ES2288070B1 - Microorganismo productor de 6hna, procedimiento de obtencion, elementos para su realizacion y sus aplicaciones. - Google Patents
Microorganismo productor de 6hna, procedimiento de obtencion, elementos para su realizacion y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Microorganismo productor de 6HNA, procedimiento de obtención, elementos para su realización y sus aplicaciones. Un objeto de la invención lo constituye un microorganismo genéticamente transformado útil para la producción de 6HNA (ácido 6-hidroxinicotínico) a partir de NA (ácido nicotínico) basado en que presenta una modificación genética de uno o varios de los genes de la ruta nic, ya sean de origen endógeno o exógeno, pertenecientes al siguiente grupo nic: nicA, nicB y nicC; así como un procedimiento de obtención del mismo mediante la manipulación de los genes de la ruta nic. Otro objeto de la invención lo constituye el uso de dicho microorganismo en un procedimiento de obtención de 6HNA en condiciones adecuadas de cultivo. El 6HNA es un importante precursor en la síntesis de insecticidas modernos.
Description
Microorganismo productor de 6HNA, procedimiento
de obtención, elementos para su realización y sus aplicaciones.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La invención se encuadra en el área de la
biotecnología, y más concretamente en un proceso de
biotransformación mediante microorganismos. Se trata de la
producción de ácido 6-hidroxinicotínico (en lo
sucesivo denominado como 6HNA), un importante precursor en la
síntesis de insecticidas modernos.
El ácido nicotínico (en lo sucesivo denominado
como NA) es un compuesto muy abundante en la naturaleza y puede
ser utilizado por algunas bacterias como única fuente de carbono,
nitrógeno y energía. La capacidad para emplear NA como sustrato de
crecimiento se encuentra ampliamente distribuida en microorganismos
del género Pseudomonas, y las distintas etapas enzimáticas
del catabolismo de este compuesto son conocidas (Behrman y Stanier
J. Biol. Chem. 1957, 228, 923-45). La
primera reacción enzimática consiste en la hidroxilación del NA
para producir 6HNA (Hughes. Biochem. J. 1955, 60, 303).
Aunque la bioquímica de la hidroxilación era conocida, hasta la
fecha no se conocían los determinantes genéticos responsables de
dicho proceso.
La bacteria Pseudomonas putida KT2440 es
uno de los organismos modelo en el estudio de la degradación de
compuestos aromáticos. Se trata de una bacteria de suelo con una
gran versatilidad metabólica y cuyo genoma ha sido secuenciado
completamente (Nelson et al. Environ. Microbiol. 2002, 4,
799-808). El análisis genómico de P. putida
KT2440 ha permitido determinar en su mapa catabólico global la
localización de distintos agrupamientos génicos ("clusters")
ya conocidos en otras bacterias para la degradación de compuestos
aromáticos (Jiménez et al. Environ. Microbiol, 2002, 4,
824-841). Además, dentro de este mapa se han
identificado nuevos clusters, como los denominados pcm y
nic, localizados en las posiciones 2.8 Mb y 4.4 Mb del
genoma, respectivamente, cuya función se desconoce.
Existen varios procesos registrados para la
producción de 6HNA, un importante precursor en la síntesis de
insecticidas modernos tales como el imidachloprid (Hurh et al.
J. Ferm. and Bioeng., 1994, 77, 382-385; Schmid
et al. Nature, 2001, 409, 258-268), a partir
de NA mediante fermentaciones con microorganismos (Kiener
US5266469, Hoeks et al. US5151351, Kulla et al.
US4738924, Lehky et al. US508277 y Hurh et al. J. Ferm.
and Bioeng., 1994, 77, 382-385). Todos ellos se
basan en el uso de bacterias de diferentes géneros
(Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter,
Serratia) capaces de degradar NA que sufren el bloqueo de la
ruta catabólica por inhibición de las enzimas implicadas en las
reacciones posteriores a la bioconversión de NA en 6HNA.
En el procedimiento que se detalla a
continuación se realiza un abordaje diferente y consistente en: i)
la manipulación genética de los genes nic para la disrupción
de aquellos que participan en el catabolismo del 6HNA, y ii) la
transferencia de los genes nicA y nicB, involucrados
en la síntesis de la monooxigenasa que convierte NA en 6HNA, a
otros microorganismos que no poseen la capacidad de catabolizar
NA.
Un objeto de la presente invención lo constituye
un microorganismo genéticamente transformado mediante técnicas de
ingeniería genética útil para la producción de 6HNA a partir de NA
basado en que tras la transformación genética dicho microorganismo
presenta los genes nicA y nicB, ya sean de origen
endógeno (procedentes del propio microorganismo anteriormente a
dicha transformación) ó exógeno (procedentes de otro microorganismo
distinto al modificado genéticamente) y no presenta el gen
nicC funcional, ya sea por tener inactivada la expresión del
gen nicC endógeno tras la
transformación genética ó porque el microorganismo no presentaba gen nicC endógeno antes de dicha transformación.
transformación genética ó porque el microorganismo no presentaba gen nicC endógeno antes de dicha transformación.
Una realización particular de este
microorganismo es el desarrollado en la presente invención
denominado P. putida KT2440dnicC depositado en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número CECT 7048
o el microorganismo P. fluorescens R2f (pNicAB) depositado
en la CECT con el número CECT 7049.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de obtención de un tipo de
microorganismo de la invención basado en la alteración genética
mediante la manipulación endógena o exógena de uno o varios de los
genes del grupo nic: nicA, nicB y nicC.
Una posibilidad particular de alteración genética del gen
nicC lo constituye un procedimiento de mutagénesis por
recombinación homóloga que provoca la disrupción de la secuencia de
nucleótidos de dicho gen y por tanto la incapacidad de degradar el
6HNA.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye la secuencia de nucleótidos completa del gen
nicC SEQ ID NO5 y el fragmento del gen nicC con la
secuencia SEQ ID NO7.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un vector de clonación que comprende una secuencia
de nucleótidos de las descritas en la presente invención que permite
llevar a cabo una disrupción del gen nicC por recombinación
homóloga.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención que consiste en un
procedimiento de transformación de un microorganismo que
inicialmente es incapaz de degradar NA con las secuencias de
nucleótidos codificantes de las proteínas NicA y NicB procedentes
de otro microorganismo.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el gen nicA con la secuencia de nucleótidos
SEQ ID NO1 o el gen nicB con la secuencia de nucleótidos SEQ
ID NO3.
De forma similar a lo anteriormente descrito,
otro objeto particular de la presente invención lo constituye un
vector de expresión génica o de clonación que porta las secuencias
de nucleótidos de nicA y nicB o una construcción
genética que contenga las anteriores y que permite la expresión de
las proteínas NicA y NicB.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de un microorganismo de la invención en un
procedimiento de obtención de 6HNA en condiciones adecuadas de
cultivo.
Finalmente, otro objeto particular de la
invención lo representan las proteínas de secuencia de aminoácidos
SEQ ID NO2 y SEQ ID NO4 codificadas por las secuencias de
nucleótidos SEQ ID NO1 y SEQ ID NO3; así como cualquier otra forma
homóloga aislada o construida mediante la información de la
presente invención.
La invención se enfrenta a la necesidad de crear
nuevas herramientas y procedimientos de síntesis enzimática de
compuestos químicos de valor industrial.
La presente invención se basa en que los
inventores han identificado y aislado mediante, en primer lugar, el
análisis del genoma de P. putida KT2440 (número de acceso en
GenBank AE015451) en busca de ORFs implicadas en procesos de
degradación de compuestos aromáticos (ver Ejemplo 1), y, en segundo
lugar, mediante ensayos experimentales de la actividad de las
enzimas expresadas o anuladas (ver Ejemplos 2 y 3), la presencia de
un agrupamiento de genes, en lo sucesivo denominado cluster
nic, responsable del catabolismo de heterociclos
aromáticos, y que en concreto contiene los genes implicados
directamente en la ruta de biotransformación del ácido nicotínico
(NA) tanto en el primer paso enzimático de transformación del NA en
6HNA -genes nicA y nicB (ver SEQ ID NO1 y NO3)-, como
en la posterior hidroxilación del 6HNA -gen nicC (ver SEQ ID
NO5)-.
En primer lugar, mediante técnicas de biología
molecular se ha diseñado un mutante de P. putida KT2440, que
presenta una inserción por recombinación homóloga del plásmido
pKnicC en el gen nicC. La cepa recombinante P. putida
KT2440dnicC, portadora de la disrupción en el gen
nicC, pierde la capacidad de crecer cuando se cultiva en
medio mínimo M63 (Miller, JH 1972 En "Experiments in molecular
genetics". Cold Spring Harbor, New York) suplementado con NA (5
mM) como única fuente de carbono. Cuando el crecimiento se repite
en presencia de una fuente de carbono adicional, citrato al 0.2%
(p/v), se ha comprobado que el NA es transformado en 6HNA según se
detecta en el análisis por cromatografía líquida de alta definición
(HPLC) del sobrenadante del cultivo (Ejemplo 2.1). La
biotransformación de NA en 6HNA también se observa con células en
suspensión del mutante P. putida KT2440dnicC crecido
en presencia de citrato y NA (Ejemplo 2.2).
Por otro lado, a partir de una librería genómica
de P. putida KT2440 se clonaron los genes nicA y
nicB en un plásmido de amplio espectro de huésped,
pBBR1MCS-5 (Kovach et al. Gene, 1995, 166,
175-176), bajo el control del promotor heterólogo
Plac. El plásmido resultante, pNicAB, se transfirió mediante
conjugación triparental a distintas bacterias incapaces de degradar
NA tales como Pseudomonas fluorescens R2f (van Elsas et
al., 1988, FEMS Microbiol. Ecol., 53,
299-306) y Pseudomonas sp. DSM 6412 (Blaschke
et al. Arch. Microbiol. 1991, 155, 164-169).
Cuando las dos cepas recombinantes se cultivan en citrato en
presencia de NA se comprueba que son capaces de producir 6HNA a
unos niveles comparables a los del mutante recombinante P.
putida KT2440dnicC, lo que indica que los genes
nicAB se expresan y generan una monooxigenasa de NA que es
activa en diferentes bacterias.
Las células recombinantes generadas acumulan
6HNA en el sobrenadante del caldo de cultivo, y éste, al contrario
de lo que sucede en los procedimientos mencionados anteriormente en
la literatura, no sufre degradación posterior. Las ventajas que
supone este procedimiento respecto a los anteriores es que el
diseño racional de cepas que expresan exclusivamente los genes
nicAB acumulan específicamente 6HNA con un rendimiento
cercano al 100% independientemente del NA presente de partida, y
además son incapaces de continuar la degradación de 6HNA.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye un microorganismo genéticamente transformado mediante
técnicas de ingeniería genética útil para la producción de 6HNA a
partir de NA, en adelante microorganismo de la presente invención,
basado en que presenta una alteración genética de uno o varios de
los genes del cluster nic, ya sean de origen endógeno o
exógeno: nicA, nicB y nicC.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "microorganismo genéticamente transformado" se refiere
a cualquier microorganismo que ha sido genéticamente modificado por
técnicas de ingeniería genética para transformar el NA en 6HNA, es
decir, cualquier microorganismo que sea capaz de expresar los
genes nicA y nicB originando las correspondientes
proteínas NicA y NicB activas y que sea incapaz de producir una
proteína NicC activa. A título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la presente invención el microorganismo de la invención
pertenece al género Pseudomonas.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye un microorganismo que posee los genes del cluster
nic pero que tiene inactivado su gen nicC de tal
forma que dicho gen nicC no es capaz de expresar la enzima
NicC o produce una enzima NicC inactiva y, por lo tanto, este
microorganismo es incapaz de modificar el 6HNA.
Una realización particular de este
microorganismo es el desarrollado en la presente invención
denominado P. putida KT2440dnicC y depositado en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número CECT 7048,
en el que el gen nicC se ha inactivado mediante
recombinación homóloga (Ejemplo 2.1).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un microorganismo al que se le han transferido los
genes nicA y nicB de otro microorganismo de tal forma
que este nuevo microorganismo genéticamente transformado es capaz
de convertir el NA en 6HNA.
Una realización particular de este
microorganismo es el desarrollado en la presente invención
denominado Pseudomonas fluorescens R2f (pNicAB) y depositado
en la CECT con el número CECT 7049.
Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención lo constituye un procedimiento de obtención del
microorganismo de la invención, en adelante procedimiento de la
invención, basado en la alteración genética mediante la
manipulación endógena o exógena de los genes del cluster
nic.
Un objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención que consiste en la
inactivación del gen nicC endógeno de un microorganismo que
posee el cluster nic. Cualquier técnica o método de
mutagénesis conocido por un experto puede ser utilizado para
inducir una inactivación del gen nicC, como por ejemplo la
mutagénesis química, la mutagénesis por irradiación, la mutagénesis
por transposones, la mutagénesis por minitransposones, y otras
técnicas de mutagénesis al azar. Para que esta técnica produzca
exclusivamente una inactivación en el gen nicC, la
mutagénesis ha de realizarse por recombinación homóloga con parte
del gen nicC o de sus regiones limítrofes. Otra forma de
inactivar la función del gen nicC sería mediante el empleo
de sistemas de RNA antisentido. También se podría inactivar la
expresión del gen nicC mediante el empleo de proteínas
reguladoras que impidiesen su
transcripción.
transcripción.
De acuerdo con lo anterior, una posibilidad
particular de disrupción del gen nicC lo constituye un
procedimiento de mutagénesis por recombinación homóloga que provoca
la disrupción de la secuencia de nucleótidos de dicho gen y por
tanto la incapacidad de degradar el 6HNA. Para llevar a cabo la
rotura del gen nicC mediante recombinación homóloga se
necesita crear un vector de recombinación que contenga un fragmento
de la secuencia de nucleótidos del gen nicC unido o no a una
secuencia limítrofe del mismo, como por ejemplo de su promotor
(Ejemplo 2). Así, una realización particular lo constituye un
procedimiento de recombinación homóloga que comprende los
siguientes pasos:
- a)
- construcción de un vector de clonación, preferentemente un plásmido, que contenga un fragmento de la secuencia de nucleótidos del gen nicC unida o no a una región limítrofe, y que sea capaz de replicarse en un microorganismo que actúa de huésped para su construcción, pero que no sea capaz de replicarse en el microorganismo original que se quiere mutagenizar por transformación genética, y
- b)
- transformación genética del microorganismo original mediante recombinación homóloga con el vector de a) en condiciones adecuadas.
Un caso ejemplarizante del procedimiento de la
invención mediante disrupción del gen nicC con un plásmido
lo constituye el procedimiento de obtención del microorganismo
P. putida KT2440dnicC mediante recombinación homóloga
a través de un procedimiento de transformación por conjugación
triparental en el que el fragmento de la secuencia de nucleótidos
del gen nicC está constituido por la secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO7, el vector de clonación es el plásmido
pKnicC y el microorganismo original es la cepa P. putida
KT2440 (ver Ejemplo 2.1). En la secuencia SEQ ID NO5 se indica la
secuencia completa codificante del gen nicC identificado y
aislado en la presente invención así como una parte del promotor de
dicho gen (ver secuencia comprendida entre el nucleótido 1 y 321),
de tal forma que pueden seleccionarse por cualquier experto en la
materia múltiples alternativas de una secuencia eficaz para la
disrupción del gen nicC mediante recombinación homóloga.
La identificación en la presente invención de la
secuencia de nucleótidos de los genes que comprende dicho cluster
nic -nicA, nicB y nicC- permite el uso de dichas
secuencias de nucleótidos, fragmentos o formas análogas en
procedimientos de ingeniería genética y en la transformación de
microorganismos que produzcan 6HNA por un experto en la materia que
puede aislar o producir dichas secuencias de nucleótidos.
Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención lo constituye la secuencia de nucleótidos del gen
nicC, a partir de la cual se pueden elaborar herramientas
para un procedimiento de disrupción génica. Tal como se utiliza en
la presente invención el término "gen nicC" se refiere a
una secuencia de nucleótidos perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de nucleótidos del gen nicC de P. putida KT2440 constituida por la SEQ ID NO5,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), que permita realizar una inactivación del gen nicC por mutagénesis insercional mediante recombinación homóloga, y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a a), b) y c).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye la secuencia de nucleótidos completa del gen
nicC SEQ ID NO5 y el fragmento del gen nicC con la
secuencia de nucleótidos SEQ ID NO7.
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de
nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a las
secuencias mostradas en la presente memoria, por ejemplo, mediante
la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la
adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de
la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier
extremo o en el interior de la secuencia, y que permita la
codificación de un péptido o proteína capaz de mimetizar la acción
de la proteína NicA y NicB juntas, y en el caso del gen nicC
cualquier secuencia de nucleótidos que permita realizar una
inactivación de dicho gen por mutagénesis insercional mediante
recombinación homóloga.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga
es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos
comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa
que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de
identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un
85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La secuencia de nucleótidos de la invención
también puede comprender (secuencia d) anterior), en caso necesario
y para permitir un mejor aislamiento, detección o expresión de la
proteína, a una secuencia de nucleótidos que codifica para un
péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento,
detección o secreción de dicho péptido. Por tanto, otro objeto
particular de la presente invención lo constituye una construcción
genética que comprende, además de la secuencia de nucleótidos de
uno de los genes del cluster nic, cualquier otra secuencia
de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptídica que
permita el aislamiento, la detección o la expresión, por ejemplo, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención,
una secuencia de polihistidina (6xHis), una secuencia peptídica
reconocible por un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, para su
identificación, o cualquier otra que sirva para purificar la
proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad:
péptidos etiqueta tales como c-myc, HA,
E-tag) (Using antibodies: a laboratory manual. Ed.
Harlow and David Lane (1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
New York. Capítulo: Tagging proteins. pp.
347-377).
Las secuencias de nucleótidos del cluster
nic descritas y aisladas en la presente invención pueden
obtenerse por un experto en el sector de la técnica mediante el
empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica
(Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory
Manual" 2^{nd} ed., Cold Sping Harbor Laboratory Press, New
York, 1989 vol 1-3). Dichas secuencias de
nucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión
génica o de clonación que permite la regulación de la expresión de
la misma en una célula huésped en condiciones adecuadas.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un vector de clonación, en adelante vector de
clonación, que comprende una secuencia de nucleótidos o una
construcción genética de las descritas en la presente invención que
permite llevar a cabo una recombinación homóloga de un gen
nicC endógeno. Este vector de clonación ha de ser capaz de
replicarse en un microorganismo que actúa de huésped para su
replicación, pero no ha de ser capaz de replicarse en el
microorganismo original que se quiere mutagenizar por
transformación genética mediante recombinación homóloga.
Un caso particular de un vector de clonación de
la invención es un plásmido movilizable capaz de replicarse en
E. coli pero no en P. putida KT2440 y que confiere
resistencia a algún antibiótico, como por ejemplo el plásmido
pKnicC obtenido a partir del plásmido pK18mob (ver Ejemplo
2.1).
En general, un vector de expresión comprende,
además de una secuencia de nucleótidos o de la construcción
genética descritos en la invención, un promotor que dirige su
transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD,
etc), al que está operativamente enlazado, y otras secuencias
necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción
y, en su caso, la traducción del producto de interés, por ejemplo,
señales de inicio y terminación de transcripción (tlt2,
etc), origen de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS),
secuencias codificantes de reguladores transcripcionales,
potenciadores de la transcripción (enhancers), silenciadores
transcripcionales (silencers), represores, puntos de corte de
enzima de restricción, etc. Ejemplos de vectores de expresión
apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y
necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión,
vectores virales, cósmidos, etc. que pueden contener, además,
marcadores utilizables para seleccionar las células transfectadas o
transformadas con el gen o genes de interés. La elección del
vector dependerá de la célula huésped y del tipo de uso que se
quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización particular
de la presente invención dicho vector es un plásmido. La obtención
de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales
conocidos por los expertos en la materia al igual que para la
transformación de microorganismos se pueden utilizar diferentes
métodos ampliamente conocidos -transformación química,
electroporación, etc- descritos en diversos manuales [Sambrook, J.,
Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual, 2^{nd} ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York].
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el procedimiento de la invención que consiste en un
procedimiento de transformación con las secuencias de nucleótidos
codificantes de las proteínas NicA y NicB de un microorganismo que
inicialmente es incapaz de degradar NA. Así, una realización
particular lo constituye un procedimiento de transformación genética
de un microorganismo que comprende los siguientes pasos:
- a)
- construcción de un vector de clonación, preferentemente un plásmido, que comprenda las secuencias de nucleótidos de los genes nicA y nicB, y
- b)
- transformación genética del microorganismo original mediante el vector de expresión de a) en condiciones adecuadas.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "gen nicA" se refiere a una secuencia de
nucleótidos perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de nucleótidos del gen nicA de P. putida KT2440 constituida por la SEQ ID NO1,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) que permita la codificación de un péptido o proteína capaz de mimetizar la acción de la proteína NicA, y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el gen nicA con la secuencia SEQ ID NO1.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "gen nicB" se refiere a una secuencia de
nucleótidos perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de nucleótidos del gen nicB de P. putida KT2440 constituida por la SEQ ID NO3,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), que permita la codificación de un péptido o proteína capaz de mimetizar la acción de la proteína NicB, y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el gen nicB con la secuencia de nucleótidos
SEQ ID NO3.
Un caso ejemplarizante del procedimiento de la
invención mediante transformación genética con un plásmido lo
constituye el procedimiento de obtención del microorganismo de la
invención en el que la secuencia de nucleótidos del gen nicA
es la SEQ ID NO1 y la del gen nicB es la SEQ ID NO3, el
vector es el plásmido pNicAB, la transformación se realiza mediante
conjugación triparenteral y el microorganismo original es una cepa
perteneciente al siguiente grupo: Pseudomonas fluorescens
R2f y Pseudomonas sp. DSM 6412 (ver Ejemplo 3).
De forma similar a lo anteriormente descrito,
otro objeto particular de la presente invención lo constituye un
vector de expresión génica o de clonación, que porta las secuencias
de nucleótidos nicA y nicB y que permite la expresión
de las proteínas NicA y NicB. En la presente invención el término
vector de clonación se refiere también a un sistema de expresión
constituido por dos vectores de clonación cada uno de ellos con una
de las secuencias de nucleótidos de los genes nicA o
nicB, respectivamente. La expresión de estos dos genes
genera una actividad monooxigenasa de NA en el interior de las
células huésped que contienen las secuencias de nucleótidos de los
genes nicA y nicB, produciéndose 6HNA. Un caso
particular de un vector de clonación de la invención es el plásmido
pNicAB, que permite la expresión de las proteínas NicA y NicB.
Igualmente, forma parte de la invención el uso
de las secuencias de nucleótidos descritas del gen nicA,
nicB y nicC (incluyendo en este último caso, fragmentos
del gen o de la región descrita de su promotor) para la elaboración
de vectores de clonación génica, así como el uso de dichos
vectores para la transformación de microorganismos productores de
6HNA.
Como se ha comentado inicialmente el 6HNA es un
importante precursor en la síntesis de insecticidas modernos. Tal
como se describe en la invención, la síntesis de 6HNA mediante
organismos vivos es posible y presenta las ventajas de la
especificidad del proceso, la sencillez, el bajo coste económico y
el ser un proceso respetuoso con el medio ambiente (Ejemplo 2 y
3).
Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención lo constituye el uso del microorganismo NA/6HNA de la
invención en un procedimiento de obtención de 6HNA en condiciones
adecuadas de cultivo.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el uso del microorganismo NA/6HNA en un procedimiento de
obtención de 6HNA en el que el microorganismo es una cepa que
presenta el gen nicC inactivado. Una realización concreta
del uso de la invención es aquel en el que la cepa que se utiliza
es la cepa mutante P. putida KT2440dnicC (CECT 7048)
que se crece en un medio de cultivo, por ejemplo, en medio mínimo
M63 suplementado con una fuente de carbono, elementos traza,
antibióticos y NA (ver Ejemplo 2.2). El procedimiento de producción
de 6HNA puede llevarse a cabo tanto con células en crecimiento como
en células en suspensión.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el uso del microorganismo NA/6HNA en un procedimiento de
obtención de 6HNA en el que el microorganismo es un microorganismo
transformado con los genes exógenos nicA y nicB. Una
realización particular lo constituye el uso del microorganismo de
la invención en el que el microorganismo es la cepa P.
fluorescens R2f (pNicAB) (CECT 7049) que se crece en un medio
de cultivo, por ejemplo, medio mínimo M63, suplementado con una
fuente de carbono, elementos traza, antibióticos y NA (Ejemplo
3.3).
Para el cultivo de estos microorganismos se
pueden utilizar otros medios mínimos diferentes al medio mínimo
M63 siempre que permitan el crecimiento del microorganismo. Para el
cultivo de estos microorganismos también se pueden utilizar medios
ricos.
Finalmente, otro objeto particular de la
invención lo representan las proteínas de secuencia de aminoácidos
SEQ ID NO2 y SEQ ID NO4 codificadas por las secuencias de
nucleótidos SEQ ID NO1 y SEQ ID NO3, correspondientes a las
proteínas NicA y NicB de la cepa P. putida KT2440,
respectivamente; así como cualquier otra forma homóloga aislada o
construida mediante la información de la presente invención; así
como su uso en un procedimiento de síntesis enzimática de 6HNA.
Figura
1
Se amplificó un fragmento interno del gen nicC
(SEQ ID NO7) por PCR empleando los oligonucleótidos Nih5 (SEQ ID
NO8) y Nih3 (SEQ ID NO9) y DNA genómico de P. putida KT2440
como molde. Posteriormente, el fragmento resultante fue clonado,
mediante digestión previa con las enzimas de restricción EcoRI y
HindIII, en el plásmido suicida pK18mob, generando el plásmido
pKnicC. El plásmido fue transferido por conjugación triparental a
P. putida KT2440 y, tras recombinación homóloga con el
correspondiente gen nicC del cromosoma de la bacteria, se
generó la cepa mutante P. putida KT2440dnicC que contiene el
gen nicC truncado.
Figura
2
El cósmido 3n5 fue digerido con las enzimas
ScaI y EcoRI. Se aisló un fragmento de 4.1 kb que comprende el
extremo 3' del gen nicA y el gen nicB completo (SEQ ID NO3), y se
clonó en el vector pUCl9 que previamente fue digerido con SmaI y
EcoRI, generando el plásmido pFUSAB. El gen nicA de esta
construcción fue sustituido por el gen nicA completo (SEQ ID NO1)
obtenido por PCR a partir de DNA cromosómico de P. putida
KT2440 empleando la pareja de oligonucleótidos nicA5 (SEQ ID NO10)
y SgraI (SEQ ID NO11), generándose el plásmido pUCNAB. Finalmente,
los genes nicAB se subclonaron en el plásmido de amplio espectro
de huésped pBBR1MCS-5 como un fragmento
HindIII-EcoRI de 4.6 kb, dando lugar al plásmido
pNicAB.
En los ejemplos que se exponen a continuación se
detalla la experimentación necesaria para desarrollar esta patente
y no se deben considerar como limitación del alcance de la presente
invención.
Como ya se ha comentado el análisis del genoma
de P. putida KT2440 permitió identificar un fragmento de ADN
de 12723 pb, localizado en la posición 4.4 Mb del genoma, que
contiene un agrupamiento de genes denominado cluster nic
cuya función se desconocía (Jiménez et al. Environ.
Microbiol, 2002, 4, 824-841). Por otra parte, se
había comprobado que la bacteria P. putida KT2440 podía
crecer en un medio que contenía NA como única fuente de carbono y
energía, pero se desconocían los genes que eran utilizados por la
bacteria para degradar este compuesto (Jiménez et al. Environ.
Microbiol, 2002, 4, 824-841). Posteriormente, a
partir de estas dos observaciones y como inicio de la presente
invención se hipotetizó que tal vez genes existentes en el cluster
nic (inicialmente denominado así por la posibilidad de que
estuviese involucrado en la degradación de un compuesto
nitrogenado, comentario éste no referenciado en la
publicación) pudieran estar implicados en la degradación de NA. El
análisis de dicho cluster ha permitido la identificación y
aislamiento posterior de una serie de secuencias de ácido nucleico
que tras los estudios de actividad de sus productos proteicos
expresados (ver ejemplos posteriores) corresponden a varios genes
implicados en la degradación de NA: una primera etapa de la ruta de
degradación de NA, la conversión de éste en 6HNA, que estaría
catalizada por los productos proteicos de los genes nicA
(SEQ ID NO1) y nicB, (SEQ ID NO3) y, una segunda etapa, la
hidroxilación del 6HNA, que estaría mediada por el producto
proteico del gen nicC (SEQ ID NO5). Las proteínas
anteriormente mencionadas NicA, NicB y NicC están identificadas por
las secuencias SEQ ID NO2, SEQ ID NO4 y SEQ ID NO6,
respectivamente.
Para demostrar si efectivamente el cluster
nic estaba involucrado en la degradación del NA se procedió
a obtener un mutante de P. putida KT2440 inactivado en uno
de los genes postulados, el gen nicC, primer gen de uno de
los operones que integran el cluster nic.
Se amplificó por PCR un fragmento interno del
gen nicC empleando los oligonucleótidos nih5
(GCAAGCTTCAT
CGGGTGGCAGGCG) (SEQ ID NO8) y nih3 (CCGAATTCCGCTGGGCGAGTTTGC) (SEQ ID N09) y DNA cromosómico de P. putida KT2440 como molde de la reacción y cuya secuencia de nucleótidos se corresponde con la SEQ ID NO7. Los oligonucleótidos nih5 y nih3 incluyen dianas de restricción HindIII y EcoRI respectivamente (subrayadas debajo de la secuencia), que se usaron para clonar el producto de la amplificación en pK18mob, un plásmido movilizable que replica en E. coli pero no en Pseudomonas y confiere resistencia a kanamicina (Schafer et al. Gene, 1994, 145, 69-73), previamente digerido con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI. El plásmido resultante, pKnicC (4.4 kb), se seleccionó transformando la mezcla de ligación en E. coli DH10B (Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York), y la presencia del fragmento nicC se confirmó mediante secuenciación utilizando ddNTPs fluorescentes y un secuenciador automático (Applied Biosystems, Inc). Todas las técnicas de manipulación de DNA, PCR y transferencia génica por transformación empleadas en este y otros ejemplos de esta patente son de uso generalizado en biología molecular y están descritas en textos generales (por ej., Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York). El plásmido pKnicC se transfirió a P. putida KT2440 por conjugación triparental según se describe en la literatura (Herrero et al. J. Bacteriol 1990, 172, 6557-6567). Para ello, se cultivaron en medio LB (Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. 1989, Molecular Cloning. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York) células de E. coli DH10B (pKnicC) (kanamicina 30 \mug/ml), E. coli HB101 (pRK600) (cloramfenicol 34 \mug/ml), cepa que aporta las funciones para la transferencia del plásmido pKnicC (Herrero et al. J. Bacteriol 1990, 172, 6557-6567), y P. putida KT2440. Se toma 1 ml de cada cultivo que, tras tres lavados sucesivos, se resuspende en 100 \mul de medio LB. Se mezclan 100 \mul de cada cultivo y la mezcla se deposita sobre un filtro de nitrocelulosa (0.22 \mum, Millipore) durante 8 horas a 30°C. Finalmente, las células se resuspenden en 1 ml de solución salina y se cultivan en placas de medio M63-agar que contiene citrato al 0.2% (p/v) y el antibiótico kanamicina (30 \mug/ml) de forma que sólo se seleccionan aquellas células de P. putida KT2440 que hayan adquirido el plásmido pKnicC. Dado que pKnicC no es capaz de replicar en Pseudomonas, los exconjugantes que crecen en M63-kanamicina son células de P. putida KT2440 que han integrado por recombinación homóloga el plásmido pKnicC en la copia cromosómica del gen nicC, o sea, células con una disrupción del gen nicC. Uno de los clones exconjugantes, P. putida KT2440dnicC, se analizó por PCR para confirmar la disrupción del gen nicC. Un esquema de este proceso puede verse en la Figura 1.
CGGGTGGCAGGCG) (SEQ ID NO8) y nih3 (CCGAATTCCGCTGGGCGAGTTTGC) (SEQ ID N09) y DNA cromosómico de P. putida KT2440 como molde de la reacción y cuya secuencia de nucleótidos se corresponde con la SEQ ID NO7. Los oligonucleótidos nih5 y nih3 incluyen dianas de restricción HindIII y EcoRI respectivamente (subrayadas debajo de la secuencia), que se usaron para clonar el producto de la amplificación en pK18mob, un plásmido movilizable que replica en E. coli pero no en Pseudomonas y confiere resistencia a kanamicina (Schafer et al. Gene, 1994, 145, 69-73), previamente digerido con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI. El plásmido resultante, pKnicC (4.4 kb), se seleccionó transformando la mezcla de ligación en E. coli DH10B (Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York), y la presencia del fragmento nicC se confirmó mediante secuenciación utilizando ddNTPs fluorescentes y un secuenciador automático (Applied Biosystems, Inc). Todas las técnicas de manipulación de DNA, PCR y transferencia génica por transformación empleadas en este y otros ejemplos de esta patente son de uso generalizado en biología molecular y están descritas en textos generales (por ej., Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York). El plásmido pKnicC se transfirió a P. putida KT2440 por conjugación triparental según se describe en la literatura (Herrero et al. J. Bacteriol 1990, 172, 6557-6567). Para ello, se cultivaron en medio LB (Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. 1989, Molecular Cloning. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York) células de E. coli DH10B (pKnicC) (kanamicina 30 \mug/ml), E. coli HB101 (pRK600) (cloramfenicol 34 \mug/ml), cepa que aporta las funciones para la transferencia del plásmido pKnicC (Herrero et al. J. Bacteriol 1990, 172, 6557-6567), y P. putida KT2440. Se toma 1 ml de cada cultivo que, tras tres lavados sucesivos, se resuspende en 100 \mul de medio LB. Se mezclan 100 \mul de cada cultivo y la mezcla se deposita sobre un filtro de nitrocelulosa (0.22 \mum, Millipore) durante 8 horas a 30°C. Finalmente, las células se resuspenden en 1 ml de solución salina y se cultivan en placas de medio M63-agar que contiene citrato al 0.2% (p/v) y el antibiótico kanamicina (30 \mug/ml) de forma que sólo se seleccionan aquellas células de P. putida KT2440 que hayan adquirido el plásmido pKnicC. Dado que pKnicC no es capaz de replicar en Pseudomonas, los exconjugantes que crecen en M63-kanamicina son células de P. putida KT2440 que han integrado por recombinación homóloga el plásmido pKnicC en la copia cromosómica del gen nicC, o sea, células con una disrupción del gen nicC. Uno de los clones exconjugantes, P. putida KT2440dnicC, se analizó por PCR para confirmar la disrupción del gen nicC. Un esquema de este proceso puede verse en la Figura 1.
A diferencia de la cepa parental, el mutante
P. putida KT2440dnicC ha perdido la capacidad de
utilizar NA como única fuente de carbono y energía, con lo que se
demostraba por primera vez que el cluster nic estaba
involucrado en la degradación del NA y que la hipótesis de partida
expresada en el Ejemplo 1 era correcta.
Se inoculó la cepa mutante P. putida
KT2440dnicC a una DO_{600 \ nm} de 0.1 en medio mínimo M63
suplementado con citrato 0.2% (p/v) como fuente de carbono,
elementos traza (Bauchop and Elsden. 1960. J. Gen.
Microbiol. 23, 457-469), kanamicina (30
\mug/ml), y NA (5 mM). Se tomaron alícuotas a diferentes tiempos
de incubación con agitación (300 rpm) a 30°C, se centrifugaron y el
sobrenadante libre de células se sometió a un análisis por HPLC
según se describe más adelante. El resultado del análisis reveló
que el NA se había transformado en 6HNA al cabo de 12 horas de
incubación con un rendimiento del 85%. La cepa parental P.
putida KT2440 incubada en similares condiciones no acumuló
6HNA. Estos resultados indican que la inactivación del gen
nicC de P. putida KT2440 provoca la transforma-
ción de NA a su derivado hidroxilado 6HNA, el cual se secreta fuera de la célula y se acumula en el medio de cultivo.
ción de NA a su derivado hidroxilado 6HNA, el cual se secreta fuera de la célula y se acumula en el medio de cultivo.
Para la detección de 6HNA en las diferentes
muestras de este ejemplo 2.2 y en los siguientes 2.3 y 3, se
preparan diluciones 1/100 de los sobrenadantes libres de células y
se analizan 20 \mul de cada una de ellas mediante HPLC empleando
un equipo Gilson equipado con una columna phenomenex 5
RP-18 (150x4.60 mm) y un
diodo-array. Se utilizan las condiciones descritas
previamente (Hurh et al. J. Ferm. and Bioeng., 1994, 77,
382-385). El eluyente utilizado es una solución de
fosfato sódico (10 mM pH 3.0)/acetonitrilo (98/2, v/v) a un flujo
de 1 ml/min. Dos picos con tiempos de retención de 4.9 y 8.1
minutos coincidentes con los de los compuestos patrón NA y 6HNA
(adquiridos de Sigma) respectivamente, fueron detectados
espectrofotométricamente a 210 nm. Los espectros de absorción de
los dos picos detectados corresponden a los de los patrones NA y
6HNA.
Se inocula la cepa mutante P. putida
KT2440dnicC a una DO_{600 \ nm} de 0.1 en medio mínimo M63
suplementado con citrato 0.2% (p/v) como fuente de carbono,
elementos traza, kanamicina (30 \mug/ml) y con NA (1 mM) como
inductor de la conversión. Tras incubación a 30°C con agitación
(300 rpm) hasta alcanzar DO_{600} de 0.8, el cultivo se
centrifugó y las células se lavaron con un volumen de solución
salina. El sedimento celular se resuspendió en 1/5 de volumen de
medio M63 conteniendo NA (5 mM). La suspensión de bacterias (10
ml) se incubó a 30°C con agitación y se tomaron muestras (0.1 ml) a
distintos tiempos. Las muestras se centrifugaron 2 minutos en una
microcentrífuga (12000 rpm) y el sobrenadante libre de células se
sometió al análisis descrito en el Ejemplo 2.1. Se observó que al
cabo de 6 horas de incubación el NA se había transformado en 6HNA
con un rendimiento del 98% (véase Tabla 1).
Rendimiento de la conversión del
ácido nicotínico (NA) en el ácido
6-hidroxinicotínico (6HNA) en función del tiempo de
ensayo utilizando distintas bacterias nativas, mutantes y
recombinantes. El rendimiento está expresado en porcentaje
sobre el total de moles de ácido nicotínico (NA) incluido en el
ensayo.
La construcción del plásmido pNicAB que contiene
los genes nicAB bajo el control del promotor Plac se
realizó en dos etapas. Primeramente, el cósmido 3n5 (amablemente
cedido por Diana Stjepandic del Krebsforschungszentrum de
Heidelberg, Alemania), que contiene clonado una región del genoma
de P. putida KT2440 que abarca desde la posición 4421 kb a
la 4464 kb, se digirió con las enzimas de restricción EcoRI
y ScaI aislándose un fragmento de 4.1 kb que comprende el
gen nicB y gran parte del gen nicA. Dicho fragmento
se subclonó en el plásmido pUC19 (Yanisch-Perron
et al. Gene, 1985, 33, 103-119) digerido con
las enzimas EcoRI y SmaI, generando el plásmido
pFUSAB (6.8 kb), que se aisló en células de E. coli DH10B
resistentes a ampicilina (100 \mug/ml) transformadas con la mezcla
de ligación. Para reconstituir el gen nicA completo en
pFUSAB, se amplificó del cromosoma de P. putida KT2440 un
fragmento de 1.4 kb mediante PCR con los oligonucleótidos nicA5
(GGGGATCCGTAACCGTTGCCGCCACCACCGTATTCG, contiene la diana de
restricción BamHI, subrayada, e híbrida con el extremo 5'
del gen nicA) (SEQ ID NO10) y SgraI (CGCTGTCATGGCCGGCATAGGG,
híbrida en el gen nicB) (SEQ ID NO11). El fragmento
amplificado se digirió con las enzimas de restricción BamHI
y SgrAI y reemplazó al fragmento BamHI-SgrAI
de 1.2 kb del plásmido pFUSAB generándose un plásmido, pUCNAB (7.3
kb), que contiene los genes nicA y nicB completos
bajo el control del promotor Plac.
Dado que el plásmido pUCNAB sólo replica en
E. coli, los genes nicA y nicB se subclonaron
en un plásmido de amplio espectro de huésped y que confiere
resistencia a gentamicina, pBBR1MCS-5 (Kovach et
al. Gene, 1995, 166, 175-176). Para ello, los
genes nicA y nicB se aislaron del plásmido pUCNAB
tras digerir éste con las enzimas de restricción EcoRI y
HindIII, y el fragmento resultante se ligó con el plásmido
pBBR1MCS-5 tratado con las mismas enzimas. Se
transformó la mezcla de ligación en la cepa E. coli DH10B y
se seleccionaron los clones resistentes a gentamicina (10 \mug/ml)
y portadores de un plásmido, pNicAB (9.4 kb), capaz de replicar en
diversos microorganismos y que expresa los genes nicA y
nicB bajo el control del promotor heterólogo Plac. Un
esquema de este proceso puede verse en la Figura 2.
El plásmido pNicAB se transfirió desde E.
coli a Pseudomonas fluorescens R2f (van Elsas et
al., 1988, FEMS Microbiol. Ecol., 53,
299-306) y Pseudomonas sp. DSM 6412
(Blaschke et al. Arch. Microbiol. 1991, 155,
164-169), dos cepas incapaces de utilizar NA,
mediante conjugación triparental según se describe en el Ejemplo 2,
seleccionándose los exconjugantes en placas de medio mínimo que
contenían gentamicina (10 \mug/ml) y citrato (0.2%, p/v) como
única fuente de carbono y energía. La presencia del plásmido pNicAB
en los exconjugantes se confirmó mediante su extracción y la
determinación de su perfil de restricción.
Se inocularon las cepas P. fluorescens
R2f (pNicAB) y Pseudomonas sp. DSM 6412 (pNicAB) en medio
mínimo M63 suplementado con citrato 0.2% (p/v) como fuente de
carbono, elementos traza y gentamicina (10 \mug/ml). Tras
incubación a 30°C con agitación (300 rpm) hasta alcanzar DO_{600}
de 0.8, los cultivos se centrifugaron y las células se lavaron con
un volumen de solución salina. Los sedimentos celulares se
resuspendieron en 1/5 de volumen de medio M63 conteniendo NA (5
mM). Las suspensiones celulares (10 ml) se incubaron a 30°C con
agitación y se tomaron muestras (0.1 ml) a distintos tiempos. Las
muestras se centrifugaron 2 minutos en una microcentrífuga (12000
rpm) y los sobrenadantes libres de células se analizaron según se
describe en el Ejemplo 2. Se observó que al cabo de 6 horas de
incubación el NA se había transformado en 6HNA con un rendimiento
similar al que proporciona la cepa P. putida
KT2440dnicC (Ejemplo 2) (véase Tabla 1). Las cepas P.
fluorescens R2f y Pseudomonas sp. DSM 6412 que contienen
el plásmido control pBBR1MCS-5 incubadas en
condiciones similares a las descritas anteriormente no generan
conversión alguna del NA, lo que demuestra que son necesarios los
genes nicA y nicB para la biosíntesis de 6HNA a
partir de NA, y que los productos de dichos genes son funcionales
en bacterias distintas a la cepa parental.
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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MICROORGANISMO PRODUCTOR DE 6HNA,
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN, ELEMENTOS NECESARIOS PARA SU
REALIZACIÓN Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6HNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 666
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas putida 2440
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(666)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<221> 221
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<212> PRT
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<213> Pseudomonas putida KT2440
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 3564
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<212> DNA
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<213> Pseudomonas putida KT2440
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(3564)
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 1187
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PRT
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<213> Pseudomonas putida KT2440
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 1470
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<212> DNA
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<213> Pseudomonas putida KT2440
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> Promoter
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<222> (1)..(321)
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<220>
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<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (322)..(1470)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 382
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas putida KT2440
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 636
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas putida KT2440
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo nih5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagcttca tcgggtggca ggcg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo nih3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgaattccg ctgggcgagt ttgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo nicA5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggatccgt aaccgttgcc gccaccaccg tattcg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo SqraI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctgtcatg gccggcatag gg
\hfill22
Claims (35)
1. Microorganismo genéticamente transformado
útil para la producción de 6HNA a partir de NA,
caracterizado porque presenta una alteración genética del
cluster genético nic de modo que el microorganismo presenta
los genes nicA y nicB ya sean de origen endógeno o
exógeno -por transferencia de los genes nicA y nicB
de otro microorganismo- y no presenta el gen nicC o la
expresión de dicho gen nicC se encuentra inactivada mediante
alteración genética.
2. Microorganismo según la reivindicación 1
caracterizado porque el microorganismo pertenece al género
Pseudomonas.
3. Microorganismo según la reivindicación 2
caracterizado porque el microorganismo es la cepa
Pseudomonas putida KT2440dnicC depositado en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número CECT
7048.
4. Microorganismo según la reivindicación 2
caracterizado porque el microorganismo es la cepa
Pseudomonas fiuorescens R2f (pNicAB) depositado en la CECT
con el número CECT 7049.
5. Procedimiento de obtención del microorganismo
según las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque se
lleva a cabo mediante la manipulación endógena o exógena de los
genes de la ruta nic.
6. Procedimiento según la reivindicación 5
caracterizado porque la manipulación consiste en la
inactivación del gen nicC endógeno de un microorganismo que
posee la ruta nic.
7. Procedimiento según la reivindicación 6
caracterizado porque la inactivación del gen nicC se
realiza por una técnica o método de mutagénesis perteneciente al
siguiente grupo: la mutagénesis química, la mutagénesis por
irradiación, la mutagénesis por transposones, la mutagénesis por
minitransposones, otras técnicas de mutagénesis al azar o
mutagénesis por recombinación homologa, empleo de sistemas de RNA
antisentido o mediante el empleo de proteínas reguladoras que
impidiesen su transcripción.
8. Procedimiento según la reivindicación 7
caracterizado porque es un proceso de mutagénesis por
recombinación homóloga del gen nicC unida o no a una
secuencia limítrofe.
9. Procedimiento según la reivindicación 8
caracterizado porque es un procedimiento de recombinación
homóloga que comprende los siguientes pasos:
- a)
- construcción de un vector de clonación que contenga un fragmento de la secuencia de nucleótidos del gen nicC unida o no a una secuencia limítrofe, y que sea capaz de replicarse en un microorganismo que actúa de huésped para su replicación, pero que no sea capaz de replicarse en el microorganismo original que se quiere mutagenizar por transformación genética, y
- b)
- transformación genética del microorganismo original mediante recombinación homóloga con el vector de a) en condiciones adecuadas.
10. Procedimiento según la reivindicación 9
caracterizado porque el vector de clonación de a) es un
plásmido.
11. Procedimiento según la reivindicación 9
caracterizado porque la recombinación homóloga se realiza
mediante conjugación triparental y porque el fragmento del gen
nicC está constituido por la secuencia de nucleótidos SEQ ID
NO7, el vector es el plásmido pKnicC y el microorganismo original
es la cepa P. putida.
12. Secuencia de nucleótidos del gen nicC
caracterizada porque es una secuencia de nucleótidos
perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de nucleótidos del gen nicC de P. putida KT2440 constituida por la SEQ ID NO5,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) capaz de inactivar la expresión del gen nicC por mutagénesis insercional mediante recombinación homóloga,
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b), c) y d).
13. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 12 caracterizada porque es la secuencia SEQ
ID NO5.
14. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 12 caracterizada porque es un fragmento del
gen nicC c) de secuencia SEQ ID NO7.
15. Vector de clonación caracterizado
porque comprende una secuencia de nucleótidos según las
reivindicaciones 12 a la 14 y que permite llevar a cabo una
recombinación homóloga de un gen nicC endógeno.
16. Vector de clonación según la reivindicación
15 caracterizado porque es un vector movilizable capaz de
replicarse en E. coli.
17. Vector de clonación según la reivindicación
16 caracterizado porque el vector es el plásmido pKnicC.
18. Procedimiento según la reivindicación 5
caracterizado porque es un procedimiento de transformación
génica de un microorganismo, que inicialmente es incapaz de
degradar NA, con las secuencias de nucleótidos codificantes de las
proteínas NicA y NicB.
19. Procedimiento según la reivindicación 18
caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
- a)
- construcción de un vector de expresión que comprenda las secuencias de nucleótidos de los genes nicA y nicB, y
- b)
- transformación genética del microorganismo original mediante el vector de expresión de a) en condiciones adecuadas.
20. Procedimiento según la reivindicación 19
caracterizado porque el vector de clonación de a) es un
plásmido.
21. Procedimiento según la reivindicación 19
caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del gen
nicA es la SEQ ID NO1 y la del gen nicB es la SEQ ID
NO3, el vector de clonación utilizado es el plásmido pNicAB, la
transformación se realiza mediante conjugación triparenteral y el
microorganismo original es una cepa perteneciente al siguiente
grupo: Pseudomonas fluorescens R2f y Pseudomonas sp.
DSM 6412.
22. Secuencia de nucleótidos del gen nicA
caracterizada porque es una secuencia de nucleótidos
perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de nucleótidos del gen nicA de P. putida KT2440 constituida por la SEQ ID NO1,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) que permita la codificación de un péptido o proteína capaz de mimetizar la acción de la proteína NicA, y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
23. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 22 caracterizada porque es la secuencia SEQ
ID NO1.
24. Secuencia de nucleótidos del gen nicB
caracterizada porque es una secuencia de nucleótidos
perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de nucleótidos del gen nicB de P. putida KT2440 constituida por la SEQ ID NO3,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) que permita la codificación de un péptido o proteína capaz de mimetizar la acción de la proteína NicB, y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
25. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 24 caracterizada porque es la secuencia SEQ
ID NO3.
26. Vector de clonación caracterizado
porque comprende una secuencia de nucleótidos nicA o
nicB, ambas, o una construcción genética que contenga las
anteriores y que permite la expresión de las proteínas NicA y NicB
en una célula huésped en condiciones adecuadas.
27. Vector de clonación según la reivindicación
26 caracterizado porque el vector es el plásmido pNicAB.
28. Uso del microorganismo según las
reivindicaciones 1 a la 4 para la elaboración de un procedimiento
de obtención de 6HNA en condiciones adecuadas de cultivo.
29. Uso del microorganismo según la
reivindicación 28 caracterizado porque el microorganismo es
una cepa que presenta el gen nicC inactivado.
30. Uso del microorganismo según la
reivindicación 29 caracterizado porque el microorganismo es
la cepa mutante P. putida KT2440dnicC (CECT 7048) que
se cultiva preferentemente en un medio adecuado suplementado con
una fuente de carbono, elementos traza, antibióticos y NA.
31. Uso del microorganismo según la
reivindicación 30 caracterizado porque se lleva a cabo tanto
con células en crecimiento como en células en suspensión.
32. Uso del microorganismo según la
reivindicación 28 caracterizado porque el microorganismo es
un microorganismo transformado con los genes nicA y
nicB.
33. Uso del microorganismo según la
reivindicación 32 caracterizado porque el microorganismo es
la cepa P. fluorescens R2f (pNicAB) (CECT 7049) que se
cultiva en medio adecuado suplementado con una fuente de carbono,
elementos traza, antibióticos y NA.
34. Secuencia de aminoácidos
caracterizada por la SEQ ID NO2 o SEQ ID NO4 codificada por
la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO1 o SEQ ID NO3 correspondiente
a la proteína NicA y NicB, respectivamente.
35. Uso de la secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 34 en un procedimiento de síntesis enzimática de
6HNA.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200501209A ES2288070B1 (es) | 2005-05-18 | 2005-05-18 | Microorganismo productor de 6hna, procedimiento de obtencion, elementos para su realizacion y sus aplicaciones. |
| PCT/ES2006/070063 WO2006123007A1 (es) | 2005-05-18 | 2006-05-17 | Microorganismo productor de 6hna, procedimiento de obtención, elementos para su realización y sus aplicaciones |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200501209A ES2288070B1 (es) | 2005-05-18 | 2005-05-18 | Microorganismo productor de 6hna, procedimiento de obtencion, elementos para su realizacion y sus aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2288070A1 ES2288070A1 (es) | 2007-12-16 |
| ES2288070B1 true ES2288070B1 (es) | 2008-11-01 |
Family
ID=37430960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200501209A Expired - Fee Related ES2288070B1 (es) | 2005-05-18 | 2005-05-18 | Microorganismo productor de 6hna, procedimiento de obtencion, elementos para su realizacion y sus aplicaciones. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2288070B1 (es) |
| WO (1) | WO2006123007A1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10055869A1 (de) * | 2000-11-10 | 2002-05-29 | Degussa | Neue für das nadA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
-
2005
- 2005-05-18 ES ES200501209A patent/ES2288070B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-05-17 WO PCT/ES2006/070063 patent/WO2006123007A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JIMÉNEZ, J. I., MIÑAMBRES, B., GARCÍA, J. L., DÍAZ, E. Genomic analysis of the aromatic catabolic pathways from Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. Diciembre 2002, Vol. 4, Nº 12, páginas 824-841. ISSN 1462-2912. * |
| NAKANO, H., WIESER, M., HURH, B. et al. Purification, characterization and gene cloning of 6-hydroxynicotinate 3-monooxygenase from Pseudomonas fluorescens TN5. European Journal of Biochemistry/ FEBS. Febrero 1999, Vol. 260, páginas 120-126. ISSN 0014-2956. * |
| NELSON, K. E., WEINEL, C., PAULSEN, I. T. et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metadolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. Diciembre 2002, Vol. 4, Nº 12, páginas 799-808. ISSN 1462-2912. \\ A 27-33,35 * |
| THACKER, R., RORVIG, O., KAHLON, P., GUNSALUS, I. C. NIC, a conjugative nicotine-nicotinate degradative plasmid in Pseudomonas convexa. Journal of Bacteriology. Julio 1978, Vol. 135, Nº1, páginas 289-290. ISSN 0021-9193. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2288070A1 (es) | 2007-12-16 |
| WO2006123007A1 (es) | 2006-11-23 |
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