NO:22 ist die Aminosäuresequenz
der OpcA Variante angegeben.
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Isolierte
coryneforme Bakterien, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die
für ein
Polypeptid mit Malat-Chinon-Oxidoreduktase
Aktivität
kodiert, welches die angegebenen Aminosäureaustausche an Position 111
und gegebenenfalls den an Position 201 besitzt, sind in der
PCT/EP2005/057216 beschrieben.
In dieser Patentanmeldung wird die Mutante DSM 16937 beschrieben,
welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase
Variante kodiert, welche an Position 111 anstelle L-Serin die Aminosäure L-Penylalanin enthält. Dieser Aminosäureaustausch
wird auch als mqo S111F bezeichnet. In der
PCT/EP2005/057216 wird außerdem eine
Mutante beschrieben, welche eine Nukleotidsquenz enthält, die
für eine
Malat-Chinon-Oxidoreduktase
Variante kodiert, welche an Position 111 anstelle L-Serin die Aminosäure L-Alanin
und an Position 201 anstelle L-Alanin die Aminosäure L-Serin enthält. Diese
Aminosäureaustausche
werden auch als mqo S111A und mqo A201S bezeichnet.
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In
SEQ ID NO:23 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion der Malat-Chinon-Oxidoreduktase des
Wildtyps von Corynebacterium glutamicum dargestellt. Das Gen, das
für die
Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodiert wird allgemein auch als mqo-Gen
bezeichnet. In SEQ ID NO:24 ist die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids
wiedergegeben. In SEQ ID NO:25 sind zusätzlich zur Kodierregion die stromaufwärts und
stromabwärts
gelegenen Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:26 ist identisch
mit SEQ ID NO:24. In SEQ ID NO:27 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion
des in der Mutante DSM 16937 vorhandenen mqo-Allels wiedergegeben.
In SEQ ID NO:28 ist die Aminosäuresequenz der
Malat-Chinon-Oxidoreduktase Variante wiedergegeben. In der SEQ ID
NO:29 ist die Nukleotidsequenz der Kodierregion des mqo-Allels einer
Mutante beschrieben, die die Aminosäureaustausche mqo S111A und
mqo A201S enthält.
In der SEQ ID NO:30 ist die Aminosäuresequenz dieser Malat-Chinon-Oxidoreduktase
Variante wiedergegeben.
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Zur
Herstellung der isolierten coryneformen Bakterien, welche eine oder
mehrere der angegebenen Aminosäureaustausche
in der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase, der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase,
dem OpcA-Polypeptid und der Malat-Chinon-Oxidoreduktase enthalten,
können
die angegebenen klassischen Mutageneseverfahren und die angegebenen
in vitro Mutageneseverfahren und Allelaustauschverfahren eingesetzt
werden. Gegebenenfalls werden die Methoden miteinander kombiniert.
Zur Identifizierung der Mutationen werden die Polynukleotidsequenzen
der entsprechenden Gene beziehungsweise Allele mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion,
vorzugsweise unter Verwendung von Primern, die an die stromaufwärts und
stromabwärts der
betreffenden Gene liegenden Polynukleotidsequenzen binden, amplifiziert
und die erhaltenen PCR-Produkte anschließend sequenziert.
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Für ein erfindungsgemäßes Verfahren
können
unter anderem beispielsweise folgende isolierte coryneforme Bakterien
eingesetzt werden:
Die Mutante DM1910, die unter der Bezeichnung DSM
18255 bei der DSMZ hinterlegt wurde.
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Die
Mutante DM1910 wurde durch zwei Runden von Mutagenese und Screening
ausgehend von Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 hergestellt.
Der Stamm DM1910 enthält
neben den die Apartatkinase betreffenden Mutationen lysC A279T und
lysC S381F ein gnd-Allel, das für
eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch
gnd V329M enthält
und ein zwf-Allel, das für
eine Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase kodiert,
die den Aminosäureaustausch
zwf G321S enthält.
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Ausgehend
von der Mutante DM1910 wurde durch das Verfahren des Allelaustausches
unter Verwendung des in der
US
Patentanmeldung 60/710314 beschriebenen Austauschvektors
pK18mobsacB opcAaa4ex der Stamm DM1917 hergestellt. Dieser Stamm
enthält
ein opcA-Allel, das für
ein OpcA-Polypeptid kodiert, das die Aminosäureaustausche opcA Y107H, opcA
K219N, opcA P233S und opcA Y261H enthält.
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Die
Mutante DM1913, die unter der Bezeichnung DSM 18256 bei der DSMZ
hinterlegt wurde.
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Die
Mutante DM1913 wurde ausgehend von ATCC14067 durch mehrere Runden
Mutagenese, Screening und Analyse ausgewählter Gene isoliert. Sie enthält ein gnd-Allel,
das für
eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch
gnd V329M enthält,
ein zwf-Allel, das für eine
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, die den Aminosäureaustausch
zwf G321S enthält, ein
opcA-Allel, das für
ein OpcA-Polypeptid kodiert, das die Aminosäureaustausche opcA Y107H und opcA
K219N enthält,
ein mqo-Allel, das für
eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodiert, die die Aminosäureaustausche
mqo S111A und mqo A201S enthält
und ein lysC-Allel, das für
eine Aspartatkinase kodiert, die den Aminosäureaustausch lysC S317A enthält.
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Ausgehend
von diesem Stamm wurde durch das Verfahren des Allelaustauschs ein
Stamm hergestellt, dessen Aspartatkinase zusätzlich zum Aminosäureaustausch
lysC S317A den Aminosäureaustausch
lysC T279A enthält.
Dieser Stamm wurde als DM1918 bezeichnet.
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In
einem erfindungsgemäßen Verfahren
können
auch coryneforme Bakterien verwendet werden, in denen die genannten
Varianten der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, der OpcA-Untereinheit
der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase
einzeln, oder in Kombination miteinander überexprimiert vorliegen.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren
kann es außerdem
vorteilhaft sein verschiedene Enzyme der Lysinbiosynthese ausgehend
von L-Asparaginsäure
zu überexprimieren.
Hierzu können
die im Stand der Technik bekannten Gene von Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Bacillus megaterium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
bovis, Streptomyces coeliclor, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
johnsonii, Bifidobacterium longum, und Saccharomyces cerevisiae
verwendet werden. Vorzugsweise werden die endogenen Gene beziehungsweise
Polynukleotide coryneformer Bakterien verwendet.
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Unter
endogenen Genen beziehungsweise Polynukleotiden versteht man die
in der Population einer Art wie zum Beispiel Corynebacterium glutamicum
vorhandenen offenen Leserahmen (ORF), Gene oder Allele beziehungsweise
deren Polynukleotide.
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Unter Überexpression
versteht man allgemein eine Erhöhung
der intrazellulären
Konzentration oder Aktivität
einer Ribonukleinsäure,
eines Proteins oder eines Enzyms.
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Die
Erhöhung
der Konzentration oder Aktivität
lässt sich
beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden
Polynukleotide chromosomal oder extrachromosomal um mindestens eine
Kopie erhöht.
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Eine
weit verbreitete Methode zur Erhöhung der
Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Polynukleotid
in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem coryneformen
Bakterium repliziert wird. Geeignete Plasmidvektoren sind beispielsweise
pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology
(1989) 64:549-554) oder die von Tauch et al. (Journal
of Biotechnology 99, 79-91
(2002)) beschriebenen pSELF-Vektoren. Ein Übersichtsartikel
zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei Tauch
et al. (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).
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Weiterhin
kann man als Vektoren Transposons, Insertionselemente (IS-Elemente)
oder Phagen einsetzen. Derartige genetische Systeme sind beispielsweise
in den Patentschriften
US 4,822,738 ,
US 5,804,414 und
US 5,804414 . In gleicher
Weise kann das in der
WO 92/02627 beschriebene
IS-Element ISaB1 oder das Transposon Tn 45 des Plasmids pXZ10142
(zitiert im „Handbook
of Corynebacterium glutamicum" (Herausgeber:
L. Eggeling und M. Bott)) verwendet werden
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Eine
andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren
der chromosomalen Genamplifikation. Bei dieser Methode wird mindestens
eine zusätzliche
Kopie des interessierenden Polynukleotids in das Chromosom eines coryneformen
Bakteriums eingefügt.
Derartige Amplifikationsverfahren sind beispielsweise in der
WO 03/014330 oder
WO 03/040373 beschrieben.
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Eine
weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin,
das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably
linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette
zu verknüpfen.
Geeignete Promotoren für
Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in dem Übersichtsartikel
von Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003) beschrieben.
Weiterhin können
die hinlänglich bekannten
von Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Amann
und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen
Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden.
Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts des
betreffenden Gens, typischerweise im Abstand von ungefähr 1-500
vom Startkodon eingefügt werden.
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Durch
die Maßnahmen
der Überexpression, wird
die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids im allgemeinen
um mindestens 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %,
400 % oder 500 %, maximal bis 1000 % oder 2000 % bezogen auf die
Aktivität
oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur Überexpression führenden
Massnahme, erhöht.
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Vorzugsweise
wird/werden ein oder mehrere der Gene beziehungsweise Allele ausgewählt aus der
Gruppe
- a) ein für eine L-Lysin insensitive
Aspartatkinase kodierendes lysCFBR-Allel,
- b) ein für
eine Aspartatsemialdehyd Dehydrogenase kodierendes asd-Gen,
- c) ein für
eine Dihydrodipicolinat Synthase kodierendes dapA-Gen ( EP 0 197 335 )
- d) ein für
eine Dihydrodipicolinat Reduktase kodierendes dapB-Gen,
- e) ein für
eine Tetrahydrodipicolinat Succinylase kodierendes dapD-Gen,
- f) ein für
eine Succinylaminopimelat Transaminase kodierendes dapC-Gen,
- g) ein für
eine Succinylaminosuccinylase kodierendes dapE-Gen,
- h) ein für
eine Diaminopimelate Epimerase kodierendes dapF-Gen ( US 6,670,156 ),
- i) ein für
eine Diaminopimelat Dehydrogenase kodierendes ddh-Gen ( US 6,090,597 )
- j) ein für
eine Diaminopimelat Decarboxylase kodierendes lysA-Gen ( US 4,861,722 ; US 6,090,597 ), und
- k) ein für
eine Lysin-Permease kodierendes lysE-Gen ( US 6,858,406 ).
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Ganz
besonders bevorzugt wird die gemeinsame Überexpression zweier oder mehrerer
der Gene ausgewählt
aus der Gruppe lysCFBR-Allel, dapA-Gen,
dapB-Gen, ddh-Gen und lysA-Gen.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren
kann es außerdem
vorteilhaft sein verschiedene Enzyme der Glykolyse und des Citronensäurezyklus
oder der L-Threonin-Biosynthese abzuschwächen oder coryneforme Bakterien
zu verwenden in denen diese abgeschwächt vorliegen.
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Der
Begriff „Abschwächung" bzw. „Abschwächen" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die
durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet,
das für
ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert
bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen
kombiniert.
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Zur
Erzielung einer Abschwächung
können entweder
die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der
Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls
werden beide Maßnahmen
kombiniert.
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Die
Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische
Veränderung (Mutation)
der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen
der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene,
Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen,
das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann
z. B. in der Patentanmeldung
WO
96/15246 , bei
Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology
170:5949-5952 (1988)), bei
Voskuil und Chambliss
(Nucleic Acids Research 26:3584-3590 (1998), bei
Pátek et
al. (Microbiology 142:1297-309 (1996) und
Journal
of Biotechnology 104:311-323 (2003)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von
Knippers
(„Molekulare
Genetik", 6. Auflage,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder
dem von
Winnacker („Gene
und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
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Ein
Beispiel für
die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des
abzuschwächenden
Gens unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)
induzierbaren Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder
des tac-Promotors. Hierzu
eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor
pXK99E (
WO 0226787 ;
hinterlegt gemäß Budapester
Vertrag am 31. Juli 2001 in DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der
Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland))
oder pVWEx2 (
Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums
Jülich,
Jül-3397, ISSN
0994-2952, Jülich,
Deutschland (1997)), die eine IPTGabhängige Expression des klonierten
Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.
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Eingesetzt
wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift
WO 0226787 zur regulierten
Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors pXK99EdeaD
in das Genom von Corynebacterium glutamicum und von
Simic
et al. (Applied and Environmental Microbiology 68:3321-3327 (2002)) zur
regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors
pK18mobglyA' in
Corynebacterium glutamicum.
-
Eine
weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression
ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxnyukleotide oder
Vektoren zur Synthese längerer
Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA
kann dort an komplementäre
Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern
oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet
der Fachmann bei Srivastava et al. (Applied Environmental
Microbiology 2000 Oct; 66 (10):4366-4371).
-
Mutationen,
die zu einer Veränderung
bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen
führen,
sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617
(1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology
and Biochemistry 61:1760-1762 (1997)) und Möckel („Die Threonindehydratase
aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation
und Struktur des Enzyms",
Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland,
1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann
(„Allgemeine
Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
-
Als
Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und
Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in
Betracht. In Abhängigkeit
von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches
auf die Enzymaktivität
wird von Fehlsinnmutationen („missense
mutations") oder
Nichtsinnmutationen („nonsense
mutations") gesprochen.
Die Fehlsinnmutation führt
zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen
eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht-konservative
Aminosäureaustausch
handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins
beeinträchtigt
und auf einen Wert von ≥ 0
bis 75 %, ≥ 0
bis 50 %, ≥ 0
bis 25 %, ≥ 0
bis 10 % oder ≥ 0
bis 5 % reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stop-Kodon im
Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der
Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar
in einem Gen führen
zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass
falsche Aminosäuren
eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht
als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies
ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation.
-
Deletionen
von mindestens einem (1) oder mehreren Kodonen führen typischerweise ebenfalls zu
einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität.
-
Durch
die Maßnahmen
der Abschwächung wird
die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids im allgemeinen
auf 0 bis 75 %, 0 bis 50 %, 0 bis 25 %, 0 bis 10 %, 0 bis 5 % oder
0 bis 1 % der Aktivität
oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration
des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt. Unter einem „Ausgangsmikroorganismus" versteht man den
Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Abschwächung durchgeführt werden.
-
Vorzugsweise
wird/werden ein oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
- a) ein für
eine Pyruvatkinase kodierendes pyk-Gen,
- b) eines oder beide der für
die Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase kodierenden Gene aceE und
aceF ( DE 10 2005 045 301 ),
- c) ein für
die Citratsynthase kodierendes gltA-Gen,
- d) ein für
die Homoserin-Dehydrogenase kodierendes hom-Gen,
- e) ein für
die Homoserin-Kinase kodierendes thrB-Gen,
- f) ein für
die Threonin-Synthase kodierendes thrC-Gen,
- g) ein für
die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierendes pck-Gen ( US 6,872,553 ),
- h) ein für
die Pyruvat-Oxidase (= Pyruvat-Chinon Oxidoreduktase) kodierendes
poxB-Gen ( EP 1 096 013 ),
und
- i) ein für
das malic enzyme (EC 1.1.1.40) kodierendes mez-Gen (= malE-Gen) ( EP 1 367 130 ) abgeschwächt.
-
Die
Fermentation der coryneformen Bakterien, kann kontinuierlich – wie beispielsweise
in der
PCT/EP 2004/008882 beschrieben – oder diskontinuierlich
im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated
fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der
Produktion von L-Lysin durchgeführt werden.
Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden
ist im Lehrbuch von
Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder
im Lehrbuch von
Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.
-
Das
zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium
muß in
geeigneter Weise den Ansprüchen
der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual
of Methods for General Bacteriology„ der American Society for
Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Die
Begriffe Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium
sind gegenseitig austauschbar.
-
Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Laktose,
Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung,
Stärke,
Stärkehydrolysat
und Cellulose, Öle und
Fette, wie zum Beispiel Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren,
wie zum Beispiel Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische
Säuren,
wie zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln
oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Stickstoffquelle können
organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, bevorzugt Ammoniak oder Ammoniumsulfat verwendet
werden. Die Stickstoffquellen können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat
oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze
verwendet werden.
-
Das
Kulturmedium muß weiterhin
Salze beispielsweise in Form von Sulfaten von Metallen wie beispielsweise
Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum
Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.
Schließlich
können
essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und
Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu
den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies
geeignete Vorstufen der jeweiligen Aminosäure zugesetzt werden.
-
Die
genannten Einsatzstoffe können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
-
Zur
PH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser bevorzugt
Ammoniak oder Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen
Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle
der Schaumentwicklung können
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt
werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium gegebenenfalls geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum
Beispiel Antibiotika hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die
Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid
angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird
die Fermentation bei Überdruck,
beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die
Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20 °C bis 45 °C und vorzugsweise
bei 25 °C
bis 40 °C.
Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich
ein Maximum der gewünschten
Aminosäure
gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden
bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten
möglich.
-
Beispiele
für geeignete
Fermentationsmedien finden sich unter anderem in den Patentschriften
US 5,770,409 ,
US 5,840,551 und
US 5,990,350 ,
US 5,275,940 oder
US 4,275,157 . Weitere Beispiele für Fermentationsmedien
finden sich bei
Ozaki und Shiio (Agricultural and Biological
Chemistry 47(7), 1569-1576, 1983) und Shiio et al. (Agricultural
and Biological Chemistry 48(6), 1551-1558, 1984).
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Methoden
zur Bestimmung von L-Lysin und anderer L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik
bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman
et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben
durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung
erfolgen, oder sie kann durch reversed Phase HPLC erfolgen, so wie
bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:1167-1174) beschrieben.
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Die
auf diese Weise hergestellte Fermentationsbrühe wird anschließend erfindungsgemäß weiterverarbeitet.
-
Unter
einer Fermentationsbrühe
versteht man ein Fermentationsmedium, in dem ein Mikroorganismus
für eine
gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde.
Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten
Medien enthält/enthalten
sämtliche
Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des
Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellt.
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Bei
Abschluss der Fermentation enthält
die entstandene Fermentationsbrühe
dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des coryneformen
Bakteriums entstandene Biomasse (= Zellmasse) des Mikroorganismus,
b) das im Laufe der Fermentation gebildete L-Lysin, c) die im Laufe
der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte und d) die
durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des/der eingesetzten
Fermentationsmediums/Fermentationsmedien beziehungsweise der Einsatzstoffe
wie beispielsweise Vitamine wie Biotin, Aminosäuren wie Homoserin oder Salze
wie Magnesiumsulfat.
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Zu
den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei
der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben
L-Lysin erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu
zählen
L-Aminosäuren,
die im Vergleich zum erwünschten
L-Lysin weniger als 30 %, 20 % oder 10 % ausmachen. Hierzu gehören weiterhin
organische Säuren,
die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Apfelsäure oder
Fumarsäure.
Schließlich
gehören dazu
auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
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Typische
für industrielle
Zwecke geeignete Fermentationsbrühen
haben einen L-Lysingehalt von 40 g/kg bis 180 g/kg oder 50 g/kg
bis 150 g/kg. Der Gehalt an Biomasse (als getrocknete Biomasse)
beträgt
im Allgemeinen 20 bis 50 g/kg.
-
Gegebenenfalls
wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe vor den weiteren Verfahrensschritten
teilweise oder ganz entfernt.
-
Die
erhaltene Fermentationsbrühe
wird anschließend
erfindungsgemäß weiterverarbeitet,
in dem man ein Verfahren durchführt
das mindestens folgende Schritte umfasst:
- a)
gegebenenfalls das Verhältnis
Sulfat/L-Lysin misst,
- b) anschließend
gegebenenfalls Ammoniumsulfat zusetzt,
- c) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,0 bis 5,2, insbesondere
4,9 bis 5,1 absenkt, wobei man durch die Zugabe der Sulfat-haltigen Verbindung(n)
in den Schritten b) und c) ein Sulfat/L-Lysin-Verhältnis von
0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0 besonders bevorzugt > 0,9 bis < 0,95 in der Brühe einstellt,
und
- d) das so erhaltene Gemisch durch Wasserentzug aufkonzentriert,
und bevorzugt granuliert,
wobei Schritt c) auch vor Schritt
b) durchgeführt
werden kann.
-
Unter
Sulfat-haltigen Verbindungen im Sinne der oben genannten Verfahrensschritte
sind insbesondere Ammoniumsulfat und Schwefelsäure gemeint.
-
Auf
diese Weise erhält
man ein Produkt mit einem L-Lysin-Gehalt von 10 bis 70 Gew.-% (ber. als Lysinbase,
bezogen auf die Gesamtmenge) und einem molaren Sulfat/L-Lysin-Verhältnis von
0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0, besonders bevorzugt > 0,9 bis < 0,95.
-
Das
molare Sulfat/L-Lysin-Verhältnis
V wird nach der Formel: V = 2 × [SO4 2–]/[L-Lysin] berechnet.
-
Diese
Formel berücksichtigt
die Tatsache, dass das SO4 2– Anion
zweiwertig ist. Ein Verhältnis
V = 1 bedeutet, dass ein stöchiometrisch
zusammengesetztes Lys2(SO4)
vorliegt, während
bei einem Verhältnis
von V = 0,9 ein 10%iger Sulfatunterschuss und bei einem Verhältnis von
V = 1,1 ein 10 % Sulfatüberschuss
gefunden wird.
-
Es
ist möglich,
die Fermentation in Gegenwart einer solchen Menge von Ammoniumsulfat durchzuführen, dass
nach Beendigung der Fermentation bereits ein Sulfat/Lysin-Verhältnis vorliegt,
das im erfindungsgemäß beanspruchten
Bereich liegt. Gegebenenfalls entfällt dann die Messung des L-Lysin/Sulfat
Verhältnisses.
Die weitere Zugabe von Ammoniumsulfat ist dann gegebenenfalls auch
nicht mehr erforderlich.
-
Wird über die
erfindungsgemäße pH-Wertabsenkung
hinaus Säure
zugesetzt, sind wegen der Pufferwirkung der in der Brühe enthaltenen
Verbindungen erhöhte
Mengen an Säure
erforderlich, die dann zu einer unerwünschten Denaturierung und Auflösung der
Zellen der coryneformen Bakterien führen können.
-
In
einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante
wird der Fermentationsbrühe
eines oder mehrerer der Salze der schwefeligen Säure (Sulfite) ausgewählt aus
der Gruppe Ammonium-, Alkali-, und Erdalkalisalz in einer Menge
von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0,1 bis 0,3 Gew.-%, besonders
bevorzugt 0,1 bis 0,2 Gew.-% bezogen auf die Fermentationsbrühe zugesetzt.
Bevorzugt wird Alkalihydrogensulfit und besonders bevorzugt Natriumhydrogensulfit
eingesetzt.
-
Die
Sulfite, insbesondere Natriumhydrogensulfit werden bevorzugt als
Lösung
vor der Aufkonzentration der Fermentationsbrühe zugesetzt. Die eingesetzte
Menge wird bevorzugt bei der Einstellung des Sulfat-/L-Lysinverhältnisses
berücksichtigt.
-
Der
bei der Aufarbeitung von Fermentationsbrühen im Allgemeinen auftretende
Verlust an L-Lysin wird durch die erfindungsgemäßen Masnahmen um bis zu ca.
50 % verringert.
-
So
wurde festgestellt, dass die Einstellung des pH-Wertes in der Fermentationsbrühe auf Werte pH ≥ 4 bis ≤ 5,2, die
Erhöhung
des Sulfat/L-Lysin Verhältnisses
auf 0,85 bis 1,2 und eine Sulfitzugabe von 0,01 bis 0,5 Gew.-% in
der Fermentationsbrühe
den Verlust an L-Lysin während
der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe deutlich reduzierte.
-
Dabei
führt die
Kombination der verschiedenen Maßnahmen vor der Aufarbeitung
zu einem synergistischen Effekt im Vergleich zur Summe der Einzeleffekte.
-
In
nicht behandelten Fermentationsbrühen (keine Zugabe eines der
Zuschlagstoffe, das heißt Ammoniumsulfat,
Schwefelsäure
oder Natriumhydrogensulfit) resultierte bei der Einengung zum Konzentrat
ein mittlerer Lysinverlust von ca. 3,5 Gew.-% (ohne Granulationsschritt).
Die Erhöhung
des Sulfatverhältnisses
durch Zugabe von Ammoniumsulfat führte zu einem mittleren Lysinverlust
von ca. 3,2 Gew.-%, die alleinige pH-Werteinstellung reduzierte
den Lysinverlust auf ca. 1,4 Gew.-%.
-
Die
Kombination von pH-Werteinstellung und Erhöhung des Sulfat-Anteils zeigte
eine höhere Schutzwirkung
für das
L-Lysin und resultierte
in einem Lysinverlust von ca. 0,9 Gew.-%. Die Kombination aller
drei Zuschlagstoffe ergab einen mittleren Lysinverlust von ca. 0,6
Gew.-% bzw. 0,7 Gew.-%. Dies entspricht einer relativen Reduktion
des Lysinverlustes um ca. 80 %.
-
Bei
der sich nach der Herstellung des Konzentrates anschließenden Granulation
bleiben die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens weitgehend erhalten.
Während
bei der Granulation von Konzentraten aus unbehandelten Fermentationsbrühen Lysinverluste
bis ca. 5 Gew.-% beobachtet wurden, ergaben sich bei Konzentraten
aus erfindungsgemäß vorbehandelten
Fermentationsbrühen
ca. 2 Gew.-%. Dies entspricht einer relativen Reduktion des Lysinverlustes
um ca. 60 %.
-
Als
Folge der Vorbehandlung von L-Lysin-haltiger Fermentationsbrühe durch
Erniedrigung des pH-Wertes, Erhöhung
der Sulfatbilanz und Zugabe von Sulfit wird die Ausbeute an L-Lysin
erhöht.
-
Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung von Lysin enthaltenden Futtermitteladditiven werden
solche Vorgehensweisen bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden,
die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten.
-
Je
nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden
wie z. B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder
einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt
oder vollständig
in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise
die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert.
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In
einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt,
so dass keine (0 %) oder höchstens
30 %, höchstens
20 %, höchstens
10 %, höchstens
5 %, höchstens
1 % oder höchstens
0,1 % Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer bevorzugten
Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt,
sodass sämtliche
(100 %) oder mehr als 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % oder 99,9 % Biomasse
im hergestellten Produkt verbleibt.
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Fermentationsbrühen, aus
denen die Biomasse teilweise oder insgesamt entfernt wurde, können auch
zur Standardisierung bei der Herstellung des Produkts eingesetzt
werden. Dies gilt natürlich auch
für die
reinen Verbindungen L-Lysinbase und Lysinsulfat.
-
Erfindungsgemäß wird die
erhaltene Fermentationsbrühe
vor der Aufkonzentration mit Schwefelsäure angesäuert und gegebenenfalls mit Ammoniumsulfat
versetzt. Schließlich
kann die Brühe
auch durch Zusatz von bevorzugt Natriumbisulfit (Natriumhydrogensulfit)
oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz
der schwefligen Säure
stabilisiert und aufgehellt werden.
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Wird
Biomasse ganz oder teilweise abgetrennt, erfolgt dies bevorzugt
vor der erfindungsgemäßen Absenkung
des pH-Werts und der Zugabe von Ammoniumsulfat und Sulfitsalz.
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Bei
der gegebenenfalls vorgenommenen Abtrennung der Biomasse werden
gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder anorganische
Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen Nebenprodukte
und die gelösten
nicht verbrauchten Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe)
bleiben mindestens teilweise (> 0
%), bevorzugt zu mindestens 25 %, besonders bevorzugt zu mindestens
50 % und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75 % im Produkt.
Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100 %) oder nahezu vollständig das
heißt > 95 % oder > 98 % im Produkt. In diesem
Sinne bedeutet der Begriff „Fermentationsbrühebasis", dass ein Produkt
mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.
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Anschließend wird
der Brühe
mit bekannten Methoden wie Erhitzen bzw. Aufheizen z. B. mit Hilfe eines
Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers
oder Fallfilmverdampfers, oder durch Umkehrosmose oder Nanofiltration
Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt bzw. aufkonzentriert.
Diese aufkonzentrierte Brühe
kann anschließend
durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation
oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden
Wirbelschicht gemäß
PCT/EP 2004/006655 beschrieben, zu
rieselfähigen,
feinteiligen oder grobkörnigen
Produkten insbesondere zu Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls
wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung
ein Produkt mit der gewünschten
Korngröße isoliert.
-
Es
ist ebenfalls möglich,
ein feinteiliges Pulver oder grobkörniges Produkt direkt d. h.
ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Sprühgranulation
aus der erfindungsgemäß behandelten
Fermentationsbrühe
zu gewinnen.
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Das
rieselfähige,
feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder
Granulier-Verfahren in ein grobkörniges,
gut rieselfähiges, lagerbares
und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.
-
-
Unter „rieselfähig" versteht man Pulver,
die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen Auslauföffnungen
mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5
mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Öle, Fette,
Wachse 94, 12 (1968)).
-
Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem
Anteil (> 50 %) einer
Korngröße von 20
bis 200 µm
Durchmesser gemeint.
-
Mit „grobkörnig" ist ein Produkt
mit einem überwiegendem
Anteil (> 50 %) einer
Korngröße von 200
bis 2000 µm
Durchmesser gemeint.
-
Der
Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt
lediglich geringe Anteile (< 5
%) an Körngrößen unter
100 µm
Durchmesser enthält.
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Die
Bestimmung der Korn- bzw. Teilchengrößen kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie
durchgeführt
werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengrößenmessung
in der Laborpraxis" von
R. H. Müller
und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart
(1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle
Technology" von
M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons
(1998) beschrieben.
-
Bevorzugt
sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngröße von 100
bis 1800 µm
oder einem Anteil von 95 Gew.-% einer Korngröße von 300 bis 1800 µm Durchmesser.
Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrösse < 100 µm liegt
bevorzugt bei > 0
bis 1 Gew.-% besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%. Das Schüttgewicht der
bevorzugten Produkte beträgt
im Allgemeinen 600 bis 950 kg/m3, insbesondere
650 bis 900 kg/m3.
-
Vorteilhaft
bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen
organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie
Stärke,
Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise
in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-,
oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen
wie zum Beispiel Kieselsäuren,
Silikaten (
EP-A 0 743 016 )
Stearaten.
-
Weiterhin
ist es vorteilhaft die Oberfläche
der erhaltenen Granulate mit Ölen
zu versehen so wie es in der
WO
04/054381 beschrieben ist. Als Öle können Mineralöle, pflanzliche Öle oder
Mischungen pflanzlicher Öle
verwendet werden. Beispiele für
derartige Öle
sind Sojaöl,
Olivenöl,
Sojaöl/Lecithingemische.
In gleicher Weise sind auch Silikonöle, Polyethylenglykole oder
Hydroxyethycellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflächen mit
den genannten Ölen
erzielt man eine erhöhte
Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils.
Der Gehalt an Öl
im Produkt beträgt
0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders
bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs.
-
Alternativ
kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung
bekannten und üblichen
organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate,
Schrote, Kleien, Mehle, Stärken
Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln
vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren
hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132
(1995) 49, Seite 817) beschrieben.
-
Schließlich kann
das Produkt auch durch Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise
Metallcarbonate, Kieselsäuren, Silikate,
Alginate, Stearate, Stärken,
Gummis und Celluloseether, wie in der
DE-C
41 00 920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden,
in dem es stabil gegenüber
der Verdauung durch Tiermägen insbesondere
dem Magen von Wiederkäuern
ist.
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Zur
Einstellung einer gewünschten
L-Lysin-Konzentration im Produkt kann je nach Anforderung während des
Verfahrens das L-Lysin in Form eines Konzentrates oder gebenenfalls
einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise deren Salz in flüssiger oder
fester Form hinzugefügt
werden. Diese können
einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten
Fermentationsbrühe, oder
auch während
des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden.
-
Die
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
festen Produkte sind bevorzugt Granulate und haben unter anderem
folgende Eigenschaften:
Sie haben einen pH-Wert von 3,5 bis
5,1 insbesondere 4,0 bis 5,0, bevorzugt 4,2 bis 4,8 gemessen in wässriger
Suspension. (Für
die PH-Messung wird eine 10 Gew.-%ige Suspension
in entionisiertem Wasser hergestellt und der pH bei 25°C mit einer PH-Elektrode
gemessen. Der Messwert stellt sich nach ca. 1 Minute konstant ein.)
Sie
weisen trotz des erhöhten
Sulfatgehalts einen deutlich höheren „Weissgrad", eine geringere
Hygroskopizität
und eine bessere Stabilität
bei thermischer Belastung als Granulate mit demselben L-Lysingehalt
auf, die suspendiert einen pH-Wert von 5,3 bis 5,7 und ein Sulfat/L-Lysin- Verhältnis im
Bereich von z. B. 0,75 bis 0,87 zeigen, wie sie aus dem Stand der Technik
bekannt sind.
-
Die
Farbwerte bzw. der „Weissgrad" der Produkte, bevorzugt
Granulate, werden nach dem in der Deutschen Industrienorm 5033 (DIN
5033) definierten Dreibereichsverfahren (L*a*b*-Farbmessung) bestimmt. Hierfür kann ein
3-Bereichs-Farbmessgerät zur Farb-
und Remissionsmessung wie beispielsweise das Farbmessgerät vom Typ
Micro Color II LMC der Firma Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) verwendet
werden. Hierbei wird die diffuse Reflexion der Probe unter einem
Winkel von 8° gemessen.
Das reflektierte Licht wird dabei über einen Lichtleiter in das Gerät zur Aufspaltung
auf die exakt definierten Normfarbfilter übertragen. Gemessen wird gegen
einen Kalibrierstandard.
-
Die
Farbwerte liegen bevorzugt in den Bereichen:
ohne Hydrogensulfitzusatz:
L* 65-70, a* 6-8, b* 20-25
mit Hydrogensulfitzusatz: L* > 70-80, a* 4-< 6, b* > 25-30.
-
Sie
haben einen Lysingehalt (gerechnet als Lysinbase) von 10 Gew.-%
bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 bis 60 Gew.-% oder 30 bis 65 Gew.-%
und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 60 Gew.-% oder 40
Gew.-% bis 65 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Produkts.
-
Das
Verhältnis
von Sulfat zu L-Lysin im Produkt beträgt 0,85 bis 1,2, bevorzugt
0,9 bis 1,0, besonders bevorzugt > 0,9
bis < 0,95.
-
Im
Allgemeinen liegt der Wassergehalt zwischen 0,1 Gew.-% und maximal
5 Gew.-%. Der Wassergehalt beträgt
bevorzugt maximal 4 % Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 3 % Gew.-%
und ganz besonders bevorzugt maximal 2,5 Gew.-%. Wassergehalte von
maximal 2 Gew.-% sind ebenfalls möglich.
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Eine
Reinkultur des Corynebacterium glutamicum Stammes DM1910 wurde am
15. Mai 2006 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
gemäß Budapester
Vertrag (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 18255 hinterlegt.
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Eine
Reinkultur des Corynebacterium glutamicum Stammes DM1913 wurde am
15. Mai 2006 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
gemäß Budapester
Vertrag (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 18256 hinterlegt.
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.