VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON L-AMINOSÄUREN UNTER VERWENDUNG REKOMBINANTER CORYNEFORMER BAKTERIEN MIT VERMINDERTER AKTIVITÄT DES REGULATORS ASUR
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere 5 L-Methionin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen das asuR-Gen abgeschwächt wird. Das asuR-Gen kodiert für den Regulator AsuR.
Stand der Technik
Chemische Verbindungen, mit denen insbesondere L-0 Aminosäuren, Vitamine, Nukleoside und Nukleotide und D- Aminosäuren gemeint sind, finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Kosmetik, in der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.
Zahlreiche dieser Verbindungen werden durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der- Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z.B. das Lysin-Analogon S- (2-Aminoethyl) -Cystein oder die Methionin- Analoga α-Methyl-Methionin, Ethionin, Norleucin, N- acetylnorleucin, S-Trifluoromethylhomocystein, 2-amino-5-
heprenoitsäure, Seleno-Methionin, Methioninsulfoximin, Methoxin, 1-Aminocyclopentan-Carboxylsäure sind oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren. Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L- Aminosäure-Produktion untersucht.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere der proteinen Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L- Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-
Gluta insäure, L-Glutamin, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin und L-Prolin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Methionin.
Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die
Aminosäuren, die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen. Sie dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.
Werden im folgenden L-Methionin oder Methionin erwähnt, sind damit auch die Salze wie z.B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat gemeint.
Der Regulator AsuR ist ein Aktivator von Genen, die in die Aufnahme und Verwertung von Schwefel-haltigen Verbindungen, insbesondere von Sulfonaten, involviert sind. Er wird durch Sulfat reprimiert. Weiterhin reprimiert AsuR Gene der Cystein-Biosynthese. Die Cystein-Biosynthese ist von grosser Bedeutung für die Methionin-Biosynthese, da der für die Biosynthese von Methionin benötigte Schwefel aus Sulfit und Cystein aus der Cystein-Biosynthese stammt. Die Bezeichnung „asuR" leitet sich ab von „alternate sulfur source utilization regulator" .
Regulatorische Proteine, welche die Expression anderer Gene regulieren sind solche Proteine, die beispielsweise durch eine spezifische Proteinstruktur, genannt Helix-Turn-Helix- Motiv, an DNA binden können und so die Transkription anderer Gene entweder verstärken oder abschwächen können.
Es wurde gefunden, dass die Funktion des Regulators AsuR aus Corynebacterium glutamicum die Expression von Genen, die in die Aufnahme und Verwertung von Schwefel-haltigen Verbindungen, insbesondere Sulfonaten, involviert sind, aktiviert und Gene der Cystein-Biosynthese reprimiert.
Das Abschwächen, insbesondere Ausschalten des für den Regulator AsuR kodierenden asuR-Gens verbessert die Produktion von L-Methionin in den entsprechenden coryneformen Bakterien im Vergleich zu den AusgangsOrganismen ohne Abschwächung oder Ausschaltung dieses Gens.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren und in denen das für das
regulatorische Protein AsuR kodierende asuR-Gen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet ist oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird.
Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, in dem folgende Schritte durchgeführt werden:
a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden reko binanten coryneformen Bakterien in einem Medium, wobei in diesen das für den Regulator AsuR kodierende Gen asuR abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet ist oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird,
b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen (> 0 bis 100 %) oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.
Die eingesetzten coryneformen Bakterien produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung oder dem Ausschalten des asuR-Gens L-Aminosäuren, insbesondere L-Methionin.
Es wurde gefunden, dass Mikroorganismen, bevorzugt coryneforme Bakterien nach Abschwächung, insbesondere Ausschalten des Regulators AsuR, in verbesserter Weise L- Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, produzieren.
Die Nukleotidsequenzen des genannten Gens von
Corynebacterium glutamicum gehören zum Stand der Technik und können verschiedenen Patentanmeldungen sowie der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI).der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) entnommen werden.
Die Nukleotidsequenz des für den Regulator AsuR von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung EP1108790 als Sequenz Nr. 12 sowie als Sequenz Nr. 1 entnommen werden. Die Nukleotidsequenz ist ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter der Accession Number AX120096 und unter der Accession Number AX120085 hinterlegt. Weiterhin ist sie unter der Accession Number BX927148 von Nukleotid 11177 bis 10104 der angegebenen Sequenz zu finden, die Aminosäuresequenz des zugehörigen Proteins ist unter der Accession Number CAF18575 hinterlegt.
Die in der angegebenen Textstelle beschriebene Sequenz kodierend für das Gen asuR kann erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des genannten Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Kodes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen („sense mutations") ergeben.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
Der Begriff „Abschwächung" bzw. „Abschwächen" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%
oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, abgesenkt.
Die Herabsetzung der Proteinkonzentration ist über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit enstprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al . (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot- Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al . , Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden wie beispielsweise im Lehrbuch „Bioanalytik" (Lottspeich/ Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag Ginbh, Heidelberg, Deutschland, 1998) beschrieben und bei Wilson et al . (J. Bacteriol . 183: 2151-2155 (2001)) angewendet. Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al . , Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um
Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstamme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020
oder wie beispielsweise der L-Methionin produzierende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC21608.
Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) ist in der US-A-5.250.434 beschrieben.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression der Gene oder die katalytischen oder regulatorischen Eigenschaften der Enzymproteine herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Riboso enbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949-5952 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3584-3590 (1998), bei Patek et al . (Microbiology 142: 1297-309 (1996) und Journal of Biotechnology 104: 311-323 (2003)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) .
Ein Beispiel für die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des abzuschwächenden Gens unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG (Isopropyl-/?-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder des tac- Promotors . Hierzu eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor pXK99E (WO0226787; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 31. Juli 2001 in
DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)) oder pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Deutschland (1997)), die eine IPTG- abhängige Expression des klonierten Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.
Eingesetzt wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift WO0226787 zur regulierten Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors pXK99EdeaD in das
Genom von Corynebacterium glutamicum und von Simic et al . (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) zur regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors pKlδmobglyA' in Corynebacterium glutamicum.
Eine weitere Methode zur spezifischen Verringerung der > Genexpression ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxyukleotide oder Vektoren zur Synthese längerer Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA kann dort an komplementäre Abschnitte spezifischer RNAs binden und deren Stabilität verringern oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet der Fachmann bei Srivastava et al . (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10) : 4366 - 4371) .
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugi oto et al . (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel (Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland (1994)) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen . („nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), in
deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuc von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung („gene disruption") und des Gen-Austausche („gene replacement") .
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird zum Beispiel ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli) , nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise PSUP301 (Simon et al . , Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pKlδmob, pKl9mob, pKlβmobsacB oder pKl9mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Shu an (1994) . Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al . , Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEMl (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der den zentralen Bereich der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum
überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al . (Journal of Bacteriology 172: 1663-1666 (1990) und Applied and Environmental Microbiology 60: 756- 759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al . (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Vektoren, die mindestens 15, bevorzugt 25 aufeinanderfolgende Nukleotide des zentralen Teils der Kodierregion des Gens asuR enthalten.
Bei der Methode des Genaustausches („gene replacement") wird eine Mutation wie z.B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels . Diese Methode -ist bei Scharzer und Pühler (Bio/Technology 9: 84-87 (1991) beschrieben und wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915 - 927 (1998)) verwendet, um das
pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten oder von Wehmeier et al . (Microbiology 144: 1853-1862 (1998)) zum Einfügen einer Deletion in das rel-Gen von C. glutamicum. Einen Überblick über verschiedene gentechnische Methoden bei C. glutamicum geben Kirchner und Tauch (Journal of Biotechnology 104: 287-299 (2003).
In eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc unc yaeE kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des Regulators AsuR eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine entweder zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren, oder abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
Der Begriff „Verstärkung" bzw. „Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen bzw. Alle! verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-
Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt. Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Methionin neben der Abschwächung des Regulators AsuR eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Gene oder Allele der Methioninproduktion verstärkt, insbesondere überexprimiert werden. Unter „Gene oder Allele der Methioninproduktion" sind sämtliche, bevorzugt endogene, offene Leserahmen, Gene oder Allele zu verstehen, deren VerStärkung/Überexpression eine Verbesserung der Methioninproduktion bewirken kann.
Hierzu gehören unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: accBC, accDA, aecD, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dps, eno, fda, gap, gap2 , gdh, gnd, glyA, hom, homFBR, lysC, lysCFBR, metA, metB, metE, metH, metY, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsl, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwal, zwf und zwf A213T. Diese sind in Tabelle 1 zusammengefasst und erläutert.
Tabelle 1
Gene und Allele der Methioninproduktion
Weiterhin kann es für die Produktion L--Methionin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des Regulators AsuR gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe der Gene oder Allele, die für das Wachstum oder die Methioninproduktion nicht essentiell sind, abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
Hierzu gehören unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: brnQ, ccpAl, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysRl, lysR2, lysR3, menE,' metD, etK, pck, pgi, poxB und zwa2. Diese sind in Tabelle 2 zusammengefasst und erläutert.
Tabelle 2
Gene und Allele, die für die Methioninproduktion nicht essentiell sind
Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Methionin, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung Regulators AsuR unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms" , in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991) ) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) ) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren . wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z.B. Glycerin und Ethanol und organische
Säuren wie z.B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische .Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete' selektiv wirkende Stoffe wie z.B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Mit den Methoden der Erfindung kann die Leistung der
Bakterien oder des Fermentationsprozesses bezüglich der Produkt-Konzentration ( (Produkt pro Volumen) , der Produkt- Ausbeute (gebildetes Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff- Quelle) , der Produkt-Bildung (gebildetes Produkt pro Volumen und Zeit) oder anderer Prozess-Parameter und
Kombinationen davon um mindestens 0,5%, mindestens 1% oder mindestens 2% verbessert werden.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1185-
1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) • beschrieben. Informationen dazu findet der Fachmann auch
bei Ashman et al . (in: Tschesche (Hrsg), Modern Methods in Protein Chemistry. 155-172, de Gruyter, Berlin 1985) .
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Methionin.
Die Konzentration von L-Methionin im Endprodukt kann gegebenenfalls durch den Zusatz von L-Methionin auf den gewünschten Wert eingestellt werden.