DE102005045301A1

DE102005045301A1 - Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung coryneformer Bakterien

Info

Publication number: DE102005045301A1
Application number: DE200510045301
Authority: DE
Inventors: Bastian Blombach; Bernhard Prof. Eikmanns; Mark Schreiner; Brigitte Dr. Bathe; Robert Dr. Gerstmeir; Georg Dr. Thierbach
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2005-09-22
Filing date: 2005-09-22
Publication date: 2007-04-05
Also published as: EP1767616A2; EP1767616A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung organisch-chemischer Verbindungen unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen das für den E1p Untereinheit-Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex kodierende aceE-Gen abgeschwächt vorliegt, und diese Bakterien.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung organisch-chemischer Verbindungen unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen das für die Pyruvat-Dehydrogenase kodierende aceE-Gen abgeschwächt vorliegt.

Chemische Verbindungen, mit denen insbesondere L-Aminosäuren, Ketosäuren, Vitamine, Nukleoside und Nukleotide und D-Aminosäuren gemeint sind, finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Kosmetik, in der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.

Zahlreiche dieser Verbindungen werden durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z.B. das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder das Valin-Analogon 2-Thiazolalanin und chemische Verbindungen beispielsweise L-Aminosäuren wie L-Lysin oder L-Valin produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene verstärkt oder abschwächt und die Auswirkung auf die Produktion der chemischen Verbindung untersucht.

Zusammenfassende Darstellungen zur Biologie, Genetik und Biotechnologie von Corynebacterium glutamicum sind im „Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: L. Eggeling und M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005), in der Spezialausgabe des Journal of Biotechnolgy (Chief Editor: A. Pühler) mit dem Titel „A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" (Journal of Biotechnolgy 104/1–3, (2003)) und im Buch von T. Scheper (Managing Editor) „Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Springer Verlag, Berlin, Deutschland, 2003) zu finden.

Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium glutamicum ist bei Ikeda und Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99–109 (2003)), in der EP 1 108 790 und bei Kalinowski et al. (Journal of Biotechnolgy 104/1–3, (2003)) beschrieben.

Die Nukleotidsequenzen des Genoms von Corynebacterium glutamicum sind ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), in der DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) oder in der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) verfügbar.

Der besseren Übersichtlichkeit halber ist die Nukleotidsequenz des für die Pyruvat-Dehydrogenase-Untereinheit des Pyruvat-Dehydrogenase Komplex aus Corynebacterium glutamicum kodierenden aceE-Gens gemäß den Angaben der NCBI-Datenbank in SEQ ID NO:1 und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz der kodierten Pyruvat-Dehydrogenase in SEQ ID NO:2 und 4 dargestellt. In SEQ ID NO:3 sind stromaufwärts (upstream) und stromabwärts (downstream) gelegene Nukleotidsequenzen zusätzlich angegeben.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt

a. Abschwächung des für die E1p Untereinheit des Pyruvat-Dehydrogenase Komplexes kodierenden aceE-Gen in einem coryneformen Bakterium, das die Fähigkeit besitzt in einem geeignetem Nährmedium die gewünschte organisch-chemische Verbindung in der Zelle und/oder im Nährmedium anzureichern
b. Fermentation des coryneformen Bakteriums gemäß a) in einem geeigneten Nährmedium, und
c. Anreicherung der organisch-chemischen Verbindung im Nährmedium (Fermentationsbrühe) oder in den Zellen der Bakterien.

Mit dem Begriff „organisch-chemische Verbindung" sind organische Säuren, Vitamine, Nukleoside und Nukleotide und Aminosäuren und deren Salze gemeint. Weiterhin gehören dazu von Pyruvat abgeleitete Metabolite. Bei den organischen Säuren werden Ketosäuren, insbesondere Brenztraubensäure (Pyruvat) und Bernsteinsäure (Succinat), bevorzugt. Bei den Aminosäuren werden L-Aminosäuren, insbesondere die proteinogenen L-Aminosäuren und L-Homoserin, bevorzugt.

Unter „proteinogenen Aminosäuren" versteht man die Aminosäuren die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen. Sie dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.

Die Begriffe Protein und Polypeptid sind gegenseitig austauschbar.

Werden im folgenden proteinogene L-Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere der Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin und L-Prolin gemeint. Besonders bevorzugt sind die L-Aminosäuren L-Aspartat, L-Lysin, L-Homoserin, L-Threonin, L-Methionin, L-Alanin, L-Valin und L-Leucin. Ganz besonders bevorzugt sind L-Lysin und L-Valin.

Wird im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z.B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.

Der Begriff „Abschwächung" bzw. „Abschwächen" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt. Unter einem „Ausgangsmikroorganismus" versteht man den Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Erfindung durchgeführt werden.

Der Pyruvat-Dehydrogenase Komplex katalysiert die Umwandlung von Brenztraubensäure zu Kohlendioxid, NADH und Acetyl-Coenzym A. Der Pyruvat-Dehydrogenase Komplex besteht aus drei Enzymen bzw. Untereinheiten, die jeweils eine Teilreaktion katalysieren. Die als E1 oder E1p bezeichnete Untereinheit katalysiert die Thiaminpyrophospat-abhängige oxidative Decarboxylierung von Pyruvat. Die E1p-Unterinheit wird auch als Pyruvat-Dehydrogenase bezeichnet (EC No. 1.2.4.1). Eine allgemeine Darstellung zum Pyruvat-Dehydrogenase Komplex findet sich beispielsweise im Lehrbuch von G. Gottschalk „Bacterial Metabolism" (Second Edition, Springer Verlag, New York, USA, 1986). Angaben zum Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex von Corynebacterium glutamicum finden sich auf Seite 245 bis 249 des oben erwähnten „Handbook of Corynebacterium glutamicum" und bei Schreiner et al. (Journal of Bacteriology 187(17), 6005–6018 (2005).

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Verwendung von coryneformen Bakterien durchgeführt. Bei den coryneformen Bakterien wird die Gattung Corynebacterium bevorzugt. Besonders bevorzugt sind organisch-chemische Verbindungen ausscheidende Stämme, die auf folgenden Arten beruhen:
Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium callunae, wie zum Beispiel der Stamm ATCC15991,
Corynebacterium thermoaminogenes wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539, und
Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,
wobei die Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.

Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Artbezeicnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium lilium DSM20137,
Corynebacterium melassecola ATCC17965,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433–1477 (1983), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989–1005 (1996)), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255–260 (1991) und in der US-A-5,250,434.

Die für die Massnahme der Abschwächung eingesetzten coryneformen Bakterien besitzen bevorzugt bereits die Fähigkeit die organisch-chemische Verbindung in der Zelle anzureichern oder in das sie umgebende Nährmedium auszuscheiden und zu akkumulieren. Insbesondere haben die eingesetzten coryneformen Bakterien die Fähigkeit ≥ (mindestens) 0,25 g/l, ≥ 0,5 g/l, ≥ 1,0 g/l, ≥ 1,5 g/l, ≥ 2,0 g/l, ≥ 4 g/l oder ≥ 10 g/l der organisch-chemischen Verbindung in ≤ (maximal) 120 Stunden, ≤ 96 Stunden, ≤ 48 Stunden, ≤ 36 Stunden, ≤ 24 Stunden oder ≤ 12 Stunden in der Zelle oder im Nährmedium anzureichern.

Bekannte Vertreter von Stämme coryneformer Bakterien, die die Fähigkeit besitzen L-Lysin zu produzieren, sind beispielsweise die Stämme
Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) beschrieben in EP 0 358 940 ,
Corynebacterium glutamicum MH20 (= DSM5714) beschrieben in EP 0 435 132 ,
Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382) beschrieben in EP 1 108 790 , und
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) beschrieben in US 5,250,423 .

Bekannte Vertreter von Stämmen coryneformer Bakterien, die die Fähigkeit besitzen L-Valin zu produzieren, sind beispielsweise die Stämme
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 beschrieben in US 5,188,948 ,
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 beschrieben in US 5,521,074 ,
Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 beschrieben in US 5,521,074 , und
Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 beschrieben in US 5,188,948 .

Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Die genannten Stämme von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, FERM BP-1540, FERM BP-1541 und FERM BP-1542) sind in der US-A 5,250,434 beschrieben.

Bei dem für die Massnahmen der Erfindung verwendeten aceE-Gen handelt es sich um ein Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das vor der Massnahme der Abschwächung für ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz ≥ (mindestens) 90%, bevorzugt ≥ 95%, besonders bevorzugt ≥ 98% und ganz besonders bevorzugt ≥ 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 und das die Aktivität einer Pyruvat-Dehydrogenase besitzt.
b) Polynukleotid, das vor der Massnahme der Abschwächung eine Nukleotidsequenz umfasst, die ≥ (mindestens) 90%, bevorzugt ≥ 95%, besonders bevorzugt ≥ 98% und ganz besonders bevorzugt ≥ 99% identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 und die für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität einer Pyruvat-Dehydrogenase besitzt.
c) Polynukleotid, das vor der Massnahme der Abschwächung eine Nukleotidsequenz umfasst die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der zu SEQ ID NO:1 komplementären Nukleotidsequenz hybridisiert und die für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität einer Pyruvat-Dehydrogenase besitzt. Anleitungen zur Hybridisierung von Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotiden findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41:255–260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen die Sonde d.h. ein Polynukleotid umfassend die zu SEQ ID NO:1 komplementäre Nukleotidsequenz und die Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 90% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996). Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C–68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 90% Identität zur Nukleotidequenz der eingesetzten Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C–68°C, ca. 52°C–68°C, ca. 54°C–68°C, ca. 56°C–68°C, ca. 58°C–68°C, ca. 60°C–68°C, ca. 62°C–68°C, ca. 64°C–68°C, ca. 66°C–68°C eingestellt wird. Temperaturbereiche von ca. 64°C–68°C oder ca. 66°C–68°C werden bevorzugt. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2 × SSC oder 0,1 × SSC zu senken. Gegebenenfalls enthält der SSC-Puffer Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 0,1%. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die mindestens 90% oder mindestens 91%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens 95% oder mindestens 96% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen und für ein Polypeptid mit Pyruvat-Dehydrogenase Enzymaktivität kodieren. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558). Die so erhaltenen Nukleotidsequenzen kodieren für Polypeptide mit Pyruvat-Dehydrogenase Enzymaktivität, die mindestens 90% bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch sind mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2.
d) Polynukleotid, das vor der Massnahme der Abschwächung eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid mit Pyruvat-Dehydrogenase Aktivität kodiert und die mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von DNA isoliert aus einem coryneformen Bakterium und unter Verwendung eines Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15, mindestens 18, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 500 von SEQ ID NO:3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 3267 und 3769 von SEQ ID NO:3 ausgewählt werden. Anleitungen und Informationen zur PCR findet der Fachmann beispielsweise im Handbuch „PCR-Strategies" (Innis, Felfand und Sninsky, Academic Press, Inc., 1995), im Handbuch von Diefenbach und Dveksler „PCR Primer – a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), im Handbuch von Gait „Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham „PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994). Weitere Details zur PCR-Technik sind in der DE 199 43 587 beschrieben. Der Primer kann mit Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, mit einer Biotin-Gruppe oder weiteren Accessoirs, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, ausgerüstet sein. Die Gesamtlänge des Primers beträgt im Allgemeinen maximal 30, 40, 50 oder 60 Nukleotide.
e) Polynukleotid, das vor der Massnahme der Abschwächung für ein Polypeptid mit Pyruvat-Dehydrogenase Aktivität und mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 kodiert. Gegebenenfalls enthält das kodierte Polypeptid einen (1) oder mehrere konservative Aminosäuraustausch(e). Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche. Bei den aromatischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und Aparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin gegeneinander ausgetauscht werden.
f) Polynukleotid, das vor der Massnahme der Abschwächung die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 umfasst.

Die genannten Polynukleotide sind typischerweise in den Chromosomen der genannten coryneformen Bakterien vorhanden.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.

Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170:5949–5952 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26:3584–3590 (1998), bei Pátek et al. (Microbiology 142:1297–309 (1996) und Journal of Biotechnology 104:311–323 (2003)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Ein Beispiel für die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des abzuschwächenden Gens unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder des tac-Promotors. Hierzu eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor pXK99E (WO0226787; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 31. Juli 2001 in DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)) oder pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jü1-3397, ISSN 0994–2952, Jülich, Deutschland (1997)), die eine IPTG-abhängige Expression des klonierten Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.

Eingesetzt wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift WO0226787 zur regulierten Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors pXK99EdeaD in das Genom von Corynebacterium glutamicum und von Simic et al. (Applied and Environmental Microbiology 68:3321–3327 (2002)) zur regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors pK18mobglyA' in Corynebacterium glutamicum.

Eine weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxnyukleotide oder Vektoren zur Synthese längerer Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA kann dort an komplementäre Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet der Fachmann bei Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10):4366–4371).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:8611–8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61:1760–1762 (1997)) und Möckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Die Fehlsinnmutation führt zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht-konservative Aminosäureaustausch handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins beeinträchtigt und auf einen Wert von ≥ 0 bis 75%, ≥ 0 bis 50%, ≥ 0 bis 25%, ≥ 0 bis 10% oder ≥ 0 bis 5% reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stop-Kodon im Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Deletionen von mindestens einem (1) oder mehreren Kodonen führen typischerweise ebenfalls zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität.

Eine Methode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Pyruvat-Dehydrogenase ist bei Schreiner et al. (Journal Bacteriology 187(17), 6005–6018 (2005)) beschrieben.

Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung („gene disruption") und des Gen-Austauschs („gene replacement").

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird zum Beispiel ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob, pK19mob, pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269:32678–84; US-Patent 5,487,993), pCR^®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534–541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510–4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der den zentralen Bereich der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Journal of Bacteriology 172:1663–1666 (1990) und Applied and Environmental Microbiology 60:756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575–580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.

Bei der Methode des Genaustausches („gene replacement") wird eine Mutation wie z.B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode ist bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9:84–87 (1991) beschrieben und wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten oder von Wehmeier et al. (Microbiology 144:1853–1862 (1998)) zum Einfügen einer Deletion in das rel-Gen von C. glutamicum.

Einen Überblick über verschiedene gentechnische Methoden bei C. glutamicum geben Kirchner und Tauch (Journal of Biotechnology 104:287–299 (2003).

Für den Einbau einer Deletion in das aceE-Gen von Corynebacterium glutamicum ist beispielsweise der von Schreiner et al. (Journal of Bacteriology 187(17), 6005–6018 (2005)) beschriebene Vektor pK19mutaceE geeignet.

Zusätzlich kann es für die verbesserte Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, in den auf die beschrieben Weise hergestellten coryneformen Bakterien eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.

Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen oder Allele.

So kann für die Herstellung von L-Lysin eines oder mehrere der Gene überexprimiert werden, ausgewählt aus der Gruppe:

a) Ein für ein Dihydrodipicolinat-Synthase kodierendes Gen dapA, wie beispielsweise das in der EP 0 197 335 beschriebene dapA-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum.
b) Ein für eine Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierendes Gen zwf, wie beispielsweise das in der JP-A-09224661 und EP-A-1108790 beschriebene zwf-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum.
c) Die in der US-2003-0175911-A1 beschriebenen zwf-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für ein Protein kodieren, bei dem beispielsweise das L-Alanin an Position 243 der Aminosäuresequenz durch L-Threonin ersetzt ist oder bei dem die L-Asparaginsäure an Position 245 durch L-Serin ersetzt ist.
d) Die in der WO 2005/058945 beschriebenen zwf-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für ein Protein kodieren, bei dem beispielsweise das L-Serin an Position 8 der Aminosäuresequenz durch L-Threonin ersetzt ist oder bei dem das L-Glycin an Position 321 durch L-Serin ersetzt ist.
e) Ein für eine Pyruvat-Carboxylase kodierendes Gen pyc, wie beispielsweise das in der DE-A-198 31 609 und EP 1108790 beschriebene pyc-Gen des Wildtyps von Corynbebacterium glutamicum.
f) Das für das in der EP 1 108 790 beschriebene pyc-Allel von Corynebacterium glutamicum, das für ein Protein kodiert, bei dem L-Prolin an Position 458 der Aminosäuresequenz durch L-Serin ersetzt ist.
g) Die in der WO 02/31158 und insbesondere EP1325135B1 beschriebene pyc-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für Proteine kodieren, welche einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe L-Valin an Position 1 ersetzt durch L-Methionin, L-Glutaminsäure an Position 153 ersetzt durch L-Asparaginsäure, L-Alanin an Position 182 ersetzt durch L-Serin, L-Alanin an Position 206 ersetzt durch L-Serin, L-Histidin an Position 227 ersetzt durch L-Arginin, L-Alanin an Position 455 ersetzt durch Glycin und L-Asparaginsäure an Position 1120 ersetzt durch L-Glutaminsäure tragen.
h) Ein für eine Aspartatkinase kodierendes lysC Gen wie beispielsweise das als SEQ ID NO:281 in der EP-A-1108790 (Siehe auch Zugangsnummer AX120085 und 120365) und das als SEQ ID NO:25 in der WO 01/00843 (Siehe Zugangsnummer AX063743) beschriebene von lysC-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum
i) Ein für eine feed back resistente Aspartatkinase Variante kodierendes lysC^FBR Allel. Unter „feed back" resistenten Aspartatkinasen versteht man Aspartatkinasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC (Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Die für diese desensibilisierten Aspartatkinasen kodierenden Gene beziehungsweise Allele werden auch als lysC^FBR-Allele bezeichnet. Im Stand der Technik (Tabelle 1) sind zahlreiche lysC^FBR-Allele beschrieben, die für Aspartatkinase-Varianten kodieren, welche Aminosäureaustausche im Vergleich zum Wildtypprotein besitzen. Die Kodierregion des Wildtyp lysC-Gens von Corynebacterium glutamicum entsprechend der Zugangsnummer AX756575 der NCBI Datenbank ist in SEQ ID NO:5 und das von diesem Gen kodierte Protein in SEQ ID NO:6 dargestellt Tabelle 1 lysC^FBR-Allele kodierend für feed back resistente Aspartatkinasen

Bevorzugt werden folgende lysC^FBR-Allele: lysC A279T (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Threonin), lysC A279V (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Valin), lysC S301F (Austausch von Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Phenylalanin), lysC T308I (Austausch von Threonin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Isoleucin), lysC S301Y (Austausch von Serin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Tyrosin), lysC G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Asparaginsäure), lysC R320G (Austausch von Arginin an Position 320 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Glycin), lysC T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Isoleucin), lysC S381F (Austausch von Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:16 gegen Phenylalanin), lysC S317A (Austausch von Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Alanin) und lysC T380I (Austausch von Threonin an Position 380 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Isoleucin). Besonders bevorzugt werden das lysC^FBR-Allel lysC T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Isoleucin) und ein lysC^FBR-Allel enthaltend mindestens einen Austausch ausgewählt aus der Gruppe A279T (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Threonin) und S317A (Austausch von Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:6 gegen Alanin).
j) Ein für ein Lysin-Export-Protein kodierendes Gen lysE, wie beispielsweise das in der DE-A-195 48 222 beschriebene lysE-Gen von des Wildtyps Corynebacterium glutamicum.
k) Ein für eine Diaminopimelate-Dehydrogenase kodierendes Gen ddh, wie beispielsweise das in der EP 1 108 790 beschriebene ddh-Gen des Wildtyps Corynebacterium glutamicum.
l) Das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum ( US 6,632,644 ).

So kann für die Herstellung von L-Valin eines oder mehrere der Gene überexprimiert werden, ausgewählt aus der Gruppe:

a) Für Acetolactate Synthase (EC 4.1.3.18) kodierenden Gene ilvBN, wie beispielsweise die von Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology 175(17):5595–603 (1993) oder die in der EP1108790 beschriebenen ilvBN Gene von Corynebacterium glutamicum (Siehe auch Zugangsnummern L09232 und AX127147).
b) Ein für eine feed back resistente Acetolactate Synthase (EC 4.1.3.18) kodierendes ilvBN^FBR Allele, wie beispielsweise das in der EP1491634 beschriebene ilvBN^FBR Allel.
c) Ein für eine Isomeroreductase (EC 1.1.1.86) kodierendes Gen ilvC, wie beispielsweise das von Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology 175(17):5595–603 (1993) oder das in der EP1108790 beschriebene ilvC-Gen (Siehe auch Zugangsnummern C48648 und AX127147).
d) Ein für eine Dihydroxy-acid Dehydratase (EC 4.2.1.9) kodierendes ilvD-Gen, wie beispielsweise das in der EP1006189 beschriebene ilvD-Gen (Siehe auch Zugangsnummer AX136925).
e) Ein für eine Transaminase B (EC 2.6.1.42) kodierendes ilvE-Gen, wie beispielsweise das in der EP1108790 beschriebene ilvE-Gen (Siehe auch Zugangsnummern AX127150 und AX122498).
f) Für Proteine, die den L-Valin-Export aus der Zelle katalysieren, kodierende Gene brnEF, wie beispielsweise die in der EP1096010 beschriebenen brnEF Gene.
g) Ein für eine Phosphoenolpyruvat Carboxykinase kodierendes pck-Gen, wie beispielsweise das in der EP1094111 und EP1108790 beschriebene pck-Gen.
h) Ein für ein Malat-Enzym (malic enzyme, EC:1.1.1.40) kodierendes mez-Gen, wie beispielsweise das in der EP1108790 beschriebene mez-Gen.

Unter Überexpression versteht man allgemein eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins oder eines Enzyms.

Die genannte Erhöhung der Konzentration oder Aktivität eines Genproduktes lässt sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden Polynukleotide um mindestens eine Kopie erhöht.

Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Gen oder Allel in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem coryneformen Bakterium repliziert wird. Geeignete Plasmidvektoren sind beispielsweise pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:549–554) oder die von Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79–91 (2002)) beschriebenen pSELF-Vektoren. Ein Übersichtsartikel zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27–40 (2003)).

Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation. Bei dieser Methode wird mindestens eine zusätzliche Kopie des interessierenden Gens oder Allels in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums eingefügt.

In einer Ausführungsform, wie sie beispielsweise bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132) für das hom-thrB-Operon beschrieben ist, wird ein in C. glutamicum nicht-replikatives Plasmid, welches das interessierende Gen enthält, in ein coryneformes Bakterium überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens beziehungsweise Allels.

In einer anderen Ausführungsform, die in der WO 03/040373 und US-2003-0219881-A1 beschrieben ist, wird eine oder mehrere Kopie(n) des interessierenden Gens mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse in einen gewünschten Ort des Chromosoms von C. glutamicum eingefügt. Auf diese Weise wurde beispielsweise eine Kopie eines lysC-Allels, das für eine L-Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, in das gluB-Gen von C. glutamicum eingebaut.

In einer weiteren Ausführungsform, die in der WO 03/014330 und US-2004-0043458-A1 beschrieben ist, wird mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse am natürlichen Ort mindestens eine weitere Kopie, vorzugsweise in tandem-Anordnung zu dem bereits vorhandenen Gen oder Allel, des interessierenden Gens eingebaut. Auf diese Weise wurde beispielsweise eine tandem-Duplikation eines lysC^FBR-Allels am natürlichen lysC-Genort erzielt.

Eine weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in dem Übersichtsartikel von Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1–3), 311–323 (2003) beschrieben. Weiterhin können die hinlänglich bekannten von Amann et al. (Gene 69(2), 301–315 (1988)) und Amann und Brosius (Gene 40(2–3), 183–190 (1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts des betreffenden Gens, typischerweise im Abstand von ungefähr 1–500 Nukleotiden vom Startkodon, eines coryneformen Bakteriums eingefügt werden. Es ist ebenfalls möglich das Gen mit einem Promotor zu verknüpfen und die erhaltene Expressionseinheit in ein extrachromosomal replizierendes Plasmid oder in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums einzubauen.

Darüberhinaus kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression des betreffenden Gens oder Allels durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Durch die Maßnahmen der Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins/Polypeptids im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200, 300, 400 oder 500%, maximal bis 1000 oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus beziehungsweise Elternstammes erhöht. Unter einem Ausgangs-Mikroorganismus oder Elternstamm versteht man einen Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Erfindung durchgeführt werden.

Die Konzentration des Proteins kann über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit enstprechender Auswertesoftware im Gel bestimmt werden.

Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712–23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32–39; Lottspeich, Angewandte Chemie 111:2630–2647 (1999)) bestimmt werden.

Schließlich kann es für die Produktion von organisch-chemischen Verbindungen, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des aceE-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

So kann für die Herstellung von L-Lysin eines oder mehrere der Gene abgeschwächt werden, ausgewählt aus der Gruppe:

a) Ein für eine Homoserin-Dehydrogenase kodierendes hom-Gen, wie beispielsweise in der EP0555661 oder in der EP1108790 beschrieben.
b) Ein für eine Malat-Chinon Oxidoreduktase kodierendes mqo-Gen, wie beispielsweise in der WO 02/086137 oder wie in der US-Anmeldung 60/645588 (entsprechend DE-Anmeldung 102005032429) beschrieben.
c) Ein für eine Citratsynthase kodierendes gltA-Gen, wie beispielsweise das in der EP09992892 oder EP1108790 beschriebene gltA-Gen.
d) Ein für eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierendes pckA-Gen, wie beispielsweise in der EP1094111 beschrieben.
e) Ein für ein Malat-Enzym (malic enzyme, EC:1.1.1.40) mez-Gen, wie beispielsweise in der EP1367130 beschrieben.

So kann für die Herstellung von L-Valin eines oder mehrere der Gene abgeschwächt werden, ausgewählt aus der Gruppe:

a) Ein für eine Pyruvat-Carboxylase kodierendes pyc-Gen. Das pyc-Gen von Corynebacterium glutamicum ist in der EP1015621 beschrieben.
b) Ein für eine Pyruvat-Oxidase kodierendes poxB-Gen, wie beispielsweise in der EP1096013 beschrieben.
c) Ein für eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierendes ppc-Gen. Das ppc-Gen von Corynebacterium glutamicum ist beispielsweise bei O'Regan et al. (Gene 77, 237–251 (1989)) beschrieben.
d) Ein für eine Threonin Deaminase kodierendes ilvA-Gen. Das ilvA-Gen von Corynebacterium glutamicum ist in der beispielsweise in der EP1108790 beschrieben.
e) Ein für ein Valin-Import-Protein kodierendes brnQ-Gen wie beispielsweise in der WO 03/023044 beschrieben.

Die Leistung der hergestellten Bakterien bzw. des Fermentationsprozesses unter Verwendung derselben bezüglich eines oder mehrerer der Parameter ausgewählt aus der Gruppe der Produkt-Konzentration (Produkt pro Volumen), der Produkt-Ausbeute (gebildetes Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle) und der Produkt-Bildung (gebildetes Produkt pro Volumen und Zeit) oder auch anderer Prozess-Parameter und Kombinationen davon, wird um mindestens 0,5%, mindestens 1%, mindestens 1,5% oder mindestens 2% bezogen auf den Ausgangstamm bzw. Elternstamm bzw. den Fermentationsprozess unter Verwendung derselben verbessert.

Die hergestellten coryneformen Bakterien können kontinuierlich – wie beispielsweise in der PCT/EP2004/008882 beschrieben- oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von organisch-chemischen Verbindungen, beispielsweise L-Aminosäuren, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.

Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology„ der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure oder Milchsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Bevorzugt werden Mischungen bestehend aus Zucker und Essigsäure.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.

Das Kulturmedium muß weiterhin Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen der jeweiligen Aminosäure zugesetzt werden.

Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH – Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten Aminosäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich.

Beispiele für geeignete Fermentationsmedien finden sich unter anderem in den Patentschriften 5,770,409, US 5,840,551 und US 5,990,350 oder US 5,275,940 .

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:1167–1174) beschrieben.

Die auf diese Weise hergestellte Fermentationsbrühe wird anschließend zu einem festen oder flüssigen Produkt weiterverarbeitet.

Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein Fermentationsmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medium enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellt.

Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus entstandene Biomasse des Mikroorganismus, b) die im Laufe der Fermentation gebildete gewünschte organisch-chemische Verbindung beispielsweise eine L-Aminosäure wie L-Lysin oder L-Valin c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten Fermentationsmediums beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin, Aminosäuren wie Homoserin oder Salze wie Magnesiumsulfat.

Zu den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben der jeweiligen erwünschten organisch-chemischen Verbindung erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu gehören auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.

Im Falle der Aminosäure L-Lysin sind im Stand der Technik im wesentlichen vier verschiedene Produktformen bekannt.

Eine Gruppe L-Lysin haltiger Produkte umfasst konzentrierte, wässrige, alkalische Lösungen von aufgereinigtem L-Lysin (EP-B-0534865). Eine weitere Gruppe, wie beispielsweise in der US 6,340,486 und US 6,465,025 beschrieben, umfasst wässrige, saure, Biomasse-haltige Konzentrate von L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühen. Die bekannteste Gruppe fester Produkte umfasst pulverförmige oder kristalline Formen von aufgereinigtem beziehungsweise reinem L-Lysin, das typischerweise in Form eines Salzes wie zum Beispiel L-Lysin-Monohydrochlorid vorliegt. Eine weitere Gruppe fester Produktformen ist beispielsweise in der EP-B-0533039 beschrieben. Die dort beschriebene Produktform enthält neben L-Lysin den größten Teil der während der fermentativen Herstellung verwendeten und nicht verbrauchten Einsatzstoffe und gegebenfalls die Biomasse des eingesetzten Mikroorganismus mit einem Anteil von > 0%–100%.

Entsprechend der verschiedenen Produktformen kennt man verschiedenste Verfahren, bei denen die L-Aminosäure aus der Fermentationsbrühe gesammelt, isoliert oder gereinigt wird, um das L-Aminosäure haltige Produkt oder die gereinigte L-Aminosäure herzustellen.

Zur Herstellung von festen, reinen L-Aminosäuren werden im wesentlichen Methoden der Ionenaustauschchromatographie gegebenfalls unter Verwendung von Aktivkohle und Methoden der Kristallisierung angewendet. Im Falle des L-Valin erhält man auf diese Weise die weitgehend reine Verbindung. Im Falle des Lysin erhält man auf diese Weise die entsprechende Base oder ein entsprechendes Salz wie beispielsweise das Monohydrochlorid (Lys-HCl) oder das Lysinsulfat (Lys₂-H₂SO₄).

Im Falle des Lysin ist in der EP-B-0534865 ein Verfahren zur Herstellung wässriger, basischer L-Lysin haltiger Lösungen aus Fermentationsbrühen beschrieben. Bei dem dort beschriebenen Verfahren wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe abgetrennt und verworfen. Mittels einer Base wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid wird ein pH-Wert zwischen 9 bis 11 eingestellt. Die mineralischen Bestandteile (anorganischen Salze) werden nach Konzentrierung und Abkühlung durch Kristallisation aus der Brühe abgetrennt und entweder als Dünger verwendet oder verworfen.

Bei Verfahren zur Herstellung von Lysin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bakterien werden solche Verfahren bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten. Diese werden insbesondere als Tierfuttermitteladditive verwendet.

Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z.B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert beispielsweise durch thermische Behandlung (Erhitzen) oder durch Säurezugabe.

In einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt, sodass keine (0%) oder höchstens 30%, höchstens 20%, höchstens 10%, höchstens 5%, höchstens 1% oder höchstens 0,1% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer weiteren Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass sämtliche (100%) oder mehr als 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder 99,9 Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird dementsprechend die Biomasse in Anteilen ≥ 0% bis ≤ 100 entfernt.

Schließlich kann die nach der Fermentation erhaltene Fermentationsbrühe vor oder nach der vollständigen oder teilweisen Entfernung der Biomasse mit einer anorganischen Säure wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säure wie beispielsweise Propionsäure auf einen sauren pH Wert gestellt werden (GB 1,439,728 oder EP 1 331 220 ). Es ist gleichfalls möglich die Fermentationsbrühe mit der vollständig enthaltenen Biomasse anzusäuern. Schließlich kann die Brühe auch durch Zusatz von Natriumbisulfit (NaHSO₃, GB 1,439,728 ) oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz der schwefligen Säure stabilisiert werden.

Bei der Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen Nebenprodukte und die gelösten nicht verbrauchten Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe) bleiben mindestens teilweise (> 0%), bevorzugt zu mindestens 25%, besonders bevorzugt zu mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75% im Produkt. Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100%) oder nahezu vollständig das heißt > 95% oder > 98% im Produkt. In diesem Sinne bedeutet der Begriff „Fermentationsbrühebasis", dass ein Produkt mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.

Anschließend wird der Brühe mit bekannten Methoden wie z.B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt oder konzentriert. Diese auf konzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden Wirbelschicht gemäß PCT/EP2004/006655 beschrieben, zu rieselfähigen Produkten insbesondere zu einem feinteiligen Pulver oder vorzugsweise grobkörnigem Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein gewünschtes Produkt isoliert.

Es ist ebenfalls möglich, die Fermentationsbrühe direkt d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Sprühgranulation zu trocknen.

Unter „rieselfähig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen Auslauföffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50%) einer Korngröße von 20 bis 200 μm Durchmesser gemeint.

Mit „grobkörnig" ist ein Produkt mit einem überwiegendem Anteil (> 50%) einer Korngröße von 200 bis 2000 μm Durchmesser gemeint.

Die Korngrößenbestimmung kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben.

Das rieselfähige, feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.

Der Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5%) an Körngrößen unter 100 μm Durchmesser enthält.

„Lagerbar", im Sinne dieser Erfindung, bedeutet ein Produkt, das mindestens ein (1) Jahr oder länger, bevorzugt mindestens 1,5 Jahre oder länger, besonders bevorzugt zwei (2) Jahre oder länger in trockener und kühler Umgebung gelagert werden kann ohne das ein wesentlicher Verlust (< 5%) der jeweiligen Aminosäure auftritt.

Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten ( EP0743016A ) Stearaten.

Weiterhin ist es vorteilhaft die Oberfläche der erhaltenen Granulate mit Ölen zu versehen so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Öle können Mineralöle, pflanzliche Öle oder Mischungen pflanzlicher Öle verwendet werden. Beispiele für derartige Öle sind Sojaöl, Olivenöl, Sojaöl/Lecithingemische. In gleicher Weise sind auch Silikonöle, Polyethylenglykole oder Hydroxyethycellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflächen mit den genannten Ölen erzielt man eine erhöhte Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils. Der Gehalt an Öl im Produkt beträgt 0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs.

Bevorzugt sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngröße von 100 bis 1800 μm oder einem Anteil von ≥ 95 Gew.-% einer Korngröße von 300 bis 1800 μm Durchmesser. Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrösse < 100 μm liegt bevorzugt bei > 0 bis 1 Gew.- besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%.

Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.

Schließlich kann das Produkt auch durch Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonate, Kieselsäuren, Silikate, Alginate, Stearate, Stärken, Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C-4100920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen insbesondere dem Magen von Wiederkäuern ist.

Zur Einstellung einer gewünschten Aminosäurekonzentration im Produkt kann je nach Anforderung die entsprechende Aminosäure während des Verfahrens in Form eines Konzentrates oder gebenenfalls einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise dessen Salz in flüssiger oder fester Form hinzugefügt werden. Diese können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder auf konzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden.

Im Falle des Lysin wird bei der Herstellung Lysin-haltiger Produkte das Verhältnis der Ionen so eingestellt, dass das Ionenverhältnis entsprechend nachstehender Formel 2 × [SO₄ ^2–] + [Cl^–] – [NH₄ ⁺] – [Na⁺] – [K⁺] – 2 × [Mg⁺] – 2 × [Ca²⁺]/[L-Lys] 0,68 bis 0,95, bevorzugt 0,68 bis 0,90 ergibt so wie von Kushiki et al. in der US 20030152633 beschrieben.
Im Falle des Lysin hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Lysingehalt (als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-% oder 20 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 Gew.-% bis 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 70 Gew.-% bezogen auf die Trockenmasse des Produkts. Maximale Gehalte an Lysinbase von 71 Gew.-%, 72 Gew.-%, 73 Gew.-% sind ebenfalls möglich.
Im Falle einer elektrisch neutralen Aminosäure wie dem L-Tryptophan hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Aminosäuregehalt von mindestens 5 Gew.-%, 10 Gew.-%, 20 Gew.-%, 30 Gew.-% und maximal 50 Gew.-%, 60 Gew.-%, 70 Gew.-%, 80 Gew.-%, 90 Gew.-% oder bis 95 Gew.-%.
Der Wassergehalt des festen Produktes beträgt bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 3 Gew.-%.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet dass man folgende Schritte durchführt a. Abschwächung des für die E1p Untereinheit des Pyruvat-Dehydrogenase Komplexes kodierenden aceE-Gens in einem coryneformen Bakterium, das die Fähigkeit besitzt in einem geeignetem Nährmedium die genannte organisch-chemische Verbindung in der Zelle und/oder im Nährmedium anzureichern b. Fermentation des coryneformen Bakteriums gemäß a) in einem geeigneten Nährmedium, und c. Anreicherung der organisch-chemischen Verbindung im Nährmedium (Fermentationsbrühe) oder in den Zellen der Bakterien.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass das aceE-Gen ausgeschaltet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet dass das aceE-Gen vor der Abschwächung für ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 90% identisch ist mit SEQ ID NO:2.
Verfahren nach nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet dass das aceE-Gen vor der Abschwächung ein Polynukleotid umfasst, dessen Nukleotidsequenz zu mindestens 90% identisch ist mit SEQ ID NO:1.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet dass das aceE-Gen vor der Abschwächung ein Polynukleotid umfasst, das mit der zu SEQ ID NO:1 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet dass das aceE-Gen vor der Abschwächung für ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz identisch ist mit SEQ ID NO:2.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet dass das aceE-Gen vor der Abschwächung ein Polynukleotid umfasst, dessen Nukleotidsequenz identisch ist mit SEQ ID NO:1.
Verfahren nach nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet dass das aceE-Gen vor der Abschwächung ein Polynukleotid umfasst, dessen Nukleotidsequenz mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von DNA isoliert aus einem coryneformen Bakterium und unter Verwendung eines Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15, aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 500 von SEQ ID NO:3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 3267 und 3769 von SEQ ID NO:3 ausgewählt werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet dass die Abschwächung des aceE-Gens durch eine oder mehrere der Massnahmen ausgewählt aus der Gruppe Deletion von mindesten einem Nukleotid, Insertion von mindestestens einem Nukleotid, Transition von mindestens einem Nukleotid mit Einbau einer Nichtsinnmutation und Transversion von mindestens einem Nukleotid mit Einbau einer Nichtsinnmutation hergestellt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet dass das coryneforme Bakterium ein Bakterium ausgewählt aus der Gruppe Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium thermoaminogenes und Corynebacterium ammoniagenes ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet dass das coryneforme Bakterium Corynebacterium glutamicum ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der organisch-chemischen Verbindung um eine L-Aminodäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine proteinogene L-Aminosäure oder um L-Homoserin handelt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der proteinogenen L-Aminosäure um eine oder mehrere der Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe L-Aspartat, L-Lysin, L-Homoserin, L-Threonin, L-Methionin, L-Alanin, L-Valin und L-Leucin handelt.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der proteinogenen L-Aminosäure um L-Lysin handelt.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der proteinogenen L-Aminosäure um L-Valin handelt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass in dem coryneformen Bakterium eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe a. ein für eine Dihydrodipicolinat-Synthase kodierendes dapA-Gen, b. ein für eine Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierendes zwf-Gen oder Allel, c. ein für eine Pyruvat-Carboxylase kodierendes pyc-Gen oder Allel, d. ein für eine Aspartatkinase kodierendes lysC-Gen oder lysC^FBR-Allel, e. ein für ein Lysin-Export-Protein kodierendes lysE-Gen, f. ein für eine Diaminopimelate-Dehydrogenase kodierendes ddh-Gen, und g. ein für ein zwa1-Protein kodierendes zwa1-Gen, verstärkt vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass in dem coryneformen Bakterium eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe a. ein für eine Homoserin-Dehydrogenase kodierendes hom-Gen, b. ein für eine Malat-Chinon Oxidoreduktase kodierendes mqo-Gen, c. ein für eine Citratsynthase kodierends gltA-Gen, d. ein für eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierendes pck-Gen, und e. ein für ein Malat-Enzym kodierendes mez-Gen, abgeschwächt vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass in dem coryneformen Bakterium eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe a. für Acetolactate Synthase kodierende ilvBN-Gene oder ilvBN^FBR-Allele, b. ein für eine Isomeroreduktase kodierendes ilvC-Gen, c. ein für eine Dihydroxysäure Dehydratase kodierendes ilvD-Gen, d. ein für eine Transaminase B kodierendes ilvE-Gen, e. für Valin-Export-Proteine kodierende brnEF-Gene, f. ein für eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierendes pck-Gen, und g. ein für ein Malat-Enzym kodierendes mez-Gen, verstärkt vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass in dem coryneformen Bakterium eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe a. ein für eine Pyruvat-Carboxylase kodierendes pyc-Gen, b. ein für eine Pyruvat-Oxidase kodierends poxB-Gen, c. ein für eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierendes ppc-Gen, d. ein für eine Threonin Deaminase kodierendes ilvA-Gen, und e. ein für ein Valin-Importprotein kodierendes brnQ-Gen abgeschwächt vorliegt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der organisch-chemischen Verbindung um eine Ketosäure handelt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Anspruche 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Ketosäure um Brenztraubensäure oder Bernsteinsäure handelt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–22, dadurch gekennzeichnet, dass man die organisch-chemische Verbindung isoliert und reinigt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–22, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder Biomasse in ihrer Gesamtheit oder in Anteilen (> 0 bis 100) im Endprodukt verbleiben.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Satzverfahren handelt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Zulaufverfahren handelt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein kontinuierliches Verfahren handelt