KR20090054596A - 분열효모용 발현벡터, 그 제조방법 및 분열효모 배양용배지 조성물 - Google Patents

분열효모용 발현벡터, 그 제조방법 및 분열효모 배양용배지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마커유전자로서 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터 및 그 제조방법, 상기 발현벡터에 의하여 형질전환된 균주, 및 분열효모배양용 배지 조성물을 제공한다. 본 발명의 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 분열효모, 및 상기 분열효모배양용 배지조성물은 노르세오트리신 저항유전자를 포함하는 분열효모의 선별에 적합하다는 장점을 갖는다.
노르세오트리신, 분열효모, 발현벡터

Description

분열효모용 발현벡터, 그 제조방법 및 분열효모 배양용 배지 조성물 {Expression vectors for fission yeast, construction method thereof, and medium composition for culturing the fission yeast}
본 발명은 항생제에 대한 저항유전자를 마커유전자로 포함하는 분열효모용 발현벡터에 관한 것이다.
효모류는 진핵 세포 중 가장 간단한 모델 세포로써 저렴한 비용으로 배양이 가능하며 유전학적인 연구 및 조작이 용이하고 생화학적, 생리적 기능 분석 시스템의 확립이 잘 이루어져 있어 인간의 질병을 유발하는 유전자의 기능 연구 및 약물 개발을 위한 모델 세포로 이용되고 있다.
특히, 분열효모는 세포 주기 및 신호 전달과 관련된 유전자가 결손되거나 세포 내에 대량 발현되면 신호전달 체계 조절에 이상이 초래됨에 따라 세포주기 조절 이상 또는 대사 이상에 의한 세포의 생장속도 저해 및 형태학적 변화가 초래된다. 따라서 이러한 표현형의 변화를 탐색하여 해당 유전자의 기능을 유추할 수 있다.
마커유전자는 분열효모에서 돌연변이 균주를 만들거나 특정 유전자를 균주 내에 삽입하여 발현시켜 그 기능을 분석하거나 하는 다양한 연구에 중요한 도구로 이용되고 있다. 가장 이상적인 마커 유전자는 세포내 어떤 기능에도 영향을 주지 않고, 세포주와의 서열상의 유사성이 적어 무작위적인 염색체로의 삽입이나 재조합 등이 최소한으로 이루어지면서 효과적인 선별이 가능하여야 한다. 현재까지 분열효모에서는 선별마커로서 ura4, his3, arg6, LEU2 등의 영양마커 유전자를 발현벡터로 많이 이용하고 있으나, 영양 마커 유전자를 가진 벡터들은 그 사용 균주가 반드시 영양마커에 돌연변이가 있는 균주이어야 한다는 제약이 있을뿐 아니라, 영양마커에 돌연변이가 있는 균주들은 정상균주와 비교하여 세포성장에 약간의 저해가 있으며, 기타 신호전달 과정에서 영향을 주기도 하므로 이상적이라고 볼 수는 없다.
영양마커 유전자 이외에 약물저항마커 유전자를 마커유전자로 사용하고 있으나, 발아효모에서 항생제 저항 마커유전자를 가진 벡터를 사용하고 있을 뿐, 현재 분열효모에서는 제네티신 저항 유전자인 KanMX를 가진 발현벡터가 유일하다.
그러나 분열효모는 제네티신에 대한 항생제 활성이 낮아, 제네티신 저항 유전자를 마커유전자로 사용할 경우 제네티신에 대한 민감도가 크지 않다는 문제점이 있다.
또한, 통상 영양 요구성 변이주를 선별하기 위해 최소배지에서 영양마커 유전자를 이용하나, 제네티신은 최소배지에서 그 활성을 잃어버리므로, 영양마커 유전자와 동시에 제네티신 저항 유전자를 마커유전자로 사용할 수 없다는 단점이 있다. 즉, 영양마커와 항생제저항마커를 동시에 갖는 벡터를 사용하고자 할 경우 제네티신 저항 유전자를 항생제마커유전자로 사용하기 어려워 분열효모를 모델시스템으로 하여 다수의 유전자를 동시에 발현시키거나 이미 다른 종류의 마커를 이용하 여 만들어진 돌연변이주를 이용하는 다양한 유전자의 기능연구 및 단백질 상호작용 연구에 마커 제한 없이 사용하기 어려웠다.
따라서, 분열효모에 대하여 활성이 충분하고, 최소배지에서 활성을 잃지 않는 항생제에 대한 저항 유전자를 마커유전자로 포함하는 분열효모용 발현벡터를 개발할 필요가 있다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 첫번째 기술적 과제는 분열효모에 대해서 활성이 충분하고 최소배지에서 활성을 잃지 않는 항생제에 대한 저항 유전자를 마커유전자로 포함하는 분열효모용 발현벡터, 상기 발현벡터에 의하여 형질전환된 균주, 및 상기 분열효모배양용 배지조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 기술적 과제는 상기 발현벡터를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 첫 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여, 마커유전자로서 노르세오트리신(nourseothricin) 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 마커유전자는 분열효모에서 돌연변이 균주를 만들거나 특정 유전자를 균주 내에 삽입하여 발현시켜 그 기능을 분석하거나 하는 다양한 연구에 중요한 도구로 사용할 수 있는 유전자를 의미한다.
본 발명에서 벡터는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
노르세오트리신은 상기 분열효모에 대하여 민감성이 큰 항생제이므로, 상기 항생제에 대한 저항유전자를 마커유전자로 사용하는 것이 가능하다.
상기 노르세오트리신 저항 유전자의 염기서열은 서열번호 3일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터에 의하여 형질전환된 균주를 제공한다.
상기 균주는 박테리아일 수 있다.
상기 박테리아는 DH5a일 수 있다.
상기 박테리아균주는 수탁번호 KCTC11231BP일 수 있다. 상기 수탁번호 KCTC11231BP인 박테리아균주는 노르세오트리신 저항유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터에 의해 형질전환된 증폭이 가능한 박테리아균주 DH5a이다.
또한, 상기 균주는 분열효모일 수 있다.
또한 본 발명은, 노르세오트리신을 포함하는 상기 분열효모배양용 배지 조성물을 제공한다. 상기 노르세오트리신을 포함하는 분열효모배양용 배지 조성물에 의해 본 발명에 따른 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 분열효모를 선별하는 것이 가능하다.
상기 분열효모배양용 배지는 복합배지(분열효모가 성장하기 위한 성분이 풍부한 배지)일 수 있다.
상기 분열효모배양용 배지 조성물은 노르세오트리신 및 탄소원으로 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 말토스, 또는 수크로스 등을 포함하며, 질소원으로 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 몰트 추출물, 비프추출물, 카제인, 소이빈 밀, NaNO3, NH4Cl, 또는 (NH4)2SO4 등을 포함하며, 또는 염공급원으로 MgSO4, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, CaCl2, FeSO4, ZnSO4 또는 MnSO4 등을 포함하고, 아미노산공급원으로 L-글루탐산, L-시스테인, 글리신, L-메티오닌, L-시스틴, 또는 타우린 등을 포함할 수 있다.
상기 노르세오트리신의 농도는 50~200 ㎍/ml일 수 있다.
또한, 본 발명에서 분열효모배양용 배지는 최소배지(minimal medium)일 수 있다.
상기 최소배지는 통상 영양요구성 돌연변이주를 선택하기 위한 배지로, 야생형 균이 자라는데 필요한 최소한의 성분만을 함유한 배지를 의미하며, 일반적으로 단일 탄소원과 무기물만으로 이루어진다. 이러한 최소배지는 영양 요구성 돌연변이체를 선별하는 목적으로 사용하므로, 최소배지에서 활성을 유지하는 항생제에 대한 마커유전자여야만, 최소배지에서 배양하는 영양마커 유전자와 동시에 사용할 수 있으므로, 돌연변이주를 이용하는 다양한 유전자의 기능연구 및 단백질 상호작용 연구에 마커 제한없이 사용할 수 있다.
종래의 최소배지(예를 들어, 3g/l 포타슘 하이드로젠 프탈레이트(Potassium Hydrogen phthallate), 2.2g/l Na2HPO4, 5g/l NH4Cl, 20g/l 글루코오스, 0.26M MgCl2, 4.99mM CaCl2, 0.67M KCl, 14.1mM Na2SO4, 4.2mM 판토테틱 산(pantothetic acid), 81.2mM 니코틴산(Nicotinic acid), 55.5mM 이노시톨(Inosito)l, 40.8uM 비오틴(Biotin), 80.9mM 붕산(Boric acid), 23.7mM MnSO4, 13.9mM ZnSO4, 7.4mM FeCl2, 2.47mM 몰리브덴산(molybdic acid), 6.02mM KI, 1.6mM CuSO4, 47.6mM 씨트르산(Citric acid); Sigma사)에서 제네티신을 사용하는 경우 제네티신은 항생제 활성을 잃어버리게 되나, 노르세오트리신은 항생제 활성을 잃지 않는다. 따라서, 본 발 명에 따른 노르세오트리신 저항유전자를 포함하는 발현벡터에 영양마커유전자를 동시에 사용하는 것이 가능하게 되어, 상기 발현벡터로 형질전환된 분열효모에 영양마커유전자와 노르세오트리신 저항유전자를 동시에 포함하도록 하여 최소배지에서 영양요구성이면서 노르세오트리신에 저항하는 분열효모를 선택하는 것이 가능하게 된다.
또한, 본 발명은 노르세오트리신을 포함하는 분열효모배양용 배지를 본 발명에 따른 분열효모의 배양에 사용하는 용도 및 노르세오트리신을 포함하는 분열효모배양용 배지에 본 발명에 따른 분열효모를 배양하는 단계를 포함하는 분열효모배양방법을 제공한다.
본 발명은 두번째 기술적 과제를 달성하기 위하여, (a) 제네티신 저항 유전자 카세트를 포함하는 벡터에서 제네티신 저항 유전자 개방해독판독틀을 제거한 후, 노르세오트리신 저항 유전자의 개방해독판독틀을 상기 제네티신 저항 유전자 개방해독판독틀이 제거된 벡터에 클로닝하여, 노르세오트리신 저항 유전자 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 제조된 벡터에서 노르세오트리신 저항 유전자 카세트를 PCR로 증폭하여 영양마커가 제거된 분열효모용 발현벡터에 클로닝하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 발현벡터 제조방법을 제공한다.
상기 (a)단계의 노르세오트리신 저항 유전자는 노르세오트리신 아세틸트랜스퍼라아제(nourseothricin acetyltransferase; Streptomyces noursei) 유전자를 가지고 있는 박테리아용 프라스미드 pRS-NAT로부터 PCR을 통하여 증폭시킬 수 있다. PCR에 사용한 프라이머는 서열번호 1(노르세오트리신 저항 유전자 개방해독판독틀용 5'말단 프라이머), 및 서열번호 2(노르세오트리신 저항 유전자 개방해독판독틀용 3'말단 프라이머)일 수 있다.
또한, 진핵세포 곰팡이 (Ashbya gossypii) 의 번역 연장 인자 (translation elongation factor)의 프로모터와 박테리아 Tn903의 터미네이터를 각각 제네티신의 개방해독판독틀(open reading frame) 의 N-말단과 C-말단에 결합시켜 만들어진 제네티신 저항유전자 카세트(KanMX4)를 가진 박테리아 플라스미드인 pFA6A에서 제네티신 저항유전자의 개방해독판독틀을 제한효소(Nco Ｉ/Sca Ｉ)를 사용하여 제거하고, 상기 PCR로 증폭시킨 노르세오트리신저항 유전자(NAT)의 개방해독판독틀(ORF)을 제네티신 저항유전자의 개방해독판독틀이 제거된 pFA6A 플라스미드에 삽입하여 노르세오트리신 저항 유전자 카세트(natMX)를 갖는 박테리아용 클로닝 벡터(pFA6-natMX 벡터)를 만들 수 있다(도 3). 상기 노르세오트리신 저항유전자 개방해독판독틀의 염기서열은 서열번호 3번일 수 있다.
상기 (b)단계는 상기 (a) 단계에서 제조된 박테리아용 클로닝 벡터 pFA6-natMX 로부터 노르세오트리신 저항 유전자 카세트(natMX)를 PCR을 통하여 증폭시킬 수 있다. PCR에 사용한 프라이머는 서열번호 4 (노르세오트리신 저항 유전자 카세트용 5'말단 프라이머), 및 서열번호 5 (노르세오트리신 저항 유전자 카세트용 3'말단 프라이머) 일 수 있다.
PCR에 의한 염기 돌연변이의 가능성을 없애기 위하여 증폭된 PCR 산물을 시퀀싱(sequencing) 하여 염기순열을 확인한 후 제한효소(Sph I/Nsi I)를 이용하여 말단을 정리하고. 제한효소 (Sph I/Nsi I)를 사용하여 영양마커인 Ura4 유전자를 제거한 분열효모용 발현 벡터(pSLF173, pSLF273, pSLF373)에 삽입하여 노르세오트리신 저항 유전자(NAT)를 가지는 분열효모용 발현벡터를 만들 수 있다(도 4). 상기 노르세오트리신 저항 유전자 카세트(natMX)의 염기서열은 서열번호 6일 수 있다.
상기 (b)단계에서 제조된 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터를 공지의 형질전환방법(예를 들어, Methods in Enzymology Vol. 194에 개시된 방법)에 의해 분열효모에 형질전환할 수 있다.
상기한 노르세오트리신 저항 유전자, 상기 저항유전자의 개방해독판독틀 및 상기 저항유전자 카세트의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하는데 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.
본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 분열효모, 및 상기 분열효모용 배지는 항생제저항유전자를 포함하는 분열효모의 선별에 적합하며, 본 발명의 발현벡터 제조방법에 의해 상기 발현벡터를 용이하게 제조할 수 있다. 또한 최소배지에서도 분열효모의 선별이 가능하다는 장점을 갖는다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> 노르세오트리신 저항유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터의 제조
1-1. 노르세오트리신 저항유전자 카세트(natMX)를 포함하는 벡터의 제조
도 3에 도시한 바와 같이 우선, 제네티신 저항 유전자카세트를 가지는 벡터 인 pFA6A(Wach et al., 1994, Yeast 10:1793)로부터 제네티신 저항유전자의 개방해독판독틀을 제한효소 NcoI/ScaI 을 사용하여 제거하였다. 제거된 DNA 절편은 전기영동하여 분리하고 DNA 절편 정제 용액(Gel Purification Kit, Bioneer)과 컬럼(Gel Purification Kit, Bioneer)을 사용하여 순수 분리하였다. 그리고 노르세오트리신 저항 유전자의 개방해독판독틀도 pRS-NAT(Taxis C and Knop M. Biotechniques 2006, 40(1): 73-78)로부터 PCR을 이용하여 증폭시킨 후 정제하였다. 이들 PCR 산물은 한쪽에는 NcoI site를 가지고 다른 한쪽에는 제한효소 자리가 없도록 디자인하였다.
PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation)하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 54℃에서 30초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 90초 동안 길이연장 반응(extension)을 30회 수행하고, 72℃에서 5분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다.
상기에서 만들어진 pFA6A 벡터로부터의 DNA 절편과 노르세오트리신 저항 유전자의 개방해독판독틀을 가지는 PCR 산물을 각각 DNA 리게이션(DNA ligation)을 통해 결합시켜 노르세오트리신 저항 유전자 카세트를 가지는 pFA6-natMX 플라스미드를 만들었다.
1-2. 노르세오트리신 저항유전자 카세트(natMX)를 포함하는 분열효모용 발현벡터의 제조
도 4에 도시한 바와 같이, pFA6-natMX 플라스미드의 노르세오트리신 저항 유 전자 카세트 부위를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 이들 PCR 산물은 한쪽에는 Sph I site를 가지고 다른 한쪽에는 Nsi I site를 가지도록 디자인하였다. PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 열 변성(denaturation) 1회를 하고, 94℃에서 1분 동안 열 변성 반응, 54℃에서 30초 동안 프라이머 결합반응(annealing), 72℃에서 120초 동안 길이연장 반응(extension)을 30회 수행하고, 72℃에서 10분 동안 최종 길이연장 반응을 수행하였다. PCR 산물은 제한효소 (Sph I, Nsi I)로 절단하고 전기영동하여 노르세오트리신 저항 유전자 카세트를 아가로스 겔로부터 분리하고, DNA 정제 kit (Bioneer Co)를 사용하여 순수 분리하였다.
Ura4 영양마커를 가지는 분열효모 발현벡터인 pSLF173(프로모터 강도 강함), pSLF273(프로모터 강도 중간), pSLF373(프로모터 강도 약함) (ATCC, The global bioresource center)의 Ura4 마커를 제거하기 위하여 제한효소 SphI/NsiI 을 이용하였다. 이렇게 Ura4가 제거된 DNA 절편을 전기영동하여 분리하였다.
Ura4 마커를 제거한 발현벡터 pSLF173, pSLF273, pSLF373 와 PCR 로 증폭된 노르세오트리신 저항 유전자 카세트를 DNA 리게이션(ligation)을 통하여 결합시키고 박테리아에 형질전환하여 노르세오트리신 저항 유전자 카세트가 제거된 Ura4 위치에 정확히 결합된 박테리아 콜로니를 선별하여 DNA를 증폭시켰다. 그 결과 노르세오트리신 저항 유전자 카세트를 가지는 분열효모 발현벡터 pSLF173-natMX, pSLF273-natMX, 및 pSLF373-natMX를 제조하였다. 얻어진 발현벡터의 카세트 부분은 염기서열 분석을 통해 돌연변이가 생기지 않았음을 확인하였다.
상기 분열효모 발현벡터 중 프로모터 강도가 가장 높은 pSLF173-natMX 벡터 를 증폭이 가능한 박테리아균주 DH5a에 형질전환(RbCl2를 이용한 Frozen Stock method)하고 'DH5a/pSLF173-natMX'라 명명하여 한국생명공학연구원 유전자은행에 2007년 11월 8일자로 기탁하였다.(수탁번호KCTC11231BP.)
<시험예 1> 복합배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모 균주의 민감도 시험
대표적인 분열효모 균주 ED665(일배체, Fanter PA 실험실, UK.)와 SP286(이배체, Paul Nurse 실험실, UK)을 액체 복합배지(5g/l 효모 추출물(Difco), 30g/l 글루코오스(덕산), 225mg/l 아데닌(시그마))를 이용하여 30℃ 배양기에서 하루동안 진탕배양하여 5×107/ml 세포로 만들고 순차적으로 4배씩 희석하여 항생제 제네티신(Promega), 또는 노르세오트리신(Werner Bioagents, Jena-Cospeda, Germany)이 첨가된 복합배지(상기 액체복합배지+ 20g/l 아가)에 스팟팅(spotting)하고 30℃ 배양기에서 2일간 배양한 후 그 성장 정도를 비교하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었으며, 도 1의 농도는 각 항생제의 농도를 의미하고, 대조군(control)은 항생제가 포함되지 않은 복합배지에서의 결과를 의미한다. 그 결과 제네티신에 비교하여 노르세오트리신이 첨가된 배지에서 분열효모 균주가 더 민감함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 마커유전자로서 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 발현벡터로 분열효모를 형질전환할 경우, 제네티신 저항 유전자의 경우에 비해 항생제 저항 균주의 선택도가 높음을 알 수 있다.
<시험예 2> 최소배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모의 민감도 시험
복합배지 대신 최소배지 (3g/l 포타슘 하이드로젠 프탈레이트(Potassium Hydrogen phthallate), 2.2g/l Na2HPO4, 5g/l NH4Cl, 20g/l 글루코오스, 0.26M MgCl2, 4.99mM CaCl2, 0.67M KCl, 14.1mM Na2SO4, 4.2mM 판토테틱산(pantothetic acid), 81.2mM 니코틴산(Nicotinic acid), 55.5mM 이노시톨, 40.8uM 비오틴(Biotin), 80.9mM 붕산(Boric acid), 23.7mM MnSO4, 13.9mM ZnSO4, 7.4mM FeCl2, 2.47mM 몰리브덴산(molybdic acid), 6.02mM KI, 1.6mM CuSO4, 47.6mM 씨트르산(Citric acid); Sigma사) 를 사용하고, 스폿팅(spotting)한 후 30도 배양기에서 3일간 배양한 것을 제외하고, 상기 시험예 1과 동일하게 실시하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 도 2의 농도는 각 항생제의 농도를 의미하고, 대조군(control)은 항생제가 포함되지 않은 복합배지에서의 결과를 의미한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 제네티신의 경우 항생제가 첨가되지 않은 배지에서와 비교하여 약간의 성장저해가 있었으나, 시간이 지나면서 세포성장이 거의 대조군(control)과 같아지는 현상을 나타내는 반면, 노르세오트리신의 경우 항생제가 첨가된 배지에서 분열효모 균주의 성장이 완벽하게 저해됨을 알수 있어 노르세오트리신은 최소배지에서도 활성을 유지함을 알 수 있다. 따라서, 최소배지에서도 본 발명에 따른 노르세오트리신 저항 유전자를 마커유전자로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
<비교예 1> 복합배지의 제조
복합배지 (5g/l 효모추출액 (Difco), 30g/l 글루코오스 (Duksan), 225mg/l 아데닌 (Sigma)) 를 Methods in Enzymology Vol. 194의 방법으로 준비하였다.
<실시예 2> 노르세오트리신 포함 복합배지의 제조
노르세오트리신 농도를 50, 100, 200㎍/ml로 변화시켜 배지에 추가한 것을 제외하고 비교예 1과 동일하게 복합배지를 제조하였다.
<시험예 3> 항생제 저항 유전자를 포함하는 효모발현벡터의 항생제 저항성 확인시험
실시예 1에서 증폭하여 준비된 분열효모 발현벡터중 대표적인 벡터인 pSLF173-natMX 및 상기 발현벡터의 모벡터(mother vector)인 pSLF173을 각각 분열효모 ED665 (Fantes PA 실험실)에 리튬아세티이트 형질전환방법으로 형질 전환 (Methods in Enzymology Vol. 194) 하여, 약 10배로 희석하고 비교예 1의 복합배지와 실시예 2의 복합배지 (노르세오트리신 200㎍/ml)에 각각 도말하여 30℃에서 2일간 배양 후 분열효모의 성장을 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 pSLF173-natMX 벡터를 분열효모에 형질 전환하여 항생제 노르세오트리신이 첨가된 복합배지에 도말하여 벡터가 형질전환된 균주의 콜로니가 형성되는지 여부를 검정한 결과를 나타낸 사진이다. 그 결과 항생제 마커를 포함하지 않는 pSLF173 벡터로 형질전환된 분열효모는 항생제가 들어있지 않은 복합배지에서만 성장을 보였고, pSLF173-natMX로 형질전환된 분열효모는 항생제가 포함된 복합배지에서도 고른 성장을 보였다. 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 분열효모용 발현벡터에 포함된 노르세오트리신 저항 유전자를 항생제마커유전자로 사용할 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 노르세오트리신 200㎍/ml 농도에서 효과적으로 항생제 활성이 일어남을 알 수 있다.
<시험예 4> 벡터의 항생제 저항력 정도 시험
실시예 1에서 증폭하여 준비된 발현벡터를 시험예 3과 동일하게 분열효모에 형질전환하여 노르세오트리신(200㎍/ml)이 들어 있는 복합배지에서 선별하고, 영양마커를 가진 pSLF173/273/373 벡터는 uracil이 없는 최소배지에서 선별하여 각각 액체 배양(5g/l 효모추출액 (Difco), 30g/l 글루코오스 (Duksan), 225mg/l 아데닌 (Sigma); 30℃)하였다.
각각의 배양액을 1×107cell/ml으로 희석하고 순차적으로 4배씩 희석하여 5단계로 만든 후 비교예 1에서 제조된 복합배지와 실시예 2의 복합배지(노르세오트리신 100㎍/ml)에 스팟팅(spotting) 하였다. 30℃에서 2일간 배양 후 각각의 벡터의 성장 정도로부터 저항력 정도를 판단하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 pSLF173-natMX, pSLF273-natMX, 또는 pSLF373-natMX 벡터를 분열효모에 형질 전환하여 액체배지에서 배양시킨 후 항생제 노르세오트리신 또는 하이그로마이신이 첨가된 복합배지에 희석하여 스팟팅(spotting)한 후 벡터가 형질 전환된 균주의 항생제 저항 여부를 균주 농도별로 검정한 결과를 나타낸 사진으로, 도 6의 1열은 비교예 1에서 제조된 복합배지에 pSLF173, 또는 pSLF173-natMX 벡터를 형질전환한 경우의 결과이고, 2~4열은 각각 실시예 2의 복합배지에서의 결과를 나타내는 것이다. 그 결과 실시예 1에서 제조한 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 모든 분열효모는 그 성장이 세포의 농도와 상관없이 이루어짐을 알 수 있었다. 또한, 노르세오트리신 100㎍/ml 농도에서 효과적으로 항생제 활성이 일어남을 알 수 있다.
<시험예 5>
실시예 2의 복합배지(노르세오트리신 50㎍/ml)에 스팟팅(spotting)한 것을 제외하고는 시험예 4와 동일하게 시험한 결과, 노르세오트리신 50㎍/ml 농도의 복합배지에서는 노르세오트리신 저항 유전자를 가지는 분열효모만이 항생제를 포함하는 복합배지에서 성장하였다.
상기의 결과와 시험예 3 및 시험예 4의 결과로부터 본 발명에 따른 분열효모용 배지 조성물은 50~200㎍/ml의 노르세오트리신 농도에서 항생제 활성을 충분히 나타내어, 노르세오트리신저항유전자를 마커유전자로 이용하는 분열효모의 선택성이 뛰어남을 알 수 있다.
<시험예 6> 효모발현벡터의 최소배지에서 사용가능성 시험
실시예 1에서 증폭하여 준비된 발현벡터를 분열효모 ED665에 리튬아세티이트 형질전환방법 (Methods in Enzymology Vol. 194)으로 형질 전환하여, 약 10배로 희석한 후 노르세오트리신 100㎍/ml이 들어 있는 최소 배지 (3g/l Potassium Hydrogem phthallate, 2.2g/l Na2HPO4, 5g/l NH4Cl, 20g/l Glucose, 0.26M MgCl2, 4.99mM CaCl2, 0.67M KCl, 14.1mM Na2SO4, 4.2mM pantothetic acid, 81.2mM Nicotinic acid, 55.5mM Inositol, 40.8uM Biotin, 80.9mM Boric acid, 23.7mM MnSO4, 13.9mM ZnSO4, 7.4mM FeCl2, 2.47mM molybdic acid, 6.02mM KI, 1.6mM CuSO4, 47.6mM Citric acid; Sigma사)에 도말하여 30℃에서 3일간 배양한 후 항생제 마커를 가지는 균주의 최소배지에서의 성장을 조사하였다. 영양마커를 가진 pSLF173 벡터를 대조군(control)으로 사용하였으며, 그 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7은 pSLF173-natMX, pSLF273-natMX, 또는 pSLF373-natMX 벡터를 분열효모에 형질 전환하여 액체배지에서 배양시킨 후 항생제 노르세오트리신(100㎍/ml)이 첨가된 최소배지에 희석하여 스팟팅(spotting)한 후 벡터가 형질 전환된 균주의 항생제 저항 여부를 균주 농도별로 검정한 결과를 나타낸 사진으로, 그 결과 노르세오트리신의 경우 영양마커를 가진 pSLF173벡터를 가진 분열효모는 성장하지 않고, 항생제 마커를 가진 분열효모만이 성장하였다. 따라서, 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 분열효모는 최소배지에서도 항생제저항성균주의 선택을 위해 사용가능함을 알 수 있다.
도 1은 복합배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모 균주의 민감도 시험 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 최소배지에서 제네티신, 또는 노르세오트리신에 대한 분열효모 균주의 민감도 시험 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 노르세오트리신 저항유전자 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 노르세오트리신 저항유저자 카세트를 포함하는 분열효모용 발현벡터의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 항생제 저항유전자를 포함하는 효모발현벡터의 항생제 저항성을 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 항생제 저항유전자를 포함하는 효모발현벡터의 항생제 저항력 정도시험 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 효모발현벡터의 최소배지에서 사용가능성을 시험한 결과를 나타낸 사진이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Expression vectors for fission yeast, construction method thereof, and medium composition for culturing the fission yeast <130> P07-068-KRI <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer for ORF of nourseothricin resistance gene <400> 1 caaccatggg taccactctt gacg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer for ORF of nourseothricin resistance gene <400> 2 tgattagggg cagggcatgc tcat 24 <210> 3 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF of nourseothricin resistance gene <400> 3 atgggtacca ctcttgacga cacggcttac cggtaccgca ccagtgtccc gggggacgcc 60 gaggccatcg aggcactgga tgggtccttc accaccgaca ccgtcttccg cgtcaccgcc 120 accggggacg gcttcaccct gcgggaggtg ccggtggacc cgcccctgac caaggtgttc 180 cccgacgacg aatcggacga cgaatcggac gccggggagg acggcgaccc ggactcccgg 240 acgttcgtcg cgtacgggga cgacggcgac ctggcgggct tcgtggtcgt ctcgtactcc 300 ggctggaacc gccggctgac cgtcgaggac atcgaggtcg ccccggagca ccgggggcac 360 ggggtcgggc gcgcgttgat ggggctcgcg acggagttcg cccgcgagcg gggcgccggg 420 cacctctggc tggaggtcac caacgtcaac gcaccggcga tccacgcgta ccggcggatg 480 gggttcaccc tctgcggcct ggacaccgcc ctgtacgacg gcaccgcctc ggacggcgag 540 caggcgctct acatgagcat gccctgcccc taa 573 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer for cassette of nourseothricin resistance gene <400> 4 gcatgcattg tttagcttgc ctcgtccc 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer for cassette of nourseothricin resistance gene <400> 5 gcgcatgccg ttttcgacac tggatggc 28 <210> 6 <211> 1255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cassette of nourseothricin resistance gene <400> 6 atgcattgtt tagcttgcct cgtccccgcc gggtcacccg gccagcgaca tggaggccca 60 gaataccctc cttgacagtc ttgacgtgcg cagctcaggg gcatgatgtg actgtcgccc 120 gtacatttag cccatacatc cccatgtata atcatttgca tccatacatt ttgatggccg 180 cacggcgcga agcaaaaatt acggctcctc gctgcagacc tgcgagcagg gaaacgctcc 240 cctcacagac gcgttgaatt gtccccacgc cgcgcccctg tagagaaata taaaaggtta 300 ggatttgcca ctgaggttct tctttcatat acttcctttt aaaatcttgc taggatacag 360 ttctcacatc acatccgaac ataaacaacc atgggtacca ctcttgacga cacggcttac 420 cggtaccgca ccagtgtccc gggggacgcc gaggccatcg aggcactgga tgggtccttc 480 accaccgaca ccgtcttccg cgtcaccgcc accggggacg gcttcaccct gcgggaggtg 540 ccggtggacc cgcccctgac caaggtgttc cccgacgacg aatcggacga cgaatcggac 600 gccggggagg acggcgaccc ggactcccgg acgttcgtcg cgtacgggga cgacggcgac 660 ctggcgggct tcgtggtcgt ctcgtactcc ggctggaacc gccggctgac cgtcgaggac 720 atcgaggtcg ccccggagca ccgggggcac ggggtcgggc gcgcgttgat ggggctcgcg 780 acggagttcg cccgcgagcg gggcgccggg cacctctggc tggaggtcac caacgtcaac 840 gcaccggcga tccacgcgta ccggcggatg gggttcaccc tctgcggcct ggacaccgcc 900 ctgtacgacg gcaccgcctc ggacggcgag caggcgctct acatgagcat gccctgcccc 960 taatcagtac tgacaataaa aagattcttg ttttcaagaa cttgtcattt gtatagtttt 1020 tttatattgt agttgttcta ttttaatcaa atgttagcgt gatttatatt ttttttcgcc 1080 tcgacatcat ctgcccagat gcgaagttaa tgcgcagaaa gtaatatcat gcgtcaatcg 1140 tatgtgaatg ctggtcgcta tactgctgtc gattcgatac taacgccgcc atccagtgtc 1200 gaaaacgagc tcgaattcat cgatgattat gtatggtgca ctctcagtac aatct 1255

Claims (12)

  1. 마커유전자로서 노르세오트리신 저항 유전자를 포함하는 분열효모용 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 노르세오트리신 저항 유전자의 염기서열은 서열번호 3인 발현벡터.
  3. 제1항 또는 제2항의 발현벡터에 의하여 형질전환된 균주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 균주는 박테리아인 균주.
  5. 제4항에 있어서, 상기 박테리아는 DH5a인 균주.
  6. 제5항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC11231BP인 균주.
  7. 제3항에 있어서, 상기 균주는 분열효모인 균주.
  8. 노르세오트리신을 포함하는 제7항의 분열효모배양용 배지 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 노르세오트리신의 농도는 50~200 ㎍/ml인 배지 조성물.
  10. (a) 제네티신 저항 유전자 카세트를 포함하는 벡터에서 제네티신 저항 유전자 개방해독판독틀을 제거한 후, 노르세오트리신 저항 유전자의 개방해독판독틀을 상기 제네티신 저항 유전자 개방해독판독틀이 제거된 벡터에 클로닝하여, 노르세오트리신 저항 유전자 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계에서 제조된 벡터에서 노르세오트리신 저항 유전자 카세트를 PCR로 증폭하여 영양마커가 제거된 분열효모용 발현벡터에 클로닝하는 단계를 포함하는 제1항의 발현벡터 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 노르세오트리신 저항 유전자 개방해독판독틀의 염기서열은 서열번호 3인 발현벡터 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 노르세오트리신 저항 유전자 카세트의 염기서열은 서열번호 6인 발현벡터 제조방법.
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