ES2252863T3 - Cepas de levadura para la produccion de acido lactico. - Google Patents
Cepas de levadura para la produccion de acido lactico.Info
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Abstract
Una cepa de Pichia, Kluyveromyces, Torulaspora o Zygosaccharomyces transformada con al menos una copia de un gen que codifica para la lactato deshidrogenasa conectado funcionalmente a secuencias promotoras que permiten la expresión de dicho gen en levaduras, y en la que dicha cepa está modificada genéticamente para tener unas actividades de piruvato descarboxilasa y/o de piruvato deshidrogenasa reducidas.
Description
Cepas de levadura para la producción de ácido
láctico.
La invención se refiere a cepas de levadura
transformadas con al menos una copia de un gen que codifica para la
lactato deshidrogenasa (LDH) y modificadas adicionalmente para la
producción de ácido láctico con un alto rendimiento y
productividad.
Las aplicaciones del ácido láctico y sus
derivados abarcan muchos campos de actividades industriales (es
decir, química, cosmética y farmacia), así como aspectos
importantes de la elaboración y uso de alimentos. Adicionalmente,
hoy en día existe un creciente interés en la producción de dicho
ácido orgánico para ser usado directamente en la síntesis de
materiales poliméricos biodegradables.
El ácido láctico puede producirse mediante
síntesis química o mediante la fermentación de hidratos de carbono
usando microorganismos.
Éste ultimo procedimiento es ahora preferible
comercialmente porque se han desarrollado microorganismos que
producen exclusivamente un isómero, por oposición a la mezcla
racémica producida mediante síntesis química. Los microorganismos
industriales más importantes, tales como especies de los géneros
Lactobacillus, Bacillus y Rhizopus, producen
ácido L(+)-láctico. También es conocida la
producción, mediante fermentación, de ácido
D(-)-láctico o de mezclas de ácido L(+)- y
D(-)-láctico.
Durante una fermentación típica de ácido láctico
hay un efecto inhibidor, causado por el ácido láctico producido,
sobre las actividades metabólicas del microorganismo productor.
Aparte de la presencia de ácido láctico, la disminución del valor
del pH también inhibe el crecimiento celular y la actividad
metabólica.
Como resultado, el grado de producción de ácido
láctico se reduce en gran medida.
Por lo tanto, la adición de
Ca(OH)_{2}, CaCO_{3}, NaOH o NH_{4}OH para
neutralizar el ácido láctico y evitar así la disminución del pH es
una operación convencional en los procesos industriales para
contrarrestar los efectos negativos de la acumulación de ácido
láctico libre.
Estos procesos permiten la producción de
lactato(s) manteniendo el pH a un valor constante en el
intervalo de aproximadamente 5 a 7; esto está bastante por encima
del pK_{a} del ácido láctico, 3,86.
Los principales inconvenientes están relacionados
con la neutralización del ácido láctico durante la fermentación. En
la mayoría de los casos se requieren operaciones adicionales para
producir ácido láctico libre a partir de su sal, y desechar o
reciclar el catión neutralizante; este proceso es caro. Todas las
operaciones y gastos extraordinarios podrían eliminarse si el ácido
láctico libre pudiera ser acumulado por microorganismos que crecen
a valores de pH bajos, minimizando así la producción de
lactato(s).
Se ha propuesto el uso de levaduras recombinantes
que expresen el gen de la lactato deshidrogenasa de forma que el
flujo glucolítico cambie hacia la producción de ácido láctico.
El documento
FR-A-2692591 (Institut Nationale la
Recherche Agronomique) describe cepas de levaduras, particularmente
cepas de Saccharomyces, que contienen al menos una copia de
un gen que codifica para una lactato deshidrogenasa procedente de
una bacteria láctica, estando dicho gen bajo el control de
secuencias que regulan su expresión en levaduras.
Dichas cepas pueden realizar tanto la
fermentación alcohólica como la láctica, y ésta denominada
fermentación "intermedia" o "equilibrada" podría
explotarse en áreas tales como la elaboración de cerveza, la
enología y la panadería.
Porro y col., (Biotechnol. Prog. 11,
294-298, 1995) también han referido la
transformación de S. cerevisiae con un gen que codifica para
la lactato deshidrogenasa bovina.
Sin embargo, debido a la alta producción de
etanol, el rendimiento en la producción de ácido láctico para los
dos procesos descritos no se consideró competitivo con el obtenible
mediante el uso de bacterias lácticas.
En la pasada década, las "levaduras no
convencionales" diferentes a S. cerevisiae han cobrado un
considerable interés industrial como hospedadoras para la expresión
de proteínas heterólogas. Algunos ejemplos son las levaduras que
utilizan metanol, tales como Hansenula polimorpha y Pichia
pastoris, las levaduras que utilizan lactosa, tales como
Kluyveromyces lactis. Además de permitir el uso de un
intervalo más amplio de sustratos como fuentes de carbono y de
energía, podrían ofrecerse otros argumentos para el uso industrial
de las "levaduras no convencionales". Hablando de forma
general, la biomasa y el rendimiento del producto se ven menos
afectados, en algunas de estas levaduras, por las condiciones
extremas del entorno celular. Están disponibles las "levaduras no
convencionales" tolerantes a altos niveles de azúcar (es decir,
el 50-80% p/v de medio de glucosa;
Torulaspora -sin. Zygosaccharomyces
delbrueckii, Zygosaccharomyces rouxii y
Zygosaccharomyces bailii; Ok T y Hashinaga F., Journal of
General & Applied Microbiology 43 (1): 39-47,
1997) y tolerantes ácidas y lácticas (Zygosaccharomyces
rouxii y Zygosaccharomyces bailii; Houtsma PC,
y col., Journal of Food Protection 59 (12),
1300-1304, 1996.). Según se subrayó anteriormente,
el coste del tratamiento corriente abajo podría reducirse
fuertemente si el proceso de fermentación se lleva a cabo en una o
más de las anteriormente mencionadas "condiciones
extremas".
Según una primera forma de realización, esta
invención proporciona cepas de levadura transformadas con al menos
una copia de un gen que codifica para una lactato deshidrogenasa
(LDH) conectada funcionalmente a secuencias promotoras que permiten
la expresión de dicho gen en levaduras.
Según otra forma de realización, esta invención
proporciona cepas de las especies de levaduras Kluyveromyces,
Torulaspora y Zygosaccharomyces, transformadas con al
menos una copia de un gen que codifica para una lactato
deshidrogenasa (LDH) conectada funcionalmente a secuencias
promotoras que permiten la expresión del gen en dichas
levaduras.
Según una forma de realización adicional, la
invención también proporciona células de levadura transformadas con
un gen de LDH heterólogo y que sobreexpresa un transportador de
lactato.
Otras formas de realización son los vectores de
expresión que comprenden una secuencia de ADN que codifica para una
lactato deshidrogenasa conectada funcionalmente a una secuencia
promotora de levadura, y un proceso para la preparación de ácido
DL, D o L-láctico cultivando las cepas de levadura
con el metabolismo modificado genéticamente descritas anteriormente
en un medio de fermentación que contiene una fuente de carbono, y
recuperando el ácido láctico del medio de fermentación.
Adicionalmente, la invención proporciona procesos
para mejorar la productividad (g/l/h), la producción (g/l) y el
rendimiento (g/g) sobre la fuente de carbono del ácido láctico
mediante el cultivo de dichas cepas de levadura en un medio de
fermentación manipulado, y recuperar el ácido láctico del medio de
fermentación.
Se ha averiguado que puede obtenerse la
producción de ácido láctico mediante levaduras con metabolismos
modificados pertenecientes a los géneros Kluyveromyces,
Saccharomyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces.
Más particularmente, se ha averiguado que se
obtienen rendimientos muy altos en la producción de ácido láctico
mediante cepas de levadura modificadas genéticamente, de forma que
se sustituya al menos la fermentación etanólica por la fermentación
láctica.
Pueden obtenerse incluso rendimientos más altos
(>80% g/g) en la producción de ácido láctico mediante las cepas
de levadura modificadas genéticamente de forma que se sustituya
tanto la fermentación etanólica como el uso del piruvato por la
mitocondria mediante la fermentación láctica.
Con este propósito, la invención también
proporciona células de levadura transformadas con una actividad
aumentada de la LDH, por ejemplo, como consecuencia de un número de
copias elevado de la LDH por célula o del uso de promotores más
fuertes que controlan la expresión de la LDH.
Un número de copias elevado de la LDH por célula
significa al menos una copia de una secuencia de un ácido nucleico
que codifica para la proteína de la lactato deshidrogenasa,
preferiblemente al menos dos copias, más preferiblemente cuatro
copias, o incluso más preferiblemente al menos 10-50
copias de dicha secuencia de ácido
nucleico.
nucleico.
Con objeto de obtener la mayor producción de
ácido láctico, las células de levadura transformadas según la
invención sobreexpresan preferiblemente un transportador de lactato.
Esto puede obtenerse transformando células de levadura con una o
más copias de un gen necesario para el transporte de lactato.
Las cepas según la invención pueden obtenerse
mediante varios procedimientos, por ejemplo, mediante técnicas de
ingeniería genética orientadas a la expresión de una actividad de
lactato deshidrogenasa, e inactivando o suprimiendo las actividades
de piruvato descarboxilasa y de alcohol deshidrogenasa, e
inactivando o suprimiendo las actividades enzimáticas implicadas en
la utilización del piruvato por la mitocondria.
Dado que la piruvato descarboxilasa cataliza la
primera etapa de la vía del alcohol, son preferibles las cepas de
levadura sin una actividad de piruvato descarboxilasa (PDC), o
sustancialmente reducida, y que expresen un gen heterólogo de la
lactato deshidrogenasa.
Además, dado que la piruvato deshidrogenasa
cataliza la primera etapa en la utilización del piruvato por
la
mitocondria, también son preferibles las cepas de levadura sin una actividad de piruvato deshidrogenasa (PDH), o sustancialmente reducida, y que expresen un gen heterólogo de la lactato deshidrogenasa.
mitocondria, también son preferibles las cepas de levadura sin una actividad de piruvato deshidrogenasa (PDH), o sustancialmente reducida, y que expresen un gen heterólogo de la lactato deshidrogenasa.
Dado que el lactato es excretado al medio a
través de un transportador de lactato, las células que producen el
ácido láctico y que sobreexpresan el transportador de lactato
también son preferibles.
La expresión de un gen de la LDH en las cepas de
levadura permite la producción de ácido láctico a unos valores de
pH ácidos, de forma que se obtiene directamente el ácido libre, y la
molesta conversión y recuperación de las sales de lactato está
minimizada. En esta invención, el pH del medio de fermentación puede
ser inicialmente superior a 4,5, pero disminuirá hasta un pH de 4,5
o menor, preferiblemente hasta un pH de 3 o menor al finalizar la
fermentación.
Según la invención puede usarse cualquier tipo de
cepa de levadura, pero son preferibles las especies
Kluyveromyces, Saccharomyces, Torulaspora y
Zygosaccharomyces debido a que estas cepas pueden crecer y/o
metabolizar a un pH muy bajo, especialmente en el intervalo de pH
de 4,5 o menor; los procedimientos de ingeniería genética para
estas cepas están muy desarrollados; y estas cepas están ampliamente
aceptadas para su uso en aplicaciones relacionadas con
alimentos.
Además, pueden obtenerse buenos rendimientos de
ácido láctico mediante las cepas Kluyveromyces, Torulaspora
y Zygosaccharomyces transformadas con un gen que codifica
para la lactato deshidrogenasa con una actividad "natural" de
piruvato descarboxilasa y/o de piruvato deshidrogenasa.
El término "actividad de piruvato
descarboxilasa reducida" significa, bien una concentración
disminuida de la enzima en la célula, o bien una actividad
catalítica reducida o ausente de la enzima.
El término "actividad de piruvato
deshidrogenasa reducida" significa, bien una concentración
disminuida de la enzima en la célula, o bien una actividad
catalítica reducida o ausente de la enzima.
Según la invención, es preferible el uso de cepas
en las que la producción de etanol es o se aproxima a cero, pero es
aceptable una producción reducida, por ejemplo, de al menos el 60%
menos, preferiblemente de al menos el 80% menos, e incluso más
preferiblemente de al menos el 90% menos de lo normal en las cepas
naturales.
Según la invención, es preferible el uso de cepas
en las que las actividades de piruvato descarboxilasa y/o de
piruvato deshidrogenasa son o se aproximan a cero, pero es aceptable
una actividad reducida, por ejemplo, de al menos el 60% menos,
preferiblemente de al menos el 80% menos, e incluso más
preferiblemente de al menos el 90% menos de lo normal en las cepas
naturales.
Un ejemplo de K. lactis sin actividad PDC
se ha descrito en Mol. Microbiol. 19 (1),
27-36, 1996.
Algunos ejemplos de cepas de Saccharomyces
con una actividad de PDC reducida están disponibles en la ATCC con
los números de acceso 200027 y 200028. Un ejemplo adicional de una
cepa de Saccharomyces con una actividad de PDC reducida como
consecuencia de la deleción del gen regulador PDC2 se ha descrito en
Hohmann S (1993) (Mol Gen Genet 241:
657-666).
Un ejemplo de una cepa de Saccharomyces
con ninguna actividad de PDC se ha descrito en Flikweert M. T. y
col. (Yeast, 12: 247-257, 1996). En S.
cerevisiae, la reducción de la actividad de PDC puede obtenerse
bien mediante la deleción de los genes estructurales (PDC1, PDC5,
PDC6) o bien mediante la deleción del gen regulador (PDC2).
Un ejemplo de una cepa de Kluyveromyces
sin actividad de PDH se ha descrito en Zeeman y col. (Genes involved
in pyruvate metabolism in K. lactis; Yeast, vol. 13
publicación especial de abril de 1997, Eighteenth International
Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, pág. 143).
Un ejemplo de una cepa de Saccharomyces
con ninguna actividad de PDH se ha descrito en Pronk JT. y col.
(Microbiology. 140 (Pt 3): 601-10, 1994).
Los genes de la PDC están altamente conservados
entre los diferentes géneros de levaduras (Bianchi y col.,
Molecular Microbiology, 19 (1): 27-36, 1996; Lu P. y
col., Applied & Environmental Microbiology, 64 (1):
94-7, 1998). Por lo tanto, puede anticiparse
fácilmente que siguiendo las metodologías moleculares clásicas,
según refieren Lu P. y col. (supra), es posible identificar,
clonar y desorganizar el (los) gen(es) requeridos para una
actividad de piruvato descarboxilasa en especies de levadura de
Torulaspora y de Zygosaccharomyces. Adicionalmente,
también puede anticiparse que siguiendo las mismas metodologías
clásicas, según refieren Neveling U. y col. (1998, Journal of
Bacteriology, 180 (6): 1540-8, 1998), es posible
aislar, clonar y desorganizar el (los) gen(es) requeridos
para la actividad de PDH en especies de levadura de
Torulaspora y de Zygosaccharomyces.
La actividad de piruvato descarboxilasa puede
medirse mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, Ulbrich J.,
Methods in Enzymology, Vol. 18, págs. 109-115, 1970,
Academic Press, Nueva York.
La actividad de piruvato deshidrogenasa puede
medirse mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, según
Neveling U. y col. (supra).
Las cepas adecuadas pueden obtenerse
seleccionando las mutaciones y/o modificando genéticamente cepas
naturales o de colección. Podrían seleccionarse cientos de mutantes
mediante metodologías de "cribado de alto rendimiento". La
modulación de la actividad de piruvato descarboxilasa usando
nutrientes que mantienen diferentes tasas de flujo glucolítico
(Biotechnol. Prog. 11, 294-298, 1995) no ha
demostrado ser satisfactoria.
Un procedimiento preferible para disminuir o
destruir la actividad de piruvato descarboxilasa y/o la actividad
de piruvato deshidrogenasa en una cepa de levadura según la
invención consiste en la deleción del correspondiente gen o
genes.
Estas deleciones pueden llevarse a cabo mediante
procedimientos conocidos, tales como los descritos en Bianchi y
col., (Molecular Microbiol. 19 (1), 27-36,
1996; Flikweert M. T. y col., Yeast, 12:
247-257, 1996 y Pronk JT. y col., Microbiology. 140
(Pt 3); 601-10, 1994), mediante una deleción o una
inserción mediante marcadores seleccionables, por ejemplo, el
marcador URA3, preferiblemente el marcador URA3 de Saccharomyces
cerevisiae. Alternativamente pueden introducirse deleciones,
mutaciones puntuales y/o mutaciones del marco de lectura en los
genes promotores y funcionales requeridos para las actividades de
PDC y/o de PDH. Estas técnicas se describen en, por ejemplo,
Nature, 305, 391-397, 1983. Un procedimiento
adicional para reducir estas actividades podría ser la introducción
de codones de terminación en las secuencias de los genes, o la
expresión de ARNm antisentido que inhiban la traducción de los ARNm
de la PDC y de la PDH.
Ya se ha descrito una cepa de Kluyveromyces
lactis en la que el gen de la PDC ha sido sustituido por el gen
URA3 de S. cerevisiae, en Molecular Microbiology 19
(1), 27-36, 1996.
El gen que codifica para la lactato
deshidrogenasa puede ser de cualquier especie (por ejemplo, de un
mamífero, tal como bovino, o bacteriano), y puede codificar para la
L(+)-LDH o para la D(-)-LDH.
Alternativamente, pueden expresarse simultáneamente ambos tipos de
genes de la LDH. Adicionalmente, puede usarse cualquier variante
natural o sintética de las secuencias de ADN de la LDH, cualquier
secuencia de ADN con una alta identidad con el gen natural de la
LDH, cualquier secuencia de ADN que complemente la actividad normal
de la LDH.
Puede usarse un gen transportador, por ejemplo el
gen JEN1, que codifica para el transportador de lactato de S.
cerevisiae.
La transformación de las cepas de levadura puede
llevarse a cabo mediante vectores integrativos o replicativos,
lineales o plasmídicos.
Las células recombinantes de la invención pueden
obtenerse mediante cualquier procedimiento que permita introducir
un ADN foráneo en una célula (Spencer Jf, y col., Journal of Basic
Microbiology 28 (5): 321-333, 1988), por ejemplo,
transformación, electroporación, conjugación, fusión de protoplastos
o cualquier otra técnica conocida. Con respecto a la transformación
se han descrito varios protocolos: en particular, puede llevarse a
cabo tratando las células completas en presencia de acetato de
litio y de polietilenglicol según Ito H. y col. (J. Bacteriol.,
153: 163, 1983), o en presencia de etilenglicol y de
dimetilsulfóxido según Durrens P. y col. (Curr. Genet., 18: 7,
1990). También se ha descrito un protocolo alternativo en el
documento EP 361991. La electroporación puede llevarse a cabo según
Becker D. M. y Guarente L. (Methods in Enzymology, 194: 18,
1991).
El uso de vectores integrativos no bacterianos
puede ser preferible cuando se usa la biomasa de levadura, al final
del proceso de fermentación, como pienso para ganado o para otros
propósitos de crianza, agrícolas o alimentarios.
En una forma de realización particular de la
invención, el ADN recombinante es parte de un plásmido de expresión
que puede ser de replicación autónoma o integrativa.
En particular, pueden obtenerse vectores de
replicación autónoma para S. cerevisiae y para K.
lactis usando las secuencias de replicación autónomas en el
hospedador elegido. Especialmente, en levaduras, pueden ser
orígenes de replicación procedentes de plásmidos (2 \mu, pKD1,
etc.) o incluso secuencias cromosómicas (ARS).
Los vectores integrativos pueden obtenerse usando
secuencias de ADN homólogas en ciertas regiones del genoma del
hospedador, permitiendo, mediante recombinación homóloga, la
integración del vector.
Las herramientas genéticas para la expresión del
gen están muy desarrolladas para S. cerevisiae y se describen
en Romanos, M. A. y col. Yeast, 8: 423, 1992. También se han
desarrollado herramientas genéticas para permitir el uso de las
especies de levadura Kluyveromyces y Torulaspora como
células hospedadoras para la producción de proteínas recombinantes
(Spencer Jf, y col., supra; Reiser J. y col., Advances in
Biochemical Engineering-Biotechnology 43,
75-102, 1990). Se refieren algunos ejemplos de
vectores de replicación autónoma en K. lactis, ya sea
basados en el plásmido lineal pKG1 de K. lactis (de
Lovencourt L. y col. J. Bacteriol., 154: 737, 1982), o que por sí
mismos contienen una secuencia cromosómica de K. lactis
(KARS), lo que confiere al vector la capacidad de autorreplicación
y una correcta segregación (Das S., Hollenberg C.P., Curr. Genet.,
6: 123, 1982).
Además, el reconocimiento de un plásmido de tipo
2 \mu natural en K. drosophilarum (plásmido pKD1- documento
US5166070) ha permitido establecer un sistema hospedador/vector muy
eficaz para la producción de proteínas recombinantes (documento
EP-A-361991). Los vectores
recombinantes basados en pKD1 contienen la secuencia original
completa, fusionada con los apropiados marcadores de levadura y
bacterianos. Alternativamente, es posible combinar parte del pKD1,
con vectores de expresión comunes de S. cerevisiae (Romanos
M. A. y col. Yeast, 8: 423, 1992) (Chen y col., Curr. Genet. 16:
95, 1989).
Se sabe que el plásmido 2 \mu de S.
cerevisiae se replica y se mantiene de forma estable en
Torulaspora. En esta levadura, la expresión de
proteína(s) heteróloga(s) se ha obtenido mediante un
procedimiento de cotransformación, es decir, la presencia
simultánea de un vector de expresión para S. cerevisiae y el
plásmido 2 \mu completo. (Compagno C. y col., Mol. Microb., 3:
1003-1010, 1989). Como resultado de las
recombinaciones inter e intramoleculares, es posible aislar un
plásmido híbrido, portador de la secuencia 2 \mu completa y del
gen heterólogo; dicho plásmido es, en principio, capaz de
transformar directamente Torulaspora.
Adicionalmente, también se ha descrito un
plásmido episomal basado en la secuencia ARS1 de S.
cerevisiae, pero la estabilidad de este plásmido es muy baja,
Compagno y col. (supra).
Recientemente se ha aislado un plásmido endógeno
de tipo 2 \mu denominado pTD1 en Torulaspora (Blaisonneau
J. y col., Plasmid, 38: 202-209, 1997); las
herramientas genéticas disponibles actualmente para S.
cerevisiae pueden ser transferidas al nuevo plásmido,
obteniendo así vectores de expresión dedicados a especies de la
levadura Torulaspora.
Los marcadores genéticos para la levadura
Torulaspora comprenden, por ejemplo, URA3 (Watanabe Y. y
col., FEMS Microb. Letters, 145: 415-420, 1996),
resistencia a G418 (Compagno C. y col., Mol. Microb., 3:
1003-1010, 1989), y resistencia a cicloheximida
(Nakata K. y Okamura K., Biosc. Biotechnol. Biochem., 60:
1686-1689,
1996).
1996).
Los plásmidos de tipo 2 \mu de especies de
Zygosaccharomyces son conocidos, y han sido aislados en Z.
rouxii (pSR1), en Z. bisporus (pSB3), en Z.
fermentati (pSMI) y en Z. bailii (pSB2) (Spencer JF. y
col., supra).
El plásmido pSR1 es el que mejor se conoce: se
replica en S. cerevisiae, pero las ARS de 2 \mu no son
reconocidas en Z. rouxii (Araki H. y Hoshima Y., J. Mol.
Biol., 207: 757-769, 1989).
Los vectores episomales basados en las ARS1 de
S. cerevisiae se describen para Z. rouxii (Araki y
col., Mol Gen. Genet., 238: 120-128, 1993).
Un marcador selectivo para
Zygosaccharomyces es el gen APT1, que permite el crecimiento
en un medio que contiene G418 (Ogawa y col., Agric. Biol. Chem.,
54: 2521-2529, 1990).
Cualquier promotor de levadura, ya sea inducible
o constitutivo, puede usarse según la invención. Hasta la fecha,
los promotores usados para la expresión de proteínas en S.
cerevisiae son descritos por Romanos y col. (supra). Los
promotores usados habitualmente en la expresión foránea de proteínas
en K. lactis son PGK y PHO5 de S. cerevisiae (Romanos
y col., supra), o promotores homólogos, tales como LAC4 (van
den Berg J. A. y col., BioTechnology, 8: 135, 1990) y KIPDC
(documento US5631143). Es particularmente preferible el promotor
del gen de la piruvato descarboxilasa de K. lactis
(KIPDC).
Los vectores para la expresión de genes
heterólogos que son particularmente eficaces para la transformación
de cepas de Kluyveromyces lactis se describen en el documento
US5166070, que se incorpora al presente documento como
referencia.
Son particularmente preferibles los promotores
del gen de la piruvato descarboxilasa, preferiblemente de especies
de Kluyveromyces, e incluso más preferiblemente de
Kluyveromyces lactis, descritos en Molecular Microbiol. 19
(1), 27-36, 1996. También son preferibles los
promotores de la triosa fosfato isomerasa y de la alcohol
deshidrogenasa, preferiblemente de especies de Saccharomyces,
e incluso más preferiblemente de Saccharomyces cerevisiae
(Romanos y col, supra).
Para la producción de ácido láctico, las cepas de
levadura de la invención se cultivan en un medio que contiene una
fuente de carbono y otros nutrientes esenciales, y el ácido láctico
se recupera a un pH de 7 o menor, preferiblemente a un pH de 4,5 o
menor, e incluso más preferiblemente a un pH de 3 o menor. Dado que
el pH del medio de cultivo es reducido, se necesita una cantidad
menor de agente neutralizante. La formación de la sal de lactato
esta correspondientemente reducida, y se requiere proporcionalmente
una menor regeneración del ácido libre con objeto de recuperar el
ácido láctico. El proceso de recuperación puede emplear cualquiera
de los procedimientos conocidos (T. B. Vickroy, volumen 3, capítulo
38 de "Comprehensive Biotechnology," (editor: M.
Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985.) (R. Datta y
col., FEMS Microbiology Reviews 16, 221-231, 1995).
Típicamente, los microorganismos se eliminan mediante filtración o
centrifugación antes de la recuperación del ácido láctico. Algunos
procedimientos conocidos para la recuperación del ácido láctico
incluyen, por ejemplo, la extracción del ácido láctico en una fase
de un disolvente inmiscible o la destilación del ácido láctico o de
un éster del mismo. Se obtienen rendimientos mayores con respecto a
la fuente de carbono (g de ácido láctico/g de glucosa consumida) y
mayores productividades (g de ácido láctico/l/h) haciendo crecer
cepas de levadura, particularmente cepas de Saccharomyces,
en un medio carente de iones Mg^{++} y Zn^{++} o con una
disponibilidad reducida de dichos iones. Preferiblemente, el medio
de cultivo contendrá menos de 5 mM de Mg^{++}, y/o menos de 0,02
mM de Zn^{++}.
La presente invención ofrece las siguientes
ventajas en la producción de ácido láctico:
- 1.
- Cuando se lleva a cabo la fermentación a un pH de 4,5 o menor, hay menos riesgo de contaminación por microorganismos foráneos en comparación con el proceso convencional. Adicionalmente, puede simplificarse la instalación de fermentación y facilitarse el control de la fermentación.
- 2.
- Dado que se añade menos agente neutralizante al medio de cultivo para la neutralización, hay una correspondientemente menor necesidad de usar ácidos minerales u otros agentes regeneradores para la conversión de la sal de lactato en ácido láctico libre. Por lo tanto, el coste de producción puede reducirse.
- 3.
- Dado que se añade menos agente neutralizante al medio de cultivo, la viscosidad del caldo de cultivo es reducida. Por consiguiente, el caldo es más fácil de tratar.
- 4.
- Las células separadas según la presente invención pueden utilizarse de nuevo como microorganismos de siembra para una nueva fermentación de ácido láctico.
- 5.
- Las células pueden separarse y recuperarse de forma continua durante la fermentación del ácido láctico, según la presente invención, y por tanto, la fermentación puede llevarse a cabo de forma continua.
- 6.
- Dado que las cepas de levaduras recombinantes carecen de la capacidad de producir etanol y de la actividad de piruvato deshidrogenasa, o tienen tanto una producción de etanol reducida como una actividad de piruvato deshidrogenasa reducida, la producción de ácido láctico puede llevarse a cabo con un rendimiento mayor en comparación con las cepas de levadura que tienen tanto la capacidad natural de producir etanol como la capacidad natural para la utilización del piruvato por la mitocondria.
- 7.
- La producción de ácido láctico por cepas no convencionales con un metabolismo modificado genéticamente pertenecientes a las especies Kluyveromyces, Torulaspora y Zygosaccharomyces puede obtenerse a partir de fuentes de carbono no convencionales (es decir, galactosa, lactosa, sacarosa, rafinosa maltosa, celobiosa, arabinosa, xilosa, por mencionar algunos ejemplos), haciendo crecer las células en un medio altamente azucarado y haciendo crecer las células en presencia de una alta concentración de ácido láctico.
Fig. 1. La clonación del gen de la lactato
deshidrogenasa cambia el flujo glucolítico hacia la producción de
ácido láctico.
Las reacciones enzimáticas clave en el punto de
ramificación del piruvato están catalizadas por las siguientes
enzimas: (1): piruvato descarboxilasa; (2): alcohol deshidrogenasa;
(3): acetaldehído deshidrogenasa;(4): acetil-COA
sintetasa; (5): lanzadera de acetil-CoA desde el
citosol hacia la mitocondria;(6): lanzadera de
acetil-CoA desde la mitocondria hacia el citosol;
(7): lactato deshidrogenasa heteróloga, (8): piruvato
deshidrogenasa. Las reacciones enzimáticas implicadas en síntesis
anapleróticas se han omitido.
Fig. 2 Diagrama del plásmido pVC1.
Figs. 3A, 3B. Diagrama de los plásmidos pKSMD8/7
y pKSEXH/l6, respectivamente.
Fig. 4. Diagrama del plásmido pEPL2.
Fig. 5. Diagrama del plásmido pLC5.
Fig. 6. Diagrama del plásmido
pLAT-ADH.
Fig. 7A. Producción de ácido
L(+)-láctico a partir de
PM6-7a[pEPL2] de Kluyveromyces lactis
transformada durante el crecimiento en un medio basado en
Glu-YNB. La concentración residual de glucosa en el
T = 49 no fue detectable. La producción de ácido
D(-)-láctico tampoco fue detectable. La actividad de
LDH específica fue mayor de 3 U/mg de proteína celular total a lo
largo de todo el experimento.
Se han obtenido resultados similares usando la
LDH bacteriana de L. casei (datos no mostrados).
(\ding{115}) células/ml; (-) valor del pH;
(\medcirc) producción de etanol, g/l (\blacksquare) producción
de ácido L(+)-láctico, g/l.
Fig. 7B. Producción de ácido
L(+)-láctico a partir de
PM6-7a[pEPL2] de Kluyveromyces lactis
transformada durante el crecimiento en un medio basado en
Glu-YNB. El medio se tamponó en el momento T = 0 (pH
= 5,6) usando tampón de fosfato 200 mM. En este lote del texto, el
valor del pH disminuye mucho más tarde que durante el lote del
texto mostrado en la figura 7A. La concentración residual de glucosa
en el T = 49 no fue detectable. La actividad de LDH específica fue
mayor de 3 U/mg de proteína celular total a lo largo de todo el
experimento.
Se han obtenido resultados similares usando la
LDH bacteriana de L. casei (datos no mostrados).
(\ding{115}) células/ml; (-) valor del pH;
(\medcirc) producción de etanol, g/l (\blacksquare) producción
de ácido L(+)-láctico, g/l.
Fig. 8A. Producción de ácido
L(+)-láctico a partir de PM1/C1[pEPL2] de
Kluyveromyces lactis transformada durante el crecimiento en
un medio basado en Glu-YNB. La concentración
residual de glucosa en el T = 60 fue de 12,01 g/l. Tiempos de
incubación más largos no rindieron producciones mayores ni de
biomasa ni de ácido L(+)-láctico. La actividad de
LDH específica fue mayor de 3 U/mg de proteína celular total a lo
largo de todo el experimento.
Se han obtenido resultados similares usando la
LDH bacteriana de L. casei (datos no mostrados).
(\ding{115}) células/ml; (-) valor del pH;
(\medcirc) producción de etanol, g/l (\blacksquare) producción
de ácido L(+)-láctico, g/l.
Fig. 8B. Producción de ácido
L(+)-láctico a partir de PM1/C1[pEPL2] de
Kluyveromyces lactis transformada durante el crecimiento en
un medio basado en Glu-YNB. El medio se tamponó en
el momento T = 0 (pH = 5,6) usando tampón de fosfato 200 mM. En
este lote del texto, el valor del pH disminuye mucho más tarde que
durante el lote del texto mostrado en la figura 8A. La
concentración residual de glucosa en el T = 87 fue de cero. La
actividad de LDH específica fue mayor de 3 U/mg de proteína celular
total a lo largo de todo el experimento.
(\ding{115}) células/ml; (-) valor del pH;
(\medcirc) producción de etanol, g/l (\blacksquare) producción
de ácido L(+)-láctico, g/l.
Se han obtenido resultados similares usando la
LDH bacteriana de L. casei (datos no mostrados).
Fig. 9A. Producción de ácido
L(+)-láctico a partir de células de
BM3-12D[pLAZ10] de Kluyveromyces
transformadas en un biorreactor con depósito en agitación (véase
también el texto)
(\ding{115}) células/ml; (\medcirc)
concentración de glucosa, g/l (\blacksquare) producción de ácido
L(+)-láctico, g/l.
Fig. 9B. Rendimiento de ácido
L(+)-láctico a partir de células de
Kluyveromyces BM3-12D[pLAZ10] en un
biorreactor con depósito en agitación.
Producción de glucosa frente a la de ácido
láctico. El rendimiento (g/g) es del 85,46%.
Fig. 10. Producción de ácido
L(+)-láctico a partir de
CBS817[pLAT-ADH] de Torulaspora (sin.
Zygosaccharomyces) delbrueckii transformada durante
el crecimiento en un medio basado en Glu-YNB. La
concentración residual de glucosa en el T = 130 fue de 3 g/l.
Tiempos de incubación más largos no rindieron producciones mayores
ni de biomasa ni de ácido L(+)-láctico. La
actividad de LDH específica fue mayor de 0,5 U/mg de proteína
celular total a lo largo de todo el experimento.
(\ding{115}) células/ml; (-) valor del pH;
(\medcirc) producción de etanol, g/l (\blacksquare) producción
de ácido L(+)-láctico, g/l.
Fig. 11. Producción de ácido
L(+)-láctico a partir de
ATCC60483[pLAT-ADH] de Zygosaccharomyces
bailii transformada durante el crecimiento en un medio basado
en Glu-YNB. La concentración residual de glucosa en
el T = 60 fue de 8 g/l. Tiempos de incubación más largos no
rindieron producciones mayores ni de biomasa ni de ácido
L(+)-láctico. La actividad de LDH específica fue
mayor de 0,5 U/mg de proteína celular total a lo largo de todo el
experimento. Se obtuvieron resultados similares usando una cepa
diferente (ATCC36947, datos no mostrados).
(\ding{115}) células/ml; (-) valor del pH;
(\medcirc) producción de etanol, g/l (\blacksquare) producción
de ácido L(+)-láctico, g/l.
Se proporcionan las siguientes definiciones con
objeto de ayudar a los expertos en la materia a comprender la
descripción detallada de la presente invención.
"Amplificación" se refiere a aumentar el
número de copias de una molécula de ácido nucleico deseada.
"Codón" se refiere a una secuencia de tres
nucleótidos que especifican un aminoácido en particular.
"Deleción" se refiere a una mutación que
elimina uno o más nucleótidos de una secuencia de un ácido
nucleico.
"ADN ligasa" se refiere a una enzima que
acopla covalentemente dos porciones de un ADN bicatenario.
"Electroporación" se refiere a un
procedimiento para introducir ADN foráneo en células que usa una
breve descarga de alto voltaje de corriente continua para
permeabilizar las células hospedadoras, provocando que acepten ADN
cromosómico extra.
El término "endógeno" se refiere a
materiales procedentes del interior del organismo o célula.
"Endonucleasa" se refiere a una enzima que
hidroliza ADN bicatenario en posiciones internas.
El término "expresión" se refiere a la
transcripción de un gen para producir el correspondiente ARNm y a la
traducción de este ARNm para producir el correspondiente producto
del gen, es decir, un péptido, un polipéptido o una proteína.
El término "expresión de ARN antisentido" se
refiere a la transcripción de un ADN para producir una primera
molécula de ARN capaz de hibridar con una segunda molécula de ARN
que codifica para un producto de un gen, por ejemplo, una proteína.
La formación del híbrido ARN-ARN inhibe la
traducción de la segunda molécula de ARN para producir el producto
del gen.
La frase "conectado funcionalmente" se
refiere a un promotor o a una región promotora y a una secuencia
codificante o estructural en una orientación y distancia tales que
la transcripción de la secuencia codificante o estructural puede
ser dirigida por el promotor o la región promotora.
El término "gen" se refiere al ADN
cromosómico, ADN de plásmido, ADNc, ADN sintético u otro ADN que
codifica para un péptido, polipéptido, proteína o molécula de ARN,
y a las regiones flanqueantes de la secuencia codificante
implicadas en la regulación de la expresión.
El término "genoma" engloba tanto el
cromosoma como los plásmidos del interior de una célula hospedadora.
Los ADN codificantes de la presente invención introducidos en
células hospedadoras pueden por tanto estar integrados en el
cromosoma o localizados en el plásmido.
"ADN heterólogo" se refiere al ADN de un
origen diferente al de la célula receptora.
"ADN homólogo" se refiere al ADN del mismo
origen que el de la célula receptora.
"Hibridación" se refiere a la capacidad de
una hebra de ácido nucleico de acoplarse con una hebra
complementaria mediante el apareamiento de bases. La hibridación se
produce cuando se unen entre sí dos secuencias complementarias de
las dos hebras de ácidos nucleicos.
"Lactato deshidrogenasa" (LDH) se refiere a
una proteína que cataliza la conversión del piruvato y el NADH en
ácido láctico y NAD^{+}. La L(+)-LDH produce ácido
L(+)-láctico; la D(-) LDH produce ácido
D(-)-láctico.
El término "transportador de lactato" se
refiere a una proteína que permite el transporte de lactato desde
dentro hacia fuera de la célula.
"Mutación" se refiere a cualquier cambio o
alteración en una secuencia de un ácido nucleico. Existen varios
tipos, incluyendo las puntuales, las de marco de lectura y las de
empalme. La mutación puede realizarse específicamente (por ejemplo,
mutagénesis dirigida) o aleatoriamente (por ejemplo, a través de
agentes químicos, mediante el paso a través de cepas bacterianas
reparadoras negativas).
Códigos de los ácidos nucleicos: A = adenosina; C
= citosina; G = guanosina; T = timidina; N = A, C, G, y T
equimolares; I = desoxiinosina; K = G y T equimolares; R = A y G
equimolares; S = C y G equimolares; W = A y T equimolares; Y = C y
T equimolares.
"Marco abierto de lectura (ORF)" se refiere
a una región de ADN o de ARN que codifica para un péptido, un
polipéptido o una proteína.
"Piruvato descarboxilasa" (PDC) se refiere a
una proteína que cataliza la conversión de piruvato en
acetaldehído.
"Piruvato deshidrogenasa" (PDH) se refiere a
un complejo proteico que cataliza la conversión de piruvato en
acetil-CoA.
"Plásmido" se refiere a una porción de ADN
circular, extracromosómico y autorreplicante.
"Mutación puntual" se refiere a una
alteración en un único nucleótido en una secuencia de un ácido
nucleico.
"Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)"
se refiere a una técnica enzimática para crear múltiples copias de
una secuencia de ácido nucleico. Las copias de la secuencia de ADN
se preparan translocando una polimerasa de ADN entre dos
amplímeros. La base de este procedimiento de amplificación consiste
en múltiples ciclos de cambios de temperatura para desnaturalizar,
después volver a aparear los amplímeros, seguido de una extensión
para sintetizar nuevas hebras de ADN en la región localizada entre
los amplímeros flanqueantes.
El término "promotor" o "región
promotora" se refiere a una secuencia de ADN que incluye
elementos que controlan la producción de ARN mensajero (ARNm)
proporcionando el sitio de reconocimiento para la polimerasa de ARN
y/u otros factores necesarios para el comienzo de la transcripción
en el sitio correcto.
Una "célula recombinante" o "célula
transformada" es una célula cuyo ADN ha sido alterado mediante la
introducción de una molécula de ácido nucleico exógena en esa
célula.
El término "constructo de ADN recombinante"
o "vector recombinante" se refiere a cualquier agente, tal como
un plásmido, un cósmido, un virus, una secuencia de replicación
autónoma, un fago, una secuencia de nucleótidos de ADN o de ARN,
monocatenaria o bicatenaria, lineal o circular, procedente de
cualquier fuente, capaz de una integración genómica o de una
replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN en la que
una o más secuencias de ADN se han conectado de una forma
funcionalmente operativa. Dichos constructos o vectores de ADN
recombinante son capaces de introducir una secuencia reguladora 5' o
una región promotora y una secuencia de ADN para el producto de un
gen seleccionado en una célula de una forma tal que la secuencia de
ADN es transcrita en un ARNm funcional que es traducido y por lo
tanto expresado. Alternativamente pueden construirse constructos o
vectores recombinantes de ADN recombinante que sean capaces de
expresar ARN antisentido, con objeto de inhibir la traducción de un
ARN específico de interés.
"Actividad (enzimática) reducida" se refiere
a una actividad enzimática medida como inferior aislada a partir de
una cepa transformada o mutagenizada en comparación con la actividad
enzimática medida aislada de una cepa natural de la misma especie.
Una actividad enzimática reducida puede ser el resultado de unas
concentraciones de la enzima disminuidas, de una actividad
específica de la enzima disminuida o de una combinación de las
mismas.
Cepas "reparadoras negativas" o
"reparadoras deficientes" se refiere a organismos con unas vías
de reparación del ADN reducidas o eliminadas. Dichas cepas muestran
unas tasas de mutación aumentadas en comparación con las tasas de
las cepas naturales de la misma especie. La propagación de una
secuencia de ácido nucleico a través de una cepa reparadora
negativa da como resultado la incorporación de mutaciones aleatorias
a lo largo de la secuencia de ácido nucleico.
"Enzima de restricción" se refiere a una
enzima que reconoce una secuencia palindrómica específica de
nucleótidos en ADN bicatenario y escinde ambas hebras; también se
denomina endonucleasa de restricción. La escisión se produce
típicamente en el sitio de restricción.
"Marcador seleccionable" se refiere a una
secuencia de ácido nucleico cuya expresión confiere un fenotipo que
facilita la identificación de las células que contienen la secuencia
de ácido nucleico. Algunos marcadores seleccionables incluyen
aquellos que confieren resistencia a sustancias químicas tóxicas,
(por ejemplo, resistencia a la ampicilina, resistencia a la
kanamicina), que complementan una deficiencia nutricional (por
ejemplo, uracilo, histidina, leucina), o que imparten una
característica distinguible visualmente (por ejemplo, cambios de
color, fluorescencia).
"Transcripción" se refiere al proceso de
producir una copia de ARN a partir de una plantilla de ADN.
"Transformación" se refiere al proceso de
introducir una secuencia de ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un
vector, un plásmido, una molécula de ácido nucleico recombinante) en
una célula en la que ese ácido nucleico exógeno es incorporado en
un cromosoma o es capaz de una replicación autónoma.
"Traducción" se refiere a la producción de
proteínas a partir de ARN mensajero.
El término "rendimiento" se refiere a la
cantidad de ácido láctico producida (g/l) dividida por la cantidad
de glucosa consumida (g/l).
"Unidad" de enzima se refiere a la actividad
enzimática, e indica la cantidad de micromoles de sustrato
convertidos por mg de proteínas celulares totales por minuto.
"Vector" se refiere a un plásmido, un
cósmido, un bacteriófago o un virus que transporta secuencias de
ácidos nucleicos a un organismo hospedador.
Con objeto de aislar a partir del ADNc completo
la secuencia codificante de la enzima bovina LDH-A
(EC 1.1.1.27), se realizó una mutagénesis dirigida clásica, (J.
Biol. Chem. 253: 6551, 1978, Meth. Enzymol, 154: 329, 1987). La
mutagénesis dirigida conducida por oligonucleótidos se basa en la
hibridación in vitro de un fragmento de ADN monocatenario
con un oligonucleótido sintético, que es complementario del
fragmento de ADN excepto por una región central desapareada en
correspondencia con la secuencia de ADN que debe ser
mutagenizada.
Con objeto de introducir un sitio de la enzima de
restricción Xba I de 11 pb antes del codón ATG, el ADNc de la LDH
bovina de 1743 pb se clonó desde el plásmido pLDH12 (Ishiguro y
col., Gene, 91 281-285, 1991) mediante digestión
con las enzimas de restricción Eco RI y Hind III (New England
Biolabs, Beverly, MA). Entonces el fragmento de ADN aislado se
insertó en el vector de expresión pALTER-1 (Promega,
nº de cat. 96210; nº de lote 48645, 1996).
Dicho vector contiene los orígenes de replicación
de los bacteriófagos M13 y R408 y dos genes de resistencia a
antibióticos. Uno de éstos genes, el de resistencia a la
tetraciclina, es funcional. El otro (es decir, el de resistencia a
la ampicilina) ha sido inactivado. Se proporciona un oligonucleótido
que restituye la resistencia a la ampicilina a la hebra mutante
durante la reacción de mutagénesis (oligoAMP; Promega, Madison, WI
Tab. 1). Este oligonucleótido está apareado con el ADN monocatenario
(ADNmc) de plantilla. Al mismo tiempo, el oligonucleótido
mutagénico (oligoLDH, Madison WI) también se ha apareado. Tras la
síntesis y la unión del ADN, el ADN es transformado en una cepa
reparadora negativa de E. coli (BMH 71-18
mutS; kit Promega). La selección se realizó en LB + ampicilina
(Molecular Cloning a laboratory manual, editado por Sambrook y
col., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Una segunda ronda de
transformación en la cepa JM 109 (kit Promega) de E. coli
aseguró la apropiada segregación de los plásmidos mutantes y
naturales.
| Oligonucleótidos | Secuencia |
| oligoAMP (Id. de secuencia. nº. 1) | 5'-GTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG-3' |
| OligoLDH (Id. de secuencia. nº. 2) | 5'-CCTTTAGGGTCTAGATCCAAGATGGCAAC-3' |
Tabla 1: secuencia de nucleótidos de los
oligonucleótidos sintéticos usados para la mutagénesis dirigida. La
secuencia subrayada en el oligoLDH muestra el sitio de restricción
Xba I introducido mediante mutagénesis.
Pueden encontrarse detalles adicionales de la
técnica y el material usado (con excepción del oligoLDH) en la hoja
de datos del kit.
El plásmido obtenido, que contiene el ADNc mutado
para la LDH bovina, se denominó pVC1 (Fig. 2).
El codón original de inicio (GTG) del gen de la
LDH de Lactobacillus casei (GTG) (la secuencia de la LDH
está disponible con el nº de acceso M76708 de la GenBAnk Sequence
Database proporcionada por el National Center of Biotechnology
-NCBI-, sitio Web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) no es reconocido
correctamente por S. cerevisiae. Obtuvimos el plásmido pST2
y la secuencia de la LDH de Hutkins Robert, University of Nebraska,
EE.UU.). El pST2 se basa en el vector pUC19 (Boehringer Mannheim
GmbH, Mannheim, Alemania, cat. 885827) y contiene un fragmento
amplificado BamHI-SphI del ADNc de L. casei
686 (Culture collection de la University of
Nebraska).
Nebraska).
Con objeto de obtener una secuencia codificante
partiendo del habitual primer codón eucariota (es decir, ATG), la
secuencia de la LDH se ha mutagenizado mediante PCR.
La introducción de un sitio de la enzima de
restricción Nco I en la posición 163 de la secuencia de la LDH (nº
de acceso M76708 de la GenBAnk Sequence Database, supra),
permite el cambio simultáneo del codón original GTG por ATG. La
reacción de PCR (Mastercycler 5330, Eppendorf, Hamburg, Alemania) se
realizó partiendo del plásmido pLC1, basado en el vector pGEM7Z
f(+) (Promega corporation, Madison WI, EE.UU., cat. P2251), y que
contiene el gen de L. casei (fragmento
BamHI-SphI escindido de pST2). Las secuencias de los
oligonucleótidos usados como cebadores de la reacción se refieren
en la Tabla 2.
| Ciclos de amplificación: 94º; 1' | (etapa desnaturalizante) |
| 94º 30'' | (etapa desnaturalizante) |
| 56º 30'' \hskip1,5cm 4 veces | (etapa de apareamiento con el cebador) |
| 68º 3' | (etapa de extensión) |
| 94º 30'' | (etapa desnaturalizante) |
| 60º 30'' \hskip1,5cm 23 veces | (etapa de apareamiento con el cebador) |
| 68º 3' | (etapa de extensión) |
| 68º 3' | (etapa de extensión final) |
Al final de la reacción se aisló una única banda
correspondiente al gen amplificado y mutado. El fragmento de ADN se
insertó entonces en el sitio EcoRV del vector de clonación pMOSBlue
(Amersham Life Science, Buckingamshire, Inglaterra; cód. RPN5110)
con una unión con extremos romos, dando lugar al plásmido pLC3.
Análogamente, puede usarse cualquier otro
protocolo de mutagénesis.
| Oligonucleótidos | Secuencia |
| OligoATG (Id. de secuencia. nº. 3) | 5'-CCATGGCAAGTATTACGGATAAGGATC-3' |
| OligoANTISENTIDO (Id. de secuencia. nº. 4) | 5'-CTATCACTGCAGGGTTTCGATGTC-3' |
Tabla 2: secuencia de nucleótidos de los
oligonucleótidos sintéticos usados para la amplificación mediante
PCR. Las secuencias subrayadas en el oligoATG muestran el sitio de
restricción NcoI introducido mediante mutagénesis, y el codón de
inicio ATG resultante obtenido.
Siguiendo una metodología clásica de PCR también
clonamos los genes de la LDH L(+) de las bacterias Bacillus
megaterium y Bacillus stearothermophylus (Biol. Chem.
Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1391) (Biol. Chem.
Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1167) (la secuencia de ADN
también está disponible con los n^{os} de acceso M22305 y M19396
de la Genbank Sequence Database proporcionada por el National
Center of Biotechnology -NCBI-, sitio Web:
http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/) en vectores de expresión para levaduras S. cerevisiae ( es decir, pBME2 y pBST2, respectivamente - véase a continuación).
www.ncbi.nlm.nih.gov/) en vectores de expresión para levaduras S. cerevisiae ( es decir, pBME2 y pBST2, respectivamente - véase a continuación).
El promotor KIPDCA y la secuencia codificante se
subclonaron como un fragmento de HindIII de 4 Kpb de un clon de una
genoteca de K. lactis que complementa la mutación rag 6 de
K. lactis (Bianchi y col., Mol. Microbiol., 19:
27-36, 1996) la región promotora se subclonó en
sitios Sal I y Xba I del vector pBleuscript II KS (Stratagene,
LaJolla, Ca nº 212205) con una ligasa de ADN T4 usando un
procedimiento de clonación molecular estándar (Sambrook y col.,
Molecular Cloning, supra). La secuencia de la LDH bovina,
aislada como un fragmento Xba I-Hind III de 1675 pb
a partir del vector pVC1, se clonó en los correspondientes sitios de
clonación del vector pBleuscript II KS. La cepa de E. coli
GM82 (dam^{-}dcm^{-}) (disponible en las colecciones
ATCC o CGSC) se transformó con los dos nuevos vectores, denominados
respectivamente pKSMD8/7 y pKSEXH/l6 (Figs. 3A y 3B).
El promotor KIPDCA y la secuencia de la LDH
bovina, aislados como fragmentos Sal I-Xba I,
respectivamente a partir de pKSMD8/7 y de pKSEXH/16, se unieron
in vitro con ligasa de ADN T4 a temperatura ambiente en
presencia de endonucleasa Sal I con objeto de permitir la unión en
los extremos Xba I. El producto de la unión se clonó en el sitio de
clonación Sal I del vector pE1 (Bianchi M. y col., Curr. Genet. 12:
185-192, 1987; Chen X. J. y col., Curr. Genet. 16:
95-98, 1989 y documento US5166070). Este plásmido se
basa en el plásmido integrativo YIp5 que contiene el marcador
genético URA3 de Saccharomyces cerevisiae y en el plásmido
pKDI (documento US5166070), aislado de Kluyveromvices
drosophilarum. El plásmido pE1 tiene una organización funcional
similar a la del ADN 2 \mu de S. cerevisiae y es capaz de
replicarse de una forma estable en células de Kluyveromvices
lactis (Chen X. J. y col., supra). El marcador URA3 en el
plásmido permite la complementación de la mutación
uraA1-1 de K. lactis (de Louvencourt y
col., J. Bacteriol. 154: 737-742 (1982)), y por lo
tanto el crecimiento de las células transformadas en medio selectivo
sin uracilo.
El vector obtenido se denominó pEPL2 (Fig. 4) y
se usó para transformar la cepa DH5-alfa de E.
coli (Life Technologies Inc., Gaitherburg, MA).
El gen de la LDH bovina descrito para el plásmido
pEPL2 se sustituyó por la secuencia de ADN de la LDH del gen
bacteriano de Lactobacillus casei (véase anteriormente),
siguiendo las metodologías moleculares clásicas descritas a lo
largo del texto, rindiendo el plásmido pEPL4. Las células de la
levadura K. lactis transformadas portadoras de las LDH
bovinas o bacterianas dieron unos resultados similares.
El vector pLAZ10 se obtuvo clonando el fragmento
SalI de pEPL2, portador del promotor KIPDC1 y de la
secuencia codificante para la LDH bovina, en el único sitio
SalI del vector p3K31. El vector p3K31 está formado por el
vector comercial pUC19 y el casete de resistencia a G418 del vector
pKan707 (Fleer y col. Bio/technology 9: 968-974,
1991) insertado en el único sitio SphI del plásmido pKD1.
El gen de la LDH de L. casei se escindió
de pLC3 (descrito anteriormente) con una digestión
NcoI-SalI, y se unió a los vectores integrativos
pYX012 o pYX022 (R&D System Europe Ltd, Abingdon,
Inglaterra).
Los dos plásmidos obtenidos, que contenían el ADN
mutado para el gen bacteriano de la LDH bajo el control del
promotor TPI, y que portaban los marcadores auxótrofos URA3 ó HIS3,
se denominaron respectivamente pLC5 (figura 5) y pLC7. Para la
construcción de pB1, pBM2 y pBST2 usamos una metodología similar a
la descrita para la
construcción de pLC5; sin embargo, usamos la LDH bovina, la LDH de B. megaterium y la LDH de B. stearothermophylus (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1391) (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1167), respectivamente. Finalmente, el plásmido pFA6a-KanMX (Wach y col, Yeast, 1994, 10: 1793-1808) se digirió con SacI y SmaI, y el fragmento resultante se unió al pLC5 cortado con las mismas enzimas, rindiendo el plásmido pLC5-kanMX. En los plásmidos, el gen de la LDH está bajo el control del promotor TPI.
construcción de pLC5; sin embargo, usamos la LDH bovina, la LDH de B. megaterium y la LDH de B. stearothermophylus (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1391) (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1167), respectivamente. Finalmente, el plásmido pFA6a-KanMX (Wach y col, Yeast, 1994, 10: 1793-1808) se digirió con SacI y SmaI, y el fragmento resultante se unió al pLC5 cortado con las mismas enzimas, rindiendo el plásmido pLC5-kanMX. En los plásmidos, el gen de la LDH está bajo el control del promotor TPI.
La secuencia de ADN de JEN1 (la secuencia de ADN
está disponible con el nº de acceso U24155 de la Genbank Sequence
Database proporcionada por el National Center of Biotechnology
-NCBI- sitio Web: http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/), que codifica para el transportador de lactato de S. cerevisiae (Davis E. S., Tesis, 1994-Laboratory of Eukeryotic Gene Expression, Advanced Bioscience Laboratories) (Davis, E. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89 (23), 11169, 1992) (Andre, B. Yeast (11), 1575, 1995), se ha obtenido de E. S. Davis (University of Maryland, EE.UU.). La secuencia codificante de JEN1 se ha amplificado mediante la metodología clásica de PCR descrita a lo largo del texto y se ha clonado en el plásmido pYX022 (véase anteriormente). En el plásmido integrativo, la sobreexpresión de JEN1 está bajo el control del promotor TPI.
gov/), que codifica para el transportador de lactato de S. cerevisiae (Davis E. S., Tesis, 1994-Laboratory of Eukeryotic Gene Expression, Advanced Bioscience Laboratories) (Davis, E. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89 (23), 11169, 1992) (Andre, B. Yeast (11), 1575, 1995), se ha obtenido de E. S. Davis (University of Maryland, EE.UU.). La secuencia codificante de JEN1 se ha amplificado mediante la metodología clásica de PCR descrita a lo largo del texto y se ha clonado en el plásmido pYX022 (véase anteriormente). En el plásmido integrativo, la sobreexpresión de JEN1 está bajo el control del promotor TPI.
En primer lugar se construyó el plásmido
pLDH-Kan, clonando en el sitio EcoRV del vector de
clonación pBluescript II KS (Promega corporation, Madison WI,
EE.UU., cat. 212208) el gen APT1, que confiere resistencia a la
geneticina (G418), procedente de una digestión SmaI/EcoRV del
vector pFA6-KanMX4 (Mach y col. Yeast 10:
1793-1808 (1994)).
En segundo lugar se clonó la región codificante
del gen de la LDH bovina bajo el control de las secuencias
promotoras y terminadoras del ADH1 de S. cerevisiae
subclonando un fragmento XbaI/HindIII del anteriormente descrito
plásmido pVC1 en el vector pVT102-U (Vernet y col.
Gene 52: 225-233 (1987)).
Finalmente, el casete de expresión completo
(promotor ADH1- gen de la LDH - terminador ADH1) se escindió
con una digestión SphI y se unió con pLDH-Kan, se
linealizó con SphI, obteniendo el vector pLAT-ADH
(Fig.6).
La deleción del gen KIPDCA en la cepa de levadura
PM5-7A (MAT a, adeT-600,
uraA1-1) (Wesolowski y col., Yeast 1992, 8: 711)
rindió la cepa PMI. La deleción se ha llevado a cabo mediante la
inserción del marcador URA3 de S. cerevisiae. La cepa PMI
crece en un medio que contiene glucosa; la actividad de PDC no es
detectable y la cepa no produce etanol (Bianchi M. M., y col.,
(1996), supra). Es importante subrayar que las células de
S. cerevisiae sin una actividad de PDC detectable no crecen
en un medio mineral con glucosa (Flikweert M. T. y col. Yeast, 12:
247-257, 1996).
Se colocaron en placas
1x10^{7}-3x10^{7} células de un cultivo
estacionario de células de levadura PMI en un medio sintético que
contiene ácido 5-fluororótico. El crecimiento de las
células de levadura en un medio que contiene ácido
5-fluororótico permite la selección de las células
incapacitadas para la síntesis de uracilo (McCusker y Davis, Yeast
7: 607-608 (1991)). Después de 5 días de incubación
a 28ºC se aislaron algunos mutantes ura. Uno de estos mutantes
obtenidos, denominados PMI/C1, resultó mutado en el gen URA3
introducido previamente mediante una transformación integrativa,
como se observó a partir de una prueba de complementación mediante
la transformación con un plásmido que contiene el gen URA3 (vector
Kep6; Chen y col., J. Basic Microbiol. 28: 211-220
(1988)). El genotipo de PMI/C1 es el siguiente: MATa,
adeT-600. uraA1-1, pdcA : :
ura3.
La estrategia general fue producir en primer
lugar mutantes de deleción única de cada uno de los genes PDC
(PDC1, PDC2, PDC5 y PDC6). Las deleciones de los
genes se realizaron mediante la integración de un casete
loxP-Kan^{SRD}-loxP mediante
recombinación homologa en el locus del correspondiente gen
PDC usando el procedimiento de la PCR de homología
flanqueante corta (SFH) descrito por Wach y col. (1994; Yeast 10,
1793-180S) y Güldener y col. (1995; Nucleic Acids
Res. 24, 2519-2524). Posteriormente, el casete de
deleción se eliminó mediante la expresión de
cre-recombinasa, dejando atrás una única copia del
sitio loxP en el locus de deleción. El mutante de deleción
triple pdc1 pdc5 pdc6 se creó cruzando posteriormente las
cepas haploides de deleción única.
La reacción de PCR se llevó a cabo sobre una
plantilla de ADN que contiene el gen para la resistencia a la
kanamicina (marco abierto de lectura del transposón Tn903 de E.
coli) fusionado con las secuencias de control
(promotoras/terminadoras) de un cierto gen de Schwanniomyces
occidentalis (confidencial). Este casete de selección está
flanqueado en ambos extremos por una secuencia loxP
(loxP-Kan^{SRD}-loxP) y fue
desarrollado por SRD (Scientific Research and Development GmbH). El
cebador usado para amplificar el casete
loxP-Kan^{SRD}-loxP está diseñado
de forma que la secuencia de ADN del cebador sentido sea homóloga
con el extremo 5' de la secuencia del casete de selección, y de
forma que el cebador presente además, en su extremo 5', una región
de 40 nucleótidos, que se corresponde con la secuencia 5' terminal
del cierto gen PDC de Saccharomyces cerevisiae. El
cebador antisentido se construye de forma análoga, es complementario
del extremo 3' del casete de selección, en el que este cebador
contiene en su extremo 5' una región de preferiblemente también 40
nucleótidos, que se corresponde con la secuencia 3' terminal del
cierto gen PDC de Saccharomyces cerevisiae.
La siguiente tabla muestra los cebadores usados
para la deleción de genes de los correspondientes genes PDC
mediante el procedimiento de SFH PCR. Las secuencias subrayadas son
homólogas con el correspondiente gen PDC, y las secuencias
complementarias del casete
loxP-Kan^{SRD}-loxP están en
negrita.
El casete de deleción amplificado mediante PCR se
usó para la transformación de la cepa prototrófica diploide
CEN.PK122 de Saccharomyces cerevisiae desarrollada por
SRD.
CEN.PK 122 (Mata, alpha, URA3, URA3, HIS3, HIS3,
LEU2, LEU2, TRP1, TRP1, MAL2-8^{c},
MAL2-8^{c}, SUC2, SUC2).
Para la selección de los transformantes se añadió
geneticina (G-418 sulfato, Life Technologies) a una
concentración final de 200 mg/l. Después del análisis en tétrada,
las esporas resistentes a G418 se analizaron posteriormente
mediante un diagnóstico por PCR para confirmar la correcta deleción
del correspondiente gen PDC y para determinar el tipo de
reproducción de la cepa haploide.
Para obtener una cepa con los tres genes
PDC delecionados se cruzaron posteriormente las cepas de
deleción haploides PDC1, PDC5 y PDC6. Para obtener las cepas de
deleción doble, pdc1 : : Ran^{SRD} pdc6 : : Kan^{SRD} y pdc5 :
: Kan^{SRD} pdc6 : : Kan^{SRD}, se cruzaron las correspondientes
cepas haploides. Después del análisis en tétrada, las esporas que
mostraban el ditipo no parental para el marcador Kan^{SRD} se
analizaron posteriormente mediante un diagnóstico por PCR para
confirmar la correcta deleción de ambos genes y para determinar el
tipo de reproducción. Las cepas de deleción doble resultantes se
cruzaron para obtener la cepa de deleción triple. Después del
análisis en tétrada se comprobaron, mediante un diagnóstico por PCR,
las esporas en las que se han delecionado los tres genes
PDC.
Para eliminar el marcador Kan^{SRD} del
exitosamente desorganizado gen se transformaron las cepas de
deleción haploides (mutantes simples, dobles y triples) con el
plásmido cre recombinasa pPK-ILV2^{SMR}
(desarrollado por SRD). El plásmido
pPR-ILV2^{SMR} contiene
cre-recombinasa bajo el control del promotor
GAL1 y, como selección dominante, el marcador del gen de
resistencia ILV2, que permite a las células de levadura
transformadas con el plásmido pPK-ILV2^{SMR}
crecer en presencia de sulfometurón-metilo (30
mg/l). La correcta escisión del marcador Kan^{SRD} se analizó
posteriormente mediante un diagnóstico por PCR con células de
levadura completas. Para eliminar el plásmido
pPK-ILV2^{SMR} las células de levadura se
incubaron durante un tiempo apropiado sin
sulfometurón-metilo en el medio, y posteriormente se
buscaron células sensibles al
sulfometurón-metilo.
La siguiente tabla muestra las células de
levadura resultantes. Las cifras entre paréntesis indican los
nucleótidos delecionados (ATG = 1) de los correspondientes genes.
En el caso de cifras negativas significan, la primera cifra, los
nucleótidos delecionados secuencia arriba del ATG, y la segunda
cifra, los nucleótidos delecionados secuencia abajo del codón de
terminación.
\newpage
Principalmente usamos las cepas CEN.PK211 y
CEN.PK182 que, en las tablas que resumen los datos obtenidos,
también se denominan CENPK113\DeltaPDC2 y
CENPK113\DeltaPDC1\DeltaPDC5\DeltaPDC6.
Usando una metodología similar se construyó una
cepa GRF18U de S. cerevisiae (Mat alfa, his3, leu2, ura3)
portadora de una deleción en el gen PDC2 (GRF18U\DeltaPDC2;
Mat alfa, his3, leu2, ura3, pdc2 : : APT1). Usamos el gen APT1, que
confería resistencia a G418, como marcador para la integración,
aislado del plásmido pFA6a-KanMX (Wach y col.,
supra); para la cepa portadora de deleciones en los genes
PDC1, PDC5 y PDC6, la actividad de PDC es
cero. Para las cepas portadoras de deleciones en el gen PDC2,
la actividad de PDC es de aproximadamente el 20-40%
del nivel determinado en las cepas naturales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionó una cepa doble deletante
K1pdc1\Delta/Klpda1\Delta a partir de la población
segregante haploide de una cepa diploide obtenida cruzando la cepa
MW341-5/Klpdc1\Delta (MAT\alpha,
lac4-8, leu2,
lysA1-1, uraA1-1,
Klpdc1 : : URA3; obtenida según se describió
previamente en Bianchi y col, 1996, Mol. Microbiol. 19 (1),
27-36; Destruelle y col., propuesta) con la cepa
CBS2359/Klpda1\Delta (MATa,
URA3-48, Klpda1 : : Tn5BLE). La
deleción del gen PDA1, que codifica para la subunidad
E1-alfa del complejo de la piruvato deshidrogenasa
(EC.1.2.4.1) (la secuencia de ADN ha sido obtenida por Steensma H.
Y.; Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Clusius Laboratory,
Leiden, Holanda -
la secuencia de ADN también está disponible con el nº de acceso AF023920 de la Genbank Sequence Database proporcionada por el National Center of Biotechnology -NCBI- sitio Web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), en la cepa de levadura CBS2359 se ha obtenido siguiendo la metodología clásica de PCR y la transformación de levadura descrita a lo largo del texto. Usamos el marcador Tn5Ble (Gatignol y col., Gene, 91: 35, 1990) que confiere resistencia a la fleomicina, como marcador de la integración.
la secuencia de ADN también está disponible con el nº de acceso AF023920 de la Genbank Sequence Database proporcionada por el National Center of Biotechnology -NCBI- sitio Web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), en la cepa de levadura CBS2359 se ha obtenido siguiendo la metodología clásica de PCR y la transformación de levadura descrita a lo largo del texto. Usamos el marcador Tn5Ble (Gatignol y col., Gene, 91: 35, 1990) que confiere resistencia a la fleomicina, como marcador de la integración.
La cepa doble deletante, denominada
BM1-3C (MATa, leu2, Klpdc1 : : URA3;
Klpda1 : : Tn5BLE), fue seleccionada como una cepa
segregante resistente a fleomicina / sensible a antimicina. Entonces
se transfirió genéticamente el vector pLAZ10 a la cepa doble
deletante como sigue.
Se cruzó un transformante pLAZ10 de la cepa
Klpdc1 : : URA3 PMI/8 (MATa,
adeT-600, uraA1-1,
Klpdc1 : : URA3; Bianchi y col., Mol. Microbiol. 19:
27-36. 1996) con la cepa MW109-8C
(MAT\alpha, lysA1-1,
trpA1-1). Después de la esporulación de la
cepa diploide resultante, se seleccionó una cepa resistente a
geneticina / sensible a antimicina, denominada cepa 7C (MAT\alpha,
adeT-600, lysA1-1,
Klpdc1 : : URA3, pLAZ10+).
Se cruzaron las cepas BM1-3C y
7C, y se seleccionaron las cepas haploides segregantes resistentes a
fleomicina /
resistentes a geneticina tras la esporulación de la cepa diploide obtenida. Todos los segregantes haploides eran sensibles a antimicina. La cepa prototrofa BM3-12D (Klpdc1 : : URA3; Klpda1 : : Tn5BLE, pLAZ10+) fue elegida para experimentos adicionales.
resistentes a geneticina tras la esporulación de la cepa diploide obtenida. Todos los segregantes haploides eran sensibles a antimicina. La cepa prototrofa BM3-12D (Klpdc1 : : URA3; Klpda1 : : Tn5BLE, pLAZ10+) fue elegida para experimentos adicionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer células PM6-7A
y PMI/C1 en medio YPD hasta una concentración de 0,5 x 10^{8}
células/ml, se recogieron, se lavaron una vez con agua, dos veces
con sorbitol 1M, y se resuspendieron en sorbitol 1M a una
concentración de 2 x 10^{9} células/ml. Las células se
electroporaron (7,5 kV/cm, 25 \muF, 200 \Omega: GenePulser,
Biorad, Hercules, Ca) en presencia de 5-10
microgramos de pEPL2 o de pEPL4. La selección de los transformantes
URA^{+} se llevó a cabo en un medio sintético sólido sin uracilo
(0,7% p/v de base de nitrógeno de levadura, 2% p/v de glucosa, 200
mg/l de adenina, 2% p/v de agar).
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer células CBS817 en medio YPD
hasta una concentración de 6 x 10^{7} células/ml, se recogieron,
se lavaron una vez con agua, dos veces con sorbitol 1M, y se
resuspendieron en sorbitol 1M a una concentración de 2 x 10^{9}
células/ml. Las células se electroporaron (1,5 kV, 7,5 kV/cm, 25
\muF, 200 \Omega: GenePulser, Biorad, Hercules, Ca) en
presencia de 1 \mug de pLAT-ADH.
Las células se hicieron crecer hasta el día
siguiente en tubos microbiológicos estériles que contenían 5 ml de
YEPD, sorbitol 1M. La selección de los transformantes G418^{r} se
llevó a cabo en un medio sólido (2% p/v de glucosa, 2% p/v de
peptona, 1% p/v de extracto de levadura, 2% p/v de agar, 200
\mug/ml de G418 (Gibco BRL, cat. 11811-
031).
031).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células ATTC36947 y ATTC60483 se hicieron
crecer en medio YPD hasta una concentración de 2 x 10^{8}
células/ml, se recogieron, y se resuspendieron a una concentración
de 4 x 10^{8} células/ml en acetato de litio 0,1 M, ditiotreitol
10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, a temperatura
ambiente durante una hora. Las células se lavaron una vez con agua,
dos veces con sorbitol 1M, y se resuspendieron en sorbitol 1M a una
concentración de 5 x 10^{9} células/ml. Las células se
electroporaron (1,5 kV, 7,5 kV/cm, 25 \muF, 200 \Omega:
GenePulser, Biorad, Hercules, Ca) en presencia de 3 \mug de
pLAT-ADH.
Las células se hicieron crecer hasta el día
siguiente en tubos microbiológicos estériles que contenían 5 ml de
YEPD, sorbitol 1M. La selección de los transformantes G418^{r} se
llevó a cabo en un medio sólido (2% p/v de glucosa, 2% p/v de
peptona, 1% p/v de extracto de levadura, 2% p/v de agar, 200
\mug/ml de G418 (Gibco BRL, cat. 11811-
031).
031).
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer células de las levaduras
GRF1BU (descrita anteriormente), GRF18U\DeltaPDC2 (descrita
anteriormente), GRF18U[pLC5] (Mat alfa, his3, leu2, ura3 : :
TPI-LDH), CENPK113 (Mat a; CBS8340),
CENPK-1 (Mat a, ura3),
CENPK113\DeltaPDC1\DeltaPDC5\DeltaPDC6 (descrita
anteriormente) y CENPK113\Delta PDC2 (descrita anteriormente) en
medio YPD rico completo (2% p/v de extracto de levadura, 1% p/v de
peptona, 2% p/v de glucosa) hasta una concentración de 2 x 10^{7}
células/ml, se lavaron una vez con acetato de litio 0,1M, EDTA 1
mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8, se recogieron y se
resuspendieron en acetato de litio 0,1M, EDTA 1 mM,
Tris-HCl 10 mM, pH 8, a una concentración de 2 x
10^{9} células/ml. 100 \mul de la suspensión celular se
incubaron 5 minutos con 5-10 \mug de vector (es
decir, previamente linealizado en el marcador auxótrofo en el caso
de pLC5, pLC7, pB1, pBST2, pBME2, pLC5-kanMX,
pJEN1). Tras la adición de 280 \mul de PEG 4000, las células se
incubaron durante al menos 45' a 30º. Se añadieron 43 \mul de DMSC
y la suspensión se incubó 5' a 42º. Las células se lavaron dos
veces con agua y se colocaron en placas en medio selectivo. Para el
aislamiento de la cepa CENPK-1 (ura3), las células
CENPK113 se hicieron crecer en medio que contenía ácido
5-fluororótico (véase también anteriormente).
Los clones simples transformados fueron tanteados
con 0,7% p/v de base de nitrógeno de levadura, 2% p/v de glucosa,
2% p/v de agar mas los suplementos adecuados o G418 según se indicó.
Para la selección de los transformantes G418R, las células también
se tantearon en 2% p/v de glucosa, 2% p/v de peptona, 1% p/v de
extracto de levadura, 2% p/v de agar, 200 \mug/ml de G418 (Gibco
BRL, cat. 11811-031.
\vskip1.000000\baselineskip
GRF18U[pLAT-ADH]: 200 mg/l
de uracilo, 200 mg/l de leucina, 200 mg/l de histidina, 200 mg/l de
G418.
GRF18U[pB1]: 200 mg/l de leucina, 200 mg/l
de histidina.
GRF18U[pLC5]: 200 mg/l de leucina, 200
mg/l de histidina.
GRF18U[pLC5][pLC7]:200 mg/l de
leucina.
GRF18U[pBM2]: 200 mg/l de leucina, 200
mg/l de histidina.
GRF18U[pBST2]: 200 mg/l de leucina, 200
mg/l de histidina.
GRF18U[pLC5][pJEN1]: 200 mg/l de
leucina.
GRF18U\DeltaPDC2[pLC5]: 200 mg/l de
leucina, 200 mg/l de histidina.
CENPK-1[pLC5]: sin
suplementos
CENPK113[pLC5-KanMX]: 200
mg/l de G418
CENPK113\DeltaPDC1\DeltaPDC5\DeltaPDC6[pLC5-KanMX]:
200 mg/l de G418
CENPK113\DeltaPDC2[pLC5-KanMX]:
200 mg/l de G418.
| Nombre: | origen de la LDH | promotor | hospedador, marcador selectivo |
| pEPL2 | Bovina | KLPDCA | K. lactis, URA3. (fig. 4) |
| pEPL4 | L. casei | KLPDCA | K. lactis, URA3 |
| PLAZ10 | Bovine | KLPDCA | K. lactis, APT1 |
| pLC5 | L. casei | SCTPI | S. cerevisiae, URA3. (fig. 5) |
| pLC5-kanMx | L. casei | SCTPI | S. cerevisiae, APT1 |
| pBME2 | B. megaterium | SCTPI | S. cerevisiae, URA3 |
| pBST2 | B. Ste.- | SCTPI | S. cerevisiae, URA3 |
| pB1 | Bovina | SCTPI | S. cerevisiae, URA3 |
| pLC7 | L. casei | SCTPI | S. cerevisiae, HIS3 |
| pJEN1 | ////////// | SCTPI | S. cerevisiae, HIS3 |
| pLAT-ADH | Bovina | SCADH1 | S. cerevisiae, APT1-URA3 (fig. 6) |
| T. delbruekii, APT1-URA3 | |||
| Z. bailii, APT1-URA3 | |||
| KL = promotor de K. lactis | |||
| SC = promotor de S. cerevisiae | |||
| B. ste = Bacillus stearothermophyllus |
Se ha usado pJEN1 para la sobreexpresión del gen
JEN1.
Los clones obtenidos mediante el procedimiento de
transformación descrito anteriormente se probaron en un cultivo en
lote durante el crecimiento en un medio sintético mínimo (1,3% p/v
de base de nitrógeno de levadura - aa (Difco, Detroit, MI), 200
mg/l de adenina, 50 g/l de glucosa). Los dos medios usados se
tamponaron o no con tampón de fosfato 200 mM hasta un pH de
5,6.
Las células se preinocularon en el mismo medio de
prueba. Las células que crecían exponencialmente se inocularon en
un matraz (300 ml de volumen) que contenía 100 ml de medio nuevo.
Los matraces se incubaron a 30ºC en un baño de agitación (Dubnoff,
150 rpm), y la fermentación se monitorizó en puntos temporales
regulares. La concentración del número de células se determinó con
un contador electrónico Coulter (Coulter Counter ZBI Coulter
Electronics Harpenden, GB, Porro y col., Res. Microbiol. (1991)
142, 535-539), tras la aplicación de ultrasonidos a
las muestras para evitar los agregados celulares (Sonicator Fisher
300, punto medio, 35% de potencia, 10 segundos) (Figs. 7 y 8 y Tab.
3).
Los clones obtenidos mediante el procedimiento de
transformación descrito anteriormente se probaron en un cultivo en
lote durante el crecimiento en un medio sintético mínimo (1,3% p/v
de base de nitrógeno de levadura - aa (Difco, Detroit, MI), 50 g/l
de glucosa, 20 g/l de etanol, 200 mg/l de G418). Los medios usados
se tamponaron con tampón de fosfato 200 mM hasta un pH de 5,6.
Las células se preinocularon en el mismo medio de
prueba. Las células que crecían exponencialmente se inocularon en
un matraz (300 ml de volumen) que contenía 100 ml de medio nuevo.
Los matraces se incubaron a 30ºC en un baño de agitación (Dubnoff,
150 rpm), y la fermentación se monitorizó a intervalos regulares. La
concentración del número de células se determinó con un contador
electrónico Coulter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics
Harpenden, GB, Porro y col., Res. Microbiol. (1991) 142,
535-539), tras la aplicación de ultrasonidos a las
muestras para evitar los agregados celulares (Sonicator Fisher 300,
punto medio, 35% de potencia, 10 segundos). Al principio las
células usaron etanol, y después transformaron la glucosa en ácido
láctico con un rendimiento muy alto (>0,75; g de ácido láctico/g
de glucosa consumido) (Tab. 3).
Los clones obtenidos mediante el procedimiento de
transformación descrito anteriormente se probaron en un cultivo en
lote durante el crecimiento en un medio sintético mínimo (1,3% p/v
de base de nitrógeno de levadura - aa (Difco, Detroit, MI), 20 g/l
de glucosa, 200 mg/l de G418). Los medios usados no se
tamponaron.
Las células se preinocularon en el mismo medio de
prueba. Las células que crecían exponencialmente se inocularon en
un matraz (300 ml de volumen) que contenía 100 ml de medio nuevo.
Los matraces se incubaron a 30ºC en un baño de agitación (Dubnoff,
150 rpm), y la fermentación se monitorizó a intervalos regulares. La
concentración del número de células se determinó con un contador
electrónico Coulter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics
Harpenden, GB, Porro y col., Res. Microbiol. (1991) 142,
535-539), tras la aplicación de ultrasonidos a las
muestras para evitar los agregados celulares (Sonicator Fisher 300,
punto medio, 35% de potencia, 10 segundos) (Fig. 10 y
Tab. 3).
Tab. 3).
Los clones obtenidos mediante el procedimiento de
transformación descrito anteriormente se probaron en un cultivo en
lote durante el crecimiento en un medio sintético mínimo (1,3% p/v
de base de nitrógeno de levadura - aa (Difco, Detroit, MI), 50 g/l
de glucosa, 200 mg/l de G418). Los medios usados no se
tamponaron.
Las células se preinocularon en el mismo medio de
prueba. Las células que crecían exponencialmente se inocularon en
un matraz (300 ml de volumen) que contenía 100 ml de medio nuevo.
Los matraces se incubaron a 30ºC en un baño de agitación (Dubnoff,
150 rpm), y la fermentación se monitorizó a intervalos regulares. La
concentración del número de células se determinó con un contador
electrónico Coulter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics
Harpenden, GB, Porro y col., Res. Microbiol. (1991) 142,
535-539), tras la aplicación de ultrasonidos a las
muestras para evitar los agregados celulares (Sonicator Fisher 300,
punto medio, 35% de potencia, 10 segundos) (Fig. 11 y
Tab. 3).
Tab. 3).
Los clones obtenidos mediante el procedimiento de
transformación descrito anteriormente se probaron en un cultivo en
lote durante el crecimiento en un medio sintético mínimo (1,3% p/v
de base de nitrógeno de levadura - aa (Difco, Detroit, MI), 50 g/l
de glucosa y los suplementos apropiados (véase anteriormente). Los
medios usados no se tamponaron. Las células se preinocularon en el
mismo medio de prueba. Las células que crecían exponencialmente se
inocularon en un matraz (300 ml de volumen) que contenía 100 ml de
medio nuevo. Los matraces se incubaron a 30ºC en un baño de
agitación (Dubnoff, 150 rpm), y la fermentación se monitorizó a
intervalos regulares. La concentración del número de células se
determinó con un contador electrónico Coulter (Coulter Counter ZBI
Coulter Electronics Harpenden, GB, Porro y col., Res. Microbiol.
(1991) 142, 535-539), tras la aplicación de
ultrasonidos a las muestras para evitar los agregados celulares
(Sonicator Fisher 300, punto medio, 35% de potencia, 10
segundos)
(Tab. 3).
(Tab. 3).
Los clones obtenidos mediante los procedimientos
descritos anteriormente se probaron en un cultivo en lote durante
el crecimiento en un medio rico (1,0% p/v de extracto de levadura,
2% p/v de peptona, 100 g/l de glucosa). Los medios usados no se
tamponaron.
Las células se preinocularon en medio de extracto
de levadura-peptona + etanol (5 g/l). Se inocularon
100 ml en matraces de agitación (1,5 l de volumen de trabajo; pH
inicial de 5,7). Los matraces de agitación se incubaron a 30ºC con
agitación: 55 rpm. La fermentación se monitorizó a intervalos
regulares (Tablas A, B y C y Tabla 3).
La actividad específica de LDH de las diferentes
cepas transformadas era mayor de 5 U/mg de las proteínas celulares
totales.
LDH bovina. Se recogieron aproximadamente
10^{8} células, se lavaron con tampón de fosfato 50 mM, pH 7,5, y
se resuspendieron en el mismo tampón. Las células se lisaron con 5
ciclos de vortización vigorosa en presencia de microperlas de
vidrio (diámetro 400 \mum, SIGMA, G-8772) a 4ºC.
Los desechos celulares se eliminaron mediante centrifugación
(Eppendorf, Hamburg, D 5415 C, 13600 RCF, 10 min), y se determinó la
concentración de lo extractos proteicos mediante Micro Assay,
Biorad, Hercules, Ca (cat. 500-0006).
Se probaron aproximadamente 0,2 mg de extracto
para comprobar la actividad LDH usando el kit
DG1340-UV de SIGMA (St. Louis, MO), según las
instrucciones del fabricante.
LDH bacterianas. Se recogieron
aproximadamente 10^{8} células, se lavaron con tampón de fosfato
50 mM, pH 7,5, y se resuspendieron en el mismo tampón. Las células
se lisaron con 5 ciclos de vortización vigorosa en presencia de
microperlas de vidrio (diámetro 400 \mum, SIGMA,
G-8772) a 4ºC. Los desechos celulares se eliminaron
mediante centrifugación (Eppendorf, Hamburg, D 5415 C, 13600 RCF, 10
min), y se determinó la concentración de lo extractos proteicos
mediante Micro Assay, Biorad, Hercules, Ca (cat.
500-0006).
Se probó la actividad de LDH del extracto celular
usando:
- 0,01 ml de NADH 12,8 mM
- 0,1 ml de fructosa-1,6-difosfato 2 mM
- 0,74 ml de tampón de acetato 50 mM (pH = 5,6)
- 0,05 ml de extracto celular diluido apropiadamente y
- 0,1 ml de piruvato sódico 100 mM.
La actividad de LDH se ensayó como micromoles de
NADH oxidado por min, por mg de extracto celular total a 340 nm,
25ºC.
Las muestras del medio de crecimiento, obtenidas
después de eliminar las células mediante centrifugación, se
analizaron para comprobar la presencia de glucosa, de etanol y de
ácido L(+) y D(-)-láctico usando los kits de
Boehringer Mannheim, Mannheim DE, (n^{os} 716251, 176290 y
1112821, respectivamente), según las instrucciones del
fabricante.
Las pruebas en lote experimentales relacionadas
con las levaduras transformadas PM6-7A[pEPL2]
y PMI/C1[pEPL2] de Kluyveromyces se muestran en las
figuras 7A, 7E y en las figuras 8A, 8B.
Los datos experimentales relacionados con las
levaduras transformadas CBS817[pLAT-ADH] de
Torulaspora se muestran en la figura 10.
Los datos experimentales relacionados con las
levaduras transformadas ATCC60483[pLAT-ADH)
de Zygosaccharomyces se muestran en la figura 11.
Los datos experimentales relacionados con las
levaduras transformadas CENPK113[pLC5-KanMX],
CENPK113 \DeltaPDC2[pLC5-kanMX] y
CENPK113\DeltaPDC1\DeltaPDC5\DeltaPDC6
[pLC5-kanMX] de Saccharomyces que crecen en
los matraces de agitación se muestran en las Tablas A, B, C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
Todos los resultados obtenidos a partir de las
levaduras transformadas Kluyveromyces, Torulaspora,
Zygosaccharomyces y Saccharomyces se resumen y comparan
en la Tabla 3. El rendimiento es la cantidad de ácido láctico
producida (g/l) dividida por la cantidad de glucosa consumida
(g/l). El porcentaje de ácido láctico libre se obtiene a partir de
la ecuación de Henderson-Hasselbalch: pH = PK_{a}
+ log [(% de lactato) / (% de ácido láctico libre)], en la que el
pK_{a} para el ácido láctico es de 3,86.
La comparación de los datos referidos en la Tabla
3A frente a la Tabla 3B prueba claramente que en los diferentes
géneros de levadura puede obtenerse una producción de ácido láctico
con un rendimiento de glucosa mayor cambiando la proporción
relativa -a nivel celular- de las actividades de LDH y de PDC. Dicho
objetivo puede obtenerse siguiendo al menos dos metodologías
diferentes:
(1) reduciendo la actividad de PDC
(compárense de los datos de los hospedadores K. lactis
transformados: PM6-7A frente a PMI/CI; (compárense
de los datos de los hospedadores S. cerevisiae transformados
GRF18U frente a GRF18\DeltaPDC2 y CENPK113 frente a
CENPK113\DeltaPDC2 y
CENPK113\DeltaPDC1\DeltaPDC5\DeltaPDC6).
(2) aumentando el número de copias del gen
de la LDH, y por lo tanto la actividad de LDH (compárense de los
datos del hospedador S. cerevisiae: GRF18U[pLCS]
frente a GRF18U[pLC5][pLC7]; la actividad de LDH heteróloga
en las dos cepas es de 5-6 y 7-8
U/mg de proteínas celulares totales, respectivamente).
Adicionalmente, pueden obtenerse rendimientos
mayores manipulando la composición del medio de crecimiento.
También en este caso se observó una producción de etanol reducida
(véase también la Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La producción de ácido láctico por parte de
células transformadas GRF18U[pLC5][pLC7] de
Saccharomyces también se llevó a cabo haciendo crecer las
células en medio sintético (D. Porro y col., Development of a pH
controlled fed-batch system for budding yeast. Res.
in Microbiol., 142, 535-539, 1991). En el medio
sintético usado, la fuente de las sales de Mg y Zn son MgSO_{4}
(5 mM) y ZnSO_{4} x 7 H_{2}O (0,02 mM), respectivamente. La
producción se probó en un cultivo en lote aeróbico (concentración de
glucosa de 50 g/l) según se describió anteriormente para las otras
células de Saccharomyces transformadas.
Se ha averiguado que la depleción de ambos
MgSO_{4} y ZnSO_{4} x 7 H_{2}O rindió un rendimiento y una
productividad de ácido láctico mayores. De hecho, estos minerales
podrían ser necesarios como cofactores para las actividades
enzimáticas que dan lugar a la producción de etanol. Los datos se
muestran en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
| Control | -Mg | -Zn | ||
| Producción de ácido láctico, g/l | 9,23 | 13,74 | 13,74 | |
| Rendimiento, g/g | 0,20 | 0,29 | 0,29 | |
| Productividad, g/l,h | 0,38 | 0,42 | 0,61 | |
| Proporción etanol/ácido láctico, mM/mM | 2,78 | 2,11 | 1,99 |
Leyenda:
- Control: medio sintético completo (Res. in Microbiol., 142, 535-539, 1991; adjunto)
- -Mg: idéntico al control pero sin MgSO_{4}
- -Zn: idéntico al control pero sin ZnSO_{4} x 7 H_{2}O
Para todas las pruebas, el valor final del pH era
inferior a 3,0, y por lo tanto el % de ácido láctico libre era
mayor del 88%.
Las mejores producciones de ácido láctico y las
menores producciones de etanol se han obtenido mediante la
sobreexpresión del gen JEN1, que codifica para el transportador de
lactato.
Se han hecho crecer GRF18U[pLC5] (es
decir, control negativo) y GRF18U[pLC5][pJEN1] en un medio
que contiene un 2% de glucosa, un 0,67% p/v de YNB y suplementos
(es decir, 100 mg/l de leucina-histidina, y 100 mg/l
de leucina, respectivamente).
Las células se preinocularon en el mismo medio de
prueba. Las células que crecían exponencialmente se inocularon en
un matraz (300 ml de volumen) que contenía 100 ml de medio nuevo.
Los matraces se incubaron a 30ºC en un baño de agitación (Dubnoff,
150 rpm), y la fermentación se monitorizó a intervalos regulares. La
concentración del número de células se determinó con un contador
electrónico Coulter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics
Harpenden, GB, Porro y col., Res. Microbiol. (1991) 142,
535-539), tras la aplicación de ultrasonidos a las
muestras para evitar los agregados celulares (Sonicator Fisher 300,
punto medio, 35% de potencia, 10 segundos).
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepa | Lactato g/l | Etanol g/l | |
| GRF18U[pLC5] | 3,33 | 4,39 | |
| GRF18U[pLC5 ][pJEN1] | 6,06 | 4,23 |
Se han obtenido producciones continuas y estables
de ácido láctico durante más de 2 semanas mediante cultivos
clásicos en quimiostato (el flujo continuo de medio nuevo en el
biorreactor favoreció una tasa de crecimiento específica que
variaba entre 0,01 y 0,3 h^{-1}) usando tanto las cepas
transformadas PM6-7A[pEPL2],
PMI/CI[pEPL2] de K. lactis como la cepa transformada
GRF18U[pLC5][pLC7] de S. cerevisiae.
La producción de ácido láctico por
PMI/C1[pEPL2] se probó adicionalmente mediante el cultivo en
un fermentador de tanque agitado de 14 litros que contenía 8 litros
de medio nutriente (30 g de sólidos secos/l líquido de remojo de
maíz, A. E. Staley Manufacturing Co., Decatur, IL; 10 g/l de
extracto de levadura de Difco, Difco, Detroit, MI; 200 mg/l de
adenina, 50 g/l de glucosa). El fermentador se mantuvo a 30ºC, se
agitó a 400 rpm y se aireó a 2 litros/min a su través. Se añadió un
antiespumante (Antifoam 1520, Dow Corning Corp., Midland, MI) según
fue necesario para controlar la formación de espuma. Se suministró
glucosa según fue necesario para mantener una concentración
residual en el medio de fermentación de aproximadamente
25-50 g/l. Cuando estaba controlado, el pH se
mantenía mediante la adición automática de hidróxido amónico 14,8 M
en agua. La producción de ácido láctico a pH ácido se probó como
sigue: (1) El pH de la fermentación se controló a 4,5 a lo largo de
la fermentación. (2) El pH inicial de la fermentación se controló a
4,0 hasta que se habían añadido 80 ml de hidróxido amónico 14,8 M.
Entonces se interrumpió el control del pH. (3) El pH inicial de la
fermentación era de 5,0, y no se añadió agente neutralizante
durante la fermentación. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
El tiempo transcurrido se midió desde el momento de la inoculación.
Las muestras de la fermentación, obtenidas tras eliminar las
células mediante filtración, se analizaron para comprobar la
presencia de glucosa y de ácido L(+)-láctico usando
un Select Biochemistry Analyzer YSI modelo 2700 (Yellow Springs
Instrument Co., Inc., Yellow Springs, OH). No se detectó etanol,
medido mediante cromatografía de gases, en ninguna de las
fermentaciones. El rendimiento y el % de ácido láctico libre se
calcularon según se describió previamente. Los inóculos para las
fermentaciones se prepararon precultivando PMI/C1[pEPL2] en
50 ml de medio sintético mínimo (1,3% p/v de base de nitrógeno de
levadura - aa (Difco, Detroit, MI), 200 mg/l de adenina, 5 g/l de
sulfato amónico, 50 g/l de glucosa) en matraces Erlenmeyer de 250 ml
amortiguados durante 30 h a 30ºC y 300 rpm en una estufa de
incubación con agitador (modelo G-24, New Brunswick
Scientific Co., Inc., Edison, NJ).
Se obtuvieron resultados similares usando el gen
de la LDH bacteriano (plásmido pEPL4; datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
| Rendimiento de | ||||||
| ácido láctico | ||||||
| Tiempo | NH_{4}OH | (g/l) | (g/g) | pH final | % de ácido | |
| transcurrido (h) | añadido (M) | láctico libre | ||||
| Caso 1 | 137 | 1,31 | 109 | 0,59 | 4,5 | 19 |
| Caso 2 | 97 | 0,14 | 35 | 0,44 | 3,0 | 88 |
| Caso 3 | 72 | 0 | 29 | 0,35 | 2,8 | 92 |
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de ácido láctico por
BM3-12D[pLAZ10] se probó adicionalmente
mediante el cultivo en un fermentador de tanque agitado de 1 litro
que contenía 0,8 litros de medio nutriente (6,7 g/YNB/base de
nitrógeno de levadura- Difco, Detroit, MI, 45 g/l de glucosa, 2%
v/v de etanol, 200 mg/l de G418). El fermentador se mantuvo a 30ºC,
se agitó a 400 rpm y se aireó a 0,8 litros/min a su través. Se
añadió un antiespumante (Antifoam 1520, Dow Corning Corp., Midland,
MI) según fue necesario para controlar la formación de espuma. Las
células transformadas usaron en primer lugar etanol para la
producción de biomasa (primeras 50 horas de crecimiento) y después
transformaron la glucosa en ácido L(+) láctico. El pH se mantuvo a
4,5 mediante la adición automática de KOH 2 M. Se suministró
glucosa según fue necesario para mantener una concentración residual
en el medio de fermentación de aproximadamente
35-45 g/L.
Los resultados se muestran en la figura 9 y la
Tabla 7 (Caso 1). El tiempo transcurrido se midió desde el momento
de la inoculación. Las muestras de la fermentación, obtenidas tras
eliminar las células mediante filtración, se analizaron para
comprobar la presencia de glucosa y de ácido
L(+)-láctico usando un análisis enzimático estándar
según se describe en Porro y col.1995 (supra). Después de T =
50 h no se detectó etanol en ninguna de las muestras de prueba. El
rendimiento y el % de ácido láctico libre se calcularon según se
describió previamente.
Los inóculos para las fermentaciones se
prepararon precultivando BM3-12D[pLAZ10] en
50 ml de medio sintético mínimo (1,3% p/v de base de nitrógeno de
levadura - aa (Difco, Detroit, MI), 2% v/v de etanol, 200 mg/l de
G418 200) en matraces Erlenmeyer de 250 ml amortiguados durante 40 h
a 30ºC y 300 rpm en una estufa de incubación con agitador (modelo
G-24, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison,
NJ).
En un experimento diferente (Tabla 7, Caso 2), el
pH inicial de la fermentación era de 5,4, y no se añadió agente
neutralizante durante la fermentación.
| Rendimiento de | |||||
| ácido láctico | |||||
| Tiempo transcurrido (h) | (g/l) | (g/g) | pH final | % de ácido láctico libre | |
| Caso 1 | 474 | 60,3 | 0,854 | 4,5 | 19 |
| Caso 2 | 498 | 32,3 | 0,881 | 3,6 | 65 |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Biopolo s. c. r. l.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: via gozzi 8
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Milán
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Italia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20129
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cepas de levadura para la producción de ácido láctico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco floppy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: IT mi97a002080
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGCCATTG CTGCAGGCAT CGTGGTG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTTAGGGT CTAGATCCAA GATGGCAAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATGGCAAG TATTACGGAT AAGGATC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATCACTGC AGGGTTTCGA TGTC
\hfill24
Claims (28)
1. Una cepa de Pichia, Kluyveromyces,
Torulaspora o Zygosaccharomyces transformada con al
menos una copia de un gen que codifica para la lactato
deshidrogenasa conectado funcionalmente a secuencias promotoras que
permiten la expresión de dicho gen en levaduras, y en la que dicha
cepa está modificada genéticamente para tener unas actividades de
piruvato descarboxilasa y/o de piruvato deshidrogenasa
reducidas.
2. Una cepa de levadura según la
reivindicación 1 con una actividad de piruvato deshidrogenasa
reducida.
3. Una cepa de levadura según la
reivindicación 1 con una actividad de piruvato descarboxilasa
reducida.
4. Una cepa de levadura según la
reivindicación 1 con ambas actividades de piruvato deshidrogenasa y
de piruvato descarboxilasa reducidas.
5. Una cepa de levadura según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el
gen o los genes que codifican para la piruvato descarboxilasa, para
la piruvato deshidrogenasa o ambas ha o han sido desorganizados
mediante deleción o inserción mediante marcador(es)
seleccionable(s).
6. Una cepa de levadura según la
reivindicación 5, en la que el marcador seleccionable es un marcador
URA3.
7. Una cepa de levadura según la
reivindicación 6, en la que el marcador seleccionable es el marcador
URA3 de Saccharomyces cerevisiae.
8. Una cepa de levadura según la
reivindicación 7, en la que el marcador seleccionable es un marcador
dominante que codifica para la resistencia a compuestos
tóxicos.
9. Una cepa de levadura según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-8, elegida
entre especies de Kluyveromyces, Torulaspora y
Zygosaccharomyces.
10. Una cepa de levadura según la
reivindicación 9 que es una cepa de Kluyveromyces lactis.
11. Una cepa de levadura según la
reivindicación 9 que es una cepa de Torulaspora
delbrueckii.
12. Una cepa de levadura según la
reivindicación 9 que es una cepa de Zygosaccharomyces
bailii.
13. Una cepa de levadura elegida entre
especies de Kluyveromyces, Torulaspora y
Zygosaccharomyces transformada con al menos una copia de un
gen que codifica para la lactato deshidrogenasa, conectada
funcionalmente a secuencias promotoras que permiten la expresión de
dicho gen en dichas levaduras.
14. Una cepa de levadura según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 transformada con un gen
que codifica para la lactato deshidrogenasa bovina.
15. Una cepa de levadura según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 transformada con un gen
que codifica para una lactato deshidrogenasa bacteriana.
16. Una cepa de levadura según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la que el gen que
codifica para la lactato deshidrogenasa está integrado en el genoma
de la levadura.
17. Una cepa de levadura según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-16 que ha sido
transformada por un vector de expresión que comprende una secuencia
promotora y una secuencia de ADN que codifica para la lactato
deshidrogenasa bajo la regulación de dicha secuencia promotora.
18. Una cepa de levadura según la
reivindicación 17 en la que la secuencia promotora es un gen
promotor de la piruvato descarboxilasa.
19. Una cepa de levadura según la
reivindicación 18 en la que la secuencia promotora es un gen
promotor de la piruvato descarboxilasa de Kluyveromyces.
20. Una cepa de levadura según una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que sobreexpresa un
transportador de lactato.
21. Una cepa de levadura según la
reivindicación 20 en la que el transportador de lactato es JEN1.
22. Un procedimiento para la preparación de
ácido láctico que comprende el crecimiento de una cepa de levadura
recombinante de las reivindicaciones 1-21 en un
medio de fermentación que contiene una fuente de carbono, y la
recuperación del ácido láctico del medio de fermentación.
\newpage
23. Un procedimiento según la
reivindicación 22, en el que la fuente de carbono se elige entre uno
más de glucosa, fructosa, galactosa, lactosa, sacarosa, rafinosa,
maltosa, celobiosa, arabinosa, xilosa.
24. Un procedimiento para la preparación de
ácido láctico según la reivindicación 22 ó 23, en el que el medio
de fermentación contiene menos de 5 mM de Mg^{++} y/o menos de
0,02 mM de Zn^{++}.
25. Un procedimiento según las
reivindicaciones 22-24, en el que el medio de
fermentación tiene un pH de 7 o menos.
26. Un procedimiento según la
reivindicación 25 en el que el pH es de 4,5 o menos.
27. Un procedimiento según la
reivindicación 26 en el que el pH es de 3 o menos.
28. Un procedimiento según la
reivindicación 22 para la preparación de ácido D o
L-láctico o una mezcla de los dos.
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