CN114667346B - EanB酶突变体及其应用 - Google Patents

EanB酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产麦角硫因(ergothionine)的方法，该方法包含N(α)‑三甲基组氨酸和氧化硫化酶突变体。加酶量8000U/g底物的条件下，通过酶突变体的帮助，24小时后转化率达到30％以上。本发明还涉及编码酶突变体的核酸、含有该核酸的表达载体、包含核酸或表达载体的表达宿主，以及使用EanB酶突变体生产麦角硫因。

Description

EanB酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种栖泥绿菌Chlorobium limicola氧化硫化酶EanB突变体及其在制备麦角硫因中的用途。
背景技术
麦角硫因(L-ergothionine，EGT)，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，其结构式如下：
Figure GDA0004054230830000011
麦角硫因是至今唯一为人们所知的天然2-硫代咪唑氨基酸。其具有抗氧化、抗炎症、延长细胞生存周期和抗细胞衰老活性、改善神经细胞生成等多种生理功效。同时，在多种疾病模型中包括阿兹海默和糖尿病等的并发症中具有较好的保护细胞和抗击损伤的功效。因此，麦角硫因具有较好的市场应用前景。
目前，已知的麦角硫因可以经化学合成、食用真菌提取和微生物发酵生产获得，并且已经有多种微生物被证实具有麦角硫因的合成能力，包括分枝杆菌、链霉菌、霉菌和酵母等多类微生物。其中，利用食用蕈菌菌丝体深层发酵技术生物合成制备麦角硫因，是低成本规模化生产麦角硫因的主流方向。
然而蕈菌发酵存在两个重大缺陷：一是蕈菌菌丝体生长较为缓慢，导致发酵周期较长，一般需要7-10天；二是蕈菌发酵合成的麦角硫因绝大部分积累于菌丝体内，需要进行菌丝体破碎提取等繁琐的后续处理工序，导致生产成本相对较高。因此，一种能简单快速且低成本的麦角硫因制备方法是迫切需要的。
发明内容
本发明涉及EanB酶突变体、编码EanB酶突变体的核酸、包含该核酸的重组表达载体、包含该核酸或表达载体的宿主细胞，以及EanB酶突变体的用途，特别是用于制造麦角硫因。
本发明酶突变体的EanB来源于栖泥绿菌Chlorobium limicola，该酶能够催化N(α)-三甲基组氨酸底物，在不需氧气参与的情况下，EanB酶突变体催化ε位的C形成C-S键，一步合成麦角硫因(Reto,B.,et al.(2017)."Anaerobic Origin of Ergothioneine."Angewandte Chemie International Edition 56(41):12508-12511.；Leisinger,F.,etal.(2019)."Structural and Mechanistic Basis for Anaerobic ErgothioneineBiosynthesis."Journal of the American Chemical Society 141(17):6906-6914.)。
以野生型EanB酶为模板，通过易错PCR(error-prone PCR)的方法建立EanB基因突变库，通过筛选基因突变库筛选出3个能够明显提高氧化硫化酶活力的位点，然后通过定向诱变(site-directed mutagenesis)获得具有显着提升活性的EanB酶突变体。
在一实施方案中，本发明提供一种EanB酶突变体，其包括在SEQ ID NO 1的氨基酸序列第75、84或369位点的一个或多个突变。
在优选的实施方案中，突变是选自以下的一个或两个：(1)位置75的异亮氨酸(I)突变为精氨酸(R)；(2)位置369的谷氨酸(E)突变为脯氨酸(P)。
在另一优选的实施方案中，突变体包含SEQ ID NO：3、5或7中任一氨基酸序列。
在一实施方案中，本发明提供编码本发明的EanB酶突变体的多核苷酸，该多核苷酸包含SEQ ID NO：4、6或8中任一核酸序列。
在一实施方案中，本发明提供一种突变表达载体，该载体包含SEQ ID NO:4、6或8中任一多核苷酸。
优选地，上述载体是包含SEQ ID NO:4、6或8中任一多核苷酸的pSH质粒。
在一实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含编码EanB酶突变体的多核苷酸，该多核苷酸为SEQ ID NO:4、6或8中任一项。
在优选的实施方案中，宿主细胞带有包含SEQ ID NO:4、6或8中任一多核苷酸的载体。
更优选地，宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia col)。
本发明还包括EanB酶突变体的应用，优选地，本发明的EanB酶突变体用于生产麦角硫因。
具体实施方式
虽然本公开能够以各种形式体现，但是以下对若干实施例的描述是在理解本公开被视为所要求保护的主题的示例的情况下进行的，并且不旨在限制。所附权利要求限于所示和/或描述的特定实施例，并且不应被解释为限制本公开的范围或广度。贯穿本公开使用的标题仅是为了方便而提供的，不应被解释为以任何方式限制权利要求。在任何标题下示出的实施例可以与在任何其他标题下示出的实施例组合。
本发明中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。本发明的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-25℃)。
在本文中，“氧化硫化酶”可简称为“EanB”。
在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指未经基因工程改造的氧化硫化酶EanB(SEQ ID NO:1)。
为了获得酶活性更高的氧化硫化酶突变体，本发明对野生型氧化硫化酶EanB基因序列SEQ ID NO:2进行点突变。通过易错PCR技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列，筛选出3个可提高酶活力的位点，然后以定点组合突变的方式，获得一株酶活力明显提高的突变体。
本发明的EanB突变体由于氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以是任何适合表达氧化硫化酶突变体的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或者枯草杆菌(Bacillus subtilis)，优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产麦角硫因时，本发明的氧化硫化酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
常规方法
材料与方法：
本发明的氧化硫化酶的分离纯化(包括固定化酶制备技术)是本领域技术人员所熟知的。
本发明中的全基因合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成；表达载体由浙江华睿生物技术有限公司亚克隆制备。引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司公司完成。分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
培养基和缓冲液：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠、5.0g/L酵母萃取物(固体培养基添加20g/L洋菜粉)，pH值7.2，121℃高压灭菌20分钟。
发酵培养基(TB培养基)：24g/L酵母萃取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L磷酸氢二钾、5g/L甘油，pH值7.0-7.5，121℃高压灭菌20分钟。
在以下实施例，当使用含抗生素的培养基时，抗生素的最终浓度为卡那霉素(kanamycin)50μg/mL。根据转化质粒的特性加入其相应的抗生素。
20x电穿孔原液：80g/L甘氨酸、2％吐温-80。
使用HPLC检测麦角硫因(EGT)：
检测条件为：安捷伦高效液相色谱仪1260infinity II，依利特ODS-BP色谱柱，柱温40℃，流动相A：磷酸二氢铵(配置方法，称取1.1503g磷酸二氢铵+400mL纯化水，氨水调pH至5.0，再加100mL纯化水)；流动相B：乙腈。A：B＝99：1，流速1mg/min，进样量10μL，检测波长258nm。
EanB酶活力测定
EanB反应测定体系：50mM磷酸缓冲液，pH值8.0、50mM硫代硫酸钠、200mM氯化钠、1mM TMH、50μM EanB蛋白(纯化后为约10mg/mL)，16小时，25℃。
酶活力定义：在pH值8.0、25℃条件下，每分钟催化TMH产生1微摩尔(μmol)麦角硫因所需要的酶量定义为1个单位(U)。
实施例1：氧化硫化酶表达菌株的构建
通过全基因序列合成序列SEQ ID NO:2，两端设计酶切位点NdeI和BamHI，然后将该序列克隆到pSH质粒上相应位点，得到重组质粒pSH-EanB，然后用电穿孔法转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，将细胞在涂含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，于37℃培养过夜。
从平板上挑选单一菌落，接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，培养过夜后，离心收集细胞，提取质粒并基因测序确定正确，获得表达野生型EanB的重组菌株BL21(DE3)/pSH-EanB。氨基酸序列测定为SEQ ID NO:1。
从上述平板上挑选单一菌落，接种到5mL LB培养基中，加入50μg/ml卡那霉素，于37℃培养。然后，将1％v/v的培养基接种到装有100mL发酵培养基的1000mL摇瓶中培养4-6小时，待OD600达到1.2-1.5，加入终浓度0.2mM的IPTG诱导重组菌株，于25℃培养10-16小时。离心获得细胞，-80℃冻存24小时备用。
实施例2：易错PCR法构建随机突变文库
以SEQ ID NO:2为模板，利用易错PCR技术(error-prone PCR)构建随机突变文库。
正向引物(EanB-Nde-F)：5’-CATATGCAGAACAAAAACTTTCG-3’，
反向引物(EanB-Bam-R)：5’-GGATCCTTATTTAGGCACGCCGGTTT-3’。
50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pSH-EanB、30pmol引物对EanB-Nde-F和EanB-Bam-R、1X Taq buffer、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP、1mM dTTP、7mM MgCl2、0mM/0.05mM/0.1mM/0.15mM/0.2mM MnCl2、2.5个单位的Taq聚合酶(fermentas)。PCR反应条件为：95℃ 5分钟；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分钟/kbp；30个循环；72℃ 10分钟。通过胶提取回收1347bp随机突变片段作为大引物，并用KOD-plus DNA聚合酶进行大引物PCR(MegaPrimer PCR)，反应条件为：94℃ 5分钟；98℃10秒，60℃ 30秒，68℃ 2分钟/kbp，25个循环；68℃ 10分钟。以DpnI消化质粒模板，并电穿孔转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变文库。
实施例3：EanB突变文库的高通量筛选
选取EanB突变文库中的转化体接种到含有700μL LB培养基和100μg/mL卡那霉素的96孔深孔培养板中，37℃培养6小时后，加入终浓度0.1mM的IPTG，降温至25℃培养过夜。5000rpm离心10分钟后，去除上清液并置于-70℃冷冻1小时，接着室温下解冻30分钟，加入200μL含0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH值7.4)重悬细胞，准备用于EanB酶活力测定。
将前述80μL细胞悬液(即酶溶液)加入80μL底物反应液(50mM磷酸缓冲液，pH值8.0、50mM硫代硫酸钠、200mM氯化钠、1mM TMH)中，在37℃的条件下反应2小时，加入40μL终止反应液(0.5ml的1M NaOH溶液)终止反应，然后5000rpm离心10分钟，取上清液用HPLC进行检测，计算EanB酶活力。
在随机突变文库中，通过筛选约1000个突变克隆，得到4个可提高EanB酶活性的突变位点，结果如表1所示。
为了确认和筛选高活性EanB酶突变体，根据上述方法重复筛选和确认各个EanB突变体的酶活性。
表1，部分EanB突变体的酶活性比较
菌株编号 突变位点 酶相对活性(％)*
EanB -- 100
EanB-19 I75R 320
EanB-665 K84L,E369P 195
EanB-888 I75R,E369P 480
*酶相对活性：野生型EanB酶活性的比率设置为100％，作为对照。
EanB-888突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，对应的核酸序列为SEQ ID NO:4；EanB-19突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，对应的核酸序列为SEQ ID NO:6；EanB-665突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，对应的核酸序列为SEQ ID NO:8。
突变体EanB-888(I75R，E369P)表现出最高的酶相对活性，比野生型酶EanB高出4.8倍。
因此，EanB-888突变体可能适合大量生产EGT。
实施例4：高酶活性基因工程菌株的构建
将突变体EanB-888的编码基因SEQ ID NO:4按照实施例1的方法克隆到pSH质粒中，得到重组质粒pSH-EanB-888，然后用电穿孔转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，将细胞在涂有卡那霉素的LB平板上于37℃培养过夜。挑选10个单一菌落接种到含有LB培养基的试管中，培养过夜后离心收集细胞，抽取质粒并基因测序确定突变正确，得到重组菌株。
本领域技术人员应当理解，包含SEQ ID NO：4的突变体EanB-888编码基因也可以在枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母中表达，表达宿主不限于大肠杆菌。
实施例5：EanB野生型和EanB-888突变菌株的发酵
分别从野生型菌株和突变菌株的平板上挑选单一菌落，接种到5mL LB培养基中，于37℃培养；接着，将1％v/v培养基接种到含有100mL TB培养基的1000mL摇瓶中培养4-6小时，OD600达到1.2-1.5后，加入最终浓度0.2mM的IPTG诱导，并于25℃培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。
实施例6：突变体EanB-888催化TMH生成麦角硫因
反应体系200mL，底物TMH的浓度为10g/L，加酶量分别为2000、4000、6000、8000、10000U/g底物；反应条件为37℃，200rpm，pH值8.0，反应24小时。测定麦角硫因生成量并计算底物转化率，结果如表2所示。
表2，不同加酶量下突变体EanB-888催化TMH制备麦角硫因
Figure GDA0004054230830000071
从上表中可以看出，加酶量10000U/g底物的转化率在24小时内已经达到34％。
由上表可知，突变体EanB-888使麦角硫因的量产成为可能。
上述实施例对本发明中EanB突变体生产麦角硫因的的工艺进行了验证，相关的工艺条件可以进一步优化。本领域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改，所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。另外，需说明的是，本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。
序列表
<110> Nanjing Nutrabuilding Bio-Tech Co.,Ltd.
<120> Ean B mutants and Their Uses
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 457
<212> PRT
<213> Chlorobium limicola
<400> 1
Met Gln Asn Lys Asn Phe Arg Ala Pro Gln Ser Glu Ala Ile Gly Ile
1               5                   10                  15
Leu Tyr Lys Leu Ile Glu Thr Gly Ser Lys His Lys Asn Met Tyr Asp
            20                  25                  30
His Thr Glu Ile Thr Thr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ser Glu
        35                  40                  45
Lys Val Lys Ile Ile Asp Val Arg Ser Ala Asp Ala Tyr Asn Gly Trp
    50                  55                  60
Arg Met Arg Gly Glu Val Arg Gly Gly His Ile Lys Gly Ala Lys Ser
65                  70                  75                  80
Leu Pro Ala Lys Trp Leu Thr Asp Pro Glu Trp Leu Asn Ile Val Arg
                85                  90                  95
Phe Lys Gln Ile Arg Pro Glu Asp Ala Ile Val Leu Tyr Gly Tyr Thr
            100                 105                 110
Pro Glu Glu Cys Glu Gln Thr Ala Thr Arg Phe Lys Glu Asn Gly Tyr
        115                 120                 125
Asn Asn Val Ser Val Phe His Arg Phe His Pro Asp Trp Thr Gly Asn
    130                 135                 140
Asp Ala Phe Pro Met Asp Arg Leu Glu Gln Tyr Asn Arg Leu Val Pro
145                 150                 155                 160
Ala Glu Trp Val Asn Gly Leu Ile Ser Gly Glu Glu Ile Pro Glu Tyr
                165                 170                 175
Asp Asn Asp Thr Phe Ile Val Cys His Ala His Tyr Arg Asn Arg Asp
            180                 185                 190
Ala Tyr Leu Ser Gly His Ile Pro Gly Ala Thr Asp Met Asp Thr Leu
        195                 200                 205
Ala Leu Glu Ser Pro Glu Thr Trp Asn Arg Arg Thr Pro Glu Glu Leu
    210                 215                 220
Lys Lys Ala Leu Glu Glu His Gly Ile Thr Ala Ser Thr Thr Val Val
225                 230                 235                 240
Leu Tyr Gly Lys Phe Met His Pro Asp Asn Ala Asp Glu Phe Pro Gly
                245                 250                 255
Ser Ala Ala Gly His Ile Gly Ala Ile Arg Leu Ala Phe Ile Met Met
            260                 265                 270
Tyr Ala Gly Val Glu Asp Val Arg Val Leu Asn Gly Gly Tyr Gln Ser
        275                 280                 285
Trp Thr Asp Ala Gly Phe Ala Ile Ser Lys Asp Asp Val Pro Lys Thr
    290                 295                 300
Thr Val Pro Glu Phe Gly Ala Pro Ile Pro Ser Arg Pro Glu Phe Ala
305                 310                 315                 320
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            340                 345                 350
Tyr Asn Tyr Ile Lys Lys Lys Gly Arg Ile Pro Gly Ala Ile Phe Ala
        355                 360                 365
Pro Cys Gly Ser Asp Ala Tyr His Met Glu Asn Tyr Arg Asn His Asp
    370                 375                 380
His Thr Thr Arg Glu Tyr His Glu Ile Glu Asp Ile Trp Ala Lys Ser
385                 390                 395                 400
Gly Ile Ile Pro Lys Lys His Leu Ala Phe Tyr Cys Gly Thr Gly Trp
                405                 410                 415
Arg Gly Ser Glu Ala Trp Phe Asn Ala Leu Leu Met Gly Trp Pro Arg
            420                 425                 430
Val Ser Val Tyr Asp Gly Gly Trp Phe Glu Trp Ser Asn Asp Pro Glu
        435                 440                 445
Asn Pro Tyr Glu Thr Gly Val Pro Lys
    450                 455
<210> 8
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgcagaaca aaaactttcg tgcaccgcag agcgaggcaa ttggcattct gtacaagctg 60
atcgagaccg gcagcaagca taagaacatg tacgaccaca ccgaaattac aaccgacagt 120
ctgctggctt tactgggtag cgaaaaagtg aaaatcatcg acgtgcgtag cgcagatgcc 180
tacaacggtt ggcgtatgcg tggtgaagtg cgtggtggtc atattaaggg cgccaaatct 240
ttaccggcat tgtggctgac agacccggaa tggctgaata ttgtgcgttt caaacagatt 300
cgcccggagg acgcaatcgt tctgtacggc tataccccgg aagaatgcga acagaccgca 360
acccgcttca aggaaaatgg ttacaataac gtgagcgttt ttcaccgctt tcacccggat 420
tggaccggta acgacgcctt tccgatggat cgtttagaac agtataaccg tctggttccc 480
gctgaatggg tgaacggtct gatcagcggt gaggaaatcc cggaatacga taacgacacc 540
ttcatcgtgt gccatgccca ctatcgcaac cgtgatgcct atctgagcgg tcacattccg 600
ggtgccaccg atatggatac tttagcttta gaaagccccg aaacatggaa tcgccgcaca 660
cccgaagaac tgaaaaaggc tttagaagag cacggcatta ccgccagcac cacagttgtg 720
ctgtacggca agttcatgca tccggataac gccgacgaat ttccgggtag tgccgctggt 780
catattggtg ccatccgttt agcctttatc atgatgtacg ccggcgtgga agatgttcgc 840
gtgctgaatg gcggttatca gagttggacc gacgccggct ttgcaattag caaagacgat 900
gtgccgaaaa ccaccgttcc ggagtttggt gccccgattc cgagtcgccc ggaatttgca 960
gtggacattg acgaggccaa ggaaatgtta caaagcgaag acagcgatct ggtgtgtgtg 1020
cgcagttatc cggagtacat cggcgaggtt agcggttaca actatattaa gaagaaaggc 1080
cgtattcccg gtgccatctt cgccccatgc ggtagcgatg cctaccacat ggagaattac 1140
cgcaaccacg accataccac acgcgaatac catgagatcg aggacatctg ggccaaaagc 1200
ggcattattc cgaagaaaca tttagccttt tattgcggca ccggttggcg tggtagcgag 1260
gcttggttca atgctttatt aatgggctgg cctcgtgtta gcgtgtatga cggtggctgg 1320
tttgagtgga gtaatgaccc ggagaaccct tatgaaaccg gcgtgcctaa ataa 1374

Claims (13)

1.一种EanB酶突变体，其特征在于，在SEQ ID No：1的氨基酸序列第75、84或369位点处发生突变，其中所述突变选自以下变化：(1)第75位的I突变为R；(2)第369位的E突变为P；(3)第75位的I突变为R和第369位的E突变为P；或(4)第84位的K突变为L和第369位的E突变为P。
2.根据权利要求1所述的EanB酶突变体，其特征在于，其中所述突变体为SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的EanB酶突变体，其特征在于，其中所述突变体为SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的EanB酶突变体，其特征在于，其中所述突变体为SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
5.一种编码权利要求2所述EanB酶突变体的多核苷酸，其特征在于，其中所述多核苷酸为SEQ ID NO：4的核酸序列。
6.一种编码权利要求3所述EanB酶突变体的多核苷酸，其特征在于，其中所述多核苷酸为SEQ ID NO：6的核酸序列。
7.一种编码权利要求4所述EanB酶突变体的多核苷酸，其特征在于，其中所述多核苷酸为SEQ ID NO：8的核酸序列。
8.一种突变表达载体，其特征在于，包括权利要求5至7中任一项所述的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的载体，其中所述载体是pSH质粒。
10.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5至7中任一项所述的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求8或9的载体。
12.根据权利要求10或11所述的宿主细胞，其特征在于，其中所述细胞是大肠杆菌。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的EanB酶突变体的用途，其特征在于，其中所述EanB酶突变体用于生产麦角硫因。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11491141B1 (en) 2022-01-06 2022-11-08 Nanjing Nutrabuilding Bio-Tech Co., Ltd. Methods of treating glutathione deficiencies and deficiencies in glutathione synthetase activity
CN115851655A (zh) * 2022-12-30 2023-03-28 华熙生物科技股份有限公司 酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法
CN116790538B (zh) * 2023-06-07 2024-04-02 深圳希吉亚生物技术有限公司 一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978121A (zh) * 2011-09-06 2013-03-20 天津市科曼思特医药科技发展有限公司 一种微生物转化法生产麦角硫因的方法
CN112004936A (zh) * 2018-02-23 2020-11-27 长濑产业株式会社 麦角硫因生产方法
CN112301013A (zh) * 2020-11-03 2021-02-02 深圳瑞德林生物技术有限公司 复合酶及其在制备麦角硫因中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6494522B2 (ja) * 2012-12-21 2019-04-03 ピンフア リウ 代謝工学によるエルゴチオネイン生産法
CA2975238C (en) * 2014-04-29 2021-05-11 Conagen Inc. Microbial ergothioneine biosynthesis
WO2016121285A1 (ja) * 2015-01-30 2016-08-04 キッコーマン株式会社 エルゴチオネイン生産能が増強された形質転換糸状菌及びエルゴチオネインの製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978121A (zh) * 2011-09-06 2013-03-20 天津市科曼思特医药科技发展有限公司 一种微生物转化法生产麦角硫因的方法
CN112004936A (zh) * 2018-02-23 2020-11-27 长濑产业株式会社 麦角硫因生产方法
CN112301013A (zh) * 2020-11-03 2021-02-02 深圳瑞德林生物技术有限公司 复合酶及其在制备麦角硫因中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anaerobic Origin of Ergothioneine;Burn R et al.;《Angewandte Chemie》;20170808;第129卷(第41期);全文 *
Structural and Mechanistic Basis for Anaerobic Ergothioneine Biosynthesis;Leisinger F et al.;《Journal of the American Chemical Society》;20190403;第141卷(第17期);全文 *

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