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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Gegenstand
der Erfindung sind für
Varianten des Sigma-Faktors
A codierende Allele des sigA-Gens aus coryneformen Bakterien sowie
ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von
Bakterien, die diese Allele enthalten.
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Stand der
Technik
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Die
Aminosäure
L-Lysin findet in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie,
in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
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Es
ist bekannt, daß Aminosäuren durch
Fermentation von Stämmen
coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum,
hergestellt werden. Wegen ihrer großen Bedeutung wird ständig an
der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können
fermentationstechnische Maßnahmen,
wie zum Beispiel Rühren
und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien,
wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
die Aufarbeitung zur Produktform, zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie,
oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus
selbst betreffen.
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Zur
Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden
Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl verwendet.
Auf diese Weise erhält
man Stämme,
die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch
bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ein bekannter
Antimetabolit ist das Lysinanalogon S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (AEC).
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Seit
einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik
zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden
Stämmen
von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene
amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäureproduktion untersucht.
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Die
Nukleotidsequenz des für
den Sigma-Faktor A von Corynebacterium glutamicum codierenden Gens
kann der Patentanmeldung EP-A-1108790 als Sequenz Nr. 2100 sowie
als Sequenz Nr. 7065 entnommen werden.
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Die
Nukleotidsequenz ist ebenfalls in der Datenbank des National Center
for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin
(Bethesda, MD, USA) unter Accession Number AX122184 und unter Accession
Number AX127149 hinterlegt.
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Aufgabe der
Erfindung
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Die
Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen
zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Wenn
im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht
nur die Basen, sondern auch die Salze, wie z.B. Lysin-Monohydrochlorid
oder Lysin-Sulfat, gemeint.
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Gegenstand
der Erfindung sind aus coryneformen Bakterien, insbesondere Corynebacterium
glutamicum, stammende, für
den Sigma-Faktor A codierende, replizierbare Nukleotidsequenzen
(DNA), wobei die zugehörigen
Aminosäuresequenzen
in der SEQ ID No. 2 an Position 414 jede proteinogene Aminosäure außer L-Alanin
enthalten.
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Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin eine aus coryneformen Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, stammende, für den Sigma-Faktor A codierende,
replizierbare Nukleotidsequenz (DNA), wobei die zugehörige Aminosäuresequenz
an Position 414 L-Valin enthält,
dargestellt in der SEQ ID No. 4.
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Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin eine aus coryneformen Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, stammende, für den Sigma-Faktor A codierende,
replizierbare Nukleotidsequenz (DNA), deren Basensequenz an Position
1241 Thymin enthält,
dargestellt in SEQ ID No. 3.
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Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin Plasmide (Vektoren), die die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
enthalten und gegebenenfalls in coryneformen Bakterien replizieren.
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Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin coryneforme Bakterien, die die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
enthalten und in denen die für
den Sigma-Faktor A codierenden Nukleotidsequenzen gegebenenfalls überexprimiert
vorliegen, wobei in den zugehörigen
Aminosäuresequenzen
an Position 414 von SEQ ID No. 2 eine andere proteinogene Aminosäure enthalten
ist.
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Unter Überexpression
versteht man eine Erhöhung
der intrazellulären
Konzentration oder Aktivität
der erfindungsgemäßen Sigma-Faktoren
A.
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Durch
die Maßnahmen
der Überexpression
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration
des Proteins im Ausgangsmikroorganismus erhöht.
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Der
Sigma-Faktor A ist ein Transkriptionsfaktor, der die Bindung der
RNA-Polymerase an spezifische Stellen (initiation sites) der DNA
vermittelt und den Beginn (initiation) der Transkription einleitet.
Er ist an der Einleitung der Transkription einer großen Anzahl
von Genen beteiligt, beispielsweise der Gene hom, welches für Homoserin-Dehydrogenase
codiert, gap, welches für
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codiert, fda, welches für Fructosebisphosphat-Aldolase
codiert, und pgk, welches für
Phosphoglycerat-Kinase codiert (Pátek et al., Microbiology
143: 1297-1309 (1996).
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Zur
Erzielung einer Überexpression
kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann der
Promotor- und Regulationsbereich oder die Ribosomenbindungsstelle,
die sich stromaufwärts
des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken
Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut
werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe
der fermentativen L-Lysin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen
zur Verlängerung der
Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls
die Enzymaktivität
verstärkt.
Die Gene oder Genkonstrukte können
entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen
oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Veränderung
der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
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Zur
Erhöhung
der Kopienzahl der erfindungsgemäßen sigA-Allele eignen sich
Plasmide, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche
bekannte Plasmidvektoren, wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and
Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns
et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene
107: 69-74 (1991)), beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519,
pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie z. B. solche, die auf
pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology
Letters 66, 119-124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in
gleicher Weise verwendet werden.
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Weiterhin
kann zur Erhöhung
der Kopienzahl das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation
angewendet werden, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur
Duplikation bzw. Amplifikation des homthrB-Operons beschrieben wurde.
Bei dieser Methode wird das vollständige Gen bzw. Allel in einen
Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli),
nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen
beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791
(1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73
(1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman,
Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994); US-A 5,487,993),
pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al.,
Journal of Bacteriology 173: 4510-4516 (1991)) oder pBGS8 (Spratt
et al., Gene 41: 337-342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der
das zu amplifizierende Gen bzw. Allel enthält, wird anschließend durch
Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die
Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben.
Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et
al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)),
Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch
et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm
mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens bzw. Allels.
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Der
Anstieg der Proteinkonzentration ist über ein- bzw. zweidimensionale
Proteingeltrennung und anschließende
optische Identifizierung der Proteinkonzentration im Gel mit entspechender
Auswertungssoftware nachweisbar. Eine übliche Methode zur Herstellung
der Proteingele bei coryneformen Bakerien und zur Identifizierung
der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23
(2001)) beschriebene Verfahrensweise. Die Proteinkonzentration läßt sich
auch mittels Western-Blot-Hybridisierung
mit einem für
das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular
cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 1989) und anschließender optischer
Auswertung mit entsprechender Software zur Bestimmung der Konzentration
(Lohaus und Mayer (1998) Biospektrum 5: 32-39; Lottspeich (1999)
Angewandte Chemie 111: 2630-2647)
analysieren. Die Aktivität
von DNA-Bindungsproteinen läßt sich
mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch Gel-Retardation genannt) (Wilson
et al. (2001) Journal of Bacteriology 183: 2151-2155) messen. Die
Wirkung von DNA-Bindungsproteinen auf die Expression anderer Gene
läßt sich
mit verschiedenen gut beschriebenen Reportergen-Testverfahren nachweisen
(Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA,
1989).
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Gegenstand
der Erfindung sind aus coryneformen Bakterien stammende, für das Protein
Sigma-Faktor A codierende, replizierbare, bevorzugt endogene Nukleotidsequenzen
(DNA), wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen
das L-Alanin an Position 414 von SEQ ID No. 2 durch eine andere
proteinogene Aminosäure,
insbesondere L-Valin, ersetzt wird, dargestellt in SEQ ID No. 4.
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Gegenstand
der Erfindung sind ebenso aus coryneformen Bakterien stammende,
für das
Protein Sigma-Faktor A codierende, replizierbare, bevorzugt endogene
Nukleotidsequenzen (DNA), deren zugehörige Basensequenz an Position
1241 Thymin enthält,
dargestellt in SEQ ID No. 3.
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Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die
in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
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Die
Erfindung betrifft ebenso Vektoren (Plasmide), die die genannten
Nukleotidsquenzen enthalten und gegebenenfalls in coryneformen Bakterien
replizieren.
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Beansprucht
werden auch coryneforme Bakterien, in denen die genannte(n) Nukleotidsequenz(en) gemäß den Sigma-Faktor A codierenden
Nukleotidsequenzen bevorzugt überexprimiert
vorliegt (vorliegen).
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder
L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditiven, bei dem man im allgemeinen
folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation coryneformer Bakterien, die
für den
Sigma-Faktor A codierende endogene Nukleotidsequenzen enthalten,
wobei in den zugehörigen
Aminosäuresequenzen
das L-Alanin an Position 414 durch eine andere proteinogene Aminosäure, vorzugsweise
L-Valin, ersetzt ist;
die Allele des endogenen sigA-Gens werden
unter Bedingungen überexprimiert,
die für
die Bildung des sigA-Genprodukts Sigma-Faktor A geeignet sind.
- b) Anreicherung des L-Lysins in der Fermentationsbrühe,
- c) Isolieren des L-Lysins oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs
aus der Fermentationsbrühe,
gegebenenfalls
- d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100%).
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Unter
proteinogenen Aminosäuren
sind sämtliche
Aminosäuren
zu verstehen, die Bestandteile von Proteinen beziehungsweise Polypeptiden
sind. Insbesondere sind dies: L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin,
L-Serin, L-Glutaminsäure,
L-Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin,
L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin,
L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin.
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Die
Wildtypform des sigA-Gens ist in Wildtypstämmen coryneformer Bakterien,
insbesondere der Gattung Corynebacterium, enthalten. Sie ist in
der SEQ ID No. 1 dargestellt. Das Wildtyp-Protein ist in der SEQ ID
No. 2 dargestellt.
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Bei
der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die in der Fachwelt
bekannte Art Corynebacterium glutamicum zu nennen. Bekannte Wildtypstämme der
Art Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium
thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
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Stämme mit
der Bezeichnung "ATCC" können von
der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten
werden. Stämme
mit der Bezeichnung "FERM" können vom
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
(AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)
erhalten werden. Der erwähnte
Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) und andere
Stämme
(FERM BP-1540, FERM BP-1541 und FERM BP-1542) sind in der US-A 5,250,434
beschrieben.
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Zur
Erzeugung der erfindungsgemäßen sigA-Allele,
die für
Varianten des Sigma-Faktors A, gekennzeichnet durch einen Aminosäureaustausch
an Position 414 der SEQ ID No. 2, codieren, werden im Stand der Technik
beschriebene Mutagenesemethoden verwendet.
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Für die Mutagenese
können
klassische In-vivo-Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe,
wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin,
oder von ultraviolettem Licht verwendet werden.
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Weiterhin
können
für die
Mutagenese In-vitro-Methoden wie beispielsweise eine Behandlung
mit Hydroxylamin (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics.
A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related
Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
1992) oder mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie
für Einsteiger,
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder die Polymerasekettenreaktion
(PCR), wie sie im Handbuch von Newton und Graham (PCR, Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) beschrieben ist, verwendet
werden.
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Weitere
Anleitungen zur Erzeugung von Mutationen können dem Stand der Technik
und bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker
("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Bei
Verwendung von In-vitro-Methoden wird das im Stand der Technik beschriebene
sigA-Gen ausgehend von isolierter Gesamt-DNA eines Wildtypstammes
mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, gegebenenfalls
in geeignete Plasmidvektoren kloniert, und die DNA anschließend dem
Mutageneseverfahren unterworfen. Anleitungen zur Amplifikation von
DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) findet
der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und
bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Deutschland, 1994). Geeignete sigA-Allele werden anschließend mit
den oben beschriebenen Verfahren ausgelesen und untersucht.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein neues, für
eine Variante des Sigma-Faktors A codierendes sigA-Allel, das in
SEQ ID No. 3 dargestellt ist.
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Die
erfindungsgemäßen sigA-Allele
können
durch das Verfahren des Genaustausches ("gene replacement"), wie es bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) oder Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144,
915-927 (1998)) beschrieben ist, in geeignete Stämme überführt werden. Das entsprechende sigA-Allel
wird hierbei in einen für
C. glutamicum nicht replikativen Vektor, wie beispielsweise pK18mobsacB oder
pK19mobsacB (Jäger
et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)) oder pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), kloniert und dieser
anschließend
durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und
eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen
bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation.
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Zusätzlich kann
es für
die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich
zur Verwendung der erfindungsgemäßen sigA-Allele
gleichzeitig eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus,
des Aminosäure-Exports
und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.
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Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die
in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen
und deren Allele.
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Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus,
die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor
verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen
kombiniert. Eine Erhöhung
der Aktivität
des entsprechenden Enzymproteins kann auch durch eine verringerte
Sensibilität
gegenüber
Inhibitoren bewirkt werden.
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Durch
die Massnahmen der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die des Wildtyp-Proteins
beziehungsweise der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, erhöht.
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So
kann für
die Herstellung von L-Lysin zusätzlich
zur Verwendung der Varianten des sigA-Gens gleichzeitig eines oder
mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- • das
für die
Dihydrodipicolinat-Synthase codierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- • das
für die
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierende Gen gap (Eikmanns
(1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- • das
für die
Enolase codierende Gen eno (DE: 199 47 791.4),
- • das
für die
Triosephosphat-Isomerase codierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076-6086),
- • das
für die
3-Phosphoglycerat-Kinase codierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076-6086),
- • das
für die
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierende Gen zwf (JP-A-09224661,
EP-A-1108790),
- • das
für die
Pyruvat-Carboxylase codierende Gen pyc (DE-A-198 31 609; EP-A-1108790),
- • das
für die
Malat-Chinon-Oxidoreduktase codierende Gen mqo (Molenaar et al.,
European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- • das
für eine
feed-back resistente Aspartatkinase codierende Gen lysC (Accession
No. P26512; EP-B-0387527;
EP-A-0699759; WO 00/63388),
- • das
für das
Lysin-Export-Protein codierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- • das
für das
Zwa1-Protein codierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
- • das
für die
6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codierende Gen gnd (WO 01/71012),
- • das
für eine
Untereinheit der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierende Gen opcA (Sequenz
Nr. 79 aus WO 01/00844; WO 01/04322),
verstärkt, insbesondere überexprimiert
werden.
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Die
Verstärkung
der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase kann unter anderem auch durch
Aminosäureaustausche,
wie beispielsweise durch den Austausch von L-Prolin gegen L-Serin,
L-Leucin, L-Isoleucin oder L-Threonin an Position 158 des Enzymproteins
und/oder durch den Austausch von L-Serin gegen L-Phenylalanin oder
L-Tyrosin an Position
361 des Enzymproteins erreicht werden.
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Die
Verstärkung
der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Untereinheit kann unter anderem auch durch
Aminosäureaustausche,
wie beispielsweise durch den Austausch von L-Serin gegen L-Phenylalanin oder
L-Tyrosin an Position
312 des Enzymproteins erreicht werden.
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Weiterhin
kann es für
die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Verwendung
der Variante des sigA-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen
Gene, ausgewählt
aus der Gruppe
- • das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
codierende Gen pck ( DE 199
50 409.1 , DSM 13047),
- • das
für die
Glucose-6-phosphat-Isomerase codierende Gen pgi (US 09/396,478,
DSM 12969),
- • das
für die
Pyruvat-Oxidase codierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
- • das
für das
Zwa2-Protein codierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113),
- • das
für die
Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase codierende Gen fda (Accession
No. X17313; von der Osten et al., Molecular Microbiology 3 (11),
1625-1637 (1989)),
- • das
für die
Homoserin-Dehydrogenase codierende Gen hom (EP-A-0131171),
- • das
für die
Isopropylmalat-Dehydrogenase codierende Gen leuB (Pátek et
al., Applied Environmental Microbiology 50: 43-47 (1989)), Accession
No. Y09578),
- • das
für die
Isopropylmalat-Dehydratase codierende Gen leuC (Accession No. AX121536,
Sequenz Nr. 1452 aus Patent EP
1108790 , Accession No. AX063983, Sequenz Nr. 265 aus dem
Patent WO 0100843),
- • das
für die
Homoserin-Kinase codierende Gen thrB (Peoples, O. W., et al., Molecular
Microbiology 2: 63-72 (1988)) und
- • das
für die
Phosphofructokinase codierende Gen pfkB (SEQ ID No. 57 aus WO 01/00844),
abzuschwächen, insbesondere
die Expression davon zu verringern.
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Der
Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch
die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen
schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet,
das für
ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität codiert bzw.
das entsprechende Gen oder Enzym oder Protein inaktiviert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen
kombiniert.
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Durch
die Maßnahmen
der Abschwächung
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins
im Ausgangs-Mikroorganismus gesenkt.
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Die
Abschwächung
der Isopropylmalat-Dehydrogenase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche,
wie beispielsweise durch den Austausch von L-Glycin gegen L-Aspartat,
L-Asparagin oder L-Glutamat an Position 131 des Enzymproteins, erreicht
werden.
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Die
Abschwächung
der Isopropylmalat-Dehydratase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche,
wie beispielsweise durch den Austausch von L-Arginin gegen L-Serin
an Position 451 oder L-Glycin gegen L-Aspartat an Position 456 des
Enzymproteins oder einer Kombination hieraus, erreicht werden.
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Die
Abschwächung
der Homoserin-Dehydrogenase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche,
wie beispielsweise durch den Austausch von L-Asparagin gegen L-Threonin oder L-Serin
an Position 118 oder L-Leucin gegen L-Prolin an Position 160 des
Enzymproteins oder einer Kombination hieraus, erreicht werden.
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Die
Abschwächung
der Phosphofructokinase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche,
wie beispielsweise durch den Austausch von L-Leucin gegen L-Alanin,
L-Glycin oder L-Prolin an Position 109 des Enzymproteins, erreicht
werden.
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Die
erfindungsgemäß hergestellten
Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich
oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder
im fed batch- (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch-Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
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Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch "Manual of
Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
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Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl
und Kokosfett, Fettsäuren,
wie zum Beispiel Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole, wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol, und organische
Säuren,
wie zum Beispiel Essigsäure,
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Stickstoffquelle können
organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muß weiterhin
Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder
Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur können
basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure in
geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt
werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika,
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft, in
die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20 °C
bis 45 °C
und vorzugsweise bei 25 °C
bis 40 °C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes
gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden
bis 160 Stunden erreicht.
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Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel
so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung
erfolgen, oder sie kann durch Umkehrphasen-HPLC erfolgen, so wie
bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)
beschrieben.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.
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Die
Konzentration von L-Lysin kann gegebenenfalls durch den Zusatz von
L-Lysin auf den gewünschten
Wert eingestellt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
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Beispiel 1
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Amplifikation und Sequenzierung
der DNA des sigA-Allels von Stamm DM1547
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Der
Stamm Corynebacterium glutamicum DM1547 wurde durch mehrfache, ungerichtete
Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl aus C. glutamicum ATCC13032
hergestellt. Der Stamm ist resistent gegen das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-L-cystein
sowie methioninsensitiv.
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Aus
dem Stamm DM1547 wird mit den üblichen
Methoden (Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale
DNA isoliert. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wird ein DNA-Abschnitt
amplifiziert, welcher das sigA-Gen bzw. Allel trägt. Aufgrund der für C. glutamicum
bekannten Sequenz des sigA-Gens (Sequenz Nr. 2100 und Sequenz Nr.
7065 aus
EP1108790 )
werden folgende Primer-Oligonukleotide für die PCR ausgewählt:
sigA-1
(SEQ ID No. 8)
5' tgatcggctgaccaactcta
3'
sigA-2 (SEQ
ID No. 9)
5' aaggtctcgaatccgagaac
3'
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Die
dargestellten Primer werden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg,
Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von
Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990,
Academic Press) die PCR-Reaktion durchgeführt. Die Primer ermöglichen
die Amplifikation eines ca. 1,89 kb langen DNA-Abschnittes, welcher
das sigA-Allel trägt.
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Das
amplifizierte DNA-Fragment von ca. 1,89 kb Länge, welches das sigA-Allel
des Stammes DM1547 trägt,
wird durch Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel identifiziert,
aus dem Gel isoliert und mit den üblichen Methoden aufgereinigt
(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).
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Die
Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragmentes bzw. PCR-Produktes
wird von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) durch Sequenzierung
ermittelt. Die Sequenz des PCR-Produktes ist in der SEQ ID No. 5
dargestellt. Die Sequenz des codierenden Bereichs ist nochmals in
SEQ ID No. 3 abgebildet. Die sich mit Hilfe des Programmes Patentin
ergebenden Aminosäuresequenzen
des dazugehörigen Sigma-Faktor-A-Proteins
sind in SEQ ID No. 6 und 4 dargestellt.
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An
Position 1241 der Nukleotidsequenz des codierenden Bereichs des
sigA-Allels von Stamm DM1547, also an Position 1466 der in SEQ ID
No. 5 dargestellten Nukleotidsequenz, befindet sich die Base Thymin.
An der entsprechenden Position des Wildtyp-Gens befindet sich die
Base Cytosin (SEQ ID No. 1).
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An
Position 414 der Aminosäuresequenz
des Sigma-Faktors A von Stamm DM1547 befindet sich die Aminosäure Valin
(SEQ ID No. 6 und 4). An der entsprechenden Position des Wildtyp-Proteins
befindet sich die Aminosäure
Alanin (SEQ ID No. 2).
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Das
sigA-Allel, welches an Position 1241 des codierenden Bereichs die
Base Thymin enthält
und dementsprechend für
einen Sigma-Faktor A codiert, welcher an Position 414 der Aminosäuresequenz
die Aminosäure
Valin enthält,
wird im folgenden als sigA_A414V-Allel bezeichnet. Bei der Bezeichnung "sigA_A414V" steht A für L-Alanin,
V für L-Valin,
und 414 gibt die Position des Aminosäureaustausches an (siehe SEQ
ID No. 2 und 4).
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Beispiel 2
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Austausch des sigA-Wildtyp-Gens
von Stamm DSM5715 gegen das sigA_A414V-Allel
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2.1. Gewinnung eines den
Bereich des sigA_A414V-Allels, auf dem die Mutation A414V lokalisiert
ist, tragenden DNA-Fragments
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Aus
dem Stamm DM1547 wird mit den üblichen
Methoden (Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale
DNA isoliert. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion wird ein den
Bereich des sigA_A414V-Allels,
auf dem die Mutation A414V lokalisiert ist, tragender DNA-Abschnitt
amplifiziert. Aufgrund der für
C. glutamicum bekannten Sequenz des sigA-Gens (Sequenz Nr. 2100
und Sequenz Nr. 7065 aus EP-A-1108790) werden folgende Primer-Oligonukleotide
für die
PCR so ausgewählt,
daß die
Mutation A414V im zentralen Bereich des Amplifikationsprodukts lokalisiert
ist:
sigA_XL-A1 (SEQ ID No. 10)
5' ac gaa ttc-cga cgg cga tga ctt cgt
ag 3'
sigA_XL-A2
(SEQ ID No. 11):
5' tg
gaa ttc-cgt tcc acc tcg ctc cat tc 3'
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Die
dargestellten Primer werden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg,
Deutschland) synthetisiert, und die PCR-Reaktion wird nach der Standard-PCR-Methode
von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications,
1990, Academic Press) durchgeführt.
Die Primer ermöglichen
die Amplifikation eines ca. 1,69 kb langen DNA-Abschnittes, welcher
einen Bereich des sigA-A414V-Allels
trägt (SEQ
ID No. 7). Außerdem
enthalten die Primer die Sequenz für eine Schnittstelle der Restriktionsendonuklease
EcoRI, die in der oben dargestellten Nukleotidabfolge durch Unterstreichen
markiert ist.
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Das
amplifizierte DNA-Fragment von ca. 1,69 kb Länge, welches das sigA-Allel
des Stamms DM1547 trägt,
wird mit der Restriktionsendonuklease EcoRI gespalten, durch Elektrophorese
in einem 0,8%igen Agarosegel identifiziert und anschließend aus
dem Gel isoliert und mit den üblichen
Methoden aufgereinigt (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).
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2.2. Konstruktion des
Austauschvektors pK18mobsacB_sigA_A414V
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Das
ca. 1,68 kb lange, mit der Restriktionsendonuklease EcoRI gespaltene
DNA-Fragment, welches einen die Mutation A414V tragenden Bereich
des sigA_A414V-Allels enthält,
wird mittels Austauschmutagenese unter Zuhilfenahme des bei Schäfer et al.
(Gene, 14, 69-73 (1994)) beschriebenen sacB-Systems in das Chromosom
des C. glutamicum Stammes DSM5715 eingebaut. Dieses System ermöglicht die
Herstellung bzw. die Selektion von Allelaustauschen, die sich durch
homologe Rekombination vollziehen.
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Der
mobilisierbare Klonierungsvektor pK18mobsacB wird mit dem Restriktionsenzym
EcoRI verdaut und die Enden mit alkalischer Phosphatase (Alkaline
Phosphatase, Boehringer Mannheim, Deutschland) dephosphoryliert.
Der so vorbereitete Vektor wird mit dem ca. 1,68 kb sigA_A414V-Fragment
gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham-Pharmacia, Freiburg,
Deutschland) behandelt.
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Anschließend wird
der E. coli Stamm S17-1 (Simon et al., Bio/Technologie 1: 784-791,
1993) mit dem Ligationsansatz transformiert (Hanahan, In. DNA cloning.
A practical approach. Vol 1. ILR-Press, Cold Spring Harbor, New
York, 1989). Die Selektion der plasmidtragenden Zellen erfolgt durch
Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook
et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor,
New York, 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert wurde.
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Plasmid-DNA
wird aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep
Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktionsspaltung mit
dem Enzym BamHI und anschließender
Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Das
Plasmid wird pK18mobsacB_sigA_A414V genannt und ist in 1 dargestellt.
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2.3 Allelaustausch
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Der
in Beispiel 2.2 genannte Vektor pK18mobsacB_sigA_A414V wird nach
einer Vorschrift von Schäfer
et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) in den C.
glutamicum Stamm DSM5715 durch Konjugation transferiert. Der Vektor
kann in DSM5715 nicht selbständig
replizieren und verbleibt nur dann in der Zelle, wenn er als Folge
eines Rekombinationsereignisses im Chromosom integriert vorliegt.
Die Selektion von Transkonjuganten, d. h. von Klonen mit integriertem
pK18mobsacB_sigA_A414V, erfolgt durch Ausplattieren des Konjugationsansatzes
auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual.
2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989), der mit 15 mg/l Kanamycin
und 50 mg/l Nalidixinsäure
supplementiert wird. Kanamycin-resistente Transkonjuganten werden
auf LB-Agarplatten mit 25 mg/l Kanamycin ausgestrichen und für 24 Stunden
bei 33 °C
inkubiert. Zur Selektion von Mutanten, bei denen als Folge eines
zweiten Rekombinationsereignisses die Exzision des Plasmides stattgefunden
hat, werden die Klone 30 Stunden nichtselektiv in LB-Flüssigmedium
kultiviert, anschließend
auf LB-Agar mit 10% Saccharose ausgestrichen und 16 Stunden inkubiert.
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Das
Plasmid pK18mobsacB_sigA_A414V enthält ebenso wie das Ausgangsplasmid
pK18mobsacB neben dem Kanamycinresistenz-Gen eine Kopie des für die Levan-Sucrase
aus Bacillus subtilis codierenden sacB-Gens. Die durch Saccharose
induzierbare Expression führt
zur Bildung der Levan-Sucrase, die die Synthese des für C. glutamicum
toxischen Produktes Levan katalysiert. Auf LB-Agar mit Saccharose
wachsen daher nur solche Klone an, bei denen das integrierte pK18mobsacB_sigA_A414V
als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses exzisiert hat.
In Abhängigkeit
von der Lage des zweiten Rekombinationsereignisses in bezug auf
den Mutationsort findet bei der Exzision der Allelaustausch bzw.
der Einbau der Mutation statt, oder die ursprüngliche Kopie verbleibt im
Chromosom des Wirtes.
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Ungefähr 40 bis
50 Kolonien werden auf den Phänotyp "Wachstum in Gegenwart
von Saccharose" und "Nicht-Wachstum in Gegenwart
von Kanamycin" geprüft. Bei
4 Kolonien, die den Phänotyp "Wachstum in Gegenwart
von Saccharose" und "Nicht-Wachstum in
Gegenwart von Kanamycin" aufweisen,
wird ein die Mutation A414V überspannender
Bereich des sigA-Gens, ausgehend von dem Sequenzierprimer sA_1 (SEQ
ID No. 12), von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz, Deutschland)
sequenziert, um nachzuweisen, daß die Mutation des sigA_A414V-Allels
im Chromosom vorliegt. Der verwendete Primer sA_1 wird dazu von
der Firma GATC synthetisiert:
sA_1 (SEQ ID No. 12):
5' aag ttc tcc acc
tac gca ac 3'
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Auf
diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der an der Position 1241
des sigA-Gens die Base Thymin enthält und somit das sigA_A414V-Allel
besitzt. Dieser Klon wurde als Stamm DSM5715sigA_A414V bezeichnet.
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Beispiel 3
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Herstellung
von Lysin
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Der
in Beispiel 2 erhaltene Stamm C. glutamicum DSM5715sigA_A414V wird
in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der
Lysingehalt im Kulturüberstand
bestimmt.
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Dazu
wird der Stamm zunächst
auf einer Agarplatte 24 Stunden bei 33 °C inkubiert. Ausgehend von dieser
Agarplattenkultur wird eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im
100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wird das Medium
MM verwendet. Die Vorkultur wird 24 Stunden bei 33 °C und 240
UpM auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wird eine Hauptkultur angeimpft,
so daß die
Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD beträgt. Für die Hauptkultur wird ebenfalls
das Medium MM verwendet. Medium
MM
CSL | 5
g/l |
MOPS | 20
g/l |
Glucose
(getrennt autoklaviert) | 50
g/l |
Salze: | |
(NH4)2SO4 | 25
g/l |
KH2PO4 | 0,1
g/l |
MgSO4·7H2O | 1,0
g/l |
CaCl2·2H2O | 10
mg/l |
FeSO4·7H2O | 10
mg/l |
MnSO4·H2O | 5,0
mg/l |
Biotin
(sterilfiltriert) | 0,3
mg/l |
Thiamin·HCl (sterilfiltriert) | 0,2
mg/l |
L-Leucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
CaCO3 | 25
g/l |
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CSL
(Corn Steep Liquor), MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) und
die Salzlösung
werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert.
Anschließend
werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte
CaCO3 zugesetzt.
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Die
Kultivierung erfolgt in einem Volumen von 10 ml in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben
mit Schikanen. Die Kultivierung erfolgt bei 33 °C und 80% Luftfeuchte.
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Nach
72 Stunden wird die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek
1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete
Lysinmenge wird mit einem Aminosäureanalysator der
Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrindetektion bestimmt.
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In
Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.
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Kurzbeschreibung der Figur:
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1: Karte
des Plasmids pK18mobsacB_sigA_A414V
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Die
verwendeten Abkürzungen
und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung. Bei der Angabe der
Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen
der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
- Kan:
- Kanamycin Resistenz-Gen
- EcoRI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms EcoRI
- BamHI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms BamHI
- 'sigA:
- kloniertes DNA-Fragment
mit einem 3'-terminalen
Bereich des sigA-Allels (= sigA_A414V-Allel) und dem stromabwärts gelegenen
Bereich
- sacB:
- sacB-Gen
- RP4-mob:
- mob-Bereich mit dem
Replikationsursprung für
den Transfer (oriT)
- oriV:
- Replikationsursprung
V
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