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Gebiet der Erfindung
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Gegenstand
der Erfindung sind für
das ppsA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien
und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter
Verwendung von Bakterien, in denen das ppsA-Gen überexprimiert wird.
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Stand der Technik
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L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen
Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung
Anwendung.
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Es
ist bekannt, dass Aminosäuren
durch Fermentation von Stämmen
coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum,
hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung wird ständig an
der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet.
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Verfahrensverbesserungen
können
fermentationstechnische Massnahmen wie zum Beispiel Rührung und
Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien
wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie
oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus
selbst betreffen.
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Zur
Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden
Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet.
Auf diese Weise erhält
man Stämme,
die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch
bedeutsame Metabolite sind und Aminosäuren produzieren.
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Seit
einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik
zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden
Stämmen
von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert
und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
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Molecular
and General Genetics, 1992, Bd. 231, Seite 332–336 (Niersbach et al.) offenbart
die Klonierung und Sequenzierung des E. coli K-12 ppsA-Gens, das
für eine
Phosphoenolpyruvat-Synthase kodiert. Die angegebene Sequenz unterscheidet
sich jedoch von der Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und
es wird auch kein Hinweis auf eine mögliche Verwendung in der Lysinproduktion
gegeben.
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EP 0877090 offenbart die
Verwendung des E. coli Phosphoenolpyruvat-Synthase-Gens zur Verstärkung der
Aminosäureproduktion
in Corynebacterium. Es wird hier jedoch kein Hinweis darauf gegeben,
daß eine Überexpression
von Phosphoenolpyruvat-Synthase zu einer Erhöhung der Lysinproduktion führen könnte.
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Aufgabe der Erfindung
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Die
Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Massnahmen zur verbesserten
fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
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Kurzbeschreibung
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Wenn
im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht
nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid
oder Lysin-Sulfat gemeint.
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Gegenstand
der Beschreibung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen
Bakterien, enthaltend eine für
das ppsA-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens
zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid
kodiert, das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden
von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),
wobei
das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Phosphoenolpyruvat-Synthase
aufweist.
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Gegenstand
der Beschreibung ist ebenfalls das oben genannte Polynukleotid,
wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- (i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID
No. 1, oder
- (ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb
des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht,
oder
- (iii) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder
(ii) komplementären
Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- (iv) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
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Gegenstände der
Erfindung sind
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere
DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein
Vektor, enthaltend das erfindungsgemässe Polynukleotid, insbesondere
Pendelvektor oder Plasmidvektor, und
coryneforme Bakterien,
die den Vektor enthalten oder in denen das ppsA-Gen überexprimiert
ist.
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Gegenstand
der Beschreibung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen
aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening
mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen
Bakteriums, die das vollständige
Gen oder Teile davon enthält,
mit einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemässen Polynukleotids
gemäss
SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten
Polynukleotidsequenz.
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Ausführliche Beschreibung
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Polynukleotide,
die die Sequenzen gemäss
der Beschreibung enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA
und DNA geeignet, um Nukleinsäuren
beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren,
die für
die Phosphoenolpyruvat-Synthase
kodieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide
oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit
der des ppsA-Gens
aufweisen. Sie eignen sich auch zur Inkorporierung in sogenannte ”Arrays”, ”Microarrays” oder ”DNA-Chips”, um die
entsprechenden Polynukleotide aufzufinden und zu bestimmen.
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Polynukleotide,
die die Sequenzen gemäss
der Beschreibung enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet,
mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt
werden kann, die für
die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodieren.
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Solche
als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens
25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23
oder 24, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19
aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide
mit einer Länge
von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40, oder
mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden.
Oligonukleotide mit einer Länge
von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden sind gegebenenfalls
ebenfalls geeignet.
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”Isoliert” bedeutet
aus seinem natürlichen
Umfeld herausgetrennt.
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”Polynukleotid” bezieht
sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide,
wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
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Die
Polynukleotide gemäss
Erfindung schliessen ein Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 ein. Die Polynukleotide
gemäss
Beschreibung schliessen ein daraus hergestelltes Fragment und auch
solche ein, die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens
81% bis 85%, besonders zu wenigstens 86% bis 90% und ganz besonders
zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem
Polynukleotid gemäss SEQ
ID No. 1 oder eines daraus hergestellten Fragments.
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Unter ”Polypeptiden” versteht
man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren
enthalten.
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Die
Polypeptide gemäss
Beschreibung schliessen ein Polypeptid gemäss SEQ ID No. 2, insbesondere solche
mit der biologischen Aktivität
der Phosphoenolpyruvat-Synthase
und auch solche ein, die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu
wenigstens 81% bis 85%, und besonders zu wenigstens 86% bis 90%
und ganz besonders zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch
sind mit dem Polypeptid gemäss SEQ
ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermermentativen
Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien,
die insbesondere bereits L-Lysin produzieren und, in denen die für das ppsA-Gen
kodierenden Nukleotidsequenzen überexprimiert
werden.
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Der
Begriff ”Verstärkung” beschreibt
in diesem Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl
des Gens bzw. der Gene erhöht,
einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym mit einer hohen Aktivität
kodiert, und gegebenenfalls diese Massnahmen kombiniert.
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Durch
die Verstärkungsmassnahmen,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um
wenigstens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, bis zu einem Maximum von 1000% oder 2000%, bezogen auf die
des Wildtyp-Proteins oder die Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus,
erhöht.
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Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind,
können
L-Lysin aus Glukose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse,
Stärke,
Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich
um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium
handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit
bekannt ist, L-Lysin zu produzieren.
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Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes
FERN BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium
flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium
divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende
Mutanten bzw. Stämme.
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Das
neue, für
das Enzym Phosphoenolpyruvat-Synthase (EC 2.7.9.2) kodierende ppsA-Gen
von C. glutamicum (SEQ ID No. 1) wurde isoliert.
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Zur
Isolierung des ppsA-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum
wird zunächst
eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli)
angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern
niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker:
Gene und Klone, Eine Einführung
in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990),
oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine
sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von
Kohara et al. (Cell 50, 495–508
(1987)) in lambda-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular
and General Genetics, 252: 255– 265,
1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings
of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im
E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research
16: 1563–1575)
angelegt wurde.
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Börmann et
al. (Molecular Microbiology 6(3), 317–326) (1992)) wiederum beschreiben
eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids
pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)).
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Zur
Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch
Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807–818 (1979))
oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als
Wirte eignen sich besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der
von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 87 (1990) 4645–4649)
beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente
können
wiederum in gängige,
für die
Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschliessend sequenziert
werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977)
beschrieben ist.
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Die
erhaltenen DNA-Sequenzen können
dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie
z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217– 232 (1986)),
dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm
von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998))
untersucht werden.
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Die
neue für
das Gen ppsA kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum wurde gefunden,
die als SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist.
Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen
Methoden die Aminosäuresequenz
des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die
sich ergebende Aminosäuresequenz
des ppsA-Genproduktes
dargestellt.
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Kodierende
DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit
des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder
Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Beschreibung.
In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen
Glutaminsäure
in Proteinen als ”Sinnmutationen” (”sense mutations”) bekannt,
die zu keiner grundsätzlichen
Veränderung
der Aktivität
des Proteins führen,
d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen
am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich
beeinträchtigen
oder sogar stabilisieren können.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat
et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237–251
(1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)),
bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321– 1325 (1988)) und in bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender
Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung.
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In
gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen
von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Beschreibung. Schliesslich
sind DNA-Sequenzen
Bestandteil der Beschreibung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich
aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise
eine Länge
von mindestens 15 Nukleotiden.
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Anleitungen
zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet
der Fachmann unter anderem im Handbuch ”The DIG System Users Guide
for Filter Hybridization” der
Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und
bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255–260).
Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das
heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d.
h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70%
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung
einschliesslich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung,
der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt
wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid
Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
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Für die Hybridisierungsreaktion
kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer
bei einer Temperatur von ca. 50°C–68°C eingesetzt
werden. Dabei können
Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität
zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil
und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt.
Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf
2 × SSC
und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter
Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995)
erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C–68°C eingestellt
wird. Es ist gegebenenfalls möglich,
die Salzkonzentration bis auf 0,1 × SSC zu senken. Durch schrittweise
Erhöhung
der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente
isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens
80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten
Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form
sogenannter Kits am Markt erhältlich
(z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland, Catalog No. 1603558).
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Anleitungen
zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und
bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland,
1994).
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Es
wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Überexpression des ppsA-Gens
in verbesserter Weise L-Lysin
produzieren.
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Zur
Erzielung einer Überexpression
kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle,
die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken
Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut
werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe
der fermentativen L-Lysin-Produktion zu steigern. Durch Massnahmen
zur Verlängerung
der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls
die Enzymaktivität
verstärkt.
Die Gene oder Genkonstrukte können
entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen
oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Veränderung
der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
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Anleitungen
hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology
5, 137–146 (1987)),
bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga
(Bio/Technology 6, 428–430 (1988)),
bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der
Europäischen Patentschrift 0472869 ,
im
US Patent 4,601,893 ,
bei Schwarzer und Pühler
(Bio/Technology 9, 84–87
(1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126–132
(1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)),
in der Patentanmeldung
WO 96/15246 ,
bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen
Offenlegungsschrift
JP-A-10-229891 ,
bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)),
bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten
Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie.
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Zur
Verstärkung
wurde das erfindungsgemässe
ppsA-Gen beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden überexprimiert.
Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert
werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Henkel
et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549– 554),
pEKE × 1
(Eikmanns et al., Gene 102: 93–98
(1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den
kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie
z. B. solche, die auf pCG4 (
US-A
4,489,160 ), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEHS Microbiology
Letters 66, 119–124
(1990)), oder pAG1 (
US-A
5,158,891 ) beruhen, können
in gleicher Weise verwendet werden.
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Weiterhin
eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das
Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom
anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied
and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) zur Duplikation
bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser
Methode wird das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen
beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)),
pK18mob oder pK19mob (Schäfer
et al., Gene 145, 69–73
(1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman
(1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84;
US-A 5,487,993 ), pCR
®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534– 541
(1993)), pEMl (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173:
4510–4516)
oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337–342) in Frage. Der Plasmidvektor,
der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschliessend durch
Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die
Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756– 759 (1994)) beschrieben.
Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et
al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)),
Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et
al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach
homologer Rekombination mittels eines ”cross over”-Ereignisses enthält der resultierende
Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
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Zusätzlich kann
es für
die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben dem ppsA-Gen
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse,
der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des
Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls
regulatorische Proteine überzuexprimieren.
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So
kann für
die Herstellung von L-Aminosäuren
zusätzlich
zur Verstärkung
des ppsA-Gens ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- – das
für die
Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA ( EP-B 0 197 335 ),
- – das
für die
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns
(1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
- – das
für die
Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076–6086),
- – das
für die
3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076–6086),
- – das
für die
Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf ( JP-A-09224661 ),
- – das
für die
Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc ( DE-A-198 31 609 ),
- – das
für die
Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al.,
European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
- – das
für eine
feed-back-resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession
No. P26512),
- – das
für den
Lysin-Export kodierende Gen lysE ( DE-A-195
48 222 ),
- – das
für die
Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom ( EP-A 0131171 ),
- – das
für die
Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology
(1992) 8065– 8072))
oder das für
eine ”feed-back-resistente” Threonin-Dehydratase
kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel
et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833–842),
- – das
für die
Acetohydroxysäure-Synthase
kodierenden Gen ilvBN ( EP-B
0356739 ),
- – das
für die
Dihydroxysäuredehydratase
kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental
Microbiology 65: 1973–1979),
- – das
für das
Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 ( DE:
199 59 328.0 , DSM 13115),
überexprimiert
werden.
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Weiterhin
kann es für
die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des
ppsA-Gens ein oder
mehrere Gene, ausgewählt
aus der Gruppe
- – das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
kodierende Gen pck ( DE 199 50
409.1 ; DSM 13047),
- – das
für die
Glukose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi ( US 09/396,478 ; DSM 12969),
- – das
für die
Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB ( DE:
199 51 975.7 ; DSM 13114),
- – das
für das
Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 ( DE:
199 59 327.2 , DSM 13113)
abzuschwächen, insbesondere
die Expression zu verringern.
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Der
Begriff ”Abschwächung” beschreibt
in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen
schwachen Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet,
das für
ein entsprechendes Enzym mit niedriger Aktivität kodiert oder das entsprechende
Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert, und gegebenenfalls diese Massnahmen
kombiniert.
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Durch
Abschwächungsmassnahmen
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins
im Ausgangs-Mikroorganismus verringert.
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Weiterhin
kann es für
die Produktion von Aminosäuren
vorteilhaft sein, neben der Überexpression
des ppsA-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: ”Breeding
of Amino Acid Producing Microorganisms”, in: Overproduction of Microbial
Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
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Die
erfindungsgemäss
hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung
und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im
fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives
Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
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Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch ”Manual of
Methods for General Bacteriology” der American Society for
Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
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Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glukose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette wie z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl
und Kokosfett, Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie
z. B. Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Stickstoffquelle können
organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Schliesslich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter
Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur können
basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können
dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise
bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten
Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
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Methoden
zur Bestimmung von L-Lysinsäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann also zum
Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190) beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie mit anschliessender
Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed
Phase HPLC erfolgen, so wie z. B. bei Lindroth et al. (Analytical
Chemistry (1979) 51: 1167–1174)
beschrieben.
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Das
erfindungsgemässe
Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.
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Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
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Die
Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken
zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden
nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989)
Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt.
Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls
in diesem Handbuch beschrieben.
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Die
Zusammensetzung gängiger
Nährmedien
wie LB- oder TV-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook
et al. entnommen werden.
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Beispiel 1
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Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank
aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
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Chromosomale
DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch
et al. (1995, Plasmid 33: 168–179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3Al (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code
no. 27-0913-02)
partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 84: 2160–2164),
bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung
SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym
XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer
Phosphatase dephosphoryliert.
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Anschliessend
wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten.
Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten
ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase,
Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschliessend
mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla,
USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no.
200217) in Phagen verpackt.
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Zur
Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Research 16: 1563–1575) wurden
die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und
mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und
Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei
die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100
mg/l Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht
bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
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Beispiel 2
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Isolierung und Sequenzierung des ppsA-Gens
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Die
Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep
Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer
Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Grössenbereich
von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product
No. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland).
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Die
DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Firma Invitrogen
(Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning
Kit, Product No. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente
in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben
durchgeführt,
wobei das DNA-Gemisch
mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht
inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschliessend in
den E. coli Stamm DH5αMCR
(Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,
87: 4645–4649)
elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:
343–7)
und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin
ausplattiert.
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Die
Plasmidpräparation
der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product
No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte
nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977,
Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463–5467) mit
Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research,
18: 1067). Es wurde der ”RR
dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit” von PE Applied Biosystems
(Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische
Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgten in einem ”Rotiphorese
NF Acrylamid/Bisacrylamid” Gel
(29:1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem ”ABI Prism
377” Sequenziergerät von PE
Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
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Die
erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschliessend unter Anwendung
des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version
97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden
zu einem zusammenhängenden
Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse
wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research,
14: 217–231)
angefertigt.
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Die
erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die
Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 1095
Basenpaaren, welches als ppsA-Gen bezeichnet wurde. Das ppsA-Gen kodiert
für ein
Protein von 364 Aminosäuren. SEQUENZPROTOKOLL