CN110872593A

CN110872593A - 一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN110872593A
Application number: CN201911231389.XA
Authority: CN
Inventors: 范文超; 高书良; 王金刚; 俞想
Original assignee: Zhejiang Huari Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Huari Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN110872593B

Abstract

本发明公开了一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，与野生型丝氨酸羟甲基转移酶相比，提高了催化甘氨酸和甲醛反应生产丝氨酸的酶活力，具有工业化开发应用前景。

Description

一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体、及其用于酶法催化甘氨酸和甲醛缩合反应生成L-丝氨酸的用途。

背景技术

L-丝氨酸，又名2-氨基-3-羟基丙酸，CAS 56-40-6。L-丝氨酸是合成蛋白质的氨基酸之一，是哺乳动物的非必需氨基酸，属脂肪族极性α-氨基酸，同时也是生酮氨基酸。

L-丝氨酸虽然属于非必需氨基酸，但具有许多重要的生理功能和作用，因此在医药、食品、化妆品中均有较为广泛的应用。丝氨酸是重要的自然保湿因子(NMF)之一，皮肤角质层保持水分的主要角色，因此是很多高级化妆品中的关键添加剂，只是因其价格高昂限制了它在化妆品中的应用。L-丝氨酸广泛用于配制第三代复方氨基酸输液和营养增补剂，并用于合成多种丝氨基酸衍生物，如心血管、抗癌、爱滋病新药及基因工程用保护氨基酸等。丝氨酸作为食品添加剂用于食品行业，L-丝氨酸用于运动饮料、氨基酸减肥饮料等；同时丝氨酸也可以用于动物饲料，可促进动物生长发育。

目前L-丝氨酸的主要生产方法有以下四种：

1.蛋白质水解法：L-丝氨酸在丝胶蛋白中的含量丰富，蚕茧衣中含量为13.64％，因此，可用水解蚕茧衣制取。

2.添加前体发酵法：L-丝氨酸在生物体内代谢运转速度极快，直接发酵法生产困难。一般采用添加前体的发酵法。添加的前体主要有甘氨酸、甘氨酸三甲内盐或甘油酸，其中以甘氨酸为前体的已工业化。产生菌可分为两类：异养型和甲基营养型细菌。

3.化学合成法：DL-丝氨酸可有以羟基乙醛为原料的合成法等，然后再拆分消旋体得L-丝氨酸。

4.酶法：利用丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)/L-苏氨酸醛缩酶催化甲醛和甘氨酸(Gly)合成L-丝氨酸。酶促反应过程中SHMT需要磷酸吡哆醛(PLP)和四氢叶酸(THFA)作为其辅因子，但由于主要原料来源广泛、价格低廉，并可合成高浓度的产物，该法是目前工业上L-丝氨酸生产主要方法(Campbell,H.Y.H.T.W.K.(1986)."Enzymatic production of L-serine."Biotechnology and bioengineering 28:857-867.)。

发明内容

为了提高酶催化法制备L-丝氨酸的反应效率，降低生产成本，本发明利用基因工程技术来对一种大肠杆菌(Escherichia coli)来源的丝氨酸羟甲基转移酶SHMT(UniProtKB-P0A825)基因进行定向进化，筛选高酶活性的丝氨酸羟甲基转移酶突变体，从而有利于提高酶法生产丝氨酸的效率。

因此，本发明包括如下技术方案：

一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，是野生型丝氨酸羟甲基转移酶SEQ ID NO:1第93位的V替换为A、第100位的Q替换为P、第214位的P替换为S、第283位的E替换为N的突变体，氨基酸序列为：MLKREMNIADYDAELWQAMEQEKVRQEEHIELIASENYTSPRVMQAQGSQLTNKYAEGYPGKRYYGGCEYVDIVEQLAIDRAKELFGADYANAQPHSGSPANFAVYTALLEPGDTVLGMNLAHGGHLTHGSPVNFSGKLYNIVPYGIDATGHIDYADLEKQAKEHKPKMIIGGFSAYSGVVDWAKMREIADSIGAYLFVDMAHVAGLVAAGVYSNPVPHAHVVTTTTHKTLAGPRGGLILAKGGSEELYKKLNSAVFPGGQGGPLMHVIAGKAVALKEAMEPDFKTYQQQVAKNAKAMVEVFLERGYKVVSGGTDNHLFLVDLVDKNLTGKEADAALGRANITVNKNSVPNDPKSPFVTSGIRVGTPAITRRGFKEAEAKELAGWMCDVLDSINDEAVIERIKGKVLDICARYPVYA(SEQ ID NO:3)；

一种编码上述的基因。

优选地，编码上述丝氨酸羟甲基转移酶突变体SEQ ID NO:3的基因可以是下述核苷酸序列：

ATGTTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCGATTATGATGCCGAACTGTGGCAGGCTATGGAGCAGGAAAAAGTACGTCAGGAAGAGCACATCGAACTGATCGCCTCCGAAAACTACACCAGCCCGCGCGTAATGCAGGCGCAGGGTTCTCAGCTGACCAACAAATATGCTGAAGGTTATCCGGGCAAACGCTACTACGGCGGTTGCGAGTATGTTGATATCGTTGAACAACTGGCGATCGATCGTGCGAAAGAACTGTTCGGCGCTGACTACGCTAACGCGCAGCCGCACTCCGGCTCCCCGGCTAACTTTGCGGTCTACACCGCGCTGCTGGAACCAGGTGATACCGTTCTGGGTATGAACCTGGCGCATGGCGGTCACCTGACTCACGGTTCTCCGGTTAACTTCTCCGGTAAACTGTACAACATCGTTCCTTACGGTATCGATGCTACCGGTCATATCGACTACGCCGATCTGGAAAAACAAGCCAAAGAACACAAGCCGAAAATGATTATCGGTGGTTTCTCTGCATATTCCGGCGTGGTGGACTGGGCGAAAATGCGTGAAATCGCTGACAGCATCGGTGCTTACCTGTTCGTTGATATGGCGCACGTTGCGGGCCTGGTTGCTGCTGGCGTCTACTCGAACCCGGTTCCTCATGCTCACGTTGTTACTACCACCACTCACAAAACCCTGGCGGGTCCGCGCGGCGGCCTGATCCTGGCGAAAGGTGGTAGCGAAGAGCTGTACAAAAAACTGAACTCTGCCGTTTTCCCTGGTGGTCAGGGCGGTCCGTTGATGCACGTAATCGCCGGTAAAGCGGTTGCTCTGAAAGAAGCGATGGAGCCTGACTTCAAAACTTACCAGCAGCAGGTCGCTAAAAACGCTAAAGCGATGGTAGAAGTGTTCCTCGAGCGCGGCTACAAAGTGGTTTCCGGCGGCACTGATAACCACCTGTTCCTGGTTGATCTGGTTGATAAAAACCTGACCGGTAAAGAAGCAGACGCCGCTCTGGGCCGTGCTAACATCACCGTCAACAAAAACAGCGTACCGAACGATCCGAAGAGCCCGTTTGTGACCTCCGGTATTCGTGTAGGTACTCCGGCGATTACCCGTCGCGGCTTTAAAGAAGCCGAAGCGAAAGAACTGGCTGGCTGGATGTGTGACGTGCTGGACAGCATCAATGATGAAGCCGTTATCGAGCGCATCAAAGGTAAAGTTCTCGACATCTGCGCACGTTACCCGGTTTACGCATAA(SEQ ID NO:4)。

一种包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是pSH系列，但并不受限于此。

一种转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

上述或者上述微生物可以用于生产L-丝氨酸。

在丝氨酸生产中，以为甘氨酸和甲醛底物原料，用上述或者微生物作为催化剂来催化缩合反应，得到产物L-丝氨酸。

作为一种可选的实施方式，上述微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，作为缩合反应的催化剂。

生产可采用常规的工艺条件，比如，反应温度选择20-40℃，例如30-35℃。

反应体系可以为缓冲液体系比如磷酸盐缓冲液，pH7.0-9.0，例如pH7.5-8.5，优选pH8.0-8.2。

在一种优选的实施方式中，上述反应体系中可以添加有四氢叶酸、磷酸吡哆醛(是氨基酸代谢中的转氨酶及脱羧酶的辅酶)、巯基乙醇。

相较野生型丝氨酸羟甲基转移酶SEQ ID NO:1，本发明构建的丝氨酸羟甲基转移酶突变体SEQ ID NO:3催化进行反应的酶活性有明显提高，具有工业化开发应用前景。

具体实施方式

本发明构建的丝氨酸羟甲基转移酶突变体SEQ ID NO:3是大肠杆菌Escherichiacoli来源的野生型丝氨酸羟甲基转移酶SEQ ID NO:1的突变体，是SEQ ID NO:1序列中多个氨基酸发生替换(V93A、Q100P、P214S、E283N)后形成的新蛋白质。其中SEQ ID NO:1氨基酸序列为：

MLKREMNIADYDAELWQAMEQEKVRQEEHIELIASENYTSPRVMQAQGSQLTNKYAEGYPGKRYYGGCEYVDIVEQLAIDRAKELFGADYANVQPHSGSQANFAVYTALLEPGDTVLGMNLAHGGHLTHGSPVNFSGKLYNIVPYGIDATGHIDYADLEKQAKEHKPKMIIGGFSAYSGVVDWAKMREIADSIGAYLFVDMAHVAGLVAAGVYPNPVPHAHVVTTTTHKTLAGPRGGLILAKGGSEELYKKLNSAVFPGGQGGPLMHVIAGKAVALKEAMEPEFKTYQQQVAKNAKAMVEVFLERGYKVVSGGTDNHLFLVDLVDKNLTGKEADAALGRANITVNKNSVPNDPKSPFVTSGIRVGTPAITRRGFKEAEAKELAGWMCDVLDSINDEAVIERIKGKVLDICARYPVYA(SEQ ID NO:1)。

野生型酶SEQ ID NO:1的编码基因是序列表中的序列SEQ ID NO:2：

ATGTTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCGATTATGATGCCGAACTGTGGCAGGCTATGGAGCAGGAAAAAGTACGTCAGGAAGAGCACATCGAACTGATCGCCTCCGAAAACTACACCAGCCCGCGCGTAATGCAGGCGCAGGGTTCTCAGCTGACCAACAAATATGCTGAAGGTTATCCGGGCAAACGCTACTACGGCGGTTGCGAGTATGTTGATATCGTTGAACAACTGGCGATCGATCGTGCGAAAGAACTGTTCGGCGCTGACTACGCTAACGTCCAGCCGCACTCCGGCTCCCAGGCTAACTTTGCGGTCTACACCGCGCTGCTGGAACCAGGTGATACCGTTCTGGGTATGAACCTGGCGCATGGCGGTCACCTGACTCACGGTTCTCCGGTTAACTTCTCCGGTAAACTGTACAACATCGTTCCTTACGGTATCGATGCTACCGGTCATATCGACTACGCCGATCTGGAAAAACAAGCCAAAGAACACAAGCCGAAAATGATTATCGGTGGTTTCTCTGCATATTCCGGCGTGGTGGACTGGGCGAAAATGCGTGAAATCGCTGACAGCATCGGTGCTTACCTGTTCGTTGATATGGCGCACGTTGCGGGCCTGGTTGCTGCTGGCGTCTACCCGAACCCGGTTCCTCATGCTCACGTTGTTACTACCACCACTCACAAAACCCTGGCGGGTCCGCGCGGCGGCCTGATCCTGGCGAAAGGTGGTAGCGAAGAGCTGTACAAAAAACTGAACTCTGCCGTTTTCCCTGGTGGTCAGGGCGGTCCGTTGATGCACGTAATCGCCGGTAAAGCGGTTGCTCTGAAAGAAGCGATGGAGCCTGAGTTCAAAACTTACCAGCAGCAGGTCGCTAAAAACGCTAAAGCGATGGTAGAAGTGTTCCTCGAGCGCGGCTACAAAGTGGTTTCCGGCGGCACTGATAACCACCTGTTCCTGGTTGATCTGGTTGATAAAAACCTGACCGGTAAAGAAGCAGACGCCGCTCTGGGCCGTGCTAACATCACCGTCAACAAAAACAGCGTACCGAACGATCCGAAGAGCCCGTTTGTGACCTCCGGTATTCGTGTAGGTACTCCGGCGATTACCCGTCGCGGCTTTAAAGAAGCCGAAGCGAAAGAACTGGCTGGCTGGATGTGTGACGTGCTGGACAGCATCAATGATGAAGCCGTTATCGAGCGCATCAAAGGTAAAGTTCTCGACATCTGCGCACGTTACCCGGTTTACGCATAA(SEQ ID NO:2)。

因此在本发明中，术语“野生(型)酶”、“野生丝氨酸羟甲基转移酶”表示相同的意义，都是指大肠杆菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

为表述方便起见，蛋白质的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：

表1氨基酸中英文对照及缩写

丙氨酸	Alanine	A或Ala	脂肪族类
				精氨酸	Arginine	R或Arg	碱性氨基酸类
天冬酰胺	Asparagine	N或Asn	酰胺类
				天冬氨酸	Aspartic acid	D或Asp	酸性氨基酸类
半胱氨酸	Cysteine	C或Cys	含硫类
				谷氨酰胺	Glutamine	Q或Gln	酰胺类
谷氨酸	Glutamic acid	E或Glu	酸性氨基酸类
				甘氨酸	Glycine	G或Gly	脂肪族类
组氨酸	Histidine	H或His	碱性氨基酸类
				异亮氨酸	Isoleucine	I或Ile	脂肪族类
亮氨酸	Leucine	L或Leu	脂肪族类
				赖氨酸	Lysine	K或Lys	碱性氨基酸类
蛋氨酸	Methionine	M或Met	含硫类
				苯丙氨酸	Phenylalanine	F或Phe	芳香族类
脯氨酸	Proline	P或Pro	亚氨基酸
				丝氨酸	Serine	S或Ser	羟基类
苏氨酸	Threonine	T或Thr	羟基类
				色氨酸	Tryptophan	W或Trp	芳香族类
酪氨酸	Tyrosine	Y或Tyr	芳香族类
				缬氨酸	Valine	V或Val	脂肪族类

本发明的丝氨酸羟甲基转移酶突变体的氨基酸数量只有417个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以使任何适合表达丝氨酸羟甲基转移酶突变体的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

当作为生物催化剂用于生产时，本发明的丝氨酸羟甲基转移酶突变体可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等；所述菌体的形式包括存活菌体细胞和死亡菌体细胞。

作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述丝氨酸羟甲基转移酶突变体SEQID NO:3的微生物菌体细胞作为酶催化反应的生物催化剂。菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

培养基使用前在121℃高温高压灭菌20分钟。

实施例1野生型丝氨酸羟甲基转移酶表达菌株的构建

1.1对于来源于大肠杆菌(Escherichia coli)来源的丝氨酸羟甲基转移酶SHMT(UniProtKB-P0A825)基因即SEQ ID NO:2，委托苏州金维智生物技术有限公司进行全基因序列合成SEQ ID NO:2，构建到pSH质粒(浙江华睿生物技术有限公司)中，得到表达野生型丝氨酸羟甲基转移酶SEQ ID NO:1的表达载体pSH-SHMT。

正向引物SHMT-F:CATATGTTAAAGCGTGAAATGAA

反向引物SHMT-R:GGATCC TTATGCGTAAACCGGGTAAC

PCR扩增约1.2kb片段，PCR反应体系包括，引物各0.3μM，模板50ng，1xKOD Neoplus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，KOD neo plus 1U，补双蒸水至总体系50μl。

PCR条件：94℃，2min；98℃10s，55℃30s，68℃30s，重复30循环；68℃10min。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收片段。质粒载体pSH或SHMT基因片段分别用NdeI和BamHI进行双酶切处理，酶切体系：质粒37μl(或片段37μl)，10x buffer 5μl，NdeI 1.5μl，BamHI 1.5μl。酶切结束同样使用胶回收试剂盒回收片段。其中PCR用酶KODNeo plus购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，胶回收试剂盒OMEGAGel Extraction KitD2500购自广州飞扬生物工程有限公司。限制性内切酶均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2通过电转化将重组质粒pSH-SHMT转化入表达宿主比如大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen公司)，得到表达野生型的重组大肠杆菌。也可以将重组质粒转化入其他宿主比如毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等中来表达野生型丝氨酸羟甲基转移酶。

实施例2通过易错PCR法构建SHMT随机突变点库和筛选

2.1易错PCR法构建SHMT随机突变点库构建

以序列SEQ ID NO:2为模板，应用易错PCR技术构建SHMT随机突变体库。SHMTmu-F为5’-ATGTTAAAGCGTGAAATGAA-3’，反向引物SHMTmu-R为5’-TTATGCGTAAACCGGGTAAC-3’。

50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pSH-SHMT，30pmol一对引物SHMTmu-F和SHMTmu-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(Fermentas)。

PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min/kbp，30个循环；72℃10min。胶回收1.2kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃ 5min；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 2min/kbp，25个循环；68℃ 10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到超过10000个克隆的随机突变库。

2.2突变体库的高通量筛选

选取突变体库中的转化子，接种到含700μLLB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL卡那霉素，37℃培养6h后，加入终浓度0.1mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)，重悬菌体，用于SHMT活力测定。

酶活测定反应体系包含：1％的菌浓全细胞或破胞粗酶液，pH8.0的0.1M磷酸盐缓冲液，甘氨酸7.5g/L，四氢叶酸2.225g/L，磷酸吡哆醛0.125g/L，甲醛(37％)300μl/L，巯基乙醇5ml/L，使用2M氢氧化钠溶液调节PH到8.0。30℃反应30min，取样检测。

底物甘氨酸和产物丝氨酸的HPLC测定条件：

使用岛津液相LC-2030C Plus进行检测，依利特hypersil BDS-C18色谱柱(5um，4.6mmX250mm)，流动相A，4.1g/L的乙酸钠溶液，流动相B，甲醇；流速1.0ml/min，柱温箱40℃，检测波长，334nm，进样量5μl，检测时长20min。

硼酸缓冲液配置：称6.183g硼酸粉末，250ml双蒸水溶解，使用6M氢氧化钠溶液调pH至9.5，过滤。

衍生剂配置：称取0.1372g邻苯二甲醛，0.0589g N-乙酰-L-半胱氨酸，共溶于2ml无水乙醇，然后加硼酸缓冲液至10ml。

衍生程序：抽取硼酸缓冲液5μl，清洗3s，抽取样品2μl，混合2次，等待0.1min，清洗3s，抽取衍生剂1μl，混合6次，等待0.3min，清洗3s，抽取针座上32μl，混合2次，等待0.5min，进样。

流动相梯度洗脱程序：0-6min，A，70％，B，30％；7-15min，A，55％，B，45％；15.5-20min，A，70％，B，30％。

酶活单位定义：在pH 8.0、温度30℃的条件下，每分钟催化底物甘氨酸产生1微摩尔(μmol)L-丝氨酸所需要的酶量定义为1个单位(U)。

2.3高酶活突变体的测定和筛选

底物反应液：pH8.0的0.1M磷酸盐缓冲液，甘氨酸7.5g/L，四氢叶酸2.225g/L，磷酸吡哆醛0.125g/L，甲醛(37％)300μl/L，巯基乙醇5ml/L，使用2M氢氧化钠溶液调节至pH8.0。

将上述步骤2.2中各转化子的80μL菌液加入到600μL底物反应液，在30℃的条件下30min，然后5000rpm离心10min。离心取上清，用HPLC检测L-丝氨酸产量，并计算活力。

从随机突变库中，通过对约1000多个突变体克隆筛选，经测序发现，发现有些位点的氨基酸的替换会导致突变体的酶活力的显著变化。部分发生了正向突变的突变体测序结果显示于表2中。

表2、SHMT突变体对甘氨酸的催化酶活力

*酶比活力：以野生酶的发酵活力(U/ml)与菌体浓度OD₆₀₀(OD/ml)的比值为100％。

表2的实验结果显示，V93A、Q100P、P214S、E283N突变所得到的突变体(即SEQ IDNO:3)的酶活性相比野生型酶SEQ ID NO:1提高了2倍。另外，T107N、L197V、E283G突变体的酶活性相比野生型酶SEQ ID NO:1提高了1倍多。

实施例3突变体菌株构建

重点研究了突变体SHMT-382，考察其催化甘氨酸与甲醛反应来生产L-丝氨酸的情况。为此，将SHMT-382基因SEQ ID NO:4克隆到pSH质粒中，得到表达丝氨酸羟甲基转移酶突变体SEQ ID NO:3的表达载体pSH-SHMT-382。

使用该质粒pSH-SHMT-382，可以构建到不同的表达系统中，比如大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等。例如，将质粒pSH-SHMT-382转化BL21(DE3)感受态细胞中，涂kan+LB平板，37℃培养过夜，挑选10个单菌落，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定突变正确，得到工程菌。

实施例4菌株发酵及反应

4.1从工程菌SHMT-382的LB平板上挑选单克隆，接种到5ml LB培养基中，37℃培养过；按1％v/v比例接种到含有100ml TB培养基的1000ml摇瓶中，37℃、220rpm培养4-6小时，OD₆₀₀达到1.2-1.3，加入0.2mM的IPTG诱导，降温到25℃继续培养12-15小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。

4.2反应体系为1L，pH8.0的0.1M磷酸盐缓冲液，甘氨酸200g/L，四氢叶酸2.225g/L，磷酸吡哆醛0.125g/L，巯基乙醇5ml/L，使用2M氢氧化钠溶液调节pH到8.0，反应阶段补加37％甲醛，维持pH，加酶量分别为2％、4％、6％、8％v/v菌浓度。30℃反应20h，取样检测。计算底物转化率。结果见表3。

表3、不同酶量的突变酶SHMT-382催化合成L-丝氨酸

加酶量％	转化率(％)
		2	70.3
4	88.2
		6	90.3
8	85.6

综上所述，相比野生型丝氨酸羟甲基转移酶，本发明构建的丝氨酸羟甲基转移酶突变体SEQ ID NO:3催化甘氨酸与甲醛缩合反应生成L-丝氨酸的酶活力提高了2倍，具有工业化开发和应用前景。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其应用

<130> SHPI1910747

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Leu Lys Arg Glu Met Asn Ile Ala Asp Tyr Asp Ala Glu Leu Trp

1 5 10 15

Gln Ala Met Glu Gln Glu Lys Val Arg Gln Glu Glu His Ile Glu Leu

20 25 30

Ile Ala Ser Glu Asn Tyr Thr Ser Pro Arg Val Met Gln Ala Gln Gly

35 40 45

Ser Gln Leu Thr Asn Lys Tyr Ala Glu Gly Tyr Pro Gly Lys Arg Tyr

50 55 60

Tyr Gly Gly Cys Glu Tyr Val Asp Ile Val Glu Gln Leu Ala Ile Asp

65 70 75 80

Arg Ala Lys Glu Leu Phe Gly Ala Asp Tyr Ala Asn Val Gln Pro His

85 90 95

Ser Gly Ser Gln Ala Asn Phe Ala Val Tyr Thr Ala Leu Leu Glu Pro

100 105 110

Gly Asp Thr Val Leu Gly Met Asn Leu Ala His Gly Gly His Leu Thr

115 120 125

His Gly Ser Pro Val Asn Phe Ser Gly Lys Leu Tyr Asn Ile Val Pro

130 135 140

Tyr Gly Ile Asp Ala Thr Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Leu Glu Lys

145 150 155 160

Gln Ala Lys Glu His Lys Pro Lys Met Ile Ile Gly Gly Phe Ser Ala

165 170 175

Tyr Ser Gly Val Val Asp Trp Ala Lys Met Arg Glu Ile Ala Asp Ser

180 185 190

Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Val Asp Met Ala His Val Ala Gly Leu Val

195 200 205

Ala Ala Gly Val Tyr Pro Asn Pro Val Pro His Ala His Val Val Thr

210 215 220

Thr Thr Thr His Lys Thr Leu Ala Gly Pro Arg Gly Gly Leu Ile Leu

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gly Ser Glu Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Asn Ser Ala Val

245 250 255

Phe Pro Gly Gly Gln Gly Gly Pro Leu Met His Val Ile Ala Gly Lys

260 265 270

Ala Val Ala Leu Lys Glu Ala Met Glu Pro Glu Phe Lys Thr Tyr Gln

275 280 285

Gln Gln Val Ala Lys Asn Ala Lys Ala Met Val Glu Val Phe Leu Glu

290 295 300

Arg Gly Tyr Lys Val Val Ser Gly Gly Thr Asp Asn His Leu Phe Leu

305 310 315 320

Val Asp Leu Val Asp Lys Asn Leu Thr Gly Lys Glu Ala Asp Ala Ala

325 330 335

Leu Gly Arg Ala Asn Ile Thr Val Asn Lys Asn Ser Val Pro Asn Asp

340 345 350

Pro Lys Ser Pro Phe Val Thr Ser Gly Ile Arg Val Gly Thr Pro Ala

355 360 365

Ile Thr Arg Arg Gly Phe Lys Glu Ala Glu Ala Lys Glu Leu Ala Gly

370 375 380

Trp Met Cys Asp Val Leu Asp Ser Ile Asn Asp Glu Ala Val Ile Glu

385 390 395 400

Arg Ile Lys Gly Lys Val Leu Asp Ile Cys Ala Arg Tyr Pro Val Tyr

405 410 415

Ala

<210> 2

<211> 1254

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atgttaaagc gtgaaatgaa cattgccgat tatgatgccg aactgtggca ggctatggag 60

caggaaaaag tacgtcagga agagcacatc gaactgatcg cctccgaaaa ctacaccagc 120

ccgcgcgtaa tgcaggcgca gggttctcag ctgaccaaca aatatgctga aggttatccg 180

ggcaaacgct actacggcgg ttgcgagtat gttgatatcg ttgaacaact ggcgatcgat 240

cgtgcgaaag aactgttcgg cgctgactac gctaacgtcc agccgcactc cggctcccag 300

gctaactttg cggtctacac cgcgctgctg gaaccaggtg ataccgttct gggtatgaac 360

ctggcgcatg gcggtcacct gactcacggt tctccggtta acttctccgg taaactgtac 420

aacatcgttc cttacggtat cgatgctacc ggtcatatcg actacgccga tctggaaaaa 480

caagccaaag aacacaagcc gaaaatgatt atcggtggtt tctctgcata ttccggcgtg 540

gtggactggg cgaaaatgcg tgaaatcgct gacagcatcg gtgcttacct gttcgttgat 600

atggcgcacg ttgcgggcct ggttgctgct ggcgtctacc cgaacccggt tcctcatgct 660

cacgttgtta ctaccaccac tcacaaaacc ctggcgggtc cgcgcggcgg cctgatcctg 720

gcgaaaggtg gtagcgaaga gctgtacaaa aaactgaact ctgccgtttt ccctggtggt 780

cagggcggtc cgttgatgca cgtaatcgcc ggtaaagcgg ttgctctgaa agaagcgatg 840

gagcctgagt tcaaaactta ccagcagcag gtcgctaaaa acgctaaagc gatggtagaa 900

gtgttcctcg agcgcggcta caaagtggtt tccggcggca ctgataacca cctgttcctg 960

gttgatctgg ttgataaaaa cctgaccggt aaagaagcag acgccgctct gggccgtgct 1020

aacatcaccg tcaacaaaaa cagcgtaccg aacgatccga agagcccgtt tgtgacctcc 1080

ggtattcgtg taggtactcc ggcgattacc cgtcgcggct ttaaagaagc cgaagcgaaa 1140

gaactggctg gctggatgtg tgacgtgctg gacagcatca atgatgaagc cgttatcgag 1200

cgcatcaaag gtaaagttct cgacatctgc gcacgttacc cggtttacgc ataa 1254

<210> 3

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Leu Lys Arg Glu Met Asn Ile Ala Asp Tyr Asp Ala Glu Leu Trp

1 5 10 15

Gln Ala Met Glu Gln Glu Lys Val Arg Gln Glu Glu His Ile Glu Leu

20 25 30

Ile Ala Ser Glu Asn Tyr Thr Ser Pro Arg Val Met Gln Ala Gln Gly

35 40 45

Ser Gln Leu Thr Asn Lys Tyr Ala Glu Gly Tyr Pro Gly Lys Arg Tyr

50 55 60

Tyr Gly Gly Cys Glu Tyr Val Asp Ile Val Glu Gln Leu Ala Ile Asp

65 70 75 80

Arg Ala Lys Glu Leu Phe Gly Ala Asp Tyr Ala Asn Ala Gln Pro His

85 90 95

Ser Gly Ser Pro Ala Asn Phe Ala Val Tyr Thr Ala Leu Leu Glu Pro

100 105 110

Gly Asp Thr Val Leu Gly Met Asn Leu Ala His Gly Gly His Leu Thr

115 120 125

His Gly Ser Pro Val Asn Phe Ser Gly Lys Leu Tyr Asn Ile Val Pro

130 135 140

Tyr Gly Ile Asp Ala Thr Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Leu Glu Lys

145 150 155 160

Gln Ala Lys Glu His Lys Pro Lys Met Ile Ile Gly Gly Phe Ser Ala

165 170 175

Tyr Ser Gly Val Val Asp Trp Ala Lys Met Arg Glu Ile Ala Asp Ser

180 185 190

Ile Gly Ala Tyr Leu Phe Val Asp Met Ala His Val Ala Gly Leu Val

195 200 205

Ala Ala Gly Val Tyr Ser Asn Pro Val Pro His Ala His Val Val Thr

210 215 220

Thr Thr Thr His Lys Thr Leu Ala Gly Pro Arg Gly Gly Leu Ile Leu

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gly Ser Glu Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Asn Ser Ala Val

245 250 255

Phe Pro Gly Gly Gln Gly Gly Pro Leu Met His Val Ile Ala Gly Lys

260 265 270

Ala Val Ala Leu Lys Glu Ala Met Glu Pro Asp Phe Lys Thr Tyr Gln

275 280 285

Gln Gln Val Ala Lys Asn Ala Lys Ala Met Val Glu Val Phe Leu Glu

290 295 300

Arg Gly Tyr Lys Val Val Ser Gly Gly Thr Asp Asn His Leu Phe Leu

305 310 315 320

Val Asp Leu Val Asp Lys Asn Leu Thr Gly Lys Glu Ala Asp Ala Ala

325 330 335

Leu Gly Arg Ala Asn Ile Thr Val Asn Lys Asn Ser Val Pro Asn Asp

340 345 350

Pro Lys Ser Pro Phe Val Thr Ser Gly Ile Arg Val Gly Thr Pro Ala

355 360 365

Ile Thr Arg Arg Gly Phe Lys Glu Ala Glu Ala Lys Glu Leu Ala Gly

370 375 380

Trp Met Cys Asp Val Leu Asp Ser Ile Asn Asp Glu Ala Val Ile Glu

385 390 395 400

Arg Ile Lys Gly Lys Val Leu Asp Ile Cys Ala Arg Tyr Pro Val Tyr

405 410 415

Ala

<210> 4

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgttaaagc gtgaaatgaa cattgccgat tatgatgccg aactgtggca ggctatggag 60

caggaaaaag tacgtcagga agagcacatc gaactgatcg cctccgaaaa ctacaccagc 120

ccgcgcgtaa tgcaggcgca gggttctcag ctgaccaaca aatatgctga aggttatccg 180

ggcaaacgct actacggcgg ttgcgagtat gttgatatcg ttgaacaact ggcgatcgat 240

cgtgcgaaag aactgttcgg cgctgactac gctaacgcgc agccgcactc cggctccccg 300

gctaactttg cggtctacac cgcgctgctg gaaccaggtg ataccgttct gggtatgaac 360

ctggcgcatg gcggtcacct gactcacggt tctccggtta acttctccgg taaactgtac 420

aacatcgttc cttacggtat cgatgctacc ggtcatatcg actacgccga tctggaaaaa 480

caagccaaag aacacaagcc gaaaatgatt atcggtggtt tctctgcata ttccggcgtg 540

gtggactggg cgaaaatgcg tgaaatcgct gacagcatcg gtgcttacct gttcgttgat 600

atggcgcacg ttgcgggcct ggttgctgct ggcgtctact cgaacccggt tcctcatgct 660

cacgttgtta ctaccaccac tcacaaaacc ctggcgggtc cgcgcggcgg cctgatcctg 720

gcgaaaggtg gtagcgaaga gctgtacaaa aaactgaact ctgccgtttt ccctggtggt 780

cagggcggtc cgttgatgca cgtaatcgcc ggtaaagcgg ttgctctgaa agaagcgatg 840

gagcctgact tcaaaactta ccagcagcag gtcgctaaaa acgctaaagc gatggtagaa 900

gtgttcctcg agcgcggcta caaagtggtt tccggcggca ctgataacca cctgttcctg 960

gttgatctgg ttgataaaaa cctgaccggt aaagaagcag acgccgctct gggccgtgct 1020

aacatcaccg tcaacaaaaa cagcgtaccg aacgatccga agagcccgtt tgtgacctcc 1080

ggtattcgtg taggtactcc ggcgattacc cgtcgcggct ttaaagaagc cgaagcgaaa 1140

gaactggctg gctggatgtg tgacgtgctg gacagcatca atgatgaagc cgttatcgag 1200

cgcatcaaag gtaaagttct cgacatctgc gcacgttacc cggtttacgc ataa 1254

Claims

1.一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.编码如权利要求1所述丝氨酸羟甲基转移酶突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

4.包含如权利要求3所述基因的质粒。

5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。

6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，是所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，是所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求1所述丝氨酸羟甲基转移酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产L-丝氨酸中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，以甘氨酸和甲醛为反应底物、用权利要求1所述突变体或者如权利要求6所述微生物催化缩合反应生成L-丝氨酸。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，反应体系中添加有四氢叶酸、磷酸吡哆醛、巯基乙醇。