Aufgabe der
Erfindung
Die
Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere
L-Methionin, mit Mikroorganismen, bevorzugt mit coryneformen Bakterien
bereitzustellen.
Beschreibung
der Erfindung
Werden
im folgenden L-Aminosäuren
oder Aminosäuren
erwähnt,
sind damit eine oder mehrere der Proteinen Aminosäuren einschließlich ihrer
Salze, ausgewählt
aus der Gruppe L-Asparaginsäure, L-Asparagin,
L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin,
L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin,
L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin,
L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin und L-Prolin gemeint.
Besonders bevorzugt ist L-Methionin.
Unter
proteinogenen Aminosäuren
versteht man die Aminosäuren,
die in natürlichen
Proteinen, das heißt
in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen
vorkommen. Sie dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen
miteinander verknüpft
sind.
Werden
im folgenden L-Methionin oder Methionin erwähnt, sind damit auch die Salze
wie z.B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat gemeint.
Die
Methionin-Aufnahme aus dem Fermentationsmedium ist für die Produktion
von Methionin sehr bedeutsam, da eine eventuelle Wiederaufnahme
des exkretierten Produktes die Produktionsrate senken würde. Die
in dieser Erfindung beispielhaft für Corynebacterium glutamicum
beschriebenen, abzuschwächenden Gene
yaeE, abc und yaeC kodieren für
das periplasmatische Bindeprotein YaeC, das ATP-Bindeprotein ABC und
die Permease YaeE, welche zusammen das Methionin-Aufnahmesystem MetD2 bilden.
Das
Abschwächen,
insbesondere Ausschalten eines oder mehrerer der für das Methionin-Aufnahmesystem
MetD2 kodierenden Gene yaeC, abc und yaeE verbessert die Produktion
von L-Methionin in den entsprechenden coryneformen Bakterien im
Vergleich zu den Ausgangsorganismen ohne Abschwächung oder Ausschaltung dieser
Gene.
Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von
L-Aminosäuren
unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen
Bakterien, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren, die weniger
Methionin als die Ausgangsorganismen oder kein Methionin aus dem
umgebenden Medium aufnehmen und in denen eine oder mehrere der für das Methionin-Aufnahmesystem
MetD2 kodierende(n) Nukleotidsequenze(n) yaeC, abc und yaeC abgeschwächt, insbesondere
ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert werden (wird).
Gegenstand
dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
von L-Aminosäuren,
in dem folgende Schritte durchgeführt werden:
- a)
Fermentation der L-Aminosäure
produzierenden rekombinanten Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen
Bakterien in einem Medium, wobei diese weniger Methionin als die
Ausgangsorganismen oder kein Methionin aus dem umgebenden Medium
aufnehmen, und in denen mindestens eines der für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2
kodierenden Gene yaeE, abc und yaeC abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet
oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird (werden),
- b) Anreicherung der L-Aminosäuren
im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolierung der gewünschten
L-Aminosäuren,
wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder
der Biomasse in Anteilen (> 0
bis 100 %) oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.
Die
eingesetzten Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien produzieren
bevorzugt bereits vor der Abschwächung
oder dem Ausschalten der Aufnahme von Methionin aus dem umgebenden
Medium, welche beispielsweise zu erreichen ist durch Abschwächung oder
Ausschalten eines oder mehrerer der Gene yaeE, abc und yaeC, L-Aminosäuren, insbesondere
L-Methionin.
Es
wurde gefunden, dass Mikroorganismen, bevorzugt coryneforme Bakterien,
die kein oder weniger Methionin aus dem umgebenden Medium aufnehmen,
was durch Abschwächung
oder Ausschalten eines oder mehrerer der für das Methionin-Aufnahmesystem MetD2
kodierenden Gene yaeE, abc und yaeC erreicht wird, in verbesserter
weise L-Aminosäuren,
insbesondere L-Methionin, produzieren.
Die
Nukleotidsequenzen der genannten Gene von Corynebacterium glutamicum
gehören
zum Stand der Technik und können
verschiedenen Patentanmeldungen sowie der Datenbank des National
Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library
of Medicin (Bethesda, MD, USA) entnommen werden. yaeC-Gen:
| Bezeichnung: | periplasmatisches
Bindeprotein YaeC |
| Funktion: | Teil
des Methionin-Aufnahmesystems MetD2 |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 7061 und Nr. 709 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX127145
und AX120793 |
abc-Gen:
| Bezeichnung: | ATP-Bindeprotein
ABC |
| Funktion: | Teil
des Methionin-Aufnahmesystems MetD2 |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 7061, Nr. 708, Nr. 7060 und Nr. 707 aus EP1108790; Sequenz Nr.
363 aus WO0100805; Sequenz Nr. 509 aus WO0100844 |
| Accession
No.: | AX127145;
AX120792; AX127144; AX120791; AX066781; AX065383 |
yaeE-Gen:
| Bezeichnung: | Permease
YaeE |
| Funktion: | Teil
des Methionin-Aufnahmesystems MetD2 |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 7060, Nr. 7061 und Nr. 706 aus EP1108790; Sequenz Nr. 365 aus
WO0100805 |
| Accession
No.: | AX127144;
AX127145; AX120790; AX066783 |
Die
in den angegebenen Textstellen beschriebenen Sequenzen kodierend
für d abc
und yaeE können erfindungsgemäß verwendet
wie Gene yaeC,erden. Weiterhin können
Allele der genannten Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit
des genetischen Kodes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen („sense
mutations") ergeben.
Bevorzugte
Ausführungsformen
finden sich in den Ansprüchen.
Der
Begriff „Abschwächung" bzw. „Abschwächen" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die
durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet,
das für
ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert
bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen
kombiniert.
Durch
die Maßnahmen
der Abschwächung
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins,
beziehungsweise der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, abgesenkt.
Die
Angabe „weniger" betrifft dieselben
Prozentsätze
gesehen im Hinblick auf die Aufnahmefähigkeit der rekombinanten Mikroorganismen
im Vergleich zu den Ausgangsmikroorganismen ohne Abschwächung oder
Ausschaltung des Methionin-Aufnahmesystems MetD2.
Die
Herabsetzung der Proteinkonzentration ist über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung
und anschließende
optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit enstprechender
Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation
der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung
der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23
(2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann
ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung
mit einem für das
nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular
cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)
und anschließender
optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung
(Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39; Lottspeich, Angewandte
Chemie 111: 2630-2647 (1999)) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden
Proteinen kann mittels DNA Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation
bezeichnet) gemessen werden wie beispielsweise im Lehrbuch „Bioanalytik" (Lottspeich/Zorbas,
Spektrum Akademischer Verlag Gmbh, Heidelberg, Deutschland, 1998)
beschrieben und bei Wilson et al. (J. Bacteriol. 183: 2151-2155
(2001)) angewendet. Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf
die Expression anderer Gene, kann durch verschiedene gut beschriebene
Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et
al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind,
können
Aminosäuren
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose
oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter
coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium
handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit
bekannt ist, L-Aminosäuren
zu produzieren.
Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium
thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
oder
wie beispielsweise der L-Methionin produzierende Stamm
Corynebacterium
glutamicum ATCC21608.
Stämme mit
der Bezeichnung „ATCC" können von
der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen
werden. Stämme
mit der Bezeichnung „FERM" können vom
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
(AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)
bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes
(FERM BP-1539) ist in der US-A-5.250.434 beschrieben.
Zur
Erzielung einer Abschwächung
können
entweder die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften
der Enzymproteine herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls
können
beide Maßnahmen
kombiniert werden.
Die
Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische
Veränderung
(Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene,
Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen,
das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann
z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal
of Bacteriology 170: 5949-5952 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic
Acids Research 26: 3584-3590 (1998), bei Pátek et al. (Microbiology
142: 1297-309 (1996) und Journal of Biotechnology 104: 311-323 (2003))
und in bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers
(„Molekulare
Genetik", 6. Auflage,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von
Winnacker („Gene
und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
Ein
Beispiel für
die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des
abzuschwächenden Gens
unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG
(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren
Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder des tac-Promotors. Hierzu
eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor
pXK99E (WO0226787; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 31.
Juli 2001 in DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)) oder pVWEx2
(Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397,
ISSN 0994-2952, Jülich,
Deutschland (1997)), die eine IPTG-abhängige
Expression des klonierten Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.
Eingesetzt
wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift WO0226787
zur regulierten Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors
pxK99EdeaD in das Genom von Corynebacterium glutamicum und von Simic
et al. (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002))
zur regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors
pK18mobglyA' in
Corynebacterium glutamicum.
Eine
weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression
ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxyukleotide oder
Vektoren zur Synthese längerer
Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA
kann dort an komplementäre
Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern
oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet
der Fachmann bei Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology
2000 Oct; 66 (10): 4366 – 4371).
Mutationen,
die zu einer Veränderung
bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen
führen,
sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten
von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617
(1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61: 1760-1762 (1997)) und Möckel
(Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-2906,
ISSN09442952, Jülich,
Deutschland (1994)) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine
Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Als
Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und
Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit
von der Wirkung des Aminosäureaustausches
auf die Enzymaktivität
wird von Fehlsinnmutationen („missense
mutations") oder
Nichtsinnmutationen („nonsense
mutations") gesprochen.
Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem
Gen führen
zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), in deren Folge
falsche Aminosäuren
eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen
von mehreren Kodonen führen
typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität.
Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum
Stand der Technik und können
bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers
(„Molekulare
Genetik", 6. Auflage,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker
(„Gene
und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann
(„Allgemeine
Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Eine
gebräuchliche
Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer
und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung („gene disruption") und des Gen-Austauschs
(„gene
replacement").
Bei
der Methode der Gen-Unterbrechung wird zum Beispiel ein zentraler
Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor
kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber
in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise
pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob,
pK19mob, pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)),
pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Firma
Invitrogen, Groningen, Niederlande; Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et
al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der
Plasmidvektor, der den zentralen Bereich der Kodierregion des Gens
enthält,
wird anschließend
durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die
Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Journal of Bacteriology 172: 1663-1666 (1990) und Applied and Environmental
Microbiology 60: 756-759
(1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise
bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29,
356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347
(1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden
Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei
unvollständige
Allele, denen jeweils das 3'-
bzw. das 5'-Ende fehlt. Diese
Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens
von C. glutamicum verwendet.
Gegenstand
der Erfindung sind ebenfalls Vektoren, die mindestens 15, bevorzugt
25 aufeinanderfolgende Nukleotide des zentralen Teils der Kodierregion
von mindestens einem der Gene yaeD, abc oder yaeE enthalten.
Bei
der Methode des Genaustausches („gene replacement") wird eine Mutation
wie z.B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden
Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in
einen für
C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch
Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und
eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen
bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw.
des Allels. Diese Methode ist bei Scharzer und Pühler (Bio/Technology 9: 84-87
(1991) beschrieben und wurde beispielsweise von Peters-Wendisch
et al. (Microbiology 144, 915 – 927
(1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion
auszuschalten oder von Wehmeier et al. (Microbiology 144: 1853-1862
(1998)) zum Einfügen
einer Deletion in das rel-Gen von C. glutamicum.
Einen Überblick über verschiedene
gentechnische Methoden bei C. glutamicum geben Kirchner und Tauch
(Journal of Biotechnology 104: 287-299 (2003).
In
eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc
unc yaeE kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein
Basenaustausch eingebaut werden.
Weiterhin
kann es für
die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich
zur Verringerung des Importes von Methionin aus dem umgebenden Medium,
erfindungsgemäß zu erreichen
durch Abschwächung
eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc
und yaeE, eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus,
des Aminosäure-Exports
und gegebenenfalls regulatorische Proteine entweder zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren,
oder abzuschwächen,
insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
Der
Begriff „Verstärkung" bzw. „Verstärken" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem
Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden,
indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen
starken Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym
bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen
kombiniert.
Durch
die Maßnahmen
der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise
der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Die
Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt. Unter „endogenen
Genen" oder „endogenen
Nukleotidsequenzen" versteht
man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise
Nukleotidsequenzen.
So
kann beispielsweise für
die Herstellung von L-Methionin neben der Verringerung des Importes
von Methionin aus dem umgebenden Medium, erfindungsgemäß zu erreichen
durch Abschwächung
eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc
und yaeE, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Gene
oder Allele der Methioninproduktion verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Unter „Gene
oder Allele der Methioninproduktion" sind sämtliche, bevorzugt endogene,
offene Leserahmen, Gene oder Allele zu verstehen, deren Verstärkung/Überexpression
eine Verbesserung der Methioninproduktion bewirken kann.
Hierzu
gehören
unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: accBC,
accDA, aecD, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dps, eno,
fda, gap, gap2, gdh, gnd, glyA, hom, homFBR,
lysC, lysCFBR, metA, metB, metE, metH, metY,
msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA,
pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC,
sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf und zwf A213T.
Diese sind in Tabelle 1 zusammengefasst und erläutert.
Tabelle
1 Gene
und Allele der Methioninproduktion
Weiterhin
kann es für
die Produktion L-Methionin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verringerung des
Importes von Methionin aus dem umgebenden Medium, beispielsweise
zu erreichen durch Abschwächung
eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc
und yaeE, gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe der Gene oder Allele, die für das Wachstum oder die Methioninproduktion
nicht essentiell sind, abzuschwächen,
insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
Hierzu
gehören
unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: brnQ,
ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR,
luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, metD, metK, pck, pgi, poxB und
zwa2. Diese sind in Tabelle 2 zusammengefasst und erläutert.
Tabelle
2: Gene
und Allele, die für
die Methioninproduktion nicht essentiell sind
Schließlich kann
es für
die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Methionin, vorteilhaft sein, neben der Verringerung
des Importes von Methionin aus dem umgebenden Medium, beispielsweise
zu erreichen durch Abschwächung
eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc
und yaeE, unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing
Microorganisms",
in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die
erfindungsgemäß hergestellten
Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich
oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung)
oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das
zu verwendende Kulturmedium muß in
geeigneter Weise den Ansprüchen
der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual
of Methods for General Bacteriology„ der American Society for
Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette wie z.B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren
wie z.B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie z.B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie
z.B. Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als
Stickstoffquelle können
organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muß weiterhin Salze
von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat,
die für
das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter
Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
Zur
pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen
wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können
dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z.B. Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise
bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten
Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Mit
den Methoden der Erfindung kann die Leistung der Bakterien oder
des Fermentationsprozesses bezüglich
der Produkt-Konzentration ((Produkt pro Volumen), der Produkt-Ausbeute (gebildetes
Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff- Quelle), der Produkt-Bildung (gebildetes
Produkt pro Volumen und Zeit) oder anderer Prozess-Parameter und
Kombinationen davon um mindestens 0,5%, mindestens 1% oder mindestens
2% verbessert werden.
Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie
bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1185-1190) beschrieben
durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin
Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC
erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979)
51: 1167-1174) beschrieben. Informationen dazu findet der Fachmann
auch bei Ashman et al. (in: Tschesche (Hrsg), Modern Methods in
Protein Chemistry. 155-172, de Gruyter, Berlin 1985).
Das
erfindungsgemäße Verfahren
dient zur fermentativen Herstellung von L-Methionin.
Die
Konzentration von L-Methionin im Endprodukt kann gegebenenfalls
durch den Zusatz von L-Methionin auf den gewünschten Wert eingestellt werden.
