CN104640439A

CN104640439A - 对孢囊线虫具有抗性的大豆

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Publication number: CN104640439A
Application number: CN201380033848.8A
Authority: CN
Inventors: K.梅克塞姆; 刘世名; P.K.肯多思; M.G.米楚姆
Original assignee: Southern Illinois University System; University of Missouri System
Current assignee: Southern Illinois University System; University of Missouri System
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-05-30
Also published as: BR112014030017A2; WO2013181411A1; US20190037795A1; CN104640439B; US10070614B2; US20160032315A1

Abstract

本发明提供一种对大豆孢囊线虫(SCN)具有抗性的转基因大豆或其部分，其包括编码丝氨酸羟甲基转移酶蛋白(例如，GmSHMT)的人工DNA构建体。本发明还提供含有突变R130P和Y358N的GmSHMT等位基因以及研究和育种方法及包含这些的组合物。

Description

对孢囊线虫具有抗性的大豆

相关申请的交叉引用

本申请案要求2012年5月30日提交的美国临时申请序列号61/653,227的权益；该临时申请通过引用整体并入本文。

关于由联邦政府资助研究或研发的声明

本发明根据由美国国家科学基金会植物基因组研究计划颁发的授权号0820642以及由美国国家科学基金会颁发的授权号DBI-0845196在政府支持下完成。政府对本发明具有一定的权利。

通过引用并入的材料

序列表(其是本公开的一部分)包括包含本发明的核苷酸和/或氨基酸序列的计算机可读形式。序列表的主题通过引用整体并入本文。

发明领域

本公开大体上涉及在大豆中赋予对线虫的抗性的方法。

发明背景

大豆孢囊线虫给美国大豆生产者造成超过十亿美元的年产量损失且是全世界大豆产区的持续性问题。造成该产量损失的线虫大豆异皮线虫(Heterodera glycines)的致害性群体已在大多数已知抗性来源上被鉴定。但赋予对大豆孢囊线虫的抗性的大豆基因先前未被克隆过。

属于异皮线虫属(Heterodera)和球孢囊属(Globodera)的孢囊线虫包括了在经济上最重要类别的植物寄生线虫中的一些。这些不同种属的线虫通过在宿主根内诱生专门取食位点(合胞体)而作为强制定栖的内寄生物在某些宿主植物上选择性地取食。大豆孢囊线虫(SCN)大豆异皮线虫(Heterodera glycines Ichinohe)的宿主范围限于豆科植物和一些杂草。其始终是大豆(大豆(Glycine max(L.)Merr.))上经济上最重要的病原体(Koenning和Wrather,2010)。侵染性二龄幼虫(J2)在土壤中自卵孵化且利用空心口矛(螫针)刺穿植物根以用机械方式对植物细胞壁穿孔并分泌细胞壁消化酶，从而促进经根皮层到维管结构附近的中柱鞘或内胚层细胞的细胞内迁移。一旦细胞被选择用于取食，线虫便将一套效应蛋白递送到细胞中，导致该细胞转化为独特的高度代谢活性取食细胞。现已定栖的幼虫在其经过被划分为四个幼虫期(J1-J4)和性别二态性成虫生命期的25-30天生命期长大时从该细胞取食。经雄性虫受精后，雌性成虫的子宫中留下数百个卵，且在其死亡后形成允许卵在缺少宿主的情况下在土壤中存活数年的保护性孢囊。宿主植物遭受营养物损失以及通过维管结构的输送减少，表现为生长较不旺盛和产量降低。

其两性融合的生活方式和独特的生存策略使得用来控制SCN的当前措施复杂化。杀线虫剂的使用是受限制的且对大豆生产者亦无成本效益。用于控制SCN的当前方法包括非宿主作物轮作与抗病栽培品种的种植的组合。大豆育种者已成功研发出抗SCN栽培品种。首批Rhg(对大豆孢囊线虫具有抗性)基因在1960年初被鉴定(Caldwell等人，1960；Matson和Williams,1965)，且从此已发表了大量关于来自多种不同种质来源的对SCN具有潜在抗性的QTL(数量性状基因座)的鉴定和定位的论文。在多种种质来源中染色体18(rhg1)和染色体8(Rhg4)上的QTL经作图是一致的(Concibido等人，2004)。在一些来源(诸如PI88788)中，rhg1对于全面抗性来说是足够的且展示不完全显性(Concibido等人，2004)。在其它情况下，诸如大豆品种栽培品种(cv.)Forrest，对SCN的全面抗性既需要rhg1又需要Rhg4，其中Rhg4展现显性基因作用(Meksem等人，2001)。

携带Rhg基因的植物展示宿主与寄生虫之间的不相容相互作用。虽然携带Rhg基因的植物的根被侵染性J2穿透，但是取食细胞最终退化且大多数线虫在到达成虫阶段之前死亡(Endo,1965；Riggs等人，1973)。大豆孢囊线虫的遗传变异性是普遍的且在抗性栽培品种上存活的线虫携带未确定的ror(在抗性宿主上的繁殖)等位基因(Dong和Opperman,1997)，从而由于大豆抗性单作而导致在这块田地中的群体转变(Niblack等人，2008)。对SCN具有抗性的理解是有限的，因为经鉴定具有潜在SCN抗性QTL的基因尚未被克隆(Melito等人，2010；Liu等人，2010)。

发明概要

在本公开的各个方面中提供对大豆孢囊线虫(SCN)具有抗性的大豆植物。

本公开的一个方面提供对大豆孢囊线虫(SCN)具有抗性的转基因大豆。所述抗SCN大豆包括赋予抗性表型的丝氨酸羟甲基转移酶基因(GmSHMT)。在一些实施方案中，GmSHMT基因对大豆为外源性的且由此提供SCN抗性。在一些实施方案中，GmSHMT基因对大豆为内源性的且转化增加了GmSHMT的表达，由此增加SCN抗性。

在一些实施方案中，大豆植物用人工DNA构建体转化，所述人工DNA构建体包含以下作为在5'到3'转录方向上可操作地相关联的组件：启动子，其在大豆中起作用；多核苷酸，其包含选自由以下组成的组的序列：(a)SEQ ID NO:1或具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的与其95％相同的序列；(b)编码SEQ ID NO:2的多肽的核苷酸序列或具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的与其95％相同的序列；(c)在严格条件下与SEQ ID NO:1的核酸序列杂交的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽，其中所述严格条件包括在65℃下在包含6X SSC(0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)的溶液中孵育；及(d)与(a)、(b)或(c)的所述多核苷酸序列互补的多核苷酸；及转录终止序列；其中该转基因大豆表现出增加的SCN抗性。

在一些实施方案中，大豆植物是包含含有突变R130P和Y358N的GmSHMT等位基因的具有大豆孢囊线虫(SCN)抗性的农艺学优良大豆栽培品种。在一些实施方案中，大豆植物通过以下方式来制备：(a)使第一大豆植物与第二大豆植物杂交，其中第一和第二植物共同地包含产生SCN抗性表型的含有突变R130P和Y358N的GmSHMT等位基因，且其中第一和第二植物共同地包含能够向所述植物的子代植物赋予农艺学优良特性的种质；及(b)分析由杂交所得的子代大豆植物的农艺学优良特性和SCN抗性；以及(c)选择包含所述SCN抗性表型和农艺学优良特性的至少第一子代植物以获得期望的植物。

本公开的另一方面是本文所述任何抗SCN大豆植物的植物部分。

本公开的另一方面是人工DNA构建体，其包括启动子，其在大豆中起作用；编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的多核苷酸；及转录终止序列。

本公开的另一方面是增加大豆抗大豆孢囊线虫(SCN)的方法，其包括用本发明的人工DNA构建体来转化植物。

其它目标和特征将在部分程度上显而易见并且将在下文中部分地指出。

附图说明

本领域技术人员应理解，下文所述附图仅出于说明目的。所述附图并非意在以任何方式限制本发明教导的范围。

图1是说明Rhg4基因的定位克隆的一系列图式和序列表。图1A显示Rhg4基因座的高密度遗传图谱。黑色水平线表示大约为300Kbp的Rhg4染色体区间。黑线下方的箭头指出每个DNA标记的位置及其名称。黑色水平线上方的数字表示每一标记相对于LRR-RLK标记(先前描述于Liu等人2011中的在Rhg4基因座处的LRR-RLK基因)的位置，其被指定为‘0’位。蓝色箭头表示Essex(E)或Williams 82(W)与Forrest(F)之间的多态性等位基因，红色箭头表示具有在双重组体ExF74和FxW5093中出现的具有Forrest(F)等位基因的DNA标记，且绿色箭头表示E、W和F之间的非多态性等位基因，其跨越大约100Kbp的区域。图1B显示通过使用GmSHMT探针筛选三个大豆BAC库(HindIII库、EcoRI库和BamHI BAC库；Meksem等人，2000)鉴定出BAC克隆100B10。BAC克隆100B10涵盖标记LRR-RLK、SHMT以及GmSHMT的部分序列(前两个外显子以及第二个内显子的一部分)。图1C显示GmSHMT基因组DNA序列的基因模型。所述基因从起始密码子到终止密码子是2189bp且含有三个外显子(红色框)和两个内显子(黑色线)。黑色线上方的数字指示相对于起始密码子的第一个核苷酸的核苷酸位置。比较Forrest与Essex之间的GmSHMT基因序列以鉴定出三个SNP(G389C、T1165A和G1473C)以及两个InDel(在1384C位和1385T位处)。图1D显示Forrest与Essex之间的预测GmSHMT蛋白质序列的比较，其中用红色突显氨基酸差异(R130P和Y358N)。

图2是展示通过突变分析对GmSHMT的功能验证的图式、序列表和柱形图。图2A显示使用大豆栽培品种Forrest的EMS诱变群体通过TILLING来筛选GmSHMT中的突变。基因被划分为3个TILLING区间(1、2和3)以供筛选。鉴定出两个错义突变体F6266(E61K)和F6756(M125I)。图2B显示包括来自Forrest的抗性野生型等位基因、来自供体亲本PI548402(Peking)的抗性等位基因、F6266和F6756Forrest突变等位基因以及来自栽培品种Essex和Williams 82的易感性等位基因的GmSHMT序列的氨基酸比对。比对上方的数字对应于Forrest GmSHMT蛋白质序列内的氨基酸位置。箭头表示在SCN抗性品系与易感性品系之间不同的两个氨基酸(R130P和Y358N)的位置以及通过EMS诱导的两个新Forrest等位基因中突变(E61K和M125I)的位置。图2C显示GmSHMT TILLING突变体的SCN表型。与抗SCN栽培品种Forrest(野生型)和易感SCN的栽培品种Essex相比，E61K和M125I突变两者均产生了从抗性到中度易感性(在纯合子突变品系中FI≥20％)以及从抗性(FI≤10％)到中度抗性(在杂合子突变品系中FI介于10％与20％之间)的转变。

图3是示出以28个植物引种(PI)中的GmSHMT鉴定的单倍型的表。对总共81个大豆品系(植物引种、地方栽培品种和优良栽培品种)的SCN表型进行评分且以rhg1和Rhg4基因座进行SNP基因分型(关于列表参见例如表1)。对此处所显示的28个品系的GmSHMT的编码区测序。如果FI≤10％，则品系被分类为对SCN具有抗性(R)，且如果FI≥10％，则品系被分类为对SCN具有易感性(S)。在Forrest中多态性位点是相对于起始密码子的第一个核苷酸定位。红色框指示G到C以及T到A的转变，所述转变产生分别连接于SCN表型的氨基酸取代R130P和Y358N。

图4是展示通过VIGS、RNAi和互补对GmSHMT的功能验证的一系列图形和图像。图4A显示使用病毒诱导的基因沉默使GmSHMT沉默的大豆根中的SCN繁殖。在经BPMV(菜豆莢斑點病毒(Beanpodmottle virus))或含有SHMT基因序列片段的BPMV(BPMV-SHMT)接种的抗SCN RIL ExF67和仅经BPMV接种的易感SCN的RIL ExF63上测量线虫繁殖。菱形表示单个根系统上孢囊的数目。每次处理使用至少十二株植物。进行四个独立的实验，其等显示相似结果。给出来自一个实验的代表性数据。不同字母表示在P<0.0001下的显著差异。图4B显示在对照根和GmSHMT沉默根中GmSHMT转录水平的qPCR分析。GmSHMT沉默根的值表示相对于大豆泛素标准化并针对BPMV对照样品中的表达刻度化的五个样品的平均值±SE。图4C显示使用RNA干扰使GmSHMT沉默的大豆根中的SCN繁殖。在用受线虫诱导型启动子的控制的GmSHMT RNAi构建体(pZF)转化的转基因ExF67毛状根品系上测量线虫繁殖(Kandoth等人，2011；pZF-SHMTi)。用含有GUS基因(GUSi)的一部分的载体转化的转基因ExF67和ExF63毛状根品系分别用作抗性和易感性对照。每次基因型处理产生至少十二个独立的转基因毛状根品系。菱形表示单个毛状根品系上孢囊的数目。进行三个独立的实验，其等显示相似结果。给出来自一个实验的数据。不同字母表示在P<0.01下的显著差异。图4D、图4E和图4F显示在抗SCN ExF67(图4D和图4E)和易感SCN的ExF63(图4F)中的GmSHMT启动子-GUS分析，其显示在用SCN接种后3天时合胞体取食细胞中的表达(图4G)，在用受天然启动子控制的全长度GmSHMT基因片段转化的易感SCN的ExF63毛状根品系上的SCN繁殖。用仅含有启动子序列的载体转化的转基因ExF67和ExF63毛状根品系分别用作抗性和易感性对照。每次基因型处理产生至少十四个独立的转基因毛状根品系。菱形表示单个毛状根上孢囊的数目。进行四个独立的实验，其等显示相似结果。给出来自一个实验的数据。不同字母表示在P<0.001下的显著差异。N＝线虫；Syn＝合胞体。在图形中，条线指示平均值。

图5是GmSHMT的计算机建模结构的一系列视图。图5A显示Essex GmSHMT同源二聚体的同源性模型，所述同源性模型显示对应Forrest突变P130R(红色)和N358Y(洋红色)位于二聚体的表面上，而F6266(E61K)突变(棕色)的位置包埋于二聚体相互作用界面中且F6756(M125I)突变(黄色)位于每一单体亚基的核心中。图5B显示与GmSHMT配体结合位点重叠的四个突变中的三个。配体结合位点是作图在形成二聚体的两个单体中的一个上。当两个配体结合位点重叠时，仅显示位点中的一个的彩色表面。Forrest突变P130R和N358Y两者均与THF/MTHF/FTHF(深紫色)结合位点重叠并与PLS(青色)和PLG(深蓝色)结合位点紧邻。另外，Forrest P130R与两个甘氨酸结合位点(两个结合位点均为深绿色)中的一个紧邻。F6266(E61K)突变与THF/MTHF/FTHF和PLS结合位点两者重叠且与PLG结合位点紧邻。

图6示出经作图到Rhg4基因座的GmSUB基因的序列分析。图6显示抗SCN大豆栽培品种Forrest(F)与易感SCN栽培品种Essex(E)和Williams 82(W)之间的GmSUB cDNA和预测蛋白质序列的比较。五个核苷酸差异用绿色突显且对应氨基酸用红色突显。图6显示来自大豆栽培品种Forrest、Essex和Williams 82的GmSUB启动子序列的比对。经鉴定在起始密码子的1,766bp序列5’中没有核苷酸差异。

图7A显示来自大豆栽培品种Forrest、Essex和Williams 82的GmSHMT启动子序列的比对。核苷酸差异用红色突显。图7B是EssexpSHMT-GUS的图像。

发明详述

本公开是至少部分地基于以下发现：作图到Rhg4基因座的丝氨酸羟甲基转移酶(GmSHMT)基因赋予对大豆孢囊线虫大豆异皮线虫的抗性。尽管Rhg4基因座被先前鉴定为促成对这种病原体的抗性的主要数量性状基因座，但本公开是在负责赋予抗性表型的Rhg4基因座处的基因的基于图谱克隆的第一个报告。

GmSHMT基因编码丝氨酸羟甲基转移酶，一种负责丝氨酸和甘氨酸的互变且对于一碳叶酸代谢是必需的酶。如本文中所报告，赋予抗性或易感性的Rhg4的等位基因的差异在于经预测会削弱叶酸结合亲和力的两种遗传多态性。也如本文中所报告，通过TILLING鉴定的两个独立的点突变、通过VIGS和RNAi进行的基因敲除以及易感品系的转基因互补证实了GmSHMT基因赋予对大豆孢囊线虫的抗性。

根据本文所述方法，大豆细胞或植物可被转化以便提供SCN抗性。在一些实施方案中，可用编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的核酸分子来转化大豆宿主细胞或植物。编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的核酸可对植物对SCN的抗性具有重大影响。

定义

提供下列定义和方法来更好地界定本发明并在本发明的实践中指导本领域技术人员。除非另外说明，否则术语应按照相关技术领域的一般技术人员的常规用法来理解。

如本文所使用的术语“异源性DNA序列”、“外源性DNA区段”或“异源性核酸”各自是指来源于对特定宿主细胞而言外来的来源、或如果来自相同来源则从其原始形式进行修饰的序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞为内源性的但已(例如)通过使用DNA改组进行修饰的基因。这些术语还包括天然存在的DNA序列的多个非天然存在的拷贝。因此，这些术语是指对于该细胞而言是外来的或异源的，或者对于该细胞而言是同源的但处于宿主细胞核酸内该元件通常不被发现的位置的DNA区段。外源性DNA区段表达产生外源性多肽。“同源性”DNA序列是与其中引入它的宿主细胞天然相关联的DNA序列。

表达载体、表达构建体、质粒或重组DNA构建体通常被理解为是指已经由人干预(包括通过重组手段或直接化学合成)利用允许指定核酸在(例如)宿主细胞中转录或翻译的一系列指定核酸元件产生的核酸。表达载体可为质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体可包括将被转录而可操作地连接于启动子的核酸。

“启动子”通常被理解为指导核酸的转录的核酸控制序列。诱导型启动子通常被理解为介导可操作地连接的基因响应于特定刺激而转录的启动子。启动子可在转录的起始位点附近包含必需的核酸序列，诸如，在聚合酶II型启动子的情况下包括TATA元件。启动子可任选地包括远端增强子或阻遏物元件，其可位于距转录的起始位点多达数千个碱基对处。

如本文所使用的“可转录核酸分子”是指能够被转录成RNA分子的任何核酸分子。已知方法是以这样的方式将构建体引入到细胞中，使得可转录核酸分子转录成功能mRNA分子且因此其被翻译且因此表达为蛋白质产物。为了抑制特定目标RNA分子的翻译，构建体也可被构建为能够表达反义RNA分子。对于本公开的实践而言，用于制备及使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员所熟知(参见例如，Sambrook和Russel(2006)Condensed Protocolsfrom Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel等人(2002)ShortProtocols in Molecular Biology，第5版，Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook和Russel(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.和Wolk,C.P.1988.Methods inEnzymology 167,747-754)。

“转录起始位点”或“起始位点”是围绕为转录序列的一部分的第一个核苷酸的位置，其也被定义为+1位。可相对于该位点对该基因的所有其它序列及其控制区进行编号。下游序列(即，在3'方向上的其它蛋白质编码序列)可命名为正的，而上游序列(在5'方向上的大多数控制区)被命名为负的。

“可操作地连接”或“在功能上连接”优选地是指在单个核酸片段上的核酸序列的关联使得一个核酸序列的功能受另一核酸序列影响。例如，如果两个序列经定位使得调节DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，使得编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下)，则调节DNA序列被称为“可操作地连接于”或“相关联于”编码RNA或多肽的DNA序列。编码序列可以正义或反义取向可操作地连接于调节序列。该两个核酸分子可为单个连续核酸分子的一部分且可为相邻的。例如，如果启动子调节或介导细胞中的目标基因的转录，则启动子可操作地连接于所述目标基因。

“构建体”通常被理解为来源于任何来源的能够进行基因组整合或自主复制的任何重组核酸分子，诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制核酸分子、噬菌体或者线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，其包含其中一或多个核酸分子已经可操作地连接的核酸分子。

本公开的构建体可含有可操作地连接于与3'转录终止核酸分子可操作地连接的可转录核酸分子的启动子。另外，构建体可包括但不限于来自(例如)3'非翻译区(3'UTR)的额外调节核酸分子。构建体可包括但不限于可在翻译开始时起重要作用且还可为表达构建体中的遗传组分的mRNA核酸分子的5'非翻译区(5'UTR)。这些额外上游和下游调节核酸分子可来源于相对于启动子构建体上存在的其它元件为天然或异源性的来源。

术语“转化”是指核酸片段转移到宿主细胞的基因组中，从而产生基因稳定遗传。含有经转化核酸片段的宿主细胞称为“转基因”细胞，且包含转基因细胞的生物体称为“转基因生物体”。

“转化”、“转基因”和“重组”是指其中已引入异源性核酸分子的宿主细胞或生物体(诸如植物)。如业内众所周知和公开的，核酸分子可稳定地整合到基因组中(Sambrook 1989；Innis 1995；Gelfand 1995；Innis&Gelfand 1999)。已知PCR方法包括但不限于使用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。术语“非转化”是指尚未经历转化过程的正常细胞。

“野生型”是指在自然界中发现的不具有任何已知突变的病毒或生物体。

转化的生物

本文提供经遗传工程化以对大豆孢囊线虫(例如，大豆异皮线虫)具有抗性的大豆植物。经遗传工程化以抵抗SCN宿主可为任何大豆植物或细胞。

用于评估SCN抗性的测定为业内熟知(参见实施例)。因此，除本文中另外说明，否则植物的SCN抗性可按照这些测定进行。

因此，本发明的一个方面涉及上述植物和其部分以及使用这些植物和植物部分的方法。术语“植物”可包括植物细胞、植物原生质体、可再生出植物的植物组织培养物细胞、植物愈伤组织、植物丛以及植物中完整的植物单元或植物部分(诸如花粉、花、种子、叶、茎等)。这些术语中的每一个可适用于大豆“植物”。植物部分(例如，大豆部分)包括但不限于花粉、胚珠和细胞。本发明进一步提供这些植物的可再生细胞的组织培养物，所述培养物再生能够表现起始品种的所有生理和形态特性的大豆植物。此类可再生细胞可包括胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖或花、或从其得到的原生质体或愈伤组织。本发明还提供从这种组织培养物再生的大豆植物，其中所述植物能够表现从其获得可再生细胞的起始植物品种的所有生理和形态特性。

此类抗SCN植物可具有商业意义的产量，例如，为大豆对照品系至少90％到至少110％(例如，至少95％、100％、105％)的产量。所提供植物包含GmSHMT等位基因及SCN抗性以及为这些品系至少约90％、至少约94％、至少约98％、至少约100％、至少约105％或至少约110％的谷物产率。

如本文中所报告，用GmSHMT基因构建体(起始密码子上游的2.3-kb序列至终止密码子下游的0.57-kb)来转化易感SCN的大豆(RILExF63)，以便根据使用大豆异皮线虫的线虫感染测定使GmSHMT合胞体中表达以在毛状根中提供SCN抗性。

另外的实验显示了使抗SCN RIL ExF67中的GmSHMT基因沉默导致植物根中的GmSHMT表达减少74％且对SCN易感性增加29％。添加使互补靶向RNAi基因沉默的方法会增加抗SCN RIL ExF67的毛状根上的线虫繁殖。

在各种实施方案中，将编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因在宿主植物(例如，大豆植物)中工程化以便产生抗SCN表型。在一些实施方案中，使编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因在宿主植物中表达。在一些实施方案中，使编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因在宿主植物中过表达。

编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因可对宿主植物为内源性或外源性的。转化植物来表达具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽可将SCN抗性传送到缺乏这种表型的宿主。转化植物来表达具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽可增加已拥有这种表型的宿主的SCN抗性。

可对经转化植物或植物细胞分析目标基因的存在以及由本发明的构建体赋予的表达水平或概况。本领域技术人员知道可用于分析经转化宿主的多种方法。例如，用于宿主分析的方法包括但不限于Southern印迹法或northern印迹法、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法以及免疫诊断测定。

在一些实施方案中，经转化以表达具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的宿主植物可展现对SCN的易感性下降至少约10％。例如，与非转化对照相比，经转化以表达具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的宿主植物可展现对SCN的易感性降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。作为另一实例，与非转化对照相比，经转化以表达具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的宿主植物可展现对SCN的易感性降低至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1000％。

用于工程化大豆植物以展现SCN抗性的尤其受关注的基因是GmSHMT(SEQ ID NO:1)。如本文中所述，GmSHMT经作图到Rhg4基因座且赋予对大豆孢囊线虫大豆异皮线虫的抗性。

在一些实施方案中，经转化宿主大豆植物包含SEQ ID NO:1的GmSHMT多核苷酸或其功能片段。在一些实施方案中，经转化宿主大豆植物包含SEQ ID NO:3的GmSHMT多核苷酸或其功能片段。在一些实施方案中，用编码SEQ ID NO:2的GmSHMT多肽的核苷酸序列或其功能片段来转化大豆植物。

在另外的实施方案中，经转化宿主大豆植物包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的GmSHMT多核苷酸具有至少约80％序列同一性的核苷酸序列或其功能片段、或编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽且与SEQ ID NO:2的GmSHMT多肽具有至少约80％序列同一性的核苷酸序列或其功能片段。作为一个实例，经转化宿主大豆植物可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的GmSHMT多核苷酸具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列或其功能片段，其中经转化大豆展现SCN抗性或丝氨酸羟甲基转移酶活性。作为一个实例，经转化大豆可包含编码与SEQ ID NO:2的GmSHMT多肽具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的多肽的核苷酸序列或其功能片段，其中经转化大豆呈现SCN抗性或丝氨酸羟甲基转移酶活性。

作为另一实例，经转化大豆可包含在严格条件下分别在SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的整个长度上与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的GmSHMT多核苷酸杂交且编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列或其功能片段。

作为另一实例，经转化大豆可包含任一上文序列的补体。

变体序列

如上文所述，可用GmSHMT多核苷酸SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的变体或用编码GmSHMT多肽SEQ ID NO:2的变体的多核苷酸来转化植物。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2的种属分别代表变体核酸和多肽的属，因为所有变体必须拥有指定催化活性(例如，丝氨酸羟甲基转移酶活性)且必须具有上文参考序列所需的同一性百分比。

此外，本公开提供关于对活性重要的序列区域的指导。

如本文中所报告，来自Forrest和Essex的GmSHMT的基因组DNA序列显示抗性等位基因与易感性等位基因之间的5个核苷酸差异(3个SNP和2个In/Del)。在Forrest与Essex GmSHMT cDNA之间发现的核苷酸差异中的两个导致预测蛋白质序列的氨基酸改变(R130P和Y358N)。在Williams 82中这两个位置处的氨基酸序列与在Essex中一致。

本文还报告了导致在E61K和M125I处的错义突变的染色体8上的GmSHMT基因的两个突变。对两个突变进行SIFT预测。基于SIFT预测(即，基于序列同源性和氨基酸的物理性质，氨基酸取代是否影响蛋白质功能)，M125I突变被预测为对蛋白质有害且在线虫感染测定中两个突变体均对SCN更易感。另外，F6756(M125I)突变与个体植物的SCN抗性表型相关。

基于SCN雌性指数评分和基于SNP GmSHMT的单倍型，在编码区中鉴定出13种多态性且在非编码DNA序列中鉴定出6种多态性。显示两种编码多态性R130P和Y358N取代产生负责“Peking型抗性”SCN表型的氨基酸改变。鉴定出八个不同的GmSHMT单倍型。

GmSHMT的结构的同源性建模提供关于不同基因型如何影响结构和功能性质的指导。将SHMT同源物的配体结合位点作图到GmSHMT模型的表面上鉴定出五个潜在结合位点，包括两个甘氨酸(GS₁和GS₂)、一个PLP-丝氨酸(PLS)、一个PLP-甘氨酸(PLG)和一个THF/MTHF/5-甲酰基THF(FTHF)结合位点，其中最后三个结合位点在物理上共定位于由SHMT二聚体分子形成的结合袋中。显示Forrest突变和TILLING突变F6266E61K两者均与试验配体结合位点紧邻。

Forrest突变P130R和N358Y与THF/MTHF/FTHF结合位点共定位且与PLS、PLG和两个甘氨酸结合位点中的一个紧邻。F6266 E61K突变的位置与PLS和THF/MTHF/FTHF结合位点重叠。因此，三个突变可直接影响L-丝氨酸和THF到甘氨酸和MTHF的可逆互变。显示TILLING突变F6756 M125I在内部β片层中，表明受TILLING突变影响的GmSHMT区的结构不稳定性。

本文所论述的变体多聚核酸分子和对应经编码多肽可含有上文所述突变中的一或多个。

因此提供关于对活性重要的序列区域的指导。

启动子

上文所论述的核苷酸序列中的一或多个(例如，GmSHMT或其变体)可操作地连接于可在植物(诸如大豆)中起作用的启动子。启动子选择可允许期望的基因产物在多种条件下表达。

启动子可针对在将插入载体构建体的大豆宿主细胞中的最佳功能来选择。启动子也可基于其调节特征来选择。这些特征的实例包括转录活性和可诱导性的增强。

在大豆植物中起作用的许多启动子对于本领域技术人员将是已知的(参见例如，Weise等人Applied Microbiology and Biotechnology70(3),337-345；Saidi等人2005 Plant Molecular Biology 59(5),697-711；Horstmann等人2004 BMC Biotechnology 4；Holtorf等人2002 PlantCell Reports 21(4),341-346；Zeidler等人1996 Plant Molecular Biology30(1),199-205)。因此，除本文中另外说明，否则本公开的方法和组合物可根据这些已知启动子来实施。可按照本文所述方法和组合物使用的启动子的实例包括但不限于因子EF1α基因启动子(美国申请公开号2008/0313776)；水稻东格鲁杆状病毒(tungro bacilliform virus,RTBV)基因启动子(美国申请公开号2008/0282431)；夜香树黄叶卷曲病毒(CmYLCV)启动子(Stavolone等人Plant Molecular Biology 53(5),663-673)；tCUP潜在启动子系统(Malik等人2002 Theoretical andApplied Genetics 105(4),505-514)；T6P-3启动子(JP2002238564)；S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶启动子(WO/2000/037662)；覆盆子E4基因启动子(美国专利第6,054,635号)；花椰菜花叶病毒35S启动子(Benfey等人1990 Science 250(4983),959-966)；玄参花叶病毒启动子(美国专利第5,378,619号)；条件热激启动子(Saidi等人2005 Plant MolecularBiology 59(5),697-711)；甜菜空泡型H+-ATP酶亚基c同种型的启动子片段(Holtorf等人2002 Plant Cell Reports 21(4),341-346)；β-微管蛋白启动子(Jost等人2005 Current Genetics 47(2),111-120)；及细菌群体感应组分(You等人2006 Plant Physiology 140(4),1205-1212)。

启动子可为诱导型启动子。例如，启动子可根据温度、pH、激素、代谢物(例如，乳糖、甘露糖醇、氨基酸、光(例如，特定波长)、渗透势(例如，受盐诱导)、重金属或抗生素来诱导。在一些实施方案中，启动子包括线虫诱导型启动子(例如，Glyma15g04570.1，参见实施例8)。许多标准诱导型启动子对于本领域技术人员将是已知的。

启动子可为组织特异性启动子。例如，本文所述可转录核酸分子可操作地连接于花粉、花、种子、叶或茎特异性启动子。作为另一实例，本文所述可转录核酸分子可操作地连接于种子特异性启动子。例如，启动子可为根特异性启动子。许多标准组织特异性启动子对于本领域技术人员将是已知的。

术语“嵌合的”被理解为是指两个或更多个不同多核苷酸分子的部分的融合产物。“嵌合启动子”被理解为是指通过操纵已知启动子或其它多核苷酸分子产生的启动子。此类嵌合启动子可组合来自一或多个启动子或调节元件的可赋予或调节基因表达的增强子结构域，例如，通过将来自第一启动子的异源性增强子结构域与第二启动子以及其自身部分或完整调节元件融合。因此，本发明涵盖根据本文所公开的方法设计、构建及使用嵌合启动子来调节可操作地连接的多核苷酸序列的表达。

可通过多种方法来设计或工程化新颖嵌合启动子。例如，可通过将来自第一启动子的增强子结构域与第二启动子融合来产生嵌合启动子。相对于第一或第二启动子，所得嵌合启动子可具有新颖表达性质。可构建新颖嵌合启动子使得来自第一启动子的增强子结构域融合在第二启动子的5'端、3'端或内部任何位置。

启动子可为与SHMT内源性地相关联的任何启动子或其变体。在一些实施方案中，启动子可包含SEQ ID NO:4，其为天然EssexGm08-A2 SHMT启动子。在其它实施方案中，启动子可包含与SEQ IDNO:4具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％)且保持启动子功能的其变体。

终止区控制序列的纳入为任选的，且如果采用，则选择主要的一个原因是为了方便，因为终止区是相对可互换的。终止区可对转录起始区(启动子)为天然的、可对目标核酸序列为天然的或可从另一来源获得。

可如所述将本公开的启动子纳入到使用标记基因的构建体中并针对在稳定宿主系统中基因表达的指标对其进行测试。如本文所使用的术语“标记基因”是指其表达可以某种方式被筛选或被评分的任何可转录核酸分子。

构建体

可在构建体中提供任一上文所述可转录多核苷酸分子序列。可在构建体中提供任一上文所述可转录多核苷酸分子序列。本发明的构建体通常包括在宿主植物(诸如大豆)中起作用的的启动子，所述启动子可操作地连接于编码诸如提供于SEQ ID NO:1中的具有丝氨酸羟甲基转移酶活性(例如，GmSHMT)的多肽及如上文所论述其变体的可转录多核苷酸分子。

上文论述了示例性启动子。还可在重组构建体中提供一或多个额外启动子。这些启动子可操作地连接于任一上文所述可转录多核苷酸分子序列。

术语“构建体”被理解为是指来源于任何来源的能够进行基因组整合或自主复制的任何重组多核苷酸分子，诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或者线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，其包含其中一或多个多核苷酸分子以功能上可操作方式连接(即，可操作地连接)的多核苷酸分子。术语“载体”或“载体构建体”被理解为是指可用于转化目的(即，将异源性DNA引入到宿主植物诸如大豆中)的任何重组多核苷酸构建体。

另外，构建体可包括但不限于来自目标基因非翻译区的额外多核苷酸分子。这些额外多核苷酸分子可来源于相对于构建体中存在的其它元件是天然或异源性的来源。

可通过业内已知的多种手段来评价根据本文所述方法研发的宿主细胞(参见例如，Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207–234；Gellissen编辑，(2005)Production of Recombinant Proteins:NovelMicrobial and Eukaryotic Expression Systems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。

分子工程

具有上文所需同一性百分比且保持所表达蛋白质的所需活性的变体核苷酸及其经编码多肽的设计、产生及测试在本领域的技术范围内。例如，突变体的定向进化和快速分离可按照参考文献中所述的方法，所述参考文献包括但不限于Link等人(2007)Nature Reviews 5(9),680-688；Sanger等人(1991)Gene 97(1),119-123；Ghadessy等人(2001)Proc NatlAcad Sci USA 98(8)4552-4557。因此，本领域技术人员可按照本领域中的常规方法生产大量与本文所述gmSHMT序列具有(例如)至少95-99％同一性的核苷酸和/或多肽变体并筛选出期望的表型。

核苷酸和/或氨基酸序列同一性百分比(％)被理解为在比对两个序列时相较于参考序列，与候选序列中的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分数。为了确定同一性百分比，将序列进行比对，且如果需要，引入空位以达成最大序列同一性百分比。用以确定同一性百分比的序列比对程序为本领域技术人员所熟知。公开的可用计算机软件诸如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件经常用于比对序列。本领域技术人员可判定用于衡量比对的合适参数，包括在被比较序列全长范围内达成最大比对所需的任何算法。当比对序列时，给定序列A对于、与或相对于给定序列B的序列同一性百分比(其或者可被描述为具有或包括对于、与或相对于给定序列B的一定序列同一性百分比的给定序列A)可计算为：序列同一性百分比＝X/Y100，其中X是通过A与B的序列比对程序或算法的比对经评分为一致匹配的残基的数目且Y是B中残基的总数目。如果序列A的长度不等于序列B的长度，则A对于B的序列同一性百分比将不等于B对于A的序列同一性百分比。

通常，可在任何位置处进行保守性取代，只要保持所需活性即可。可进行所谓的保守性交换，其中被替代的氨基酸具有与原始氨基酸相似的性质，例如由Asp交换Glu、由Asn交换Gln、由Ile交换Val、由Ile交换Leu及由Thr交换Ser。缺失是氨基酸由直接键替代。缺失的位置包括多肽末端及个别蛋白质结构域之间的键联。插入是将氨基酸引入到多肽链中，形式上为直接键由一或多个氨基酸替代。可借助于业界已知的计算机模拟程序来调节氨基酸序列，所述计算机模拟程序可产生具有(例如)改良的活性或改变的调控的多肽。基于该人工产生的多肽序列，可使用期望的宿主细胞的特定密码子用法在体外合成编码这种经调节多肽的对应核酸分子。

“高度严格杂交条件”定义为在65℃下在6 X SSC缓冲液(即，0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)中杂交。在这些条件下，可通过计算两个序列之间的DNA双链体的解链温度(T_m)关于一组给定序列是否将杂交做出判定。如果特定双链体在6 X SSC的盐条件下具有低于65℃的解链温度，则两个序列将不杂交。另一方面，如果在相同盐条件下解链温度高于65℃，则所述序列将杂交。一般来说，用于任何杂交DNA:DNA序列的解链温度皆可使用下式来确定：T_m＝81.5℃+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(成分G/C含量)–0.63(甲酰胺％)–(600/l)。此外，核苷酸同一性每降低1％，DNA:DNA杂合体的T_m便下降1-1.5℃(参见例如，Sambrook和Russel,2006)。

可使用本领域已知的多种标准技术来转化宿主细胞(参见，例如，Sambrook和Russel(2006)Condensed Protocols from MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel等人(2002)Short Protocols in MolecularBiology，第5版，Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook和Russel(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.和Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology 167,747-754)。这些技术包括但不限于病毒感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的递送、受体介导的吸收、细胞融合、电穿孔等。转染的细胞可经选择并繁殖以提供包括稳定地整合于宿主细胞基因组中的表达载体的重组宿主细胞。

可引入到宿主细胞中的示例性核酸包括(例如)来自另一种属的DNA序列或基因或者甚至来源于相同种属或存在于相同种属中但通过基因工程方法纳入到受体细胞中的基因或序列。术语“外源性”还意在指通常不存在于被转化的细胞中或可能根本不以如在转化DNA区段或基因中发现的形式、结构等存在的基因、或者通常存在且期望以不同于天然表达模式的方式表达(例如，过表达)的基因。因此，术语“外源性”基因或DNA意在指引入到受体细胞中的任何基因或DNA区段，不论相似基因是否可能已存在于这个细胞中。外源性DNA中包括的DNA的类型可包括已存在于植物细胞中的DNA、来自另一植物的DNA、来自不同生物体的DNA或外部产生的DNA，诸如含有基因的反义消息的DNA序列或编码合成或经修饰版本基因的DNA序列。

根据本文所述方法研发的宿主菌株可通过业内已知的多种手段来评价(参见例如，Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207–234；Gellissen编辑，(2005)Production of Recombinant Proteins:NovelMicrobial and Eukaryotic Expression Systems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。

下调基因或使基因沉默的方法为业内已知。例如，可使用反义寡核苷酸、蛋白质适体、核苷酸适体和RNA干扰(RNAi)(例如，小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微RNA(miRNA)来下调或消除表达的蛋白质活性(参见例如，Fanning和Symonds(2006)HandbExp Pharmacol.173,289-303G，描述锤头核酶和小发夹RNA；Helene,C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-36；Maher(1992)Bioassays14(12):807-15，描述靶向脱氧核糖核苷酸序列；Lee等人(2006)CurrOpin Chem Biol.10,1-8，描述适体；Reynolds等人(2004)NatureBiotechnology 22(3),326–330，描述RNAi；Pushparaj和Melendez(2006)Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6),504-510，描述RNAi；Dillon等人(2005)Annual Review ofPhysiology67,147-173，描述RNAi；Dykxhoorn和Lieberman(2005)AnnualReview ofMedicine 56,401-423，描述RNAi)。RNAi分子可商购自多种来源(例如，Ambion,TX；SigmaAldrich,MO；Invitrogen)。使用多种算法的若干siRNA分子设计程序对于本领域是已知的(参见例如，Cenix algorithm,Ambion；BLOCK-iT^TMRNAi Designer,Invitrogen；siRNA Whitehead Institute Design Tools,Bioinofrmatics&ResearchComputing)。对定义最佳siRNA序列具有影响的性状包括：在siRNA末端处的G/C含量、siRNA的具体内部结构域的Tm、siRNA长度、CDS(编码区)内的目标序列的位置以及3'突出端的核苷酸含量。

育种

本公开提供遗传标记以及将GmSHMT等位基因引入农艺学优良大豆植物中的方法。因此，本发明允许产生组合有这些赋予SCN抗性的GmSHMT等位基因与商业意义产量和农艺学优良遗传背景的植物。使用本发明方法，例如在具有商业意义产量和SCN抗性的新品种的生产中，可将赋予SCN表型的基因座引入所需大豆遗传背景中。

标记辅助渗入涉及将由一个或多个标记界定的染色体区域从一个种质转移到另一个种质。该方法中的初始步骤是通过基因作图来定位性状，这是通过连锁分析确定一个基因相对于其它基因和遗传标记的位置的方法。连锁作图的基本原则是，两个基因在染色体上越靠近，它们越有可能被一起遗传。简单地说，杂交通常在两个遗传上相容但相对于所研究的性状不同的亲本之间进行。遗传标记则可被用来追踪在来自杂交的后代(通常为回交(BC1)、F2或重组自交群体)中所研究性状的分离。

术语数量性状基因座或QTL用来描述基因组中显示对于表型具有数量或加性效应的区域。Rhg4基因座(其含有GmSHMT等位基因)代表示例性QTL，因为GmSHMT等位基因产生SCN抗性。本文鉴定出针对非转基因GmSHMT等位基因的遗传标记，所述遗传标记使得能够用农艺学优良植物培育包含GmSHMT等位基因的大豆植物，并选择出遗传了突变GmSHMT等位基因的后代。因此，本发明允许使用分子工具将这些QTL与所需农艺特性组合。

标记辅助育种的方法为业内熟知。因此，除非在本文中另有说明，否则本公开的方法可根据此类方法进行。

研究工具

SHMT基因可用来发现或表征相关(相互作用)基因或用来鉴定或进一步表征关于SCN抗性的级联。SHMT作为对抗SCN抗性信号传导通路的一部分的发现提供了对此复杂宿主-病原体相互作用的新颖见解。本文所报道的见解可用来辨别SHMT与代谢之间的关系。

在一些实施方案中，SHMT基因可用于基因组学、蛋白质组学、生物信息学或统计建模方法以探明或分离在介导大豆对SCN的疾病抗性中具有直接或间接作用的候选基因或编码的蛋白质或其它分子。在一些实施方案中，SHMT基因可用于基因组学、蛋白质组学、生物信息学或统计建模方法以探明或分离在介导大豆对SCN(例如，对线虫或任何中介物)的相容或不相容反应中具有直接或间接作用的候选基因或编码的蛋白质或其它分子。由此提供多种可发现或表征与SCN抗性有关连的相关(相互作用)基因的方法。

除了Hs1^pro-1(甜菜中甜菜孢囊线虫(H.schachtii)的抗性基因，其编码具有不完善的富含亮氨酸的重复序列的282-aa跨膜蛋白(Cai等人，1997))以外，迄今鉴定的所有其它线虫抗性基因均属于典型NB-LRR(核苷酸结合位点，富含亮氨酸的重复序列)类植物抗性基因(Milligan等人，1998；van der Vossin等人，2000；Ernst等人，2002；Paal等人，2004)。相反地，SHMT是在一碳叶酸代谢中具有关键作用的代谢酶。尽管该酶具有多种催化活性，但它的主要作用之一是催化丝氨酸与四氢叶酸(THF)向甘氨酸与5,10-亚甲基THF(MTHF)的可逆转化以供应一碳单元用于重新合成嘌呤、胸苷酸和甲硫氨酸，此暗示了其在DNA合成及细胞的甲基化反应中的重要性。

SHMT为一种在自然界中普遍存在的酶，其是跨界结构上保守的。除绿豆SHMT(Sukanya等人，1991)以外，迄今所表征的所有其它SHMT均需要5'-磷酸吡哆醛(PLP)(维生素B6的活性形式)。已确定了来自多种生物体(包括人、兔、小鼠和大肠杆菌)的SHMT的3-D结构(Renwick等人，1998；Scarsdale等人，2000)。二聚体SHMT主要见于原核生物中，而真核生物的SHMT形成二聚体的二聚体。

拟南芥属(Arabidopsis)具有七个编码预测线粒体、质体或细胞质定位的酶的SHMT家族成员，其等在植物发育期间展现器官特异性表达模式(McClung等人，2000；Moreno等人，2004)。SHMT1在叶、茎和花中高度表达，且在根中是不可检测的，与其作为光呼吸线粒体家族成员的作用一致(Moreno等人，2004)。在线粒体中，甘氨酸经甘氨酸脱羧酶复合物(GDC)脱羧以形成MTHF。SHMT1然后将一碳单元从MTHF转移到甘氨酸用于产生丝氨酸，其经再循环进入叶绿体卡尔文(Calvin)循环。SHMT1中潜伏无效等位基因的拟南芥属植物矮小且萎黄，并且在产生后代之前死亡。另外，展现降低的SHMT1活性的拟南芥属EMS突变体不能提供有效的防御反应来限制活体营养型和死体营养型叶面病原体的侵袭，这突显了光呼吸途径在植物抵抗病原体中的重要性。然而，植物胞质SHMT和一碳通量在细胞质中的作用尚不十分清楚。也未得知一个区室中的一碳通量如何变化可影响其它区室中的一碳通量。在植物的质体和线粒体中核苷酸合成的区室化表明，细胞质中的一碳通量可偏重于高半胱氨酸重新甲基化为蛋氨酸以及在主动产生甲基化化合物(诸如木质素和生物碱)的细胞类型中高度活跃(Christensen和MacKenzie，2006)。

在建立后数天，在携带Rhg基因的植物中诱生的取食细胞因已被描述为过敏反应(HR)(植物中局部程序性细胞死亡(PCD)的一种形式)的事件而开始退化，从而抵御入侵的病原体。该机制可能归因于所述植物激活HR样PCD以杀死喂养细胞，致使线虫饥饿并死亡或者线虫死亡发生在HR样PCD激活之前。响应于SCN的取食部位局部坏死是抗性大豆栽培品种间的共同主题，但坏死的时机及合胞体退化视抗性来源而变化(Acedo等人，1984)。大量组织学研究已证明，大豆中与合胞体退化相关的细胞变化包括次生细胞壁物质的沉积和脂质样小球的形成(Endo,1965；Riggs等人，1973；Acedo等人，1984)。在抗性大豆与易感大豆中合胞体转录图谱的比较分析已确认，增加的防御相关基因表达与凋亡细胞死亡以及在抗性植物中形成的合胞体中的植物过敏反应相关(Kandoth等人，2011)。

Essex SHMT以及Forrest SHMT的生物化学分析可用来更具体地判定所观察氨基酸差异可如何改变GmSHMT功能来促成针对SCN的抗性。本文证据表明，改变叶酸代谢或许是大豆对SCN的抗性的促成因素，这提供了对该农艺学重要的病害系统的分子基础的新见解。

活性生物体抑制

叶酸(维生素B)对于线虫的健康至关重要。如果SHMT的表达或其调控正在影响植物组织中的叶酸途径，则它可能会影响线虫对该植物组织取食。假设线虫可从大豆植物本身获取叶酸或其前体或衍生物。进一步假设SHMT基因或基因产物可干扰线虫的叶酸途径。

在人类中，SHMT中的突变已被与众多种疾病状态相联系，包括成人淋巴细胞性白血病(Skibola等人，2002)、心血管疾病(Lim等人，2005)和神经管缺陷(Heil等人，2001)。考虑SHMT在为多个叶酸途径供应一碳单元中的重要性不足为怪。因SHMT蛋白表达、稳定性或活性发生改变所致的一碳单元的利用率降低可以模仿叶酸缺乏。叶酸对于维持DNA完整性和稳定性是必不可少的，细胞缺乏此种重要的B族维生素会导致DNA前体失衡以及DNA的合成与修复发生改变。因此，已显示叶酸缺乏介导多种恶性肿瘤(Kim,2003年)。在叶酸足够的情况下，胸苷酸合成酶利用MTHF作为甲基供体将dUMP(单磷酸脱氧尿苷酸)转化为嘧啶核苷酸dTMP(单磷酸脱氧胸苷酸)。然而，如果在叶酸缺乏的情况下MTHF是有限的，则该反应被阻断，升高的dUMP水平导致尿嘧啶错误参入到DNA中，导致链断裂以及染色体畸变。已显示此类细胞变化诱导哺乳动物中的细胞凋亡(Novakovic等人，2006)。叶酸缺乏也会改变正常DNA甲基化。低MTHF水平导致高半胱氨酸转化为蛋氨酸所需的5-甲基THF的利用率降低。蛋氨酸的减少消耗S-腺苷甲硫氨酸汇集物，此致使DNA以及其它细胞化合物的低甲基化，从而导致不适当的基因表达以及其它细胞异常。

SHMT和一碳叶酸代谢在植物中的作用远没有在酵母和哺乳动物中特征明显，尽管如此，在这些生物体之间显著差异已得到认可(综述于Christensen和MacKenzie，2006中)。在酵母和哺乳动物中，一碳叶酸代谢是在线粒体区室和细胞质区室之间分开进行。相比之下，在植物中一碳叶酸代谢是在细胞质区室、质体区室和线粒体区室之间分开进行。与此区室化一致，已鉴定出一碳叶酸酶(包括SHMT)的细胞质、线粒体和质体同种型。这些观察结果表明，这些酶的代谢作用以及这些生物体间的一碳通量有可能存在差异。

经本文鉴定并证明在大豆对SCN的抗性中发挥作用的GmSHMT被预测为胞质酶。发育中合胞体的LCM-微阵列分析(Ithal等人，2007)和本文所述启动子-GUS分析指示在易感SCN的大豆栽培品种中形成的取食细胞中GmSHMT上调。孢囊线虫诱生的取食细胞经历基因表达的急剧变化，细胞器增殖，且它们成为代谢非常活跃的营养物汇点。作为在不存在有丝分裂情况下反复多轮DNA合成(即，核内复制)的结果，合胞体含有多个大的变形虫样细胞核，并且已证明，阻断DNA合成对合胞体的建立和发育产生不利影响(de Almeida Engler等人，2011)。合胞体的转录和的代谢概况研究证明氨基酸、DNA和次生细胞壁生物合成的速率增加(Ithal等人，2007；Hofmann等人，2010)。因此，可预测合胞体的发育和维持高度需要叶酸一碳代谢。

计算分析预测，Forrest SHMT中的突变可能对其活性产生不利影响，这可能最终导致叶酸缺乏，特别是在对一碳代谢有较高需要的细胞类型中。线虫的营养需求也可能影响在发育中合胞体中的叶酸代谢。尽管对植物寄生线虫的营养需求没有明确定义，但假定同其它动物一样，它们从其饮食中获取叶酸。已显示叶酸缺乏诱导哺乳动物细胞中的细胞凋亡(Novakovic等人，2006)，可能最终导致HR样PCD或线虫饥饿。然而，在含有功能Essex GmSHMT的遗传背景中通过转化对应于Forrest GmSHMT抗性等位基因的全长基因组克隆能够恢复抗性也证明了其中触发抗性必须发生宿主-病原体识别事件的模型。

本文所述利用分子生物学方案的组合物和方法可根据各种此项技术已知的标准技术(参见，例如，Sambrook和Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology，第5版，CurrentProtocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook和Russel(2001)MolecularCloning:ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.和Wolk,C.P.1988.Methods inEnzymology 167,747-754；Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207–234；Gellissen编辑，(2005)Production of Recombinant Proteins:Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。

本文所述定义及方法被提供来更好地定义本公开并且在本公开的实践中指导本领域技术人员。除非另外说明，否则术语应按照相关技术领域的一般技术人员的常规用法来理解。

在一些实施方案中，用来描述并要求本公开某些实施方案的表达成分的量、性质(诸如分子量)、反应条件等的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”所修饰。在一些实施方案中，术语“约”用来指示数值包括为确定该值所采用的装置或方法的平均值的标准偏差。在一些实施方案中，所撰写说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是近似值，其可端视力图通过具体实施方案获得的所需性质而变化。在一些实施方案中，各数值参数应按照所报道的有效数字的数值并采用一般的舍入技术来解释。尽管本公开的一些实施方案的宽范围所列出的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中所列出的数值被尽可能精确地报道。在本公开一些实施方案中所展示的数值可能含有由在其各自的测试测量中发现的标准偏差所必然产生的某些误差。本文中数值范围的引用仅意在充当个别地提及落在该范围内的每一单独值的便捷方法。除非本文另外说明，否则将每个单独的数值并入说明书中，如同其在本文中单独列举一般。

在一些实施方案中，除非另外说明，否则在描述具体实施方案的背景下(尤其在下文某些权利要求中的背景下)使用的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”及“该/所述(the)”和类似所指物可被理解为包括单数和复数。在一些实施方案中，除非明确指出仅是指替代方案或替代方案是互斥的，否则如本文中(包括权利要求书)所使用的术语“或”用于意指“和/或”。

术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式系动词。这些动词中一者或多者的任何形式或时态(诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”)也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅拥有该一个或更多个步骤且也可涵盖其它未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物或装置不限于仅拥有该一个或多个特征且可涵盖其它未列出的特征。

除非本文另外指出或者上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行。除非声明，否则任何和所有实例的使用或针对本文某些实施方案所提供的示例性语言(例如，“诸如”)仅旨在更好地阐明本发明且并非对本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应理解为指出任何未要求保护的实施本公开的必需要素。

本文所公开的本公开的替代要素或实施方案的分组不应理解为限制。每一组成员可单独地或与该组中其它成员或本文中存在的其它要素进行任何组合来提及和要求保护。出于方便性或专利性的原因，组中一个或多个成员可包括在组中或从组中删除。当进行任一此纳入或删除时，认为说明书含有所修改的组，由此实现随附权利要求中所用所有马库什组的书面说明。

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请以及其它参考文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文中，该引用的程度如同将每一单独的出版物、专利、专利申请或其它参考文献出于所有目特定地且单独地指出通过引用以其整体并入一般。本文对参考文献的引用不应被理解为承认这些是本公开的现有技术。

已详细描述了本公开，将显而易见的是，在不背离所附权利要求书中所定义的本公开范围的情况下，修改、变化和等效实施方案是可能的。此外，应理解，本公开中的所有实施例被提供作为非限制性实施例。

实施例

提供以下非限制性实施例来进一步说明本公开。本领域技术人员应理解，下文实施例中公开的技术表示由本发明人发现在本公开实践中发挥良好作用的技术，且因此可视为构成本发明实践模式的实施例。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应理解，可在不背离本公开的精神和范围的情况下在公开的具体实施方案中进行诸多改变，并且仍获得类似或相似的结果。

实施例1：植物引种(PI)在RHG4和RHG1基因座处的单倍型分析

对总计81个大豆品系(植物引种、地方品种和优良栽培品种)的SCN表型以及在rhg1和Rhg4基因座处的基因分型SNP进行评分。如果FI≤10％，则品系被分类为对SCN具有抗性(R)，且如果FI≥10％，则品系被分类为对SCN具有易感性(S)。大豆品系在Rhg4基因座处进行基因分型时使用DNA标记Sat_162、SHMT和SUB1，且在rhg1基因座处时使用DNA标记560、570和Satt309(参见例如，表1)。

表1：植物引种(PI)在Rhg4和rhg1基因座处的单倍型分析。

表1(续)：植物引种(PI)在Rhg4和rhg1基因座处的单倍型分析。

实施例2：引物

下面列出关于本文所述引物的参考文献。I.用于初步筛选Rhg4重组体的引物；II.用于Rhg4重组体的高分辨率遗传作图和植物引种(PI)的单倍型分析的引物；III.用于TILLING、SHMT克隆和测序的引物以及IV.用于启动子克隆、互补、RNAi、VIGS和qPCR的引物

表2：引物。

实施例3：线虫和植物材料

所用SCN(大豆异皮线虫)自交系群体PA3(Hg型0)是在密苏里大学根据标准程序对大豆栽培品种Williams 82进行质量选择而得到的(Niblack等人1993)。大豆栽培品种Forrest(Hartwig和Epps,1973)对SCN PA3具有抗性。大豆栽培品种Essex(Smith和Camper,1973)和Williams 82(Bernard和Cremeens,1988)对SCN PA3具有易感性。使用Forrest研发2,000个品系的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的M2群体用于TILLING。两个F2:6 RIL品系ExF67(rhg1_Frhg1_FRhg4_FRhg4_F)和ExF63(rhg1_Frhg1_FRhg4_ERhg4_E)分别对PA3具有抗性和易感性。这两个RIL品系在分配给Rhg4区域的大多数标记方面不同且出现几乎相反的重组事件。用于本研究植物引种的集合是从Randal Nelson博士(美国农业部大豆种质馆长，UI,Urbana,IL)获得。

实施例4：RHG4基因的基于图谱的定位克隆

使用针对对SCN PA3(Hg型0)的抗性分离的三个遗传群体进行作图。这些群体包括来自Forrest与Essex之间杂交的F2:6重组自交品系(RIL)群体(98名个体；Meksem等人，2001)和由Forrest与Essex(1,755个品系)或Williams 82(2,060个品系)之间杂交产生的两个大的F2群体，以利用重组体来富集携带Rhg4基因的染色体区间。按照Brown等人(2010)进行SCN表型分型。

由于Forrest对SCN的抗性需要rhg1和Rhg4两者(Meksem等人，2001)，故在两个基因座侧翼使用DNA标记进行基因分型来检测在Rhg4基因座处的信息重组(参见例如，表2)。使用SSR标记Satt632、Sat_162和GMES6186(网站soybase.org和Hwang等人，2009)来鉴定在Rhg4基因座处的染色体断点。使用来自所述三个遗传群体中的每一个的个体的DNA进行PCR扩增。循环参数如下：94℃30秒、50℃30秒和72℃30秒的35个循环，其中在72℃下延长7分钟。在3％-4％metaphor琼脂糖凝胶上分离PCR产物。使用SSR标记Sat_210和Satt309(网站soybase.org)和SIUC-SAT143对鉴定的重组体进行二次筛选以鉴定每一重组体的rhg1基因型。

为了富集携带具有DNA标记的Rhg4基因座的染色体区，使用Genbank公布的序列AX196297和AX197417将PCR引物设计为300Kbp中每5Kbp到10Kbp携带Rhg4基因座(参见例如，表2)。使用改良的EcoTILLING方案利用每一引物测试来自Forrest和Essex的DNA以发现在Rhg4基因座处的多态性序列并作图(Meksem等人，2008；Liu等人，2011)。将鉴定的SNP和InDel DNA标记整合到信息重组体中以鉴定染色体断点和携带Rhg4基因的区间。

使用最靠近Rhg4基因座潜伏的DNA标记来筛选Forrest BAC文库(Meksem等人，2001，Liu等人，2011)。鉴定出BAC克隆100B10、与所研发的遗传图谱整合并对其进行部分地测序。

实施例5：GMSHMT基因组序列和cDNA序列的分离

对5.103kb Forrest SHMT基因组DNA片段(Genbank登录号JQ714083)进行克隆和测序，所述DNA片段横跨ATG起始位点的2.339kb序列5’、从起始到终止包括3个外显子和2个内显子的2.189kb序列和终止密码子的0.675kb序列3’。由于100B10BAC克隆仅含有包括ATG起始位点的2.339kb序列5’和ATG起始位点的1.315bp下游的部分SHMT基因序列(参见例如，图1)，故对全长基因组序列的基于PCR的克隆方法使用距ATG起始处在108位处的内部Sac I位点。首先，使用设计有Asc I位点的正向引物和横跨内部Sac I位点的反向引物对包括ATG起始位点的2.339kb序列5’和108bp外显子1的2.447kb片段进行PCR扩增。将所述片段消化并使用Asc I和Sac I克隆到CGT35S载体中(Wang等人，2010)。还将Sbf I位点引入到正向引物中Asc I的内部以用于对随后的亚克隆进行互补分析(参见例如，表2)。通过PCR用横跨内部Sac I位点的正向引物和设计有Kpn I位点的反向引物从Forrest基因组DNA对SHMT gDNA片段的其余部分(包括独特内部Sac I位点)进行扩增。将该片段消化并克隆到上文CGT35S克隆中5’片段下游的Sac I和Kpn I位点中。出于对随后亚克隆进行互补分析的目的，反向引物在Kpn I内部设计有Sbf I位点(参见例如，表2)。利用内部Sac I限制位点将所述片段连接在一起以产生5.103kb SHMT基因组DNA片段且对其进行测序。使用针对Forrest基因组DNA序列而设计的引物来克隆Essex SHMT基因组DNA序列。使用基于Forrest和Essex基因组DNA序列而设计的PCR引物来扩增对应cDNA序列。使用DNeasy植物小量制备试剂盒(Qiagen Science,USA)从嫩叶中分离出基因组DNA。使用RNeasy植物小量制备试剂盒(Qiagen)从根中分离出总RNA且使用cDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。

实施例6：GMSHMT的突变筛选

将来自抗SCN栽培品种Forrest的含有1,920个M2家族的EMS诱变的M2群体(Cooper等人，2008，Meksem等人，2008)用于筛选GmSHMT基因序列内的突变。将基因划分为3个区间(参见例如，图2)且如先前所述进行TILLING(Meksem等人，2008)。对每一突变体的GmSHMT基因进行测序以表征鉴定的等位基因以及其随后在预测蛋白质序列内的氨基酸改变。

实施例7：GMSHMTTILLING突变体的表型及接合性分析

种植突变体种子且按照Brown等人(2010)对其SCN雌性指数对其进行评分。在错配分析之前不对反应管添加Forrest的参考野生型DNA的情况下对来自每一植物的DNA进行TILLING分析以检测鉴定的突变体的接合性水平。

实施例6：植物引种的单倍型分析

对代表大豆中的90％遗传变异性的总共81个大豆品系(植物引种、地方品种和优良栽培品种)的SCN雌性指数进行评分。如果FI≤10％，则品系被分类为对SCN具有抗性(R)，且如果FI≥10％，则品系被分类为对SCN具有易感性(S)。在Rhg4基因座处使用DNA标记Sat_162、SHMT和SUB1且在rhg1基因座处使用DNA标记560、570和Satt309对大豆品系进行基因分型。对28个品系的GmSHMT的编码区进行测序。鉴定出常见SNP和Indel并用来判定不同的GmSHMT单倍型。

实施例7：病毒诱导的基因沉默(VIGS)

在该实施例中使用菜豆莢斑點病毒(BPMV)VIGS载体、pBPMVIA-R1M和pBPMV-IA-D35(Zhang等人，2010)。pBPMV-IA-D35是pBPMV-IA-R2的衍生物，其在编码运动蛋白的顺反子与外壳蛋白大亚基之间含有Bam HI和Kpn I限制位点。简单地说，通过RT-PCR由大豆(栽培品种Forrest)根cDNA扩增GmSHMT cDNA序列(Genbank登录号JQ714080)的328个碱基对(bp)片段(横跨bp 210到537)。使PCR产物设计有Bam HI和Kpn I且连接到经相同酶消化的pBPMV-IA-D35中以产生pBPMV-IA-SHMT。将包覆有对应于pBPMV-IA-R1M和pBPMV-IA-SHMT的质粒DNA的金粒子共轰击到大豆叶组织中，如Zhang等人(2010)中所描述。在接种后3至4周，收集感染BPMV的叶，冻干并贮存于-20℃下以用于未来实验。将感染的大豆叶组织与0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)一起用研钵和研杵研磨且用作VIGS测定的病毒接种物。

用pBPMV-IA-SHMT接种抗SCN RIL ExF67。对照植物仅用BPMV感染。每次处理由至少12株植物构成。按照Zhang等人(2010)使用碳化硅用病毒接种对9天大的植物的单叶的叶。使植物在设定为以下条件的生长室中生长：20℃-21℃、16小时光照/8小时黑暗以及100mE m^-2s^-1光强度。在病毒接种后的二十一天，用1500 SCN卵接种植物且在20℃下保持35天。通过倾析和筛分从个别植物的根系统中分离孢囊且在立体显微镜下计数。通过使用GraphPad软件进行未配对t-检验来绘制并分析结果的统计学显著性。为了估计根中的GmSHMT基因沉默，在病毒接种后的21天(线虫接种的时间)从接种有pBPMV-IA-SHMT或仅BPMV的两种代表性植物收获根组织且在-80℃下冷冻以用于RNA分离和qPCR分析。

实施例8：毛状根RNAI实验

通过RT-PCR由大豆(栽培品种Forrest)根cDNA扩增GmSHMTcDNA序列的338bp片段(横跨bp 205到542)，克隆到pDONR-zeo通路(gateway)克隆载体(Invitrogen)中，且随后转移到受Glyma15g04570.1线虫诱导型启动子控制的通路RNAi双元载体(Kandoth等人，2011)(pZF-RNAi载体)中以产生pZF-SHMTi。通过在足底具有GFP选择标记的pAKK载体(Wang等人，2010)中pZF启动子下游的FADR内显子侧翼引入通路克隆位点来构建pZF-RNAi载体。按照Kandoth等人(2011)从大豆子叶产生用pZF-SHMTi转化的转基因ExF67毛状根。用pZF-GUSi(含有GUS基因的一部分的pZF-RNAi载体)转化的ExF63和ExF67毛状根分别用作易感性和抗性对照。如先前所述在线虫接种之前将GFP阳性毛状根的根尖在含有抗生素的培养基上繁殖三次以清除土壤杆菌属(Agrobacterium)(Kandoth等人，2011)。简单地说，使毛状根(长度为3cm到4cm)在正方形Petri板中生长且根尖上方一厘米用大约400个无菌侵染性线虫二龄幼虫感染。将板在室温下在暗处孵育30天。30天后，在立体显微镜下对孢囊进行计数。每次处理用最少12个独立的毛状根品系独立地进行三次实验。通过使用GraphPad软件进行未配对t-检验来绘制并分析结果的统计学显著性。

实施例9：启动子-GUS分析

通过PCR分别由100B10 BAC克隆和Essex gDNA对对应于Forrest SHMT基因(Genbank登录号JQ714083)的ATG起始位点的序列5’的2.339kb片段和来自Essex SHMT基因(Genbank登录号JQ714084)的相同区进行扩增，且克隆到pYXT1载体(Xiao等人，2005)中以产生与β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的转录融合物。产生用这些构建体转化的大豆毛状根且用SCN感染。在接种后的两天和四天时，针对GUS活性对从感染区切除的根片进行染色(Jefferson等人，1987)。针对每种构建体对来自至少五个独立品系的多个根进行染色。用4％v/v多聚甲醛的磷酸盐-缓冲盐水将根片在室温下固定过夜，包埋于石蜡中，且纵向切片为10μm的厚度。使用微分干涉相差显微术在Vanox(Olympus)显微镜上观察切片且用CMOS彩色数码相机进行拍照。

实施例10：基因组互补实验

将5.103kb Forrest SHMT基因组DNA片段亚克隆到对转基因事件具有GFP选择的pAKK双元载体的Sbf 1限制位点中。如针对RNAi实验所述产生转基因毛状根且用SCN感染。将易感SCN的RILExF63用于互补实验。通过用仅携带SHMT启动子序列的pAKK双元载体转化ExF63和ExF67毛状根来产生对照毛状根。每次处理用最少15个独立毛状根品系独立地进行五次实验。通过使用GraphPad软件进行未配对t-检验来绘制并分析结果的统计学显著性。

实施例11：RNA分离和QPCR分析

根据制造商说明书使用RNeasy植物小量制备试剂盒(Qiagen)从根组织中分离出总RNA。如Kandoth等人(2011)中所述进行实时qRT-PCR。

实施例12：计算方法

执行计算方法以在结构上和功能上注释鉴定的GmSHMT蛋白且估计突变对GmSHMT功能的影响。我们的方法由两个阶段构成。首先，使用Essex序列作为标靶来获得GmSHMT的同源性模型。其次，使用与SHMT同源物配体结合的结构信息将功能位点作图到GmSHMT的表面上。GmSHMT的同源性分析已确定了来自一组多样细菌和哺乳动物种属的43个经结构解析的SMHT同源物；未发现经结构解析的植物SHMT。在具有最高序列相似性的四种同源物组当中，选择具有GmSHMT序列的最大覆盖率(序列同一性57％，模板覆盖率100％)的鼠SHMT(PDB ID 1EJI)作为用于GmSHMT的同源性建模的模板。使用MODELLER-9(Sali和Blundell，1993)完成同源性建模且使用建立MODELLER评分功能从该组候选模型中选择排名首位的模型。为了确定PLP-丝氨酸、PLP-甘氨酸和THF/MTHF)/FTHF的配体结合位点，将所获得的GmSHMT模型与已知与小配体相互作用的同源SHMT中的每一个进行结构上比对，且通过结构比对将来自每一同源物的配体结合位点作图到GmSHMT模型的表面上。在文献中鉴定在SHMT同源物中构成甘氨酸结合位点GBS1和GBS2的残基且然后使用GmSHMT与其同源物的结构比对以相似方式将它们作图到GmSHMT的结构上。

实施例13：来自抗SCN大豆栽培品种FORREST的RHG4基因的定位克隆

使用针对对SCN的抗性分离的三个遗传群体进行作图。这些群体包括来自Forrest与易感SCN的栽培品种Essex之间的杂交的F6重组自交品系(RIL)群体(98名个体；Meksem等人，2001)和由Forrest与Essex(1,755个品系)或易感SCN的栽培品种Williams 82(2,060个品系)之间的杂交产生的两个大的F2群体，以利用重组体来富集携带Rhg4基因的染色体区间。

除非另有说明，否则各方法是按照实施例1-12。

由于Forrest对SCN的抗性需要rhg1和Rhg4两者(Meksem等人，2001)，故在两个基因座侧翼使用DNA标记进行基因分型来检测在Rhg4基因座处的信息重组(参见例如，表2)。使用来自经鉴定在Rhg4基因座处有染色体断点的总共355个重组品系的两个重组体(ExF74和FxW5093)来界定携带Rhg4基因的区间。两个品系均在rhg1基因座处携带抗性等位基因且是8kb区间携带Rhg4抗性等位基因的双重组体(参见例如，图1)。在8kb区间中鉴定出两个基因，一个编码丝氨酸羟甲基转移酶(GmSHMT)且另一个编码枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(GmSUB)。来自Forrest和Essex的GmSHMT的基因组DNA序列之间的比较显示了抗性等位基因与易感性等位基因之间的5个核苷酸差异(3个SNP和2个In/Del)；然而，在Forrest与Essex GmSHMTcDNA之间发现的核苷酸差异中仅两个导致预测蛋白质序列的氨基酸改变(R130P和Y358N)(参见例如，图1D)。Williams 82中在这两个位置处的氨基酸序列与在Essex中一致(参见例如，图1D)。

实施例14：GMSHMT表征

在GmSHMT的预测起始位点的2,339bp序列5’中鉴定出Forrest与Essex之间的三个核苷酸差异(参见例如，图7)。基于这些发现，进一步针对在SCN抗性中的作用来表征GmSHMT。

除非另有说明，否则各方法是按照实施例1-12。

使用对GmSHMT特异的引物(参见例如，表2)来筛选来自抗SCN栽培品种Forrest的1920个甲磺酸乙酯(EMS)诱变的M2品系的群体。使用TILLING(靶向诱导的基因组局部损伤)方法，在染色体8上鉴定出导致在E61K和M125I处的错义突变的GmSHMT基因中的两个突变。对两个突变进行SIFT预测。SIFT基于序列同源性和氨基酸的物理性质预测氨基酸取代是否影响蛋白质功能(Kumar等人，2009)。其中IC<3.25的SIFT预测被认为是可信的。其中SIFT评分<0.05的改变被预测为对蛋白质有损害。由于经鉴定的两个错义突变具有IC值<3.25(参见例如，图2)，故可认为SIFT预测是可信的。在两个TILLING突变体中，M125I突变(SIFT评分＝0.02)被预测为对蛋白质有害。在线虫感染测定中两个突变体对SCN更具易感性(参见例如，图2)。另外，在分离的M3突变体种子中，F6756(M125I)突变与个体植物的SCN抗性表型相关。

这些数据表明Rhg4基因座处的GmSHMT在对SCN的抗性中起作用。

实施例15：GMSHMT单倍型的鉴定

通过对代表大豆中90％遗传变异性的81个大豆品系(包括植物引种、地方品种和优良栽培品种)的SCN雌性指数进行评分并判定其基于SNP的GmSHMT单倍型在GmSHMT等位基因与大豆对SCN的抗性之间建立联系。

除非另有说明，否则各方法是按照实施例1-12。

对来自28个所选植物引种(包括所有已知SCN报道品系)的GmSHMT基因进行完全测序。在编码区中鉴定出13种多态性且在非编码DNA序列中鉴定出6种多态性。在十三种编码多态性中，有两种产生氨基酸改变。R130P和Y358N取代负责SCN表型，除非SCN抗性来源于植物引种PI88788时。鉴定出八种不同的GmSHMT单倍型(参见例如，图3)。

具有单倍型H1-H3的大豆品系在GmSHMT和rhg1处携带抗性等位基因，且对SCN具有抗性。这些大豆品系包括大豆品系PI548402(Peking)、Forrest、PI90763、PI437654和PI89772，全部先前经报道展现所谓的“Peking型抗性”，其需要rhg1和Rhg4两者(Meksem等人，2001)。具有单倍型H4-H5的大豆品系在GmSHMT处携带易感性等位基因，但在rhg1基因座处的抗性或易感性等位基因不同，那些品系不管rhg1等位基因如何均对SCN具易感性，且包括大豆栽培品种Essex和Williams 82，二者均因其对SCN的易感性而被熟知。H6-H8在GmSHMT处携带易感性等位基因，但在rhg1基因座处的抗性或易感性等位基因不同，携带rhg1易感性等位基因的那些对SCN具有易感性且携带rhg1抗性等位基因的那些对SCN具有抗性。这些品系包括PI88788、PI209332和PI548316(栽培品种Cloud)，全部先前经报道展现所谓的“PI88788型抗性”，已显示其对SCN的抗性需要rhg1而非Rhg4(Concibidio等人，2004)。

总之，GmSHMT单倍型分析与先前抗SCN QTL报道(参见例如，Concibido等人的综述，2004)一致且证实Peking型对SCN的抗性需要Rhg4。

实施例16：通过VIGS、RNAI和互补来验证GMSHMT

使用VIGS(病毒诱导的基因沉默)和靶向RNAi(RNA干扰)的敲除研究进一步提供了GmSHMT基因赋予对大豆异皮线虫的抗性的证据。

除非另有说明，否则各方法是按照实施例1-12。

已显示，菜豆莢斑點病毒(BPMV，豇豆花叶病毒属(Comovirus))是大豆的有效VIGS载体(Meyer等人，2009；Pandey等人，2011)。此外，BPMV具有由RNA-1和RNA-2构成的双边阳性链RNA基因组。使用基于DNA的系统来放置受花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaic Virus)(CaMV 35S)启动子控制的BPMV基因组RNA1和RNA2的cDNA(Zhang等人，2009)以将328-bp GmSHMT克隆到RNA2中且通过生物弹道法(biolistic)递送到大豆叶组织中来产生感染组织。

对接种有BPMV-SHMT或仅BPMV的大豆植物进行线虫感染测定。使用在分配给Rhg4区域的大多数标记方面不同且出现几乎相反的重组事件的两个RIL品系。RIL品系、ExF67(rhg1_Frhg1_FRhg4_FRhg4_F)和ExF63(rhg1_Frhg1_FRhg4_ERhg4_E)分别是抗SCN和易感SCN的(Liu等人，2011)。

结果显示，与仅接种有BPMV的ExF67相比，抗SCN RIL ExF67中的GmSHMT基因沉默导致对SCN易感性增加29％(参见例如，图4A；P<0.0001)。在植物经线虫接种时，通过qRT-PCR判定：与仅接种有BPMV的那些根相比，接种有BPMV-SHMT的植物的根中的GmSHMT表达平均减少74％(参见例如，图4B)。

鉴于相对于使用VIGS的线虫的局部转录减少、瞬时性质和不能空间上控制根中的GmSHMT的沉默，采用互补靶向RNAi基因沉默方法来测试GmSHMT在对SCN的抗性中的作用。在大豆毛状根中，对应于GmSHMT的338-bp dsRNA是在SCN诱导型锌指转录因子启动子控制下表达(Kandoth等人，2011)。

结果显示，在用pZF-SHMTi转化的抗SCN RIL ExF67的毛状根上的线虫繁殖大于在用pZF-GUSi对照转化的ExF67毛状根上的线虫繁殖(参见例如，图4C；P<0.01)。在用pZF-SHMTi转化的ExF67毛状根与用pZF-GUSi转化的ExF63毛状根之间未观察到线虫繁殖的统计上显著差异(参见例如，图4C)。

这些数据进一步证实了GmSHMT在赋予SCN抗性中的作用。

将来自Forrest和Essex的GmSHMT的2.3-kb潜在启动子序列与β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因融合以判定GmSHMT基因是否在由SCN诱导的合胞体取食细胞中表达且判定易感性品种与抗性品种之间的抗性的差异是否与Rhg4的表达水平有关(Jefferson，1987)。

来自用pSHMT-GUS构建体转化的大豆毛状根的线虫感染测定的结果证实GmSHMT在合胞体中表达(参见例如，图4D-4F)。在用EssexpSHMT-GUS构建体转化的ExF63的感染线虫的大豆毛状根中也观察到相同的GUS表达模式(参见例如，图7B)。在抗性品系与易感性品系之间未检测到可见差异，这与在GmSHMT的潜在2.3-kb启动子区中Forrest与Essex之间仅有三种多态性一致(参见例如，图7A)。

为了证实GmSHMT是Rhg4，用包括具有起始密码子上游的2.3-kb序列和终止密码子下游的0.57-kb的Forrest SHMT基因的5.1-kb基因组片段(gSHMT)对易感SCN的RIL ExF63进行转化。

使用大豆异皮线虫的线虫感染测定的结果展示在互补的转化毛状根中的抗性恢复(参见例如，图4G；P<0.0001)，从而证实GmSHMT是Rhg4基因。

实施例16：GMSHMT的建模结构

使用同源性建模，预测GmSHMT的结构以检验变体基因型(来自抗性和易感性栽培品种以及TILLING突变体)可如何影响其结构和功能性质。

除非另有说明，否则各方法是按照实施例1-12。

分析可获得的关于SHMT同源物与小配体结合的结构信息且将配体结合位点作图到GmSHMT模型的表面上。因此，确定了五个潜在结合位点，包括两个甘氨酸(GS₁和GS₂)、一个PLP-丝氨酸(PLS)、一个PLP-甘氨酸(PLG)和一个THF/MTHF/5-甲酰基THF(FTHF)结合位点(参见例如，图5)，其中后三个结合位点在物理上共定位于由SHMT二聚体分子形成的结合袋中。将Forrest和TILLING突变作图到GmSHMT的结构模型上时，发现Forrest突变和TILLING突变F6266E61K两者均与试验配体结合位点紧邻。具体来说，发现Forrest突变P130R和N358Y与THF/MTHF/FTHF结合位点共定位且与PLS、PLG和两个甘氨酸结合位点中的一个紧邻。F6266E61K突变的位置与PLS和THF/MTHF/FTHF结合位点重叠。这些发现表明，三个突变可直接影响L-丝氨酸和THF到甘氨酸和MTHF的可逆互变。另一方面，在内部β片层中发现TILLING突变F6756 M125I(参见例如，图5)，表明该突变体中可能存在使GmSHMT的功能改变的不同机制，或许因受TILLING突变影响的区域的结构不稳定性所致。该假设与使用SIFT软件的先前功能基因组分析一致(Kumar等人，2009)，表明F6756 M125I可能为有害突变。

GenBank登录号

Forrest全长基因组DNA，JQ714083；Essex全长基因组DNA，JQ714084；Forrest cDNA序列，JQ714080；Essex cDNA序列，JQ714079；Forrest TILLING突变体F6266序列，JQ714081；ForrestTILLING突变体F6756序列，JQ714082。

序列

参考文献

S.R.Koenning，J.A.Wrather，Suppression of soybean yield potential inthe continental United States from plant diseases estimated from 2006 to 2009.Plant Health Prog.http://dx.doi.org/10.1094/PHP-2010-1122-01-RS(2010).

B.E.Caldwell，C.A.Brim，J.P.Ross，Inheritance of resistance of soybeansto the cyst nematode，Heterodera glycines.Agron J.52，635-636(1960).

A.L.Matson，L.F.Williams，Evidence of a fourth gene for resistance to thesoybean cyst nematode.Crop Sci.5，477(1965).

V.C.Concibido，B.W.Diers，P.R.Arelli，A decade of QTL mapping for cystnematode resistance in soybean.Crop Sci.44，1121(2004).

K.Meksem等人，Forrest′resistance to the soybean cyst nematode isbigenic：saturation mapping of the Rhg1and Rhg4 loci.Theor.Appl.Genet.103，710-717(2001).

B.Y.Endo，Histological responses of resistant and susceptible soybeanvarieties，and backcross progeny to entry development of Heterodera glycines.Phytopathology 55，375-381(1965).

R.D.Riggs，K.S.Kim，I.Gipson，Ultrastructural changes in Pekingsoybeans infected with Heterodera glycines.Phytopathology 63，76-84(1973).

K.Dong，C.H.Opperman，Genetic analysis of parasitism in soybean cystnematode Heterodera glycines.Genetics 146(4)，1311-1318(1997).

T.L.Niblack，A.L.Colgrove，K.Colgrove，J.P.Bond，Shift in virulence ofsoybean cyst nematode is associated with use of resistance from PI 88788.Online.Plant Health Progress doi：10.1094/PHP-2008-0118-01-RS.(2008).

S.Melito等人，A nematode demographics assay in transgenic rootsreveals no significant impacts of the Rhg1 locus LRR-Kinase on soybean cystnematode resistance.BMC Plant Biol.10，104(2010).

X.Liu等人，Soybean cyst nematode resistance in soybean isindependent of the Rhg4locus LRR-RLK gene.Func.Integr.Gen.11(4)，539-549(2011).

J.D.F.Meyer等人，Identification and analyses of candidate genes forRpp4-mediated resistance to Asian Soybean Rust in soybean.Plant Physiol.150，295-307(2009).

A.K.Pandey等人，Functional analysis of the Asian Soybean Rustresistance pathway mediated by Rpp2，Mol.Plant-Microbe Interact.24(2)，194-206(2011).

P.K.Kandoth等人，The soybean Rhg1 locus for resistance to thesoybean cyst nematode Heterodera glycines regulates expression of a largenumber of stress-and defense-related genes in degenerating feeding cells.PlantPhysiol.155：1960-1975(2011).

R.A.Jefferson，Assaying chimeric genes in plants：the GUS gene fusionsystem.Plant Mol.Biol.Rep.5，387-405(1987).

D.Cai等人，Positional cloning of a gene for nematode resistance insugar beet.Science 275，832-834(1997).

S.B.Milligan等人，The root knot nematode resistance gene Mi fromtomato is a member of the leucine zipper，nucleotide binding，leucine-rich repeatfamily of plant genes.Plant Cell 10，1307-1319(1998).

E.A.van der Vossen et al.，Homologues of a single resistance genecluster in potato confer resistance to distinct pathogens：a virus and a nematode.Plant J.23，567-576(2000).

K.Ernst等人，The broad-spectrum potato cyst nematode resistance gene(Hero)from tomato is the only member of a large gene family of NBS-LRR geneswith an unusual amino acid repeat in the LRR region.PlantJ.31，127-136(2002).

J.Paal等人，Molecular cloning of the potato Gro1-4 gene conferringresistance to pathotype Ro1 of the root nematode Globodera rostochiensis，based on a candidate gene approach.Plant J.38，285-297(2004).

S.B.Renwick，K.Snell，U.Baumann，The crystal structure of humancytosolic serine hydroxymethyltransferase：a target for cancer therapy.Structure6，1105(1998).

J.N.Scarsdale等人，Crystal structure at 2.4 A resolution of E.coli serinehydroxymethyltransferase in complex with glycine substrate and 5-formyltetrahydrofolate.J Mol.Biol.296，155-168(2000).

N.Sukanya等人，Serine hydroxymethyltransferase from mung bean(Vigna radiata)is not a pyridoxal-5′-phosphate-dependent enzyme.PlantPhysiol.95，351-357(1991).

P.Kumar，S.Henikoff，P.C.Ng，Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm.Nat Protoc.4，1073-81(2009).

Y.I.Kim，Role of folate in colon cancer development and progression.J.Nutr.133，3731S-3739S(2003).

E.F.Hartwig，J.M.Epps，Registration of′Forrest′soybeans.Crop Sci.13，287(1973).

T.J.Smith，H.M.Camper，Registration of Essex soybean.Crop Sci.13，495(1973).

R.L.Bernard，C.R.Cremeens，Registration of′Williams 82′soybean.CropSci.28，1072-1028(1988).

J.L.Cooper等人，TILLING to detect induced mutations in soybean.BMCPlant Biol.8，123-132(2008).

K.Meksem等人，TILLING：A reverse genetics and a functional genomicstool in soybean.In G.Kahl and K.Meksem，eds，The handbook of PlantFunctional Genomics：Concepts and Protocols.Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，Weinheim，pp 251-265(2008).

Sali，A.，T.L.Blundell，Comparative protein modeling by satisfaction ofspatial restraints.J Mol Bio/234(3)，779-815(1993).

C.Q.Zhang，J.D.Bradshaw，S.A.Whitham，J.H.Hill，The development ofan efficient multipurpose Bean pod mottle virus viral vector set for foreign geneexpression and RNA silencing.Plant Physiol.153，52-65(2010).

S.Brown等人，A high-throughput automated technique for countingfemales of Heterodera glycines using a fluorescence-based imaging system.J.Nematol.42(3)，201-201(2010).

J.Wang等人，Dual roles for the variable domain in protein trafficking andhost-specific recognition of Heterodera glycines CLE effector proteins.NewPhytol.187(4)，1003-1017(2010).

K.Meksem等人，Two large-inset soybean genomic libraries constructedin a binary vector：Applications in chromosome walking and genome widephysical mapping.Theor.Appl.Genet.101(5-6)，747-755(2000).

K.E.Christensen，R.E.MacKenzie，Mitochondrial one-carbon metabolismis adapted to the specific needs of yeast，plants，and mammals.BioEssays28(6)，595-605(2006).

C.R.McClung等人，Integrated temporal regulation of thephotorespiratory pathway.Circadian regulation of two Arabidopsis geneencoding serine hydroxymethyltransferase.Plant Physiol.123(1)，381-391.

J.I.Moreno，R.Martin，C.Castresana，Arabidopsis SHMT1，a serinehydroxymethyltransferase that functions in the photorespiratory pathwayinfluences resistance to biotic and abiotic.Plant J.41(3)，451-463.

N.Ithal等人，Developmental transcript profiling of cyst nematode feedingcells in soybean roots.Mol.Plant-Microbe Interact.20(5)，510-525.

J.Hofmann等人，Metabolic profiling reveal local and systemic responsesof host plants to nematode parasitism.Plant J.62(6)，1058-1071.

P.Novakovic，J.M.Stempak，K.-J.Sohn，Y.-I.Kim，Effects of folatedeficiency on gene expression in the apoptosis and cancer in colon cancer cells.Carcinogenesis 27(5)，916-924.

S.G.Heil，等人，Is mutated serine hydroxymethyltransferase(SHMT)involved in the etiology of neural tube defects.Mol.Genet.Metab.73(2)，164-172.

U.Lim，Polymorphisms in cytoplasmic serine hydroxymethyltransferaseand methylenetetrahydrofolate reductase affect the risk of cardiovasculardisease in men.J.Nut.135(8)，1989-1994.

C.F.Skibola等人，Polymorphisms in the thymidylate synthase and serinehydroxymethyltransferase genes and risk of adult acute lymphocytic leukemia.Blood 99(10)，3786-3791.

Y-L.Xiao，Analysis of the cDNAs of hypothetical genes on Arabidopsischromosome 2 reveals numerous transcript variants.Plant Physiol.139，1323-1337.

J.R.Acedo，V.H.Dropkin，V.D.Luedders，Nematode population attritionand histopathology of Heterodera glycines-soybean associations.J.Nematol.16，48-56(1984).

T.L.Niblack，R.D.Heinz，G.S.Smith，P.A.Donald.Distribution，density，and diversity of Heterodera glycines in Missouri.J.Nematol.25，880-886(1993).

Claims

1.一种对大豆孢囊线虫(SCN)具有抗性的转基因大豆，所述大豆植物用人工DNA构建体转化，所述人工DNA构建体包含以下在5'至3'转录方向上作为可操作地相关联的组分：

启动子，其在大豆中起作用；

多核苷酸，其包含选自由以下组成的组的序列

(a)SEQ ID NO:1或与其95％相同的序列，其中所述多核苷酸编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽，或其功能片段；

(b)编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的SEQ ID NO:2或与其95％相同的序列的多肽的核苷酸序列，或其功能片段；

(c)在严格条件下与SEQ ID NO:1的核酸序列杂交的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽，其中所述严格条件包括在65℃下在包含6X SSC(0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)的溶液中孵育，或其功能片段；以及

(d)与(a)、(b)或(c)的所述多核苷酸序列互补的多核苷酸，或其功能片段；以及

转录终止序列；

其中所述转基因大豆展现增加的SCN抗性。

2.根据权利要求1所述的转基因大豆，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1的序列。

3.根据权利要求1所述的转基因大豆，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:195％相同的序列，其中所述多核苷酸编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽。

4.根据权利要求1所述的转基因大豆，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO:2的多肽的序列。

5.根据权利要求1所述的转基因大豆，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:295％相同且具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的序列。

6.根据权利要求1所述的转基因大豆，其中SEQ ID NO:2的130位是脯氨酸或SEQ ID NO:2的358位是天冬酰胺。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的转基因大豆，其中所述启动子包括诱导型启动子或组织特异性启动子。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的转基因大豆，其中所述启动子包括线虫诱导型启动子。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的转基因大豆，其中所述启动子包括SEQ ID NO:4的序列或其功能片段。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的转基因大豆，其包括与非转化对照相比至少约90％、至少约94％、至少约98％、至少约100％、至少约105％或至少约110％的谷物产率。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的转基因大豆，其中增加的SCN抗性包括与非转化对照相比对SCN的易感性降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1000％。

12.一种具有大豆孢囊线虫(SCN)抗性的农艺学优良大豆品种的植物，其包含含有突变R130P和Y358N的GmSHMT等位基因。

13.根据权利要求12所述的植物，其通过包括以下步骤的方法来制备：

(a)将第一与第二大豆植物杂交，其中所述第一和第二植物共同地包含含有突变R130P和Y358N的GmSHMT等位基因，从而产生SCN抗性表型，且其中所述第一和第二植物共同地包含能够赋予所述植物的子代植物农艺学优良特性的种质；以及

(b)测定由所述杂交产生的子代大豆植物的农艺学优良特性和SCN抗性；以及

(c)选择包含所述SCN抗性表型和农艺学优良特性的至少第一子代植物以获得根据权利要求12所述的植物。

14.一种根据权利要求1-13中任一项所述的植物的植物部分。

15.一种人工DNA构建体，其包含以下在5'至3'转录方向上作为可操作地相关联的组分：

启动子，其在大豆中起作用；

多核苷酸，其包含选自由以下组成的组的序列

转录终止序列。

16.一种增加大豆的大豆孢囊线虫(SCN)的方法，其包括：

用人工DNA构建体来转化植物，所述人工DNA构建体包含以下在5'至3'转录方向上作为可操作地相关联的组分：

启动子，其在大豆中起作用；

多核苷酸，其包含选自由以下组成的组的序列

转录终止序列；

其中所述转基因大豆与不含DNA构建体的植物相比展现增加的SCN抗性。