DE60132341T2

DE60132341T2 - Isolierung und sequenzierung vom gen ptsi aus c. glutamicum

Info

Publication number: DE60132341T2
Application number: DE60132341T
Authority: DE
Inventors: Bettina Möckel; Stephan Hans; Natalie Schischka; Walter Pfefferle
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-09-13
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2021-09-01
Also published as: US20030198991A1; US6680187B2; WO2002022827A1; DE60132341D1; EP1317549A1; US20020132323A1; ATE383428T1; US7160703B2; AU2001289858A1; EP1317549B1; DE10045496A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind für das ptsI-Gen codierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen das endogene ptsI-Gen verstärkt wird.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung, Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht. EP-A-1-029 929 beschreibt eine Mutante von C. glutamicum, die ein am L-AS-Metabolismus beteiligtes Enzym überexprimiert, sowie deren Verwendung in der Biosynthese von L-AS.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren bereitzustellen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das ptsI-Gen codierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das oben genannte Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:

(i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
(ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
(iii) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
(iv) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).

Weitere Gegenstände sind
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;
ein Vektor, enthaltend das erfindungsgemäße Polynukleotid, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, und
coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das endogene ptsI-Gen verstärkt ist.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums, die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemäßen Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die für das Phosphotransferase System Enzyme I codieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der des ptsI-Gens aufweisen. Sie eignen sich auch für die Einarbeitung in so genannte "Arrays", "Mikroarrays" oder "DNA-Chips" für den Nachweis und die Bestimmung der entsprechenden Polynukleotide.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für das Phosphotransferase System Enzyme I codieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden. Auch Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden sind gegebenenfalls geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens insbesondere 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90% und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder einem daraus hergestellten Fragment.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität des Phosphotransferase System Enzyme I und auch solche ein, die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90% und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits Aminosäuren produzieren und in denen die für das ptsI-Gen codierenden Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch Verstärkungsmaßnahmen, insbesondere Überexprimierung, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, bis zu einem Maximum von 1000% oder 2000%, bezogen auf die des Wildtyp-Proteins oder die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus, erhöht.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme.
Das neue, für das Enzym Phosphotransferase System Enzyme I (EC 2.7.1.69) codierende ptsI-Gen von C. glutamicum wurde isoliert.
Zur Isolierung des ptsI-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in lambda-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255– 265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317–326) (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807–818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645–4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)) untersucht werden.
Die neue für das Gen ptsI codierende DNA-Sequenz von C. glutamicum wurde gefunden, die als SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des ptsI-Genproduktes dargestellt.
Codierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" ("sense mutations") bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255–260). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, daß die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C–68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C–68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration bis auf 0,1 × SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Überexpression des ptsI-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Aminosäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869 , im US Patent 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Zur Verstärkung wurde das erfindungsgemäße ptsI-Gen beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden überexprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554), pEKE × 1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 ( US-A 4,489,160 ) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119–124 (1990)) oder pAG1 ( US-A 5,158,891 ) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84; US-A 5,487,993 ), pCR^®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337–342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Weiterhin stellte sich heraus, daß die Aminosäureproduktion, insbesondere die Lysinproduktion, coryneformer Bakterien durch Aminosäureaustausche im Abschnitt zwischen Position 134 und 140 der Aminosäuresequenz von Enzym I des Phosphotransferase-Systems und/oder Aminosäureaustausche im Abschnitt zwischen Position 120 und 127 der Aminosäuresequenz von Enzym I des Phosphotransferase-Systems, dargestellt in SEQ ID No. 2, verbessert wird.
Vorzugsweise wird L-Lysin in Position 123 gegen alle anderen proteinogenen Aminosäuren mit Ausnahme von L-Lysin und/oder L-Arginin in Position 137 gegen alle anderen proteinogenen Aminosäuren mit Ausnahme von L-Arginin ausgetauscht.
In Position 123 ist ein Austausch gegen L-Glutaminsäure oder L-Asparaginsäure, insbesondere L-Glutaminsäure, bevorzugt. In Position 137 ist ein Austausch gegen L-Cystein bevorzugt.
Die Basensequenz des im Stamm DM1547 vorliegenden Allels ptsI-1547 ist in der SEQ ID No. 3 dargestellt. Das ptsI-1547-Allel codiert für ein Protein, dessen Aminosäuresequenz in der SEQ ID No. 4 dargestellt ist. Das Protein enthält L-Glutaminsäure in Position 123 und L-Cystein in Position 137. Die DNA-Sequenz des ptsI-1547-Allels (SEQ ID No. 3) enthält die Base Guanin anstelle der in Position 520 im ptsI-Wildtypgen (SEQ ID No. 1) vorliegenden Base Adenin und die Base Thymin anstelle der in Position 562 vorliegenden Base Cytosin.
Bei der Mutagenese können herkömmliche Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Substanzen, wie beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, oder von ultraviolettem Licht zum Einsatz kommen. Weiterhin können für die Mutagenese In-vitro-Methoden wie beispielsweise eine Behandlung mit Hydroxylamin (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) oder mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie sie im Handbuch von Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) beschrieben ist, verwendet werden.
Die entsprechenden Allele bzw. Mutationen werden sequenziert und in das Chromosom mit dem Verfahren des Genaustausches ("gene replacement"), wie es beispielsweise bei Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) für das pyc-Gen aus C. glutamicum, bei Schäfer et al. (Gene 145: 69–73 (1994)) für den hom-thrB-Genbereich aus C. glutamicum oder bei Schäfer et al. (Journal of Bacteriology 176: 7309–7319 (1994)) für den cgl-Genbereich aus C. glutamicum beschrieben ist, eingeführt. Die entsprechenden Allele oder die damit assoziierten Proteine lassen sich gegebenenfalls der Reihe nach verstärken.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, neben dem ptsI-Gen ein oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
So kann für die Herstellung von L-Aminosäuren zusätzlich zur Verstärkung des ptsI-Gens ein oder mehrere endogene Gene, ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Dihydrodipicolinat-Synthase codierende Gen dapA ( EP-B 0 197 335 ),
– das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase codierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
– das für die Triosephosphat-Isomerase codierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
– das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase codierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
– das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase codierende Gen zwf ( JP-A-09224661 ),
– das für die Pyruvat-Carboxylase codierende Gen pyc ( DE-A-198 31 609 ),
– das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase codierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
– das für eine feed back resistente Aspartatkinase codierende Gen lysC (Accession No. P26512; EP-B-0387527 ; EP-A-0699759 ),
– das für den Lysin-Export codierende Gen lysE ( DE-A-195 48 222 ),
– das für die Homoserin-Dehydrogenase codierende Gen hom ( EP-A 0131171 ),
– das für die Threonin-Dehydratase codierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065–8072)) oder das für eine "feed back resistente" Threonin-Dehydratase codierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833–842),
– das für die Acetohydroxysäure-Synthase codierende Gen ilvBN ( EP-B 0356739 ),
– das für die Dihydroxysäuredehydratase codierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973–1979),
– das für das Zwa1-Protein codierende Gen zwa1 ( DE 199 59 328.0 , DSM 13115),

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des ptsI-Gens ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende Gen pck ( DE 199 50 409.1 ; DSM 13047),
– das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase codierende Gen pgi ( US 09/396,478 ; DSM 12969),
– das für die Pyruvat-Oxidase codierende Gen poxB ( DE 199 51 975.7 ; DSM 13114),
– das für das Zwa2-Protein codierende Gen zwa2 ( DE 199 59 327.2 , DSM 13113)

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer geringen Aktivität codiert oder das entsprechende Gen bzw. Enzym (Protein) inaktiviert, und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus gesenkt.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren vorteilhaft sein, neben der Überexpression des ptsI- Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Innenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed Phase HPLC erfolgen, so wie z. B. bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben.
Eine Reinkultur des Stamms Corynebacterium glutamicum DM1547 wurde am 16. Januar 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 13994 dem Budapester Vertrag gemäß hinterlegt.
Eine Reinkultur des Stamms Escherichia coli DH5alphamcr/pEC-K18mob2ptsIexp (= DH5αmcr/pEC-K18mob2ptsIexp) wurde am 2. Mai 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 14278 dem Budapester Vertrag gemäß hinterlegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TV-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168–179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160–2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des ptsI-Gens
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., 87: 4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sauger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgten in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29:1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Codierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) angefertigt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 1707 Basenpaaren, welches als ptsI-Gen bezeichnet wurde. Das ptsI-Gen codiert für ein Protein von 568 Aminosäuren.
Der stromaufwärts zur SEQ ID No. 1 liegende DNA-Abschnitt wurde auf die gleiche Weise identifiziert und ist in der SEQ ID No. 5 dargestellt. Der um die SEQ ID No. 5 verlängerte Bereich des ptsI-Gens ist in der SEQ ID No. 6 dargestellt.
Beispiel 3
Herstellung eines Shuttlevektors pEC-K18mob2ptsIexp zur Verstärkung des ptsI-Gens in C. glutamicum
3.1 Klonierung des ptsI-Gens in den Vektor pCR^®Blunt II
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde chromosomale DNA nach dem Verfahren von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert. Anhand der Sequenz des für C. glutamicum bekannten ptsI-Gens aus Beispiel 2 wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion gewählt (siehe auch SEQ ID No. 8 und SEQ ID No. 9): pstI2exp1:
pstI2exp2:
Die gezeigten Primer wurden von ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert, und die PCR-Reaktion wurde nach dem PCR-Standardverfahren von Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase von Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion gestatten die Primer die Amplifikation eines DNA-Fragments mit einer Größe von 2121 bp, das das ptsI-Gen mit dem potentiellen Promotorbereich trägt. Die DNA-Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments wurde durch Sequenzieren überprüft.
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem Zero Blunt^WZ Kit von Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalognummer K2700-20) in den Vektor pCR^®Blunt II (Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)) ligiert.
Der E. coli Stamm TOP10 wurde dann mit dem Ligationsansatz elektroporiert (Hanahan, in: DNA cloning. A Practical Approach, Band I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Die Selektion auf plasmidtragende Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf mit 25 mg/l Kanamycin supplementiertem LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989). Plasmid-DNA wurde aus einem Transformanten mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und darauffolgende Agarosegelelektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCRB1-ptsIexp genannt.
3.2 Herstellung des E. coli-C. glutamicum-Shuttlevektors pEC-K18mob2
Der E. coli-C. glutamicum-Shuttlevektor wurde dem Stand der Technik gemäß hergestellt. Der Vektor enthält den Replikationsbereich rep des Plasmids pGA1, einschließlich des Replikationseffektors per ( US-A-5,175,108 ; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525–1532 (1997)), des Kanamycinresistenz-verleihenden aph(3')-IIa-Gens des Transposons Tn5 (Geck et al., Gene 19, 327–336 (1982)), des Replikationsbereichs oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium an Quantitative Biology 43, 77–90, (1979)), des lacZα-Genfragments, das den lac-Promotor und eine multiple Klonierungsstelle (mcs) enthält (Norrander, J. M. et al., Gene 26, 101–106 (1983)), sowie des mob-Bereichs des Plasmids RP4 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784–791 (1983)).
Der konstruierte Vektor pEC-K18mob2 wurde in C. glutamicum DSM5715 mittels Elektroporation (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303) übertragen. Die Auswahl der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, der 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionsboullion, 0,5 M Sorbit, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar enthielt und mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation wurde 2 Tage lang bei 33°C durchgeführt.
Plasmid-DNA wurde aus einem Transformanten mit herkömmlichen Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915–927) isoliert, mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII gespalten, und das Plasmid wurde mittels anschließender Agarosegelelektrophorese überprüft.
Die so erhaltene Plasmidkonstruktion wurde pEC-K18mob2 genannt und ist in 1 dargestellt. Der durch Elektroporation des Plasmids pEC-K18mob2 in dem Stamm C. glutamicum DSM5715 erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-K18mob2 genannt und am 20. Januar 2000 als DSM13245 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) dem Budapester Vertrag gemäß hinterlegt.
3.3 Klonierung von ptsI in dem E. coli-C. glutamicum-Shuttlevektor pEC-K18mob2
Für die Klonierung des ptsI-Gens in dem in Beispiel 3.2 beschriebenen E. coli-C. glutamicum-Shuttlevektor pEC-K18mob2 wurde Plasmid-DNA von pEC-K18mob2 vollständig mit der Restriktionsendonuklease EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase (Alkalische Phosphatase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) behandelt.
Der Vektor pCRB1-ptsIexp wurde aus Escherichia coli Top10 isoliert und vollständig mit der Restriktionsendonuklease EcoRI gespalten, und das Fragment mit einer Größe von etwa 2140 bp mit dem ptsI-Gen wurde aus einem 0,8%igen Agarosegel (QIAquick Gelextraktionskit der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgereinigt. Das Fragment mit dem ptsI-Gen wurde anschließend mit dem Vektor pEC-K18mob2 ligiert (T4-Ligase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland). Der Ligationsansatz wurde in den E. coli-Stamm DH5αmcr transformiert (Hanahan, in: DNA cloning. A Practical Approach, Band I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). Die Selektion auf plasmidtragende Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf mit 25 mg/l Kanamycin supplementiertem LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989). Plasmid-DNA wurde aus einem Transformanten mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits von Qiagen (Hilden, Deutschland) isoliert und durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym PstI mit anschließender Agarosegelelektrophorese überprüft. Das Plasmid wurde pEC-K18mob2ptsIexp genannt und ist in 2 dargestellt.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Karte des Plasmids pEC-K18mob2
2: Karte des Plasmids pEC-K18mob2ptsIexp
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:

Kan:: Resistenzgen für Kanamycin
per:: Gen für die Kontrolle der Kopienzahl aus pGA1
oriV:: Co1E1-ähnlicher Ursprung aus pMB1
rep:: Plasmidcodierter Replikationsbereich aus dem C. glutamicum-Plasmid pGA1
RP4mob:: RP4-Mobilisationsstelle
ptsI:: ptsI-Gen aus C. glutamicum
EcoRI:: Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII:: Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms HindIII
PstI:: Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms PstI

Claims

Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das ptsI-Gen codierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe a) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, und b) Polynukleotid, das komplementär ist zu dem Polynukleotid von a), wobei das Polypeptid die Aktivität des Phosphotransferase System Enzyme I aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, bei dem das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, rekombinante DNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, bei dem das Polynukleotid eine RNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 2, enthaltend die Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt.
DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend die Nukleinsäuresequenz der Nukleotide 154 bis 1857 von SEQ ID No. 1.
Coryneforme Bakterien, in denen die Expression des ptsI-Gens verstärkt ist, wobei das ptsI-Gen die Polynukleotide gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 enthält.
Corynebacterium glutamicum DSM5715/pEC-K18mob2, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig als DSM 13245.
Escherichia coli des Stammes DH5alphamcr/pEC-K18mob2ptsIexp (= DH5αmcr/pEC-K18mob2ptsIexp), hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig als DSM 14278.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt: a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, wobei man i) ein Polynukleotid, das zu mindestens 90% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, oder ii) ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 90% identisch ist mit der in SEQ ID No. 2 dargestellten Aminosäuresequenz, oder iii) ein Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von i) oder ii), rekombinant überexprimiert und wobei das Polypeptid die Aktivität des Phosphotransferase System Enzyme I aufweist, b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien sowie c) Isolieren der L-Aminosäure.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Aminosäure L-Lysin herstellt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt, wobei der Plasmidvektor die für das ptsI-Gen codierende Nukleotidsequenz trägt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Überexpression die Kopienzahl des genannten Polynukleotids bzw. der genannten Polynukleotide erhöht.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Steigerung der Expression des Polynukleotids bzw. der Polynukleotide das besagte Polynukleotid mit einem starken Promotor verbindet.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des L-Lysins coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe 14.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase codierende Gen dapA, 14.2 das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase codierende Gen zwf, 14.3 das für die Pyruvat-Carboxylase codierende Gen pyc, 14.4 das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase codierende Gen mqo, 14.5 das für eine feed back resistente Aspartkinase codierende Gen lysC, 14.6 das für den Lysin-Export codierende Gen lysE, überexprimiert.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des L-Lysins coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe 15.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende Gen pck, 15.2 das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase codierende Gen pgi, 15.3 das für die Pyruvat-Oxidase codierende Gen poxB, 15.4 das für das Zwa2-Protein codierende Gen zwa2, abschwächt.
Coryneforme Bakterien oder Escherichia coli, die einen Vektor enthalten, der ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 trägt.
Verfahren nach den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das Corynebacterium glutamicum des mit dem Plasmid pEC-K18mob2ptsIexp des Stamms DH5alphamcr/pEC-K18mob2ptsIexp transformierten Stamms einsetzt, wobei der genannte Stamm als DSM 14278 hinterlegt ist.
DNA aus coryneformen Bakterien codierend für Phosphotransferase System Enzyme I, gemäß SEQ ID No 4.
DNA nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleobase Guanin bei Position 520 und die Nukleobase Thymin bei Position 562 gemäß SEQ ID No. 3 enthält.
Coryneforme Bakterien, enthaltend eine DNA gemäß den Ansprüchen 19 bis 20.
Vektor, enthaltend eine der DNA der Ansprüche 19 bis 20.
Vektor, enthaltend eines der isolierten Polynukleotide der Ansprüche 1 bis 5.