DE10055869A1 - Neue für das nadA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für das nadA-Gen kodierende NukleotidsequenzenInfo
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- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
Abstract
Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, DOLLAR A c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und DOLLAR A ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nicotinsäure oder Nicotinsäurederivaten unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen zumindest das nadA-Gen verstärkt vorliegt, und die Verwendung von Polynukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen enthalten, als Hybridisierungssonden.
Description
Gegenstand der Erfindung sind für das nadA-Gen kodierende
Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nicotinsäure
oder Nicotinsäurederivaten unter Verwendung von
coryneformen Bakterien, in denen das nadA-Gen verstärkt
wird.
Nicotinsäure und Nicotinsäurederivate finden in der
Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß L-Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Verfahren
zur Herstellung von Nicotinsäure oder Nicotinsäurederivaten
mit coryneformen Bakterien sind nicht bekannt.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Nicotinsäure und
Nicotinsäurederivaten bereitzustellen.
Werden im folgenden Nicotinsäure oder Nicotinsäurederivate
erwähnt, sind damit eine oder mehrere Verbindungen
einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe
Nicotinsäure, Nicotinamid, Chinolinsäure (Quinolinat),
Nicotinsäure-mononuklueotid, Nicotinsäure-adenin-
dinukleotid, Nicotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) und
Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (NADP) gemeint.
Besonders bevorzugt ist Nicotinsäure.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid
aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das
nadA-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, und
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b),
wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der
Chinolinsäure-Synthetase A (Quinolate-Synthetase A)
aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das oben genannte
Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine
replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb der Degeneriertheit des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i), die die Aktivität des Proteins/Polypeptids nicht verändern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind schließlich
Polynukleotide ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 1 und 742;
- b) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 743 und 2029; und
- c) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 2030 und 2730.
Weitere Gegenstände sind
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;
ein Vektor, enthaltend das erfindungsgemäße Polynukleotid, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, und
coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das nadA-Gen verstärkt ist.
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;
ein Vektor, enthaltend das erfindungsgemäße Polynukleotid, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, und
coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das nadA-Gen verstärkt ist.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums,
die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit
einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemäßen
Polynukleotids gemäß SEQ ID. No. 1 oder ein Fragment davon
enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA
und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die
für die Quinolinate Synthetasekodieren, oder um solche
Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu
isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des
nadA-Gens aufweisen. Sie sind ebenso zum Einbau in
sogenannte "arrays", "micro arrays" oder "DNA chips"
geeignet, um die entsprechenden Polynukleotide zu
detektieren und zu bestimmen.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren
Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen
hergestellt werden kann, die für die Quinolinate-Synthetase
A kodieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Polynukleotide bzw.
Oligonukleotide, enthalten mindestens 25, 26, 27, 28, 29
oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24, ganz
besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19
aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls
Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40, oder mindestens 41, 42, 43,
44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls
sind auch Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens
100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein
Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus
hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu
wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis
85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90%, und
ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97%
oder 99% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID
No. 1 oder einem daraus hergestellten Fragment.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid
gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der
biologischen Aktivität der Quinolinate-Synthetase A und
auch solche ein, die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt
zu wenigstens 81 bis 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens
86% bis 90%, und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens
91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem
Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität
aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermermentativen Herstellung von Nicotinsäure oder
Nicotinsäurederivaten ausgewählt aus der Gruppe
Nicotinsäure, Nicotinamid, Chinolinsäure (Quinolinat),
Nicotinsäure-mononukleotid, Nicotinsäure-adenin-
dinukleotid, Nicotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) und
Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (NADP) unter
Verwendung von coryneformen Bakterien in denen die für das
nadA-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen verstärkt,
insbesondere überexprimiert werden.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken
Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein
entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können Nicotinsäure oder
Nicotinsäurederivate aus Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus
Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter
coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung
Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium
ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu
nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist,
L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind
besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Das neue, für das Enzym Quinolinate-Synthetase A kodierende
nadA-Gen von C. glutamicum wurde isoliert.
Zur Isolierung des nadA-Gens oder auch anderer Gene von
C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses
Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt.
Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten
Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel
seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim,
Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank
ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et
al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde.
Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265,
1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032,
die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al.,
1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli
können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences,
25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene,
19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich
besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der
Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)
beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten
langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in
gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren
subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es
z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467,
1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten
Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von
Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem von
Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder
dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical
Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.
Die neue für das Gen nadA kodierende DNA-Sequenz von C.
glutamicum wurde gefunden, die als SEQ ID No. 1 Bestandteil
der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurde aus der
vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen
Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins
abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende
Aminosäuresequenz des nadA-Genproduktes dargestellt. Es ist
bekannt, daß wirtseigene Enzyme die N-terminale Aminosäure
Methionin bzw. Formylmethionin von gebildeten Proteinen
während oder nach der Translation abspalten können.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der
Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von
Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als
"Sinnmutationen" ("sense mutations") bekannt, die zu keiner
grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins
führen, d. h. funktionsneutral sind. Derartige Mutationen
werden unter anderem auch als neutrale Substitutionen
bezeichnet. Weiterhin ist bekannt, daß Änderungen am N-
und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht
wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-
Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)),
bei O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth
et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et
al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten
Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus
SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der
Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1
oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren Bestandteil der
Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der
Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich
aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben
typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255-260). Die Hybridisierung findet unter stringenten
Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride
gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit
der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70%
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der
Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch
Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der
Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die
Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten
durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited,
Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 ×
SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C-68°C
eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit
Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride
sind weniger stabil und werden durch Waschen unter
stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise
durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und
gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's
Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim,
Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine
Temperatur von ca. 50°C-68°C eingestellt wird. Es ist
gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1 ×
SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der
Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1-2°C von
50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert
werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens
80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 99%
Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Es
ist ebenfalls möglich Polynukleotidfragmente zu isolieren,
die eine vollständige Identität zur Sequenz der
eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur
Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt
erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No.
1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann
unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide
synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK,
1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach
Überexpression des nadA-Gens in verbesserter Weise
Nicotinsäure produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der
entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise
wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des
Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare
Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im
Verlaufe der fermentativen Nicotinsäure-Produktion zu
steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer
der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des
Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die
Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit
unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom
integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin
eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung
der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht
werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und
Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns
et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen
Patentschrift 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei
Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei
Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung
WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24
(1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift
JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides
(Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in
bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Zur Verstärkung wurde das erfindungsgemäße nadA-Gen
beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden
überexprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in
coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche
bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al.,
Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554),
pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1
(Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den
kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere
Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4
(US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS
Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1
(US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise
verwendet werden.
Ein Beispiel für ein derartiges Plasmid ist das in Fig. 1
dargestellte Plasmid pZ-nadAex.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe
derer man das Verfahren der Genamplifikation durch
Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es
beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and
Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur
Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons
beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt
(typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum
replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise
pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)),
pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73
(1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA),
pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry
269: 32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma
Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf
et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) oder
pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342) in Frage. Der
Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird
anschließend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode
der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))
beschrieben. Methoden zur Transformation sind
beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-
Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei
Kopien des betreffenden Gens.
Zusätzlich kann es für die Produktion von Nicotinsäure oder
Nicotinsäurederivaten vorteilhaft sein, neben dem nadA-Gen
eines oder mehrere Enzyme der Glykolyse, der Anaplerotik,
und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken,
insbesondere überzuexprimieren.
So kann für die Herstellung von Nicotinsäure oder
Nicotinsäurederivaten zusätzlich zur Verstärkung des nadA-
Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A- 198 31 609),
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115) und
- - das für die Phosphoribosylpyrophosphat-Synthetase kodierende prs-Gen (ACCESSION No.: U76387)
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von Nicotinsäure oder
Nicotinsäurederivaten vorteilhaft sein, zusätzlich zur
Verstärkung des nadA-Gens eines oder mehrere Gene,
ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1; DSM 13047),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7; DSM 13114),
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)
abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder
Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Weiterhin kann es für die Produktion von Nicotinsäure oder
Nicotinsäurederivaten vorteilhaft sein, neben der
Überexpression des nadA-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind
ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von Nicotinsäure kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch
von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie
z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B.
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische
Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen
phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das
Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie
z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum
notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben
genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des
gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird
normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden
erreicht.
Methoden zur Bestimmung von Nicotinsäure oder
Nicotinsäurederivaten sind aus dem Stand der Technik
bekannt. Die Konzentration an gebildeter Nicotinsäure bzw.
gebildeten Nicotinsäurederivaten kann mit oder
mikrobiologischen Verfahren wie zum Beispiel dem
Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10th Edition,
S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.
Eine Reinkultur des C. glutamicum Stammes DSM12455/pZ-
nadAex wurde am 26. Oktober 2000 bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM13794
hinterlegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen
Herstellung von Nicotinsäure und Nicotinsäurederivaten.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie
alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische
Phosphatasebehandlung werden nach Sambrook et al.
(Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia
coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-
Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al.
entnommen werden.
Der Stamm ATCC13032ΔilvA ist als DSM12455 bei der Deutschen
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in
Braunschweig (Deutschland) gemäss Budapester Vertrag
hinterlegt und in der EP-A-1006189 beschrieben.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wird wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell
gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wird mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert.
Anschließend wird die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten.
Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wird mit der
behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-
DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04)
behandelt. Das Ligationsgemisch wird anschließend mit Hilfe
des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla,
USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract,
Code no. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al.
1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575) werden die Zellen
in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der
Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der
Cosmidbank werden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 100 mg/l Ampicillin
ausplattiert werden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C
werden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wird mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-
0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No.
1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer
Auftrennung erfolgt die Isolierung der Cosmidfragmente im
Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel
Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden,
Germany).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der
Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande,
Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product
No. K2500-01), wird mit dem Restriktionsenzym BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04)
gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den
Sequenziervektor pZero-1 wird wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit
T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über
Nacht inkubiert wird. Dieses Ligationsgemisch wird
anschließend in den E. coli Stamm DHSαMCR (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,
87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox,
1955, Virology, 1 : 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgt mit
dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,
Deutschland). Die Sequenzierung erfolgt nach der Dideoxy-
Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings
of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467)
mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic
Acids Research, 18 : 1067). Es wird der "RR dRhodamin
Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems
(Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet.
Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der
Sequenzierreaktion erfolgt in einem "Rotiphorese NF
Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1,
Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377"
Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt,
Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten werden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate werden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wird mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergibt ein
offenes Leseraster von 1287 Basenpaaren, welches als nadA-
Gen bezeichnet wurde. Das nadA-Gen kodiert für ein Protein
von 428 Aminosäuren.
Aus dem Stamm ATCC 13032 wird nach der Methode von Eikmanns
et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale
DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum
bekannten Sequenz des nadA-Gens werden die folgenden
Oligonukleotide für die Polymerase-Kettenreaktion
ausgewählt. Zusätzlich werden geeignete
Restriktionsschnittstellen eingefügt, die das Klonieren in
den Zielvektor ermöglichen:
nadA-ex1 dargestellt in SEQ ID No. 3
nadA-ex1 dargestellt in SEQ ID No. 3
nadA-ex2 dargestellt in SEQ ID No. 4
Die dargestellten Primer wurden von der Firma ARK
Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland)
synthetisiert. Die Primer nadA-ex1 und nadA-ex2 enthalten
die Sequenz für die Schnittstelle der
Restriktionsendonuklease SalI, die in den oben
dargestellten Nukleotidabfolgen durch Unterstreichen
markiert sind. Die PCR-Reaktion wird nach der Standard-PCR-
Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods
and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase
der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland)
durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
ermöglichen die Primer die Amplifikation eines 1287 bp
großen DNA-Fragmentes, welches das nadA-Gen aus
Corynebacterium glutamicum ohne potentielle Promotor-Region
trägt. Das so amplifizierte Fragment wird in einem 0,8%igen
Agarosegel elektrophoretisch geprüft und durch
Sequenzierung kontrolliert.
Das auf diese Weise gewonnene PCR Fragment wird mit den
Restriktionsenzymen SalI vollständig gespalten und nach
Auftrennung in einem 0,8%tigem Agarosegel mit dem QiaExII
Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden,
Germany) aus dem Gel isoliert.
Als Basisvektor zur Expression sowohl in C. glutamicum als
auch in E. coli wird der E. coli - C. glutamicum - Shuttle
- Expressionsvektor pZ8-1 (EP 0 375 889) eingesetzt. DNA
dieses Plasmides wird mit den Restriktionsenzym SalI
vollständig gespalten und anschließend mit shrimp
alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250)
dephosphoryliert. Das in Beispiel 3.1 aus dem Agarosegel
isolierte nadA-Fragment wird mit dem so vorbereiteten
Vektor pZ8-1 gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04)
behandelt.
Der Ligationsansatz wird in den E. coli Stamm DH5αmcr
(Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I.
IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die
Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch
Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 50 mg/l Kanamycin. Nach
Inkubation über Nacht bei 37°C werden rekombinante
Einzelklone selektioniert. Plasmid DNA wird aus einer
Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product
No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben
isoliert und durch Restriktionsspaltung überprüft. Das
erhaltene Plasmid wird pZ-nadAex genannt. Es ist in Fig. 1
dargestellt.
Der Stamm ATCC13032ΔilvA wird mit dem Plasmid pZ-nadAex
unter Anwendung der von Liebl et al., (FEMS Microbiology
Letters, 53: 299-303 (1989)) beschriebenen
Elektroporationsmethode transformiert. Die Selektion der
Transformanten erfolgt auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l
Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l
Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und
18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert
worden ist. Die Inkubation erfolgt für 2 Tage bei 33°C.
Plasmid DNA wird aus einer Transformante nach den üblichen
Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), mit der
Restriktionsendonuklease SalI geschnitten und das Plasmid
durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft.
Der erhaltene Stamm wird C. glutamicum ATCC13032ΔilvA/pZ-
nadAex bzw. DSM12455/pZnadAex genannt.
Die Bildung von Nicotinsäure durch die C. glutamicum Stämme
ATCC13032ΔilvA/pZ8-1 und ATCC13032ΔilvA/pZ-nadAex wird in
Medium CGXII (Keilhauer et al., 1993, Journal of
Bacteriology, 175: 5595-5603) geprüft, das mit 25 µg/ml
Kanamycin und 1 mM L-Isoleucin supplementiert worden ist.
Dieses Medium wird im Folgenden als C. glutamicum-
Testmedium bezeichnet. Je 50 ml frisch angesetztes C.
glutamicum-Testmedium werden aus einer 16 Stunden alten
Vorkultur des gleichen Mediums dergestalt angeimpft, daß
die optische Dichte der Kultursuspension (o. D.580) bei
Inkubationsbeginn 0,1 beträgt. Die Kulturen werden bei 30°C
und 130 U/min bebrütet. Nach der 48stündiger Inkubation
wird die optische Dichte (o. D.580) der Kultur bestimmt und
anschließend die Zellen durch 10minütige Zentrifugation bei
5000 g entfernt und der Überstand sterilfiltriert.
Zur Bestimmung der optischen Dichte wird ein Novaspec II
Photometer der Firma Pharmacia (Freiburg, Deutschland) bei
einer Messwellenlänge von 580 nm eingesetzt.
Die Quantifizierung der Nicotinsäure im Kulturüberstand
erfolgt mittels Lactobacillus plantarum ATCC 8014 nach
Angaben des Handbuchs der Firma DIFCO (DIFCO MANUAL, 10tn
Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA). Für die Kalibrierung
wird Nicotinsäure der Firma Sigma (Deisenhofen,
Deutschland) verwendet.
Folgende Figur ist beigefügt:
Fig. 1: Karte des Plasmides pZ-nadAex
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen
handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der
Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Ptac Ptac Promotor
rep: Plasmidkodierte Replikationsregion aus C. glutamicum Plasmid pGA1
rrnB: Terminator T1T2 des rrnB-Gens von E. coli
Kan: Resistenzgen für Kanamycin
nadA-ex: nadA-Gen von C. glutamicum ohne Promotorregion
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
Ptac Ptac Promotor
rep: Plasmidkodierte Replikationsregion aus C. glutamicum Plasmid pGA1
rrnB: Terminator T1T2 des rrnB-Gens von E. coli
Kan: Resistenzgen für Kanamycin
nadA-ex: nadA-Gen von C. glutamicum ohne Promotorregion
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
Claims (21)
1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine für das nadA-Gen kodierende
Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c)
2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid
eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt
rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid
eine RNA ist.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die
Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (1) innerhalb der Degeneriertheit des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i), die die Aktivität des Proteins/Polypeptids nicht verändern.
6. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Hybridisierung
unter einer Stringenz entsprechend höchstens 2x SSC
durchgeführt wird.
7. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, die für ein
Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No. 2
dargestellte Aminosäuresequenz enthält.
8. Coryneforme Bakterien, in denen das nadA-Gen verstärkt,
insbesondere überexprimiert wird.
9. Corynebacterium glutamicum DSM12455/pZ-nadAex
hinterlegt am 26. Oktober 2000 als DSM13794 bei der
Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ).
10. Verfahren zur fermentativen Herstellung von
Nicotinsäure oder Nicotinsäurederivaten, dadurch
gekennzeichnet, daß man folgende Schritte
durchführt:
- a) Fermentation der die gewünschte Nicotinsäure oder die Nicotinsäurederivate produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das nadA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert;
- b) Anreicherung der Nicotinsäure oder des Nicotinsäurederivats im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolierung der Nicotinsäure oder des Nicotinsäurederivats.
11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des
Biosyntheseweges der gewünschten Nicotinsäure oder des
Nicotinsäurederivats verstärkt.
12. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest
teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der
gewünschten Nicotinsäure oder des Nicotinsäurederivats
verringern.
13. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen mit einem
Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt, und der
Plasmidvektor die für das nadA-Gen kodierende
Nukleotidsequenz trägt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Expression des
(der) Polynukleotides (e), das (die) für das nadA-Gen
kodiert (kodieren) verstärkt, insbesondere
überexprimiert.
15. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man die
regulatorischen/katalytischen Eigenschaften des
Polypetids (Enzymprotein) erhöht, für das das
Polynukleotid nadA kodiert.
16. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von Nicotinsäuren oder Nicotinsäurederivate coryneforme
Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig
eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 16.1 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc,
- 2. 16.2 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1,
- 3. 16.3 das für die Phosphoribosylpyrophosphat- Synthetase kodierende prs-Gen
17. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von Nicotinsäure oder Nicotinsäurederivaten coryneforme
Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig
eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 17.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck,
- 2. 17.2 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB
- 3. 17.3 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 abschwächt.
18. Coryneforme Bakterien, die einen Vektor enthalten, der
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 trägt.
19. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium
glutamicum einsetzt.
20. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um
Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene
zu isolieren, die für die Quinilinate Synthetase A
kodieren oder eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des
nadA-Gens aufweisen, dadurch
gekennzeichnet, daß man das Polynukleotid,
enthaltend die Polynukleotidsequenzen gemäß den
Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, als Hybridisierungssonden
einsetzt.
21. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch
gekennzeichnet, daß man arrays, micro
arrays oder DNA-chips einsetzt.
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