DE60113441T2

DE60113441T2 - Sahh (s-adenosyl homocysteinase) kodierende nukleotidsequenzen

Info

Publication number: DE60113441T2
Application number: DE60113441T
Authority: DE
Inventors: Mike Farwick; Klaus Huthmacher; Jennifer Brehme; Walter Pfefferle; Michael Binder; Dieter Greissinger; Georg Thierbach
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-09-09
Filing date: 2001-07-17
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2021-07-18
Also published as: DE60113441D1; DE10109685A1; EP1507008A2; EP1507008A3

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen das sahH-Gen verstärkt wird.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Methionin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung, Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren bereitzustellen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Werden im Folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt sind L-Lysin und L-Methionin.
Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Werden im Folgenden L-Methionin oder Methionin erwähnt, sind damit auch die Salze wie z. B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat gemeint.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung coryneformer Bakterien, die insbesondere bereits Aminosäuren produzieren und in denen die für das sahH-Gen codierenden Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die für die Adenosylhomocysteinase codieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der des sahH-Gens aufweisen.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für die Adenosylhomocysteinase codieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide, enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder eines daraus hergestellten Fragments.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Adenosylhomocysteinase und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf den Ausgangs-Mikroorganismus, erhöht.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme.
Zur Isolierung des sahH-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255–265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317–326, (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807–818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645–4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)) untersucht werden.
Die neue für das Gen sahH codierende DNA-Sequenz von C. glutamicum, die als SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist, wurde gefunden. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des sahH-Genproduktes dargestellt.
Codierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" ("sense mutations") bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255–260). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C–68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C–68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1 × SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalog-Nr. 1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Überexpression des sahH-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Aminosäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869, im US-Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Zur Verstärkung wurde das erfindungsgemäße sahH-Gen beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden überexprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pH52-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119–124 (1990)), oder pAGl (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pKl8mob oder pKl9mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84; US-A 5,487,993), pCR^®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)), pEMl (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337–342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, neben dem sahH-Gen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
So kann für die Herstellung von L-Aminosäuren zusätzlich zur Verstärkung des sahH-Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Dihydrodipicolinat-Synthase codierende Gen dapA (EP-B 0 197 335)
• das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase codierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• das für die Triosephosphat-Isomerase codierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase codierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase codierende Gen zwf (JP-A-09224661),
• das für die Pyruvat-Carboxylase codierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),
• das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase codierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
• das für eine feedback-resistente Aspartatkinase codierende Gen lysC (Accession No. P26512),
• das für den Lysin-Export codierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
• das für die Homoserin-Dehydrogenase codierende Gen hom (EP-A 0131171),
• das für die Threonin-Dehydratase codierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065–8072)) oder das für eine "feedback-resistente" Threonin-Dehydratase codierende Allel i1vA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 83.3–842),
• das für die Acetohydroxysäure-Synthase codierende Gen i1vBN (EP-B 0356739),
• das für die Dihydroxysäuredehydratase codierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973–1979),
• das für das Zwa1-Protein codierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115), verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des sahH-Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende Gen pck ( DE 199 50 409.1 DSM 13047),
• das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase codierende Gen pgi (US 09/396,478; DSM 12969),
• das für die Pyruvat-Oxidase codierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7; DSM 13114),
• das für das Zwa2-Protein codierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität codiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins reduziert.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren vorteilhaft sein, neben der Überexpression des sahH-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der. Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Schwefelquelle, insbesondere für die Herstellung von Methionin, können organische und anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfide, Sulfite, Sulfate und Thiosulfate verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die so erhaltenen, insbesondere L-Methionin enthaltenden Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-% und enthalten L-Methionin. Vorteilhaft ist ausserdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf ≥ 0 bis 3 g/l abgesenkt wird.
Die in dieser Weise hergestellte, insbesondere L-Methionin haltige, Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z. B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Anschließend wird diese mit bekannten Methoden wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration eingedickt beziehungsweise konzentriert. Diese auf konzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise rieselfähigen, feinteiligen Pulver aufgearbeitet werden.
Dieses rieselfähige, feinteilige Pulver kann dann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.
Unter "rieselfähig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden grossen Auslauföffnungen aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein, Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
Wie hier beschrieben, ist mit "feinteilig", ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50%) einer Korngröße von 20 bis 200 μm Durchmesser gemeint. Mit "grobkörnig" sind Produkte mit überwiegendem Anteil (> 50%) einer Korngröße von 200 bis 2000 μm Durchmesser gemeint. In diesem Sinne, bedeutet "staubfrei", dass das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5%) an Körngrößen unter 20 μm Durchmesser enthält. Die Korngrößenbestimmung kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur "Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch "Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben.
"Lagerbar", im Sinne dieser Erfindung, bedeutet ein Produkt, das bis zu 120 Tagen, bevorzugt bis 52 Wochen, besonders bevorzugt 60 Monate gelagert werden kann ohne das ein wesentlicher Verlust (< 5%) an Methionin auftritt.
Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Schließlich kann das Produkt durch Beschichtungsverfahren ("Coating") mit Filmbildnern, wie beispielsweise Metallcarbonaten, Kieselsäuren, Silikaten, Alginaten, Stearaten, Stärken, Gummis und Celluloseethern, wie in der DE-C-41 00 920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen, insbesondere dem Magen von Wiederkäuern ist.
Wird die Biomasse während des Verfahrens abgetrennt, werden im allgemeinen weitere, zum Beispiel während der Fermentation zugesetzte anorganische Feststoffe entfernt. Daneben enthält der erfindungsgemäße Tierfuttermittelzusatz zumindest den überwiegenden Teil der in der Fermentationsbrühe gelöst vorliegenden, weiteren gebildeten oder zugesetzten, insbesondere organische Stoffe, soweit sie nicht durch geeignete Verfahren abgetrennt wurden.
In einem Aspekt der Erfindung kann die Biomasse bis zu 70%, bevorzugt bis zu 80%, bevorzugt bis zu 90%, bevorzugt bis zu 95%, und besonders bevorzugt bis zu 100% abgetrennt werden. In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden bis zu 20% der Biomasse, bevorzugt bis zu 15%, bevorzugt bis zu 10%, bevorzugt bis zu 5%, besonders bevorzugt keine Biomasse abgetrennt.
Zu diesen organischen Stoffen gehören organische Nebenprodukte, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen. gegebenenfalls neben dem L-Methionin erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Dazu zählen L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Lysin, L-Valin, L-Threonin, L-Alanin oder L-Tryptophan. Dazu zählen Vitamine ausgewählt aus der Gruppe Vitamin B1 (Thiamin), Vitamin B2 (Riboflavin), Vitamin B5 (Pantothensäure), Vitamin B6 (Pyridoxin), Vitamin B12 (Cyanocobalamin), Nicotinsäure/Nicotinsäureamid und Vitamin E (Tocopherol). Dazu gehören weiterhin organische Säuren, die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure oder Fumarsäure. Schließlich gehören dazu auch Zucker, wie zum Beispiel Trehalose. Diese Verbindungen sind gegebenenfalls erwünscht, wenn sie den Nährwert des Produktes verbessern.
Diese organischen Stoffe einschließlich des L-Methionins und/oder D-Methionins und/oder des racemischen Gemisches D,L-Methionin können auch je nach Anforderung während eines geeigneten Verfahrensschrittes als Konzentrat oder Reinsubstanz in fester oder flüssiger Form hinzugefügt werden. Diese genannten organischen Stoffe können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder auf konzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden. Es ist gleichfalls möglich, einen organischen Stoff oder eine Mischung mehrerer organischer Stoffe zur Fermentationsbrühe und einen weiteren organischen Stoff oder eine weitere Mischung mehrerer organischer Stoffe bei einem späteren Verfahrensschritt, beispielsweise der Granulation, hinzuzufügen.
Das oben beschriebene Produkt ist als Futtermittelzusatz, d. h. Futterzusatz, für die Tierernährung geeignet.
Der L-Methionin-Gehalt des Tierfuttermittelzusatzes beträgt üblicherweise 1 Gew.-% bis 80 Gew.-%, bevorzugt 2 Gew.-% bis 80 Gew.-%, besonders bevorzugt 4 Gew.-% bis 80 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 8 Gew.-% bis 80 Gew-%, bezogen auf die Trockenmasse des Tierfuttermittelzusatzes. Gehalte von 1 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 2 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 4 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 6 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 1 Gew.-% bis 40 Gew.-%, 2 Gew.-% bis 40 Gew.-% oder 4 Gew.-% bis 40 Gew.-% sind gleichfalls möglich. Der Wassergehalt des Futtermittelzusatzes beträgt üblicherweise bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 2 Gew.-%.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines L-Methionin-haltigen Tierfuttermittelzusatzes aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

a) Kultivierung und Fermentation eines L-Methionin produzierenden Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium;
b) Entfernung von Wasser aus der L-Methionin-haltigen Fermentationsbrühe (Aufkonzentration);
c) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-%; und
d) Trocknung der gemäß a) und/oder b) erhaltenen Fermentationsbrühe, um den Tierfuttermittelzusatz in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten.

Wenn erwünscht, können in dem erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin einer oder mehrere der folgenden Schritte durchgeführt werden:

e) Zusatz von einem oder mehreren der organischen Stoffe, einschließlich L-Methionin und/oder D-Methionin und/oder des racemischen Gemisches D,L-Methionin, zu den gemäß a), b) und/oder c) erhaltenen Produkten;
f) Zugabe von Hilfstoffen, ausgewählt aus der Gruppe Kieselsäuren, Silikate, Stearate, Schrot und Kleie, zu den nach a) bis d) erhaltenen Stoffen zur Stabilisierung und Erhöhung der Lagerfähigkeit; oder
g) Überführung der nach a) bis e) erhaltenen Stoffe in eine gegenüber einem Tiermagen, insbesondere Pansen, stabile Form durch Beschichtung ("Coating") mit Filmbildnern.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch Reversed-phase-HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Der folgende Mikroorganismus wurde als Reinkultur am 18. Mai 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt: Escherichia coli DH5amcr/pEC-XK99sahHalex als DSM 14316.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach dem Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168–179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913–02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase aus Shrimp (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160–2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit alkalischer Phosphatase aus Shrimp dephosphoryliert.
Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des sahH-Gens
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase aus Shrimp (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-I, bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr.
403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29: 1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Rohsequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231), Version 97–0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu. einem zusammenhängenden Contig zusammengestellt. Die computergestützte Codierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) angefertigt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 1497 Basenpaaren, welches als sahH-Gen bezeichnet wurde. Das sahH-Gen codiert für ein Protein von 498 Aminosäuren.
Beispiel 3
Herstellung eines Shuttle-Expressionsvektors pEC-XK99EsahHex zur Verstärkung des sahH-Gens in C. glutamicum
Klonierung des sahH-Gens
Aus dem Stamm ATCC 13032 wird nach dem Verfahren von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Auf Grundlage der Sequenz des für C. glutamicum bekannten sahH-Gens aus Beispiel 2 wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion gewählt (siehe SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4):
sahHex1:
5' gt ggt acc-ttc ggt gtc cac tcc aac at 3'
sahHex2:
5' ca tct aga-tag gcg ctg tcg gtg agg tc 3'
Die gezeigten Primer wurden von der Firma MWG-Biotech AG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert, und die PCR-Reaktion wurde nach dem Standard-PCR-Verfahren von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Pwo-Polymerase von Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion gestatten die Primer die Amplifikation eines ca. 1,7 kb großen DNA-Fragments, das das sahH-Gen trägt. Weiterhin enthält der Primer sahHexl die Sequenz für die Schnittstelle der Restriktionsendonuklease KpnI und der Primer sahHex2 die Schnittstelle der Restriktionsendonuklease XbaI, die jeweils zur Kennzeichnung in der oben gezeigten Nukleotidsequenz unterstrichen sind.
Das ca. 1,7 kb große sahH-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und XbaI geschnitten und danach aus dem Agarosegel mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
Konstruktion des Shuttle-Vektors pEC-XK99E
Der E. coli/C. glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-XK99E wurde nach dem Stand der Technik konstruiert. Der Vektor enthält den Replikationsbereich rep des Plasmids pGAI, einschließlich des Replikationseffektors per (US-A- 5.175.108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525–1532 (1997)), das Kanamycinresistenz-Gen aph(3')-IIa aus Escherichia coli (Beck et al., (1982), Gene 19: 327–336), den Replikationsursprung des trc- Promotors, die Terminationsbereiche T1 und T2, das lacI^q-Gen (Repressor des lac-Operons von E. coli) sowie eine Mehrfachklonierungsstelle (mcs) (Norrander, J.M. et al., Gene 26, 101–106 (1983)) des Plasmids pTRC99A (Amann et al., (1988), Gene 69: 301–315).
Der konstruierte E. coli/C. glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-XK99E wurde mittels Elektroporation (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303) in C. glutamicum DSM5715 überführt. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar mit 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionsbrühe, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von 2 Tagen bei 33°C.
Plasmid-DNA wurde mit herkömmlichen Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915–927) aus einem Transformanten isoliert und mit der Restriktionsendonuklease HindIII geschnitten, und das Plasmid wurde durch anschließende Agarosegelelektrophorese überprüft.
Das auf diese Weise erhaltene Plasmidkonstrukt wurde mit pECXK99E bezeichnet (1). Der durch Elektroporation des Plasmids pEC-XK99E in den C. glutamicum-Stamm DSM5715 erhaltene Stamm wurde mit DSM5715/pEC-XK99E bezeichnet und als DSM13455 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Klonierung von sahH in den E. coli/C. glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-XK99E
Als Vektor wurde der in Beispiel 3.2 beschriebene E. coli/C. glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-XK99E verwendet. DNA dieses Plasmids wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI vollständig geschnitten und anschließend mit alkalischer Phosphatase aus Shrimp (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert.
Das in Beispiel 3.1 beschriebene, mittels PCR gewonnene und mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und XbaI restriktionsverdaute 1,7 kb große sahH-Fragment wurde mit dem Vektor pEC-XK99E gemischt, und der Ansatz wurde mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli-Stamm DH5amcr transformiert (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Bd. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). Die Selektion plasmidtragender Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformaionsansatzes auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 50 mg/l Kanamycin. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert. Plasmid-DNA wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß Herstellerangaben aus einem Transformanten isoliert und mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI geschnitten, um das Plasmid durch anschließende Agarosegelelektrophorese zu überprüfen. Das erhaltene Plasmid wurde mit pEC-XK99EsahHalex bezeichnet und ist in 2 dargestellt.
Beispiel 4
Transformation des Stamms DSM5715 mit dem Plasmid pEC-XK99EsahHalex
Der Stamm DSM5715 wurde mit dem Plasmid pEC-XK99EsahHalex unter Verwendung des von Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsverfahrens transformiert.
Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar mit 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionsbrühe, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von 2 Tagen bei 33°C.
Plasmid-DNA wurde mit herkömmlichen Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915–927) aus einem Transformanten isoliert und mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und XbaI geschnitten, und das Plasmid wurde durch anschließende Agarosegelelektrophorese überprüft. Der erhaltene Stamm wurde mit DSM5715/pEC-XK99EsahHexl bezeichnet.
Beispiel 5
Herstellung von Lysin
Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum-Stamm DSM5715/pEC-XK99EsahHalex wurde in einem für die Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Hierzu wurde der Stamm zunächst 24 Stunden bei 33°C auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/l)) inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium in einem 100-ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet.
Medium Cg III
Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 eingestellt.
Hierzu wurde Kanamycin (25 mg/l) hinzugefügt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C und 240 UpM auf einem Schüttelgerät inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so daß der Ausgangswert der OD (660 nm) der Hauptkultur bei 0,1 lag. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet. Medium MM
CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 gebracht und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen ebenso wie das in trockenem Zustand autoklavierte CaCO₃ zugegeben.
Die Kultivierung wird in einem Volumen von 10 ml in einem 100-ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen durchgeführt. Nach Zugabe von Kanamycin (25 mg/l) wurde die Kultivierung bei 33°C und einer Luftfeuchtigkeit von 80% durchgeführt.
Nach 48 Stunden wurde der OD-Wert bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge an gebildetem Lysin wurde mit einem Aminosäureanalysegerät der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) mittels Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
Das Ergebnis des Experiments ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Karte des Plasmids pEC-XK99E.
2: Karte des Plasmids pEC-XK99EsahHalex.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung:
Kan: Kanamycinresistenz-Gen aph(3')-IIa aus Escherichia coli
HindIII Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
XbaI Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
KpnI Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
Ptrc trc-Promotor
T1 Terminationsbereich T1
T2 Terminationsbereich T2
per Replikationseffektor per
rep Replikationsbereich rep des Plasmids pGA1
lacIq lacIq-Repressor des lac-Operons von Escherichia coli
sahH Kloniertes sahH-Gen
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Escherichia-coli-Stamm DH5amcr/pEC-XK99sahHalex, hinterlegt unter DSM 14316 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: a) Fermentation der coryneformen Bakterien, die die gewünschte L-Aminosäure produzieren und in denen wenigstens das sahH-Gen, umfassend eine für ein Enzym, das mindestens zu 90% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 identisch ist und bei dem es sich um ein Adenosylhomocysteinase-Enzym handelt, codierende Nukleinsäuresequenz, oder dafür codierende Nukleotidsequenzen überexprimiert werden; b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und c) Isolierung der L-Aminosäure.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz der Nukleotide 227 bis 1720 der SEQ ID NO: 1 aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei ein mit einem Plasmidvektor transformierter Stamm eingesetzt wird und der Plasmidvektor die für das sahH-Gen codierende Nukleotidsequenz trägt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Expression des bzw. der für das sahH-Gen codierenden Polynukleotids bzw. Polynukleotide überexprimiert wird, so daß die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Enzyms um mindestens 10% erhöht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei coryneforme Bakterien fermentiert werden, in denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: dem für Dihydrodipicolinat-Synthase codierenden Gen dapA, dem für Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen gap, dem für Triosephosphat-Isomerase codierenden Gen tpi, dem für 3-Phosphoglycerat-Kinase codierenden Gen pgk, dem für Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen zwf, dem für Pyruvat-Carboxylase codierenden Gen pyc, dem für Malat-Chinon-Oxidoreduktase codierenden Gen mqo, dem für eine Feedback-resistente Aspartatkinase codierenden Gen lysC, dem für das Protein für Lysin-Export codierenden Gen lysE und dem für das Protein Zwa1 codierenden Gen zwa1, überexprimiert wird oder werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Bakterien fermentiert werden, in denen gleichzeitg eines oder mehrere der Gene, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: dem für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierenden Gen pck, dem für Glucose-6-phosphat-Isomerase codierenden Gen pgi, dem für Pyruvatoxidase codierenden Gen poxB, dem für das Protein Zwa2 codierenden Gen zwa2, ausgeschaltet ist oder sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 8, wobei Mikroorganismen der Spezies Corynebacterium glutamicum eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Stamm DSM5715/pEC-XK99EsahHalex eingesetzt wird.