CN115927380A

CN115927380A - 具有增强性状的转基因植物

Info

Publication number: CN115927380A
Application number: CN202211184347.7A
Authority: CN
Inventors: E·M·艾伦; B·达沃奥克斯; S·M·达夫; M·费尔南德斯; B·S·葛德曼; C·L·格里菲斯; B·卡鲁纳南达; S·V·库利亚克斯; P·J·罗伊达; L·L·路非亚; R·J·梅斯特; M·S·拉加尼; D·拉玛查德拉; E·A·莱斯; D·鲁齐卡; A·M·桑特; J·J·施姆克; R·L·汤普森; S·B·文卡塔查拉雅; T·V·文卡特希
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2016-03-18
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2023-04-07
Also published as: US11873502B2; US20220195452A1; CA3018098A1; CN109152344A; MX2018011302A; US20240093221A1; EP3429332A1; BR112018068868A2; MX2021014100A; US20200199612A1; WO2017161063A1; EP3429332A4

Abstract

本公开提供了重组DNA构建体和具有增强性状诸如提高的产量、提高的氮利用率、及提高的耐旱性或水分利用率的转基因植物。转基因植物可包括大田作物以及所述转基因植物的植物繁殖体和子代。还提供了制备和使用所述转基因植物的方法。本公开还提供了由所述转基因植物产生种子、使所述种子生长及选择具有增强性状的子代植物的方法。还公开了具有改变的表型的转基因植物，所述改变的表型适用于就所需增强的性状来筛选并选择转基因事件。

Description

具有增强性状的转基因植物

本申请是申请日为2017年3月16日、申请号为2017800305251、发明名称为“具有增强性状的转基因植物”的发明专利申请的分案申请。

序列表的并入

序列表文件名为“61673US0000_ST25.txt”，有323千字节(在MS-WINDOWS中测量)并且创建于2016年3月18日，其一并提交并以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本文公开了重组DNA构建体；具有改变的表型、增强的性状、提高的产量、提高的氮利用率和提高的水分利用率的植物；所述植物的繁殖体、子代和大田作物；以及制备和使用所述植物的方法。还公开了由所述植物产生种子，使所述种子生长和/或选择具有改变的表型、增强的性状、提高的产量、提高的氮利用率和提高的水分利用率的子代植物的方法。

发明内容

一方面，本公开提供了重组DNA构建体，其各自包含：与选自由SEQ ID NO:1-29组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多核苷酸序列；或编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:30-92组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。所述重组DNA构建体可包含启动子，如异源启动子，所述启动子在植物细胞中有功能并且与所述多核苷酸序列可操作地连接。进一步提供包含所述重组DNA构建体的载体、质粒、植物、繁殖体和植物细胞。

包含重组DNA构建体的植物可为大田作物植物，如玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、奎奴亚藜和甘蔗。包含重组DNA构建体的植物与对照植物相比可具有改变的表型或增强的性状。与对照植物相比的增强的性状可为例如从种植到成熟的天数减少、减小的茎杆尺寸、增加的叶片数、在营养体阶段中提高的植物高度生长速率、增大的穗尺寸、增加的每株植物的穗干重、增加的每穗的籽粒数、增加的每籽粒的重量、增加的每株植物的籽粒数、减小的穗空隙、延长的谷物饱满期、降低的植物高度、增加的根分支数、增加的总根长度、提高的产量、提高的氮利用率及提高的水分利用率。改变的表型可为例如植物高度、生物量、冠层面积、花青素含量、叶绿素含量、水用量、水含量和水分利用率。

根据另一方面，本公开提供了用于在植物中改变表型、增强性状、提高产量、提高氮利用率或提高水分利用率的方法，所述方法包括产生包含重组DNA构建体的转基因植物，其中所述重组DNA构建体包含：与选自由SEQ ID NO:1-29组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多核苷酸序列；或编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:30-92组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。产生转基因植物的步骤可进一步包括用重组DNA构建体转化植物细胞或组织，及由包含重组DNA构建体的植物细胞或组织再生或发育成转基因植物。转基因植物可与以下杂交：(a)自身；(b)来自相同植物株系的第二植物；(c)野生型植物；或(d)来自不同植物株系的第二植物，以产生一个或多个子代植物；并且植物可选自与对照植物相比具有提高的产量、提高的氮利用率或提高的水分利用率的子代植物。进一步提供了通过此方法产生的植物。根据一些实施方案，转基因植物可通过以下操作产生：使用包含重组DNA构建体的供体模板将重组DNA构建体定点整合到植物细胞或组织的基因组中，接着由所述转基因植物细胞或组织再生或发育成转基因植物。

根据另一方面，本公开提供了用作定点整合中的供体模板的重组DNA分子，其中重组DNA分子包含含有以下的插入序列：与选自由SEQ ID NO:1-29组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多核苷酸序列；或编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:30-92组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。重组DNA分子的插入序列可包含启动子，如异源启动子，所述启动子在植物细胞中有功能并且与所述多核苷酸序列可操作地连接。重组DNA分子可进一步包含至少一个侧接插入序列的同源臂。进一步提供了包含插入序列的植物、繁殖体和植物细胞。根据一些实施方案，重组DNA分子可进一步包含编码位点特异性核酸酶和/或一个或多个指导RNA的表达盒。

根据另一方面，本公开提供了用作定点整合中的供体模板的重组DNA分子，其中重组DNA分子包含用于调节内源基因表达的插入序列，其中所述内源基因包含：与选自由SEQID NO:1-29组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多核苷酸序列或其一部分；或编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:30-92组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。插入序列可包含启动子、增强子、内含子和/或终止子区，其可对应于内源基因的启动子、增强子、内含子或终止子区。进一步提供了包含插入序列的植物、繁殖体和植物细胞。根据一些实施方案，重组DNA分子可进一步包含编码位点特异性核酸酶和/或一个或多个指导RNA的表达盒。

根据另一方面，本公开提供了用于在植物中改变表型、增强性状、提高产量、提高氮利用率或提高水分利用率的方法，所述方法包括：(a)通过以下步骤修饰植物细胞的基因组：(i)鉴别对应于选自本文的表1和12中的基因列表的基因的植物的内源基因及其同源物，及(ii)经由定点整合修饰所述植物细胞中的内源基因序列以改变所述内源基因的表达水平；以及(b)由所述植物细胞再生或发育成植物。

具体实施方式

在所附序列表中：

SEQ ID NO 1至29为用于在植物中赋予增强性状的重组DNA构建体中的DNA的编码链的核苷酸序列，各自表示蛋白质的编码序列。

SEQ ID NO 30至58为分别以相同顺序具有SEQ ID NO 1至29的核苷酸序列的DNA分子的同源蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO 59至92为与具有SEQ ID NO 30至58的氨基酸序列的蛋白质同源的蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO 93至101为用于在植物中赋予增强的性状或改变的表型的重组DNA构建体中的DNA分子的核苷酸序列，其各自表示具有特异性表达模式的启动子。

除非另有说明，在本说明书正文中的核酸序列当从左到右读取时是以5’至3’方向给出。本领域技术人员将知晓，给定的DNA序列应理解为定义与DNA序列相同的相应RNA序列，例外之处在于用尿嘧啶(U)核苷酸置换DNA的胸腺嘧啶(T)核苷酸。因此，提供特定的DNA序列应理解为定义确切的RNA等同物。给定的第一多核苷酸序列(不管是DNA抑或RNA)进一步限定其确切互补物(其可为DNA或RNA)的序列，即，通过形成沃森-克里克碱基配对完全杂交至第一多核苷酸的第二多核苷酸。与靶基因或靶基因的一个片段“基本相同”或“基本互补”意味着多核苷酸链(或双链多核苷酸的至少一条链)经设计以杂交(一般在生理条件下，如活的植物或动物细胞中所见的那些生理条件)至靶基因或靶基因的一个片段或者靶基因或靶基因的所述片段的转录物；本领域技术人员应理解这种杂交不一定需要100％序列同一性或互补性。当第一核酸序列与第二核酸序列呈功能关系放置时，第一核酸序列与第二核酸序列“可操作地”相连或“连接”。例如，如果启动子提供DNA序列的转录或表达，那么启动子序列与DNA序列“可操作地连接”。一般说来，可操作连接的DNA序列是连续的。

如本文所用，术语“表达”是指通过可得到改变的表型或增强的性状的植物、植物细胞或植物组织实现的多核苷酸或蛋白质的产生。表达也可指的是来自基因的信息借此用于合成功能基因产物的过程，所述功能基因产物可包括但不限于可发挥例如酶促、结构或调控功能的其它多核苷酸或蛋白质。具有调控功能的基因产物包括但不限于影响靶蛋白的转录或翻译的发生或水平的元件。在一些情况下，表达产物为非编码功能性RNA。

表达的“调节”是指实现多核苷酸或蛋白质的过度表达或抑制的过程。

如本文所用，术语“抑制”是指在基因的任何发育或时间阶段下，与野生型或对照植物、细胞或组织中的表达相比在植物、植物细胞或植物组织中的靶多核苷酸或靶蛋白的表达水平下降。如在抑制背景下使用的术语“靶蛋白”是指受抑制的蛋白质；类似地，“靶mRNA”是指可受抑制或者一旦表达便降解以导致其所编码的靶蛋白的抑制的多核苷酸。如在抑制背景下使用的术语“靶基因”是指“靶蛋白”或“靶mRNA”。在替代的非限制性实施方案中，靶蛋白或靶多核苷酸的抑制可直接或间接地产生增强的性状或改变的表型。在一个示例性实施方案中，靶蛋白为可间接地增加或减少一种或多种其它蛋白质的表达的蛋白，其增加或减少的表达分别与增强的性状或改变的表型有关。在另一示例性实施方案中，靶蛋白可结合至一种或多种与改变的表型或增强的性状有关的其它蛋白质以增强或抑制其功能且由此间接地实现改变的表型或增强的性状。

可使用众多手段来施加抑制。非限制性实例包括：抑制内源基因或途径中的基因的子集；抑制导致蛋白质活性降低的一个或多个突变；抑制抑制剂的产生以升高、降低或消除酶活性所需的底物的水平；产生新的蛋白质、激活通常沉默的基因；或积聚通常在自然条件下不增加的产物。

相反地，如本文所用的术语“过度表达”是指在基因的任何发育或时间阶段下，与野生型植物、细胞或组织中的表达相比在植物、植物细胞或植物组织中的多核苷酸或蛋白质的表达水平的提高。过度表达可发生在通常缺乏与本发明多肽在功能上等效或相同的多肽的表达的植物细胞中。过度表达也可发生在其中通常存在本发明多肽或功能等效分子的内源性表达但这种正常表达处在较低水平下的植物中。过度表达因此造成多肽在植物、细胞或组织中的超过正常产生或“过量产生”。

如在过度表达的背景下使用的术语“靶蛋白”是指过度表达的蛋白质；“靶mRNA”是指编码并被翻译以产生靶蛋白并且也可过度表达的mRNA。如在过度表达的背景下使用的术语“靶基因”是指“靶蛋白”或“靶mRNA”。在替代实施方案中，靶蛋白可直接或间接地实现增强的性状或改变的表型。在后一情况下，可例如通过影响一种或多种其它蛋白质的表达、功能或其可利用的底物来实现此目的。在一个示例性实施方案中，靶蛋白可结合至一种或多种与改变的表型或增强的性状有关的其它蛋白质以增强或抑制其功能。

可使用众多手段实现过度表达。在一个实施方案中，过度表达可通过将编码一种或多种多核苷酸或多肽的DNA序列置于启动子控制下来实现，启动子的实例包括但不限于内源性启动子、异源性启动子、诱导型启动子、发育特异性启动子和组织特异性启动子。在一个示例性实施方案中，启动子为组成型启动子，例如，花椰菜花叶病毒35S启动子及本领域中已知的其它组成型启动子。因此，取决于所用的启动子，过度表达可发生在整个植物中、在植物的特定组织中、在植物的特定发育阶段中或在不同的诱导剂或可诱导剂(如激素或环境信号)存在或不存在下。

基因抑制元件：基因抑制元件可为任何合适长度的可转录DNA，且对于重组DNA构建体意图抑制的每个靶基因一般包括至少约19至约27个核苷酸(例如19、20、21、22、23或24个核苷酸)。在许多实施方案中，对于重组DNA构建体意图抑制的每个靶基因，基因抑制元件包括多于23个核苷酸(例如，多于约30、约50、约100、约200、约300、约500、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000或约5000个核苷酸)。

适用于本发明的重组DNA构建体中的合适的基因抑制元件包括选自由以下组成的组的至少一个元件(且在一些实施方案中，多个元件)：(a)包括至少一个反义DNA节段的DNA，所述反义DNA节段对至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义；(b)包括多个拷贝的至少一个反义DNA节段的DNA，所述反义DNA节段对至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义；(c)包括至少一个有义DNA节段的DNA，所述有义DNA节段是至少一个第一靶基因的至少一个节段；(d)包括多个拷贝的至少一个有义DNA节段的DNA，所述有义DNA节段是至少一个第一靶基因的至少一个节段；(e)转录成通过形成双链RNA抑制至少一个第一靶基因的RNA且包括至少一个反义DNA节段和至少一个有义DNA节段的DNA，所述反义DNA节段对至少一个靶基因的至少一个节段呈反义，而所述有义DNA节段是至少一个第一靶基因的至少一个节段；(f)转录成通过形成单个双链RNA抑制至少一个第一靶基因的RNA且包括多个连续的反义DNA节段和多个连续的有义DNA节段的DNA，所述反义DNA节段对至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义，而所述有义DNA节段是至少一个第一靶基因的至少一个节段；(g)转录成通过形成多个双链RNA抑制至少一个第一靶基因的RNA且包括多个反义DNA节段和多个有义DNA节段的DNA，所述反义DNA节段对至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义，而所述有义DNA节段是至少一个第一靶基因的至少一个节段，且其中所述多个反义DNA节段与所述多个有义DNA节段以一系列反向重复序列排列；(h)包括来源于miRNA、较佳植物miRNA的核苷酸的DNA；(i)包括siRNA的核苷酸的DNA；(j)转录成能够结合至配体的RNA适体的DNA；以及(k)转录成能够结合至配体的RNA适体的DNA，和转录成能够调控第一靶基因的表达的调控RNA的DNA，其中所述调控取决于调控RNA的构象，且所述调控RNA的构象在变构水平上受RNA适体的结合状态的影响。

这些基因抑制元件中的任一个(不管是转录成单个双链RNA抑或多个双链RNA)可被设计来抑制多于一个靶基因，包括例如靶基因的多于一个等位基因、来自单一物种的多个靶基因(或至少一个靶基因的多个节段)或来自不同物种的靶基因。

反义DNA节段：在一个实施方案中，对至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义的至少一个反义DNA节段包括与至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义或互补的DNA序列，且可包括多个反义DNA节段，亦即对至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义的至少一个反义DNA节段的多个拷贝。多个反义DNA节段可包括与以下呈反义或互补的DNA序列：至少一个第一靶基因的多个节段、或至少一个第一靶基因的一个节段的多个拷贝、或多个第一靶基因的节段、或它们的任何组合。多个反义DNA节段可融合成嵌合体，例如，包括对一个或多个第一靶基因的多个节段呈反义并融合在一起的DNA序列。

与至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义或互补(其与所述至少一个节段可形成沃森-克里克碱基配对)的反义DNA序列与至少一个第一靶基因的至少一个节段具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％互补性。在一个实施方案中，与至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义或互补的DNA序列与至少一个第一靶基因的至少一个节段具有约95％至约100％互补性。当至少一个反义DNA节段包括多个反义DNA节段时，互补性程度对于所有多个反义DNA节段可为(但不一定是)相同的。

有义DNA节段：在另一实施方案中，作为至少一个第一靶基因的至少一个节段的至少一个有义DNA节段包括对应于(即具有与其相同或实质上相同的序列)至少一个第一靶基因的至少一个节段的DNA序列，并且可包括多个有义DNA节段，亦即对应于(即具有其核苷酸序列)至少一个第一靶基因的至少一个节段的至少一个有义DNA节段的多个拷贝。多个有义DNA节段可包括为以下或对应于以下的DNA序列：至少一个第一靶基因的多个节段、或至少一个第一靶基因的一个节段的多个拷贝、或多个第一靶基因的节段、或它们的任何组合。多个有义DNA节段可融合成嵌合体，亦即可包括对应于一个或多个第一靶基因的多个节段并融合在一起的DNA序列。

对应于靶基因的至少一个节段的有义DNA序列与靶基因的至少一个节段具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％序列同一性。在一个实施方案中，对应于靶基因的至少一个节段的DNA序列与靶基因的至少一个节段具有约95％至约100％序列同一性。当至少一个有义DNA节段包括多个有义DNA节段时，序列同一性程度对于所有多个有义DNA节段可为(但不一定是)相同的。

多个拷贝：当基因抑制元件包括反义DNA序列的多个拷贝或有义DNA序列的多个拷贝时，这些多个拷贝可以串联重复连续排列。在一些实施方案中，这些多个拷贝可端至端地连续排列，亦即以直接连接的串联重复进行排列。在一些实施方案中，这些多个拷贝可以中断的串联重复连续地排列，其中一个或多个间隔区DNA节段可位于多个拷贝中的一个或多个的邻近处。串联重复(不管是直接连接的或中断的或两者的组合)可包括以连续排列的单个反义DNA序列的多个拷贝或单个有义DNA序列的多个拷贝或可包括以连续排列的多于一个反义DNA序列的多个拷贝或多于一个有义DNA序列的多个拷贝。

双链RNA：在其中基因抑制元件包括至少一个反义DNA节段(其对至少一个靶基因的至少一个节段呈反义)或至少一个有义DNA节段(其为至少一个靶基因的至少一个节段)的那些实施方案中，从至少一个反义DNA或至少一个有义DNA转录的RNA可在RNA依赖性RNA聚合酶的作用下变成双链。参见，例如美国专利号5,283,184，其以引用的方式并入本文。

在又一些实施方案中，基因抑制元件可包括转录成通过形成双链RNA抑制至少一个第一靶基因的RNA且包括至少一个反义DNA节段和至少一个有义DNA节段的DNA，所述反义DNA节段对至少一个靶基因的至少一个节段呈反义(如上在标题“反义DNA节段”下所述)，而所述有义DNA节段是至少一个第一靶基因的至少一个节段(如上在标题“有义DNA节段”下所述)。所述基因抑制元件可进一步包括间隔区DNA节段。至少一个反义DNA节段各自与至少部分有义DNA节段互补以便允许通过至少一个反义DNA节段与至少一个有义DNA节段的分子内杂交形成双链RNA。反义DNA节段与有义DNA节段之间的这种互补性可为(但不一定为)100％互补；在一些实施方案中，此互补性优选可为至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％互补。

双链RNA可呈单个dsRNA“茎干(stem)”(有义与反义链之间的碱基配对区)形式，或可具有多个dsRNA“茎干”。在一个实施方案中，基因抑制元件可包括转录成通过形成基本上单个双链RNA抑制至少一个第一靶基因的RNA且包括多个连续的反义DNA节段和多个连续的有义DNA节段的DNA，所述反义DNA节段对至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义，而所述有义DNA节段是至少一个第一靶基因的至少一个节段；所述多个连续的反义节段与多个连续的有义节段可形成单个双链RNA“茎干”或呈连续排列的多个“茎干”(有或没有分隔多个“茎干”的非碱基配对间隔区DNA)。在另一实施方案中，基因抑制元件包括转录成通过形成RNA的多个dsRNA“茎干”抑制至少一个第一靶基因的RNA且包括多个反义DNA节段和多个有义DNA节段的DNA，所述反义DNA节段对至少一个第一靶基因的至少一个节段呈反义，而所述有义DNA节段是至少一个第一靶基因的至少一个节段，且其中所述多个反义DNA节段与所述多个有义DNA节段以一系列dsRNA“茎干”(如但不限于“反向重复”)排列。所述多个dsRNA“茎干”可进一步连续或成簇地排列以形成串联反向重复或类似“锤头”或“苜蓿叶”形状的结构。这些基因抑制元件中的任一个可进一步包括见于dsRNA“茎干”(例如，作为多个反义或有义DNA节段之间的间隔区或作为碱基配对的反义DNA节段与有义DNA节段之间的间隔区)内或见于双链RNA“茎干”(例如，作为分隔一对反向重复的环区域)之外的间隔区DNA节段。在其中碱基配对的反义与有义DNA节段具有不相等的长度的情况下，更长的节段可充当间隔区。

miRNA：在又一实施方案中，基因抑制元件可包括含有来源于miRNA(微RNA)的核苷酸的DNA，亦即对应于所关注的病毒或真核生物(包括植物和动物，特别是无脊椎动物)所原生的DNA序列、或来源于所述原生miRNA但经修饰以含有不对应于原生miRNA的核苷酸序列的DNA序列。虽然迄今为止miRNA未曾在真菌中报道过，但真菌miRNA如果存在的话也适用于本发明。一个实施方案包括含有DNA的基因抑制元件，所述DNA包含来源于病毒或植物miRNA的核苷酸。

在一个非限制性实施例中，来源于miRNA的核苷酸可包括DNA，所述DNA包含对应于原生miRNA的环区域的核苷酸和选自靶基因序列的核苷酸。在另一非限制性实施例中，来源于miRNA的核苷酸可包括DNA，所述DNA来源于miRNA前体序列，如原生pri-miRNA或前miRNA序列，或对应于原生miRNA的区域的核苷酸和选自靶基因序列数的核苷酸，以使得整体结构(例如，在前miRNA的茎干结构中错配的位置)受到保护，从而允许前miRNA被加工成为成熟的miRNA。在又一实施方案中，基因抑制元件可包括DNA，所述DNA包含来源于miRNA并且能够诱导或指导内源性转录物同相裂解成反式作用siRNA的核苷酸，如由Allen等人(2005)Cell,121:207-221所述。因此，包含来源于miRNA的核苷酸的DNA可包含天然存在于miRNA或miRNA前体分子中的序列、合成序列或这两者。

siRNA：在又一实施方案中，基因抑制元件可包括DNA，所述DNA包含小干扰RNA(siRNA)的核苷酸。siRNA可为一个或多个原生siRNA(如从非转基因真核生物或从转基因真核生物分离的siRNA)，或可为经预测具有siRNA活性(如通过利用本领域中已知的预测工具，参见，例如Reynolds等人(2004)Nature Biotechnol.,22:326-330)的一个或多个DNA序列。多个原生或预测的siRNA序列可于用于基因抑制的嵌合siRNA序列中相连。包含siRNA的核苷酸的所述DNA包含至少19个核苷酸，且在一些实施方案中，包括至少20、至少21、至少22、至少23或至少24个核苷酸。在其它实施方案中，包含siRNA的核苷酸的DNA可含有实质上多于21个核苷酸，例如多于约50、约100、约300、约500、约1000、约3000或约5000个核苷酸或更多。

工程化的miRNA和反式作用siRNA(ta-siRNA)适用于以提高的特异性进行基因抑制。本发明提供了重组DNA构建体，其各自包含经设计以抑制靶序列的可转录的工程化miRNA前体，其中所述可转录的工程化miRNA前体衍生自MIR基因(优选植物MIR序列)的向后折叠结构。这些miRNA前体还适用于指导siRNA的同相产生(例如，经设计以在植物的反式作用siRNA抑制机制中加工的异源序列)。本发明进一步提供了一种抑制靶序列在植物细胞中的表达的方法，所述方法包括在植物细胞中转录包含经设计以抑制靶序列的可转录的工程化miRNA前体的重组DNA，其中所述可转录的工程化miRNA前体衍生自MIR基因(优选植物MIR序列)的向后折叠结构，由此靶序列的表达与在重组DNA构建体的转录不存在下的其表达相比受到抑制。

由这些miRNA前体产生或经预测将要由这些miRNA前体产生的成熟miRNA可被工程化以用于抑制靶基因，例如用于通过miRNA实现转录抑制，或指导siRNA在反式作用siRNA抑制机制中的同相产生(参见Allen等人(2005)Cell,121:207-221,Vaucheret(2005)ScienceSTKE,2005:pe43，及Yoshikawa等人(2005)Genes Dev.,19:2164-2175)。植物miRNA一般对其靶序列具有接近完全的互补性(参见，例如Llave等人(2002)Science,297:2053-2056，Rhoades等人(2002)Cell,110:513-520，Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol.Cell,14:787-799)。因此，成熟miRNA可通过用靶向于抑制的序列的核苷酸替代成熟miRNA序列的核苷酸被工程化以作为适用于靶序列的基因抑制的序列；参见，例如由以下文献所公开的方法：Parizotto等人(2004)Genes Dev.,18:2237-2242，尤其是美国专利申请公布US2004/0053411A1、US2004/0268441A1、US2005/0144669和US2005/0037988，所有这些以引用的方式并入本文。当将新型miRNA工程化以靶向特定序列时，一种策略是在靶序列内选择具有与原生miRNA序列尽可能相似的序列的区域。或者，原生miRNA序列可被替换为靶序列区域，优选替换为满足据信对miRNA功能重要的结构和热力学标准的区域(参见，例如美国专利申请公布US2005/0037988)。序列优选被工程化以使得在向后折叠区域或前miRNA的茎干结构中的错配数量和位置受到保护。因此，工程化的miRNA或工程化的miRNA前体可来源于本文所公开的任何成熟的miRNA序列或其相应的miRNA前体(包括相应MIR基因的向后折叠部分)。工程化的miRNA前体可以在植物细胞或组织或完整的植物体中克隆并表达(瞬时地或稳定地)。

调节非编码小RNA活性的重组DNA构建体的构建和说明公开于美国专利申请公布US 2009/0070898 A1、US2011/0296555 A1、US2011/0035839 A1中，所有这些申请都以引用的方式整体并入本文。具体地说，关于US2011/0035839 A1，参见，例如在段落122至135中的标题“Gene Suppression Elements”下的部分和在段落188至190中标题“EngineeredHeterologous miRNA for Controlling Gene Expression下的部分。

如本文所用，“植物”包括整个植物、转基因植物、分生组织、嫩枝器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花、花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚芽、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、花粉、叶肉细胞等)、以及它们的子代。可用于所公开的方法中的植物种类通常与适应转化和育种技术的高等和低等植物种类一样宽，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓类植物和多细胞藻类。

如本文所用，“转基因植物细胞”意指通过例如以下方式用稳定整合的重组DNA转化的植物细胞：农杆菌介导的转化、使用经重组DNA包被的微粒进行轰击或通过其它手段，如定点整合。本公开的植物细胞可为最初转化的植物细胞，其作为微生物或子代植物细胞而存在，再生成分化组织，例如成为具有稳定整合的重组DNA的转基因植物或衍生自子代转基因植物花粉种子或花粉。

如本文所用，“对照植物”意指不含赋予增强的性状或改变的表型的本公开的重组DNA的植物。对照植物被用于鉴别和选择具有增强的性状或改变的表型的转基因植物。合适的对照植物可为用于产生转基因植物的亲本系的非转基因植物，例如，不含重组DNA的野生型植物。合适的对照植物也可为含有赋予其它性状的重组DNA的转基因植物，例如，具有提高的除草剂耐受性的转基因植物。在一些情况下，合适的对照植物可为不含重组DNA的半合子转基因植物株系，称为阴性分离子或阴性等基因系。

如本文所用，“繁殖体”包括减数分裂和有丝分裂的所有产物，包括但不限于能繁殖出新植物的植物、植物的种子和部分。繁殖体包括整个植物、细胞、花粉、胚珠、花、胚芽、叶、根、茎、嫩枝、分生组织、谷粒或种子或能够长成整个植物的任何植物部分。繁殖体还包括其中植物的一部分被移植到不同植物的另一部分以生成活生物体的移植体。繁殖体还包括通过克隆或通过将减数分裂产物集合在一起或容许减数分裂产物聚在一起形成胚芽或受精卵(天然地或利用人工干预)而产生的所有植物和种子。

如本文所用，“子代”包括包含来源于祖先植物的本公开的重组DNA的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生的植物部分。子代对于转基因可为纯合的或杂合的。子代可由通过包含本公开的重组DNA的转基因植物产生的种子和/或通过用来自包含本公开的重组DNA的转基因植物的花粉或胚珠受精的植物产生的种子长出。

如本文所用，“性状”是植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特征。在一些情况下，此特征是人眼可见的并且可用机械方法测量，如种子或植物大小、重量、形状、形态、长度、高度、生长速率和发育阶段；或可通过生化技术来测量，如检测种子或叶的蛋白质、淀粉、某些代谢物或油含量；或通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对缺水或具体的盐或糖浓度的耐受性；或通过测量一个或多个基因的表达水平，例如通过采用RNA印迹分析、RT-PCR、微阵列基因表达测定或报道基因表达系统，或通过农业观察，如高渗应激耐受性或产量。然而，任何技术都可用于测量任何所选化合物或大分子在转基因植物中的量、比较水平或差异。

如本文所用，“增强的性状”意指转基因植物作为重组DNA在转基因植物中的稳定整合和表达的结果的特征。此类性状包括但不限于增强的农艺性状，其特征为提高的植物形态、生理、生长和发育、产量、营养强化、疾病或害虫抗性或环境或化学药品耐受性。在本公开的一些特定方面中，增强的性状选自由以下组成的组：如表7-10中所示的从种植到成熟的天数减少、减小的茎尺寸、增加的叶片数、在营养体阶段中提高的植物高度生长速率、增大的穗尺寸、增加的每株的穗干重、增加的每穗的籽粒数、增加的每籽粒的重量、增加的每株的籽粒数、减小的穗空隙、延长的谷类饱满期、降低的植物高度、增加的根分支数、增加的总根长度、耐旱性、提高的水分利用率、耐寒性、提高的氮利用率和提高的产量，以及如表3-5中所示的改变的表型。在本公开的另一方面中，性状是在非应激条件下提高的产量或在环境应激条件下提高的产量。应激条件既可包括生物应激也可包括非生物应激，例如，干旱、阴凉、真菌病、病毒病、细菌病、昆虫侵扰、线虫侵染、低温暴露、热暴露、渗透应激、降低的氮养分有效性、降低的磷养分有效性和植物高密度。“产量”可受以下许多性质的影响，包括但不限于植物高度、植物生物量、荚数、植物上的荚位置、节间数、荚落粒发生率、谷粒尺寸、穗尺寸、穗尖饱满、籽粒败育、结瘤固氮效率、营养同化效率、抗生物和非生物应激性、碳同化、植物结构、抗倒伏性、种子萌芽百分比、幼苗活力和幼体性状。产量也可受以下的影响：萌芽效率(包括在应激条件下的萌芽)、生长速率(包括在应激条件下的生长速率)、开花时间和持续时间、穗数量、穗尺寸、穗重量、每穗或每荚的种子数、种子尺寸、种子组成(淀粉、油、蛋白质)及种子饱满的特征。

同样在本文中所用，术语“性状改变”涵盖通过在包含本公开的重组DNA的植物中产生特征相对于不包含重组DNA的植物(如野生型植物或阴性分离子)的可检测的差异改变天然存在的性状。在一些情况下，性状改变可被定量地评估。例如，性状改变可带来与对照植物相比在所观察的性状特征或表型上的增强或减弱。已知在所改变的性状中可存在天然变异。因此，观察到的性状改变带来了与对照植物相比在植物中的性状特征或表型的正态分布和量级的变化。

本公开涉及一种具有改善的经济上重要特征(更具体地，提高的产量)的植物。更具体地说，本公开涉及一种包含本公开的多核苷酸的植物，其中所述植物与对照植物相比具有提高的产量。本公开的许多植物与对照植物相比展现提高的产量。在一个实施方案中，本公开的植物展现与产量有关的改善的性状，包括但不限于提高的氮利用率、提高的氮应激耐受性、提高的水分利用率和提高的耐旱性，如在下文所定义和论述。

产量可被定义为来自作物的经济价值的可测量产生。产量可以数量和/或质量的范围来定义。产量可直接取决于几个因素，例如，器官的数量和尺寸、植物结构(如分支数量、植物生物量等)、开花时间和持续时间、谷粒饱满期。根结构和发育、光合效率、营养摄入、应激耐受性、早期活力、延迟衰老和功能性保绿表型可为决定产量的重要因素。优化上述因素可因此有助于提高作物产量。

在本文中提及产量相关性状的增强也可意味着植物的一个或多个部分的生物量(重量)的增加，所述一个或多个部分可包括地上和/或地下(可收获的)植物部分。具体地说，这种可收获的部分是种子，并且执行本公开的方法得到相对于合适的对照植物的种子产量具有提高的产量且具体地说具有提高的种子产量的植物。术语植物的“产量”可涉及植被生物量(根和/或嫩枝生物量)、所述植物的繁殖器官和/或繁殖体(如种子)。

本公开植物的提高的产量可以许多方式测量，包括测试重量、每株植物的种子数量、种子重量、每单位面积的种子数量(例如，每英亩的种子或种子重量)、每英亩的蒲式耳数、每英亩的吨数或每公顷的公斤数。例如，玉米产量可测量为每单位生产面积的有壳玉米籽粒的产量，例如以每英亩的蒲式耳数或每公顷的公吨数为单位。这时常也在水分调整过的基础上报告，例如，在15.5含水率下。提高的产量可通过以下来实现：改善关键生化化合物如氮、磷和碳水化合物的利用率；或改善对环境应激如冷、热、干旱、盐、阴凉、植物高密度及害虫或病原体的侵袭的反应。本公开还可用于提供具有改善的生长和发育及最终提高的产量的植物，这要归因于植物生长调节剂的改良表达或细胞周期或光合作用途径的改变。还关注植物的产生，所述植物相对于可对应于或不对应于总植物产量提高的种子组成显示出提高的产量。

在一个实施方案中，“苜蓿产量”也可以饲料产量(即在收获时地上生物量的量)来测量。促进生物量增加的因素包括增加的营养生长、分支、节点和节间、叶面积和叶面积指数。

在另一实施方案中，“加拿大油菜产量”也可以如下指标测量：荚数、每株植物的荚数、每节点的荚数、节间数、荚落粒发生率、每角的种子数、每角的种子重量、改良的种子、油或蛋白质组成。

另外，“玉米(corn)或玉米(maize)产量”也可测量为每单位生产面积的有壳玉米籽粒的产量、每英亩的穗数、每穗的籽粒行数和每行的籽粒数、每穗的籽粒数或籽粒重、每籽粒的重量、穗数量、穗重量、新鲜的或干燥的穗生物量(重量)

在又一实施方案中，“棉花产量”可测量为每株植物的铃数、铃尺寸、纤维质量、籽棉产量(克/株植物)、籽棉产量(磅/英亩)、皮棉产量(磅/英亩)和包数。

“水稻产量”的具体实施方案也可包括每穴的穗数、每穴的谷粒数、和每穗的实粒数。

“大豆产量”的又一实施方案也可包括每株植物的荚数、每英亩的荚数、每株植物的种子数、每荚的种子数、每粒种子的重量、每荚的重量、每节点的荚数、每株植物的节点数和节间数。

在又一实施方案中，“甘蔗产量”可测量为蔗茎产量(吨/英亩；公斤/公顷)、总可制糖量(磅/吨)和糖产量(吨/英亩)。

在仍又一实施方案中，“小麦产量”可包括：每单位面积的谷物、谷粒数、谷粒重、谷粒尺寸、每头的谷粒数、每头的种子数、每株植物的种子数、每英亩的头数、每株植物的活分蘖数、种子的组成(例如，碳水化合物、淀粉、油和蛋白质)及种子饱满的特征。

术语“产量”、“种子产量”在上文是针对许多核心作物来定义。术语“增强的”、“改善的”、“提高的”可互换并且在本文中被定义。

在另一实施方案中，本公开提供了一种用于产生具有改变的表型、增强的性状或提高的产量的植物的方法；所述方法的执行赋予植物以改变的表型、增强的性状或提高的产量。

“提高的产量”可表现为以下一项或多项：(i)植物的一个或多个部分、尤其是植物的地上(可收获的)部分的增加的植物生物量(重量)、增加的根生物量(增加的根数量、增加的根厚度、增加的根长度)或任何其它可收获部分的增加的生物量；或者(ii)增强的早期活力，在本文中定义为在萌芽后大约三周增加的幼苗地上面积。“早期活力”是指积极健康的植物生长，特别是在植物生长早期，并且可由提高的植物适合度产生，例如，归因于植物更好地适应其环境(例如，优化能源的使用、营养素的摄取及划分嫩枝与根之间的碳分配)。玉米中的早期活力是玉米种子在播种后发芽并出苗的能力与幼年玉米植物在出苗后生长并发育的能力的组合。具有早期活力的植物还展示增加的幼苗存活和更佳的作物建立，这通常产生极其均匀的大田，其中大部分植物实质上同时达到各个发育阶段，由此常得到提高的产量。因此，早期活力可通过测量以下各种因素来确定，如籽粒重、萌芽率、出苗率、幼苗生长、幼苗高度、根长、根和嫩枝生物量、冠层尺寸和颜色等等。

此外，提高的产量也可表现为(iii)提高的总种子产量，这可由以下一项或多项产生：种子生物量(种子重量)的增加，归因于在每株植物和/或单个种子基础上种子重量的增加；每株植物穗数的增加；荚数的增加；节点数的增加；每穗/植物的花(“小花”)数的增加；种子饱满率的提高；饱满种子数的增加；种子尺寸(长度、宽度、面积、周长)的增加，其也可影响种子的组成；和/或种子体积的增加，其也可影响种子的组成。

提高的产量也可(iv)产生改良的结构，或可因改良的植物结构而存在。

提高的产量也可表现为(v)增加的收获指数，其表示为可收获的部分如种子的产量在总生物量上的比率

提高的产量也可表现为(vi)增加的籽粒重量，其是由所计数的饱满种子数量及其总重量外推。增加的籽粒重量可由以下产生：增加的种子尺寸和/或种子重量、增加的胚芽尺寸、增加的胚乳尺寸、糊粉和/或胚子叶或造成籽粒重量增加的种子的其它部分的增加。

提高的产量也可表现为(vii)增加的穗生物量，其是穗的重量且可基于每穗、每株植物或每块样地来表示。

在一个实施方案中，提高的产量可为提高的种子产量，且选自以下中的一者：(i)增加的种子重量；(ii)增加的饱满种子的数量；及(iii)增加的收获指数。

本公开还延伸到植物的可收获的部分，如但不限于种子、叶、果实、花、铃、茎、根茎、块茎和球茎。本公开此外涉及来源于所述植物的可收获部分的产物，如干燥丸粒、粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本公开提供了一种用于提高植物的“产量”或者植物或植物部分的“广泛英亩产量”的方法，所述植物部分被定义为每单位面积可收获的植物部分，例如种子，或每英亩的种子重量、每英亩的磅数、每英亩的蒲式耳数、每英亩的公吨数、每英亩的吨数、每公顷的公斤数。

本公开进一步提供了一种通过产生包含本公开的多核苷酸序列的植物而在植物中改变表型、增强性状或提高产量的方法，其中所述植物可与以下杂交产生种子：自身、来自相同植物株系的第二植物、野生型植物或来自不同植物株系的植物。所获得的植物的种子可由能育植物收获并用于使本公开的植物的子代生长。除用重组DNA构建体直接转化植物之外，转基因植物还可通过使具有稳定整合的重组DNA构建体的第一植物与缺乏所述DNA的第二植物杂交来制备。例如，可将重组DNA引入适合于转化的第一植物株系中以产生转基因植物，所述转基因植物可与第二植物株系杂交以便将所述重组DNA渐渗入第二植物株系中。

用重组DNA构建体转化并具有本公开的多核苷酸的所选转基因植物与对照植物相比提供了改变的表型、增强的性状或提高的产量。与重组DNA有关的遗传标记的使用可促进对于所需重组DNA是纯合的转基因子代的产生。携带这两种亲本性状的DNA的子代植物可回交至亲本株系多次，例如通常6至8代，以产生具有与一个重现的原始转基因亲本株系实质上相同的基因型但具有另一转基因亲本株系的重组DNA的子代植物。术语“子代”表示通过本公开方法所制备的含有本文所述的重组多核苷酸的任何一代亲本株系的后代。

如本文所用，“氮利用率”是指造成每个施氮单位的植物产量、生物量、活力和生长速率增加的过程。该过程可包括通过植物对氮的摄取、同化、积累、信号传递、传感、再易位(植物内)和使用。

如本文所用，“氮限制条件”是指提供小于充分或成功的植物代谢、生长、繁殖成功和/或存活所需的氮的最佳量的生长条件或环境。

如本文所用，“提高的氮应激耐受性”是指当植物经受小于最佳量的可用/施用氮或在氮限制条件下通常生长、发育或产出、或者更快或更好地生长、发育或产出的能力。

如本文所用，“提高的氮利用率”是指当植物经受与在正常或标准条件下相同量的可用/施用氮时与正常相比更快或更好地生长、发育或产出的能力；当植物经受小于最佳量的可用/施用氮或在氮限制条件下通常生长、发育或产出、或者更快或更好地生长、发育或产出的能力。

提高的植物氮利用率在本领域中可被解释为在供应较少氮的情况下收获相似程度的产量，或通过供应最佳/足够量的氮获得提高的产量。提高的氮利用率可增强植物的氮应激耐受性，并且也可改善作物的质量和种子的生化成分，如蛋白质产量和油产量。术语“提高的氮利用率”、“提高的氮利用效率”和“氮应激耐受性”在本公开中可互换使用并且指的是在氮限制条件下具有提高的生产力的植物。

如本文所用，“水分利用率”是指每单位产生的水蒸汽由叶片同化的二氧化碳的量。它构成了在干燥环境中控制植物生产力的最重要的性状之一。“耐旱性”是指植物适应干燥或干旱条件的程度。植物对缺水的生理反应包括叶枯萎、叶面积减少、叶脱落、及通过将营养素引导到植物的地下部分所引起的根生长的刺激。植物在开花和种子发育(生殖期)期间更易受干旱的影响，因为植物的资源为支持根生长而偏离。另外，脱落酸(ABA，一种植物应激激素)诱导叶气孔(气体交换所涉及的微观孔隙)闭合，由此减少经由蒸发所造成的水分流失，并降低光合强度。这些反应提高植物的短期水分利用效率。术语“提高的水分利用率”、“提高的水分利用效率”和“提高的耐旱性”在本公开中可互换使用并且指的是在水限制条件下具有提高的生产力的植物。

如本文所用，“提高的水分利用率”是指当植物经受与在正常或标准条件下相同量的可用/施用水时与正常相比更快或更好地生长、发育或产出的能力；当植物经受减少量的可用/施用水(水输入)或在水应激或缺水应激条件下通常生长、发育或产出、或者更快或更好地生长、发育或产出的能力。

如本文所用，“提高的耐旱性”是指当植物经受减少量的可用/施用水和/或在短期或长期干旱条件下时通常生长、发育或产出、或与正常相比更快或更好地生长、发育或产出的能力；当植物经受减少量的可用/施用水(水输入)或在缺水应激条件下或在短期或长期干旱条件下通常生长、发育或产出的能力。

如本文所用，“干旱应激”是指造成缺水且使植物经受应激和/或使植物组织受损和/或消极地影响谷物/作物产量的一段干燥期(短期或长期/持续很久的)；造成缺水和/或较高的温度且使植物经受应激和/或使植物组织受损和/或消极地影响谷物/作物产量的一段干燥期(短期或长期/持续很久的)。

如本文所用，“缺水”是指小于植物的充分/成功的生长和发育所需的最佳水分含量的条件或环境。

如本文所用，“水分应激”是指以下条件或环境：提供与植物/作物的充分/成功的生长和发育所需相比的不当(较少/不足或较多/过量)水分含量，从而使植物经受应激和/或使植物组织受损和/或消极地影响谷物/作物产量。

如本文所用，“缺水应激”是指以下条件或环境：提供与植物/作物的充分/成功的生长和发育所需相比的较少/不足水分含量，从而使植物经受应激和/或使植物组织受损和/或消极地影响谷物产量。

如本文所用，“多核苷酸”是包含多个聚合核苷酸的核酸分子。多核苷酸可被称为核酸、寡核苷酸或其任何片段。在许多情况下，多核苷酸编码多肽(或蛋白质)或其结构域或片段。另外，多核苷酸可包含启动子、内含子、增强子区、聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5’或3’非翻译区、报道基因、可选标记、可计分标记等。多核苷酸可为单链或双链DNA或RNA。多核苷酸任选地包含修饰的碱基或修饰的主链。多核苷酸可为例如基因组DNA或RNA、转录物(如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆的DNA、合成的DNA或RNA等。多核苷酸可与碳水化合物、脂质、蛋白质或其它材料组合以执行特定的活性，如转化，或形成组合物，如肽核酸(PNA)。多核苷酸可包含在有义或反义方向上的序列。“寡核苷酸”实质上等同于术语扩增引物、引物、寡聚物、元件、靶标和探针，且优选为单链。

如本文所用，“重组多核苷酸”或“重组DNA”是不在其天然状态下的多核苷酸，例如，包含一系列在自然界中未发现的核苷酸(表示为核苷酸序列)的多核苷酸或处于非其天然所发现的环境中的多核苷酸；例如，从其通常在自然界中邻近的多核苷酸中分离，或其通常不邻近的相邻(或连续)多核苷酸。“重组多核苷酸”或“重组DNA”是指已被遗传工程化并构建在含有DNA(包括天然存在的DNA或cDNA或合成DNA)的细胞外的多核苷酸或DNA。例如，所讨论的多核苷酸可被克隆到载体中，或以其它方式与一种或多种另外的核酸重组。

如本文所用，“多肽”包含多个连续的聚合氨基酸残基，例如，至少约15个连续的聚合氨基酸残基。在许多情况下，多肽包含一系列聚合氨基酸残基(其是转录调节剂或结构域)或其部分或片段。另外，多肽可包含：(i)定位结构域；(ii)激活结构域；(iii)抑制结构域；(iv)寡聚化结构域；(v)蛋白质-蛋白质相互作用结构域；(vi)DNA-结合结构域；等等。所述多肽任选地包含修饰的氨基酸残基、并非由密码子编码的天然存在的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基。

如本文所用，“蛋白质”是指一系列的氨基酸、寡肽、肽、多肽或其部分，不管它们是天然存在的抑或合成的。

如本文所用，“重组多肽”是通过重组多核苷酸的翻译产生的多肽。

“合成多肽”是使用本领域中已知的方法，通过分离的氨基酸残基的连续聚合生成的多肽。

“分离的多肽”(不管是天然存在的多肽抑或重组多肽)在(或来自)细胞中比在野生型细胞中呈其天然状态的多肽更富集，例如，大于约5％富集、大于约10％富集、或大于约20％、或大于约50％或更多富集，例如，替代地表示：相对于在100％下标准化的野生型105％、110％、120％、150％或更多富集。此类富集不是野生型植物的天然反应的结果。替代或另外，将分离的多肽例如通过各种蛋白质纯化方法中的任一种与通常和其有关的其它细胞组分分离。

如本文所用，“功能片段”是指保留全长多肽的完整或部分分子、生理或生化功能的本文所提供的多肽的一部分。功能片段常含有在序列表中提供的多肽中所鉴别的一个或多个结构域，如Pfam结构域(参见下文)。

如本公开所用的“重组DNA构建体”包含至少一个具有在植物细胞中可操作的启动子和本公开的多核苷酸的表达盒。DNA构建体可用作将重组DNA构建体递送至植物细胞以实现重组分子至植物细胞基因组中的稳定整合的方式。在一个实施方案中，多核苷酸可编码蛋白质或蛋白质的变体或蛋白质的片段，其在功能上被限定以保持在转基因宿主细胞中的活性，所述宿主细胞包括植物细胞、植物部分、外植体和整个植物。在另一实施方案中，多核苷酸可编码非编码RNA，其干扰调控表达的内源性类别小RNA的功能，所述小RNA包括但不限于taRNA、siRNA和miRNA。重组DNA构建体是使用本领域普通技术人员已知的方法来装配且通常包含与DNA可操作地连接的启动子，其表达提供了增强的农艺性状。

其它构建体组分可包含另外的调控元件，如用于增强转录的5’前导序列和内含子、3’非翻译区(如聚腺苷酸化信号和位点)、及用于转运或靶向的DNA或信号肽。

同一性百分比描述了多核苷酸或蛋白质节段在序列(例如核苷酸序列或氨基酸测序)的比对中不变的程度。序列比对是通过以下操作来进行：手动比对两个序列，例如，如本文提供的所述序列与作为参考序列的另一序列，以产生最高的匹配元件(例如，单个核苷酸或胺基酸)数量，同时允许将缺口引入到任一个序列中。序列与参考序列比对的“同一性分数”是匹配元件的数量除以参考序列的全长，不包括通过比对过程引入到参考序列中的缺口。如本文所用，“同一性百分比”(“同一性％”)是同一性分数乘100。

如本文所用，“同源物”或“同源生物”意指在执行相同生物功能的一组蛋白质中的蛋白质，例如，属于同一Pfam蛋白家族且在本公开的转基因植物中提供常见的增强性状的蛋白质。同源物是由同源基因表达。关于同源基因，同源物包括直向同源物，例如，在通过物种形成而从共同的祖先基因进化来的不同物种中表达并且编码保留相同功能的蛋白质的基因，但不包括横向同源物，即，通过复制而相关但已进化以编码具有不同功能的蛋白质的基因。同源基因包括天然存在的等位基因和人工生成的变体。

遗传密码的简并性提供以下可能性：用不同的碱基取代基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基，而不会引起由所述基因产生的多肽的氨基酸序列改变。当最佳比对时，同源物蛋白质或其相应的核苷酸序列与经鉴定同在植物细胞中表达时赋予增强的性状或改变的表型有关的全长蛋白质或其相应的核苷酸序列通常具有至少约60％同一性，在一些情况下至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或甚至至少约99.5％同一性。在本公开的一方面中，同源物蛋白质与可由本文所公开的序列构建的蛋白质和同源物的共有氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％同一性。

通过例如手动地比较蛋白质序列或通过利用基于计算机的工具，使用已知序列比较算法如BLAST和FASTA，从序列相似性推断出同源物。序列搜索和局部比对程序(例如BLAST)可用于针对各种生物体的蛋白质序列的数据库搜索基础生物体的查询蛋白质序列，以找出相似的序列，并且概要期望值(E-值)可用于测量序列相似性的水平。因为针对具体生物体具有最低E-值的蛋白质命中不一定是直向同源物或唯一的直向同源物，所以交互查询被用于过滤具有直向同源物鉴别的显著E-值的命中序列。交互查询需要搜索针对基础生物体的蛋白质序列的数据库的显著命中。当交互查询的最佳命中是查询蛋白自身或查询蛋白的横向同源物时，命中可被鉴定为直向同源物。利用交互查询过程，在所有同源物中将直向同源物进一步与横向同源物区分开，由此允许基因的功能等价物的推断。由适用于本发明的转基因植物中的DNA编码的同源物的另一方面是因为一个或多个氨基酸在原生序列中的缺失或插入而不同于所公开的蛋白质的那些蛋白质。

其它功能性同源物蛋白由于一个或多个已知的保守氨基酸取代而在一个或多个氨基酸方面不同于本文所公开的性状增强的蛋白质，例如，缬氨酸是丙氨酸的保守取代物且苏氨酸是丝氨酸是保守取代物。原生序列内的氨基酸的保守取代可选自天然存在的氨基酸所属类别的其它成员。这些不同类别内的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电的)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电的)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；以及(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。原生蛋白质或多肽内的氨基酸的保守取代物可选自天然存在的氨基酸所属组的其它成员。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺的侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰氨；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且具有含硫侧30链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。天然保守的氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰氨。本公开的另一方面包括由于一个或多个氨基酸在原生序列中的缺失或插入而在一个或多个氨基酸方面不同于所述蛋白质序列的蛋白质。

一般说来，术语“变体”是指与参考(原生)多核苷酸或多肽相比分别在其核苷酸或氨基酸序列中具有一些差异(合成地或天然地产生)的分子。这些差异包括在原生多核苷酸或氨基酸序列中的取代、插入、缺失或此类变化的任何所需组合。

关于多核苷酸变体，在本公开的多核苷酸与多核苷酸变体之间的差异是有限的，以便前者与后者的核苷酸序列总体上相似，且在许多区域中是相同的。由于遗传密码的简并性，前者与后者核苷酸序列之间的差异可以是沉默的(例如，由多核苷酸编码的氨基酸是相同的，且变体多核苷酸序列编码与本公开的多核苷酸相同的氨基酸序列)。变体核苷酸序列可编码不同的氨基酸序列，在此情况下，这种核苷酸差异将产生相对于类似所公开的多核苷酸序列的氨基酸取代、添加、缺失、插入、截短或融合。这些变异可产生编码共有至少一种功能特征的多肽的多核苷酸变体。遗传密码的简并性还指示许多不同变体多核苷酸可编码相同和/或实质上相似的多肽。

如本文所用，“基因”或“基因序列”是指基因的部分或完整编码序列、它的互补序列、以及它的5’和/或3’非翻译区(UTR)和它们的互补序列。基因还是遗传的功能单位，且在物理术语中是核苷酸沿着涉及产生多肽链的DNA分子(或RNA，在RNA病毒的情况下)的核苷酸或具体节段或序列。后者可经受后续加工，如化学修饰或折叠，以获得功能蛋白或多肽。举例来说，转录调控基因编码转录调控多肽，其可具有功能并需要加工以用作转录起始物。

如本文所用，术语“启动子”一般是指参与RNA聚合酶II及其它蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合以起始转录的DNA分子。启动子最初可从基因的基因组拷贝的5’非翻译区(5’UTR)上分离。或者，启动子可为合成产生或操纵或工程化的DNA分子。启动子也可以是嵌合的，即经由两个或两个以上异源DNA分子的融合产生的启动子。植物启动子包括从植物、植物病毒、真菌和细菌如农杆菌和慢生根瘤菌处获得的启动子DNA。启动子也可以是异源的。如本文所用，如果在自然界中启动子或调控序列不与可转录的DNA序列可操作地连接和/或不存在于将要用启动子或调控序列转化的植物宿主细胞中，那么与可转录的DNA序列(如编码序列)可操作连接的启动子或其它调控序列被认为是“异源的”。两个或两个以上启动子或调控序列也可相对于彼此是异源的。

在植物的全部或大部分组织中起始转录的启动子被称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段期间起始转录的启动子被称为“发育”启动子。其表达在植物的某些组织中相对于其它植物组织而言增加的启动子被称为“组织增加的”或“组织优选的”启动子。在植物的特定组织内表达而在其它植物组织中几乎不或不表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。在植物的某一细胞类型(例如小孢子母细胞)中表达的启动子被称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是其中转录响应于以下刺激而起始的启动子：环境刺激，如寒冷、干旱或光；或其它刺激，如伤口或化学品应用。植物中的许多生理和生化过程在约24小时的时期内展现内源节律。“昼夜启动子”是在昼夜节律振荡子的控制下展现改变的表达模式的启动子。昼夜调控经历环境输入，如光和温度及通过昼夜节律钟的协调。植物可表达的启动子的许多实例是本领域中已知的。

在植物种子组织中的充分表达是实现种子组成的改良所需的。用于种子组成修饰的示例性启动子包括来自例如以下种子基因的启动子，如美国专利号5,420,034中所公开的napin、如美国专利号6,433,252所公开的玉米L3油体蛋白、如由Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-166所公开的玉米蛋白Z27、如由Belanger等人(1991)Genetics129:863-872所公开的球蛋白1、如由Russell(1997)见上文所公开的谷蛋白1、及如由Stacy等人(1996)Plant Mol Biol.31(6):1205-1216所公开的过氧化物还原酶抗氧化剂(Per1)。

如本文所用，术语“前导序列”是指从基因的基因组拷贝的非翻译5’区(5’UTR)分离的DNA分子且一般定义为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸节段。或者，前导序列可为合成产生或操纵的DNA元件。前导序列可用作5’调控元件，所述元件是用于调节可操作连接的可转录的多核苷酸分子的表达。如本文所用，术语“内含子”是指可从基因的基因组拷贝中分离或鉴别的DNA分子并且一般可定义为在翻译之前于mRNA加工期间被剪切掉的区域。或者，内含子可为合成产生或操纵的DNA元件。内含子可含有实现可操作连接的基因的转录的增强子元件。内含子可用作调控元件，所述调控元件是用于调节可操作连接的可转录的多核苷酸分子的表达。DNA构建体可包含内含子，并且所述内含子可关于或不关于可转录的多核苷酸分子。

如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用转录调控元件，也称作顺式元件，其赋予总体表达模式的一个方面，但通常单独不足以驱动可操作连接的多核苷酸的转录。与启动子不同，增强子元件通常不包含转录起始位点(TSS)或TATA盒或等价序列。启动子可天然地包含一个或多个影响可操作连接的多核苷酸的转录的增强子元件。分离的增强子元件也可融合至启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的总体调节的一个方面。启动子或启动子片段可包含一个或多个实现可操作连接的基因的转录的增强子元件。据信许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白和/或影响DNA拓扑结构，由此产生局部构象，所述局部构象选择性地容许或限制RNA聚合酶接触DNA模板或促进在转录起始位点处双螺旋的选择性打开。增强子元件可用于结合调控转录的转录因子。一些增强子元件结合多于一个转录因子，且转录因子可以不同亲和力与多于一个增强子结构域相互作用。

本公开的表达盒可包含位于所述基因的5’或3’或其中的“转运肽”或“靶向肽”或“信号肽”分子。这些术语一般指的是当连接到目标蛋白质上时将所述蛋白质导向特定组织、细胞亚细胞位置或细胞器的肽分子。实例包括但不限于叶绿体转运肽(CTP)、叶绿体靶向肽、线粒体靶向肽、核靶向信号、核输出信号、液泡靶向肽和液泡分选肽。关于使用叶绿体转运肽的说明，参见美国专利号5,188,642和美国专利号5,728,925。关于在本公开中的拟南芥EPSPS基因的转运肽区域的说明，参见Klee,H.J.等人(MGG(1987)210:437-442。本公开的表达盒还可包含一个或多个内含子。本公开的表达盒可含有在所述盒的3’端附近的DNA，其是用作终止由异源核酸的转录的信号并且指导所得的mRNA的聚腺苷酸化。它们通常被称为“3’-非翻译区”或“3’-非编码序列”或“3’-UTR”。“3’非翻译序列”意指位于结构核苷酸序列的下游的DNA序列并且包括编码聚腺苷酸化及能够影响mRNA加工或基因表达的其它调控信号的序列。聚腺苷酸化信号在植物中起作用以促使聚腺苷酸化核苷酸向mRNA前体的3’端中的添加。聚腺苷酸化信号可来源于天然基因、多种植物基因或T-DNA。聚腺苷酸化序列的一个实例是胭脂碱合酶3’序列(nos 3’；Fraley等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-4807,1983)。不同3’非翻译序列的使用是由Ingelbrecht等人,Plant Cell 1:671-680,1989例示。

本公开的表达盒还可含有一个或多个编码可选标记并赋予针对选择性试剂如抗生素或除草剂的抗性的基因。许多可选标记基因是本领域中已知的并且可用于本公开中：可选标记基因，其赋予对抗生素如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、壮观霉素(aadA)美国专利公布2009/0138985A1和庆大霉素(aac3和aacC4)的耐受性；或对以下除草剂的耐受性：如草甘膦(例如，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，美国专利号5,627,061；美国专利号5,633,435；美国专利号6,040,497；美国专利号5,094,945)、磺酰基除草剂(例如，乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶，赋予对乙酰乳酸合酶抑制剂如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸酯和苯酞的耐受性(美国专利6,225,105；5,767,366；4,761,373；5,633,437；6,613,963；5,013,659；5,141,870；5,378,824；5,605,011))、双丙氨膦或草丁瞵或衍生物(例如，草丁瞵转乙酰酶(bar)，对草丁瞵或草铵膦的耐受性(美国专利5,646,024；5,561,236；5,276,268；5,637,489；5,273,894)；麦草畏(麦草畏单加氧酶，专利申请公布US2003/0115626A1)或稀禾定(修饰的乙酰基-辅酶A羧化酶，用于赋予对环己二酮的耐受性)、及芳氧基苯氧丙酸酯(吡氟氯禾灵，美国专利号6,414,222)。

本公开的转化载体可含有一个或多个“表达盒”，各自包含与目标多核苷酸序列可操作连接的原生或非原生植物启动子，其与3’UTR序列和终止信号可操作地连接，以便于在适当的宿主细胞中表达。其通常还包含多核苷酸或转基因的适当翻译所需的序列。如本文所用，术语“转基因”是指人工地掺入到宿主细胞基因组中的多核苷酸分子。这种转基因可对宿主细胞是异源的。术语“转基因植物”是指包含这种转基因的植物。编码区通常编码目标蛋白质，但也可编码目标功能性RNA，例如反义RNA、非翻译RNA(在有义或反义方向上)、miRNA、非编码RNA或用于靶基因序列的抑制或过度表达的合成RNA。包含目标核苷酸序列的表达盒可为嵌合的，意味着至少一种它的组分相对于至少一种它的其它组分是异源的。如本文所用，术语“嵌合”是指由两个或更多个遗传多样性来源生成的DNA分子，例如，来自一个基因或生物体的第一分子和来自另一基因或生物体的第二分子。

本公开中的重组DNA构建体一般包含通常含有聚腺苷酸化信号和位点的3’元件。已知的3’元件包括来自根癌农杆菌基因如nos 3’、tml 3’、tmr 3’、tms 3’、ocs 3’、tr7 3’的那些，例如在美国专利号6,090,627中所公开的；来自以下植物基因的3’元件，如小麦(Triticum aesevitum)热休克蛋白17(Hsp17 3’)、小麦泛素基因、小麦果糖-1,6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β-微管蛋白基因，所有这些都公开于美国专利申请公布2002/0192813A1中；及豌豆(Pisum sativum)二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbs 3’)，和来自寄主植物内的基因的3’元件。

作为传统转化方法的一种替代，可将DNA序列如转基因、表达盒等经由定点整合插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特异性位点或基因座中。本公开的重组DNA构建体和分子可因此包含供体模板序列，所述供体模板序列包含至少一个转基因、表达盒或用于插入到植物或植物细胞的基因组中的其它DNA序列。用于定点整合的这种供体模板可进一步包含侧接插入序列(即，有待插入植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的重组DNA构建体可进一步包含编码位点特异性核酸酶和/或用于进行定点整合的相关任何相关蛋白的表达盒。这些核酸酶表达盒可与供体模板存在于同一分子或载体中(以顺式)或存在于单独的分子或载体上(以反式)。用于定点整合的若干方法是本领域中已知的，其涉及切割基因组DNA以在所需基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同蛋白质(或蛋白质和/或指导RNA的复合物)。简言之，如在本领域中所理解，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程中，供体模板DNA可在DSB或切口的位点处被整合到基因组中。同源臂在供体模板中的存在可促进在经由同源重组修复的过程中插入序列在植物基因组中的采用和定位，但插入事件也可经由非同源末端连接(NHEJ)发生。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化或原生的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导到植物基因组内的所需位点的序列。

如本文所用，术语“同源臂”是指与被转化的植物或植物细胞中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸序列。同源臂可包含至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少250、至少500或至少1000个核苷酸。

如本文所用，“可操作连接的”意指在重组DNA构建体中两个或更多个DNA片段的结合以使得一个(例如)蛋白质编码DNA的功能受到另一(例如)启动子的控制。

转基因植物可包含许多本文所公开的一个或多个多核苷酸，由此产生多个多肽序列。包含大量多核苷酸的转基因植物可通过传统育种方法或经由基因工程化方法中的任一种或两种而获得。这些方法包括但不限于杂交各自包含目标多核苷酸的单个转基因系，用第二基因转化包含本文所公开的第一基因的转基因植物，以及将基因共转化到单个植物细胞中。基因的共转化可使用包含多个基因的单转化载体或单独携带在多个载体上的基因进行。

包含或衍生自用重组DNA转化的本公开的植物细胞的转基因植物可进一步以叠加的性状来增强，例如，具有由本文所公开的DNA的表达与除草剂和/或害虫抗性性状组合造成的增强的性状的作物。例如，本公开的基因可与农艺学上关注的其它性状叠加：如提供除草剂抗性或昆虫抗性的性状；如使用来自苏云金杆菌的基因以提供针对鳞翅目、鞘翅目、同翅目、半翅目及其它昆虫的抗性；或改善的质量性状，如提高的营养价值。转基因植物已显示出耐受性且本公开的方法可适用的除草剂包括但不限于草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲、溴苯腈、达草灭、2,4-D(2,4-二氯苯氧基)乙酸、芳氧基苯氧基丙酸酯、对羟苯基丙酮酸加双氧酶抑制剂(HPPD)和原卟啉原氧化酶抑制剂(PPO)除草剂。编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子是本领域中已知的并且包括但不限于：编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子，公开于美国专利5,094,945；5,627,061；5,633,435和6,040,497中，用于赋予草甘膦耐受性；编码草甘膦氧化还原酶(GOX)的多核苷酸分子，公开于美国专利号5,463,175中，和编码草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)的多核苷酸分子，公开于美国专利号申请公布2003/0083480A1中，也用于赋予草甘膦耐受性；麦草畏单加氧酶，公开于美国专利申请公布2003/0135879A1中，用于赋予麦草畏耐受性；编码溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子，公开于美国专利号4,810,648中，用于赋予溴苯腈耐受性；编码八氢番茄红素去饱和酶(crtI)的多核苷酸分子，描述于Misawa等人,(1993)Plant J.4:833-840和Misawa等人,(1994)Plant J.6:481-489中，用于达草灭耐受性；编码乙酰羟酸合酶(AHAS，又名ALS)的多核苷酸分子，描述于Sathasiivan等人(1990)Nucl.Acids Res.18:2188-2193中，用于赋予磺酰脲除草剂的耐受性；被称为bar基因的多核苷酸分子，公开于DeBlock等人(1987)EMBO J.6:2513-2519中，用于赋予草铵膦和双丙氨膦耐受性；公开于美国专利申请公布2003/010609 A1中的多核苷酸分子，用于赋予N-氨基甲基膦酸耐受性；公开于美国专利号6,107,549中的多核苷酸分子，用于赋予吡啶除草剂抗性；用于赋予对如草甘膦、莠去津、ALS抑制剂、异噁唑草酮和草铵膦除草剂等多种除草剂的耐受性的分子和方法公开于美国专利号6,376,754和美国专利申请公布2002/0112260中。用于赋予昆虫/线虫/病毒抗性的分子和方法公开于美国专利5,250,515；5,880,275；6,506,599；5,986,175及美国专利申请公布2003/0150017 A1中。

植物细胞转化方法

用重组DNA转化植物细胞中的染色体和质体的众多方法是本领域中已知的，其可用于产生转基因植物细胞和植物的方法中。用于转化的两种有效方法是农杆菌介导的转化和微粒轰击介导的转化。微粒轰击方法阐述于中美国专利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)；6,153,812(小麦)和6,365,807(水稻)中。农杆菌介导的转化方法描述于例如美国专利5,159,135(棉花)；5,824,877(大豆)；5,463,174(加拿大油菜)；5,591,616(玉米)；5,846,797(棉花)；8,044,260(棉花)；6,384,301(大豆)、7,026,528(小麦)和6,329,571(水稻)、美国专利申请公布号2004/0087030 A1(棉花)和美国专利申请公布号2001/0042257 A1(甜菜)中，所有这些专利都以引用的方式整体并入本文。植物材料的转化是在培养基(例如，容许细胞体外生长的营养素的混合物)上于组织培养中进行。受体细胞靶包括但不限于分生组织细胞、芽尖、下胚轴、愈伤组织、未成熟或成熟的胚芽、及配子细胞，如小孢子、花粉、精子和卵细胞。愈伤组织可由包括但不限于以下的组织来源起始：未成熟或成熟的胚芽、下胚轴、幼苗顶端分生组织、小孢子等。含有转基因核的细胞生长成为转基因植物。

如上所引入，用于转化植物细胞中的染色体的另一种方法是经由使用重组DNA供体模板在基因组的预定位点通过定点整合方法插入DNA序列。可通过本领域中已知的任何方法完成定点整合，例如，通过利用锌指核酸酶、工程化或原生的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶或RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。重组DNA构建体可通过同源重组(HR)或通过非同源末端连接(NHEJ)插入预定位点处。除了将重组DNA构建体插入植物染色体中的预定位点处之外，基因组编辑还可经由寡核苷酸定向诱变(ODM)(Oh和May,2001；美国专利号8,268,622)或通过用位点特异性核酸酶引入双链断裂(DSB)或切口、继之以NHEJ或修复而实现。DSB或切口的修复可用于在DSB或切口的位点处引入插入或缺失，并且这些突变可造成移码的引入、氨基酸取代和/或蛋白质翻译的早期终止密码子或基因调控序列的改变。基因组编辑可在有或没有供体模板分子的情况下实现。

除用重组DNA构建体直接转化植物材料之外，转基因植物还可通过使包含重组DNA的第一植物与缺乏所述重组DNA的第二植物杂交来制备。例如，可将重组DNA引入适合于转化的第一植物株系中，所述第一植物株系可与第二植物株系杂交以便将重组DNA渐渗入第二植物株系中。具有提供增强的性状(例如提高的产量)的重组DNA的转基因植物可与具有赋予另一种性状(例如除草剂抗性或害虫抗性)的其它重组DNA的转基因植物株系杂交，以产生具有赋予这两种性状的重组DNA的子代植物。通常，在用于组合性状的这类育种中，提供额外性状的转基因植物是雄性株系，而携带基本性状的转基因植物是雌性株系。此杂交的子代将分离以使得一些植物将携带这两种亲本性状的DNA且一些将携带其中一种亲本性状的DNA；这类植物可由与亲本重组DNA有关的标记来鉴别，例如，通过分析重组DNA或在可选标记连接至重组体的情况下通过施用选择性试剂如供除草剂耐受性标记使用的除草剂或通过选择增强的性状进行标记鉴别。携带这两种亲本性状的DNA的子代植物可回交至雌性亲本株系多次，例如通常6至8代，以产生具有与原始转基因亲本株系实质上相同的基因型但具有另一转基因亲本株系的重组DNA的子代植物。

关于转化，通常在任何一个转化实验中将DNA引入仅较小百分比的靶植物细胞中。标记基因用于提供一种有效的系统，该系统是用于鉴别通过接受并整合重组DNA构建体到其基因组中而稳定转化的那些细胞。优选的标记基因提供选择性标记，所述选择性标记赋予针对选择性试剂如抗生素或除草剂的抗性。本公开植物可对其表现出抗性的任何除草剂都是用于选择性标记的试剂。将潜在转化的细胞暴露于选择性试剂。在存活细胞群中，是以下那些细胞，其中赋予抗性的基因一般被整合并在足以允许细胞存活的水平下表达。可进一步测试细胞以证实外源性DNA的稳定整合。常用的选择性标记基因包括以下那些：赋予对抗生素如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、壮观霉素(aadA)和庆大霉素(aac3和aacC4)的抗性；或赋予对除草剂如草铵膦(bar或pat)、麦草畏(DMO)和草甘膦(aroA或EPSPS)的抗性。这类可选标记的实例示于美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708；6,118,047和8,030,544中。也可采用提供视觉上筛选转化体的能力的标记，例如，表达有色或荧光蛋白如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)的基因或表达β-葡糖醛酸酶的基因或已知其各种产色底物的uidA基因(GUS)。

经受住暴露于选择性试剂的植物细胞或已在筛选测定中评定为阳性的植物细胞可在体外培养以发育或再生成小植物。从转化的植物细胞再生的发育中的小植物可被转移到植物生长混合物中，并且在例如环境受控的室中，在约85％相对湿度、600ppm CO₂和25-250微爱因斯坦m^-2s^-1的光下变得茁壮，之后转移到用于成熟的温室或生长室中。取决于初始组织和植物物种，在转化体被鉴别之后约6周至10个月，植物可再生。可使用本领域技术人员已知的常规植物育种方法对植物授粉以产生种子，例如，自花授粉常用于转基因玉米。可针对重组DNA的表达测试再生的所转化的植物或其子代种子或植物并针对改变的表型或增强的农艺学性状的存在进行选择。

转基因植物和种子

使衍生自具有本公开的转基因核的转基因植物细胞的转基因植物生长以产生与对照植物相比具有改变的表型或增强的性状的转基因植物，并产生本公开的转基因种子和单倍体花粉。具有增强的性状的这类植物是通过针对所述增强的性状选择所转化的植物或子代种子来鉴别。关于效率，设计一种选择方法以评估包含重组DNA的多重转基因植物(事件)，例如，从2至20或更多个转基因事件的多重植物。由本文所提供的转基因种子长成的转基因植物显示出有助于提高产量的改良的农艺性状或提供增加的植物价值的其它性状，包括例如改良的种子质量。特别关注的是具有提高的水分利用率或耐旱性、提高的耐高温性或耐旱性、提高的产量和提高的氮利用率的植物。

表1提供了作为用于产生具有增强性状的转基因植物的重组DNA的蛋白质编码基因的序列的列表。参照以下来描述表1的元件：“NUC SEQ ID NO.”，其标识DNA序列；“PEPSEQ ID NO.”，其标识氨基酸序列；“基因ID”，指的是任意标识符；及“基因名称和描述”，是指基因的通用名称和功能描述。

表1.蛋白质编码基因的序列

针对增强的性状选择和测试转基因植物

在各自从具有重组DNA的植物细胞发育或再生的转基因植物群内，能存活成为产生种子和子代植物的可育转基因植物的许多植物不会展现增强的农艺学性状。从群中的选择是鉴别一个或多个具有增强的性状的转基因植物所必需的。采用有力的测试的进一步评估是理解以下所必要的：性状的贡献组分、支持性状改进的决定及产生作用模式假设。具有增强的性状的转基因植物是通过在多种测定中评估植物以检测增强的性状而从由如本文所述进行转化的植物细胞发育、再生或衍生的植物群中选出并测试，所述增强的性状是例如提高的水分利用率或耐旱性、提高的耐高温性或耐寒性、提高的产量或产量构成、期望的结构、最佳生命周期、提高的氮利用率、增加的种子组成，如增加的种子蛋白质和增加的种子油。

这些测定可采用许多形式，包括但不限于直接筛选温室或大田试验中的性状或筛选替代性状。此类分析可涉及检测以下的变化：植物的化学组成、生物量、产量构成、生理特性、根结构、形态或生命周期。谷物的化学组成如营养组成的变化可通过分析种子组成及蛋白质、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉或生育酚的含量来检测。化学组成的变化还可通过分析叶中的含量，如叶绿素或类胡萝卜素的含量来检测。生物量特征的变化可对温室或大田生长的植物评估并且可包括植物高度、茎直径、根和嫩枝干重、冠层尺寸；及对于玉米植物来说，穗长和直径。产量构成的变化可通过每单位面积的籽粒总数及其个体重量来测量。生理特性的变化可通过评估对应激条件的反应来鉴别，例如，使用所施加的应激条件如缺水、缺氮、冷生长条件、病原体或昆虫侵袭或光照不足或增加的植物密度进行的测定。根结构的变化可通过根长度和分支数量来评估。形态的变化可通过目视观察转化的植物同针对以下的变化相比看起来像是正常植物的倾向来测量：浓密、更长、更厚、较窄的叶子、有条纹的叶子、节瘤性状、萎黄病、白化、花青素产生、或改变的雄穗、穗或根。形态的变化还可采用基于形状参数的形态测定分析，使用尺寸测量如穗直径、穗长度、籽粒行数、节间长度、植物高度或茎体积来测量。生命周期的变化可通过宏观或微观形态变化来测量，所述形态变化被划分为发育阶段，如花粉脱落期、抽丝期、叶片延伸速率。其它选择和测试特性包括花粉脱落期、抽丝期、叶片延伸速率、叶绿素含量、叶温、立根(stand)、幼苗活力、节间长度、植物高度、叶数量、叶面积、分蘖、支柱根、保绿或延迟衰老、茎杆倒伏、根倒伏、植物健康、光秃/多产、green snap和害虫抗性。另外，可对收获的谷物的表型特征进行评估，包括穗上每行的籽粒数、穗上的籽粒行数、籽粒败育、籽粒重量、籽粒尺寸、籽粒密度和物理谷粒质量。

实践本领域的技术人员容易设计用于筛选所需性状的测定。以下说明了使用杂交玉米植物筛选玉米性状的测定。所述测定可适于将其它植物如加拿大油菜、小麦、棉花和大豆筛选为杂交系或自交系。

具有提高的氮利用率的转基因玉米植物可通过筛选与对照植物相比在相同和充足量的氮供应下的大田中的转基因植物来鉴别，其中所述植物与对照植物相比提供更高的产量。具有提高的氮利用率的转基因玉米植物还可通过筛选与对照植物相比在减少量的氮供应下的田地中的转基因植物来鉴别，其中所述植物与对照植物相比提供相同或相似的产量。

具有提高的产量的转基因玉米植物是通过几年来使用在多个位置处的转基因植物的子代进行筛选来鉴别，其中植物在最佳生产管理实践及最大杂草和害虫防治或标准农艺实践(SAP)下生长。选择方法可应用于多个及多种地理位置，例如，高达16或更多个位置，在一个或多个种植季节，例如，至少两个种植季节，以便在统计上将产量提高与天然环境效应相区分。

具有提高的水分利用率或耐旱性的转基因玉米植物是通过在测定中筛选植物来鉴别，在该测定中停止供水一段时间以诱导应激，然后浇水以使植物恢复。例如，在11天的初始无应激生长期之后，选择过程对植物施加总时间15天的3个干旱/再浇循环。每个循环由5天组成，在开头四天不施用水且在循环的第5天施以水冷。通过选择方法分析的主要表型是如由植物干旱处理期间的高度和生物量所决定的植物生长速率的变化。

虽然本公开的植物细胞和方法可应用于任何植物细胞、植物、种子或花粉，例如任何水果、蔬菜、草、树木或观赏植物，但本公开的各个方面也应用于玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、奎奴亚藜和甘蔗植物。

实施例

实施例1.玉米转化

此实施例说明了产生转基因玉米植物细胞、种子和植物的转化方法，所述转基因植物细胞、种子和植物具有如表3-5中所示的改变的表型、及增强的性状、提高的水分利用率、提高的氮利用率和提高的产量、及如表7、8和10中所示的改变的性状和物候学。

对于农杆菌介导的玉米胚芽细胞的转化，收获来自玉米植物的穗，并通过将所述穗喷洒或浸泡于乙醇中，然后风干来进行表面灭菌。从表面灭菌的穗的单个籽粒中分离胚芽。在切除之后，将玉米胚芽用含有质粒DNA(其具有目标基因盒及植物可选的标记盒)的农杆菌细胞接种，然后将它们与农杆菌共培养几天。将共培养的胚芽转移到各种选择和再生培养基中，并且在选择开始之后6至8周回收转化的R0植物，将所回收的植物移植到盆栽土中。将再生的R0植物自交，并且获得R1和后续子代。

可重复上述过程以产生来自用具有表1中鉴别的基因的重组DNA转化的细胞的转基因玉米植物的多重事件。针对插入基因的存在和单拷贝来筛选所转化的植物的子代转基因植物和种子，并且测试如表3-5、7、8和10中所示的各种改变或增强的性状和表型，如提高的水分利用率、提高的产量和提高的氮利用率。由具有来自表1的特定重组DNA的转基因植物的多重事件的各组，鉴别显示出提高的产量、提高的水分利用率、提高的氮利用率、及改变的表型和性状的事件。

实施例2.大豆转化

此实施例说明了在产生具有如表9和10中所示改变的表型或增强的性状诸如提高的水分利用率、耐旱性和提高的产量的转基因大豆植物细胞、种子和植物中的植物转化。

对于农杆菌介导的转化，使大豆种子吸胀过夜并切除分生组织外植体。在不晚于种子吸胀开始的14小时，将大豆外植体与所诱导的含有质粒DNA(其具有目标基因盒及植物可选的标记盒)的农杆菌细胞混合，并采用超声波创伤。创伤后，将外植体共培养2-5天，在那时将它们转移到选择培养基中，以允许选择和转基因嫩枝的生长。在大约6-8周内收获抗性嫩枝，并且置于选择性生根培养基中2-3周。将生根的嫩枝转移到温室中并盆栽在土壤中。将在选择时保持健康但没有生根的嫩枝转移到非选择性生根培养基中另外生长两周。在转移到温室并盆栽在土壤中之前，对脱离选择生根的从任何嫩枝生出的根分析植物可选标记的表达。

可重复上述过程以由用具有表1中所鉴别的基因的重组DNA转化的细胞产生转基因大豆植物的多次事件。针对插入基因的存在和单拷贝来筛选所转化的植物的子代转基因植物和种子，并就如表9和10中所示的各种改变或增强的表型和性状进行测试。

实施例3.在自动化温室中改变的表型的鉴别

此实施例说明了在自动化温室(AGH)中关于改变的表型对转基因玉米植物的筛选和鉴别。用于植物的自动化表型筛选的装置和方法公开于例如美国专利公布号2011/0135161中，该专利以引用的方式整体并入本文。

在三个AGH筛选中，在包括非应激、缺氮和缺水应激的不同条件下测试玉米植物。所有筛选在第0-5天萌发期都从非应激条件开始，之后使植物在表2中所示的筛选特定的条件下生长22天。

表2.关于玉米植物的三个AGH筛选的描述

缺水被定义为比非应激植物的VWC降低的比体积含水量(VWC)。例如，非应激植物可保持在55％VWC下，且对于缺水分析的VWC可被定义在约30％VWC。使用可见光和超光谱成像收集数据，并且直接测量盆重量及每天施于单株植物的水和营养素的量。

缺氮被定义(部分地)为比非应激植物的氮浓度降低的氮的比毫米浓度。例如，可将非应激植物保持在8mM氮中，而在缺氮分析中施加的氮浓度可保持在2mM的浓度下。

对每次筛选测量高达十个参数。基于可见光彩色成像的测量是：生物量、冠层面积和植物高度。生物量(Bmass)被定义为从由多个视角获取的图像获得的植物的估计的嫩枝鲜重(g)。冠层面积(Cnop)被定义为如在自顶向下的图像(mm²)中所见的叶面积。植物高度(PlntH)是指从盆顶部到来源于侧面图像的植物的最高点的距离(mm)。花青素得分和面积、叶绿素得分和浓度、及含水量得分是基于超光谱成像的参数。花青素得分(AntS)是对从自顶向下超光谱图像中获得的叶冠层中的花青素的估计值。花青素面积(AntA)是对由侧视超光谱图像获得的茎中的花青素的估计值。叶绿素得分(ClrpS)和叶绿素浓度(ClrpC)都是由自顶向下的超光谱图像获得的叶冠层中的叶绿素的测量值，其中叶绿素得分是以相对单位来测量，且叶绿素浓度是以百万分率(ppm)单位来测量。含水量得分(WtrCt)是对由自顶向下的超光谱图像获得的叶冠层中的水的测量值。水分利用率(WUE)是由每升添加的水的植物生物量的克数导出。施加的水(WtrAp)是在实验过程中添加至盆(无孔盆)中的水的直接测量值。

设置这些生理筛选轮次以便将所测试的转基因株系与对照株系比较。使用δ％和某些p-值截止将所收集的数据针对对照进行分析。表3-5分别是在非应激、缺氮和缺水条件下包含所公开的具有改变的表型的重组DNA构建体的转基因玉米植物的概况。

测验结果是由三个数量表示：字母“p”之前的第一个数字表示在p≤0.1下测试参数增加的事件数量；字母“n”之前的第二个数字表示在p≤0.1下测试参数减少的事件数量；字母“t”之前的第三个数字表示在特定的筛选中对于给定参数测试的转基因事件的总数。增加或减少是与非转基因对照植物相比进行测量。符号“-”表示其尚未被测试。例如，2p1n5t表示筛选5个转基因植物事件，其中2个事件显示增加，且1个显示所测量参数的减少。

表3.在AGH非应激筛选中具有改变的表型的转基因玉米植物的概况

基因ID

AntS

Bmass

Cnop

ClrpS

PlntH

WtrAp

WtrCt

WUE

ClrpC

AntA

T5MON15

0p1n5t

0p2n5t

0p1n5t

0p0n5t

0p1n5t

0p0n5t

0p2n5t

-

T5MON02

0p0n5t

1p0n5t

0p0n5t

1p0n5t

0p0n5t

-

1p0n5t

-

T5MON23

1p0n5t

0p0n5t

0p2n5t

0p1n5t

1p1n5t

-

0p0n5t

-

T5MON17

0p0n5t

0p1n5t

0p4n5t

1p0n5t

0p0n5t

1p1n5t

0p1n5t

-

T5MON03

0p0n5t

1p0n5t

-

0p1n5t

1p0n5t

-

0p0n5t

T5MON05

1p1n10t

0p2n10t

-

1p3n10t

0p2n10t

-

0p1n10t

2p0n10t

0p1n10t

T5MON16

0p1n5t

-

1p0n5t

0p1n5t

-

0p2n5t

0p0n5t

-

T5MON26

0p0n5t

1p2n5t

0p1n5t

-

0p1n5t

0p0n5t

-

1p1n5t

0p0n5t

-

T5MON27

1p1n7t

0p0n7t

3p0n7t

0p1n7t

0p0n7t

-

T5MON06

0p0n8t

1p0n8t

0p0n8t

-

T5MON28

0p0n5t

0p1n5t

-

0p2n5t

1p2n5t

-

0p2n5t

0p0n5t

-

T5MON19

0p1n5t

-

0p2n5t

0p1n5t

-

0p2n5t

0p0n5t

0p1n5t

T5MON29

2p1n5t

0p2n5t

0p1n5t

-

0p2n5t

0p0n5t

-

0p2n5t

0p0n5t

T5MON08

0p1n5t

0p0n5t

-

0p1n5t

0p0n5t

-

0p1n5t

-

T5MON14

000n5t

1p0n5t

0p0n5t

-

2p0n5t

1p0n5t

-

1p0n5t

0p0n5t

-

表4.在AGH缺氮筛选中具有改变的表型的转基因玉米植物的概况

基因ID

AntS

Bmass

Cnop

ClrpS

PlntH

WtrAp

Wtrct

WUE

ClrpC

AntA

T5MON01

-

3p0n5t

-

2p0n5t

3p0n5t

-

1p0n5t

-

1p0n5t

T5MON02

0p0n5t

3p0n5t

1p0n5t

1p2n5t

0p0n5t

1p0n5t

-

T5MON03

0p0n5t

1p0n5t

-

0p1n5t

0p0n5t

-

0p0n5t

0p1n5t

0p0n5t

T5MON04

0p0n10t

0p1n10t

-

1p1n10t

0p2n10t

-

0p0n10t

1p0n10t

T5MON05

1p0n10t

0p0n10t

0p3n10t

-

0p3n10t

1p1n10t

-

1p1n10t

1p0n10t

0p2n10t

T5MON06

0p1n8t

0p5n8t

1p1n8t

0p1n8t

0p3n8t

-

T5MON07

0p0n5t

-

0p0n5t

1p0n5t

-

0p0n5t

0p1n5t

1p0n5t

T5MON08

0p2n5t

4p0n5t

1p0n5t

-

0p0n5t

3p0n5t

-

4p0n5t

2p0n5t

-

T5MON14

2p0n5t

0p3n5t

-

0p1n5t

0p3n5t

-

0p2n5t

0p1n5t

-

T5MON15

0p1n5t

0p0n5t

0p2n5t

0p0n5t

0p4n5t

0p3n5t

0p0n5t

-

T5MON16

1p0n5t

0p1n5t

-

0p2n5t

0p1n5t

-

0p1n5t

1p0n5t

-

T5MON17

0p1n5t

0p3n5t

1p1n5t

2p0n5t

0p4n5t

1p1n5t

0p3n5t

0p4n5t

-

T5MON19

0p1n5t

0p0n5t

0p2n5t

-

1p0n5t

0p5n5t

-

0p0n5t

0p3n5t

T5MON23

0p0n5t

4p0n5t

2p0n5t

0p1n5t

2p0n5t

4p0n5t

1p0n5t

3p0n5t

-

T5MON25

0p1n8t

2p0n8t

0p1n8t

-

2p1n8t

0p4n8t

-

3p0n8t

3p1n8t

0p0n8t

T5MON26

0p0n5t

0p2n5t

0p3n5t

-

0p2n5t

0p1n5t

-

0p2n5t

0p0n5t

-

T5MON27

1p0n7t

0p1n7t

0p0n7t

0p2n7t

0p0n7t

0p1n7t

-

T5MON28

0pon5t

0p2n5t

0p0n5t

-

0p3n5t

0p1n5t

-

0p1n5t

1p0n5t

-

T5MON29

0p0n5t

0p2n5t

-

0p1n5t

0p2n5t

-

1p0n5t

0p0n5t

表5.在AGH缺水筛选中具有改变的表型的转基因玉米植物的概况

基因ID

AntS

Bmass

Cnop

ClrpS

PlntH

WtrAp

WtrCt

WUE

ClrpC

AntA

T5MON01

0p0n5t

0p2n5t

0p3n5t

-

1p1n5t

0p3n5t

-

0p0n5t

0p1n5t

2p0n5t

T5MON02

0p0n5t

1p1n5t

0p1n5t

0p3n5t

0p1n5t

1p2n5t

0p1n5t

0p0n5t

-

T5MON03

0p0n5t

0p1n5t

0p0n5t

-

0p0n5t

0p3n5t

-

2p0n5t

0p0n5t

1p0n5t

T5MON04

0p1n10t

3p1n10t

4p0n10t

-

1p1n10t

-

3p0n10t

0p0n10t

T5MON05

0p1n10t

0p0n10t

1p0n10t

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1p1n10t

2p2n10t

-

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3p0n10t

0p4n10t

T5MON06

0p0n8t

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0p2n8t

0p1n8t

0p3n8t

0p2n8t

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T5MON07

1p0n5t

0p0n5t

0p1n5t

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0p1n5t

1p1n5t

-

0p0n5t

1p1n5t

1p0n5t

T5MON08

1p0n5t

0p0n5t

-

0p0n5t

-

0p0n5t

-

T5MON14

0p0n5t

2p1n5t

3p1n5t

-

0p1n5t

-

2p0n5t

0p0n5t

-

T5MON15

0p3n5t

2p0n5t

3p0n5t

1p0n5t

2p0n5t

3p0n5t

0p0n5t

2p0n5t

-

T5MON16

0p0n5t

0p1n5t

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0p0n5t

0p2n5t

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0p1n5t

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T5MON17

0p0n5t

1p0n5t

0p0n5t

1p0n5t

0p1n5t

0p0n5t

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T5MON19

1p0n5t

2p0n5t

-

1p0n5t

3p0n5t

-

0p0n5t

0p2n5t

0p1n5t

T5MON23

0p0n5t

4p0n5t

3p0n5t

1p0n5t

4p0n5t

5p0n5t

0p0n5t

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T5MON25

0p1n8t

3p0n8t

1p0n8t

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2p0n8t

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3p0n8t

2p0n8t

0p1n8t

T5MON26

0p1n5t

0p2n5t

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0p1n5t

0p4n5t

-

0p0n5t

-

T5MON27

0p2n7t

1p0n7t

2p0n7t

0p0n7t

0p1n7t

3p0n7t

1p0n7t

0p0n7t

-

T5MON28

1p0n5t

2p1n5t

2p0n5t

-

0p1n5t

3p0n5t

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0p1n5t

1p0n5t

-

T5MON29

2p0n5t

3p1n5t

1p1n5t

-

1p1n5t

2p1n5t

-

2p1n5t

0p0n5t

实施例4.转基因植物的性状特征的评估

进行性状分析以评估转基因植物中与非转基因对照相比的性状特征和表型变化。玉米和大豆植物生长在大田和温室条件下。在某些植物发育阶段，在物候学、形态测定、生物量和产量构成研究中对玉米测量高达18个参数。对于根分析，使大豆植物生长在温室中的透明培养基中以容许对根系成像并分析。

通过以下发育标准定义玉米的发育阶段：

发育的叶：具有可见叶领的叶片；

V-阶段：在玉米植物上的发育的叶的数量对应于植物营养营养体阶段-即，V6阶段玉米植物具有6个发育的(完全展开的)叶片；

R1(抽丝)：定义为R1的植物必须具有一条或多条延伸到苞叶之外的丝。确定作物植物的生殖阶段在R1或更后面仅是基于初生穗的发育；

R3(乳)：通常出现在抽丝之后18-22天，取决于温度和相对成熟度。籽粒通常呈黄色且每个籽粒内的液体呈乳白色；

R6(生理成熟)：通常出现在抽丝之后55-65天(取决于被观察的胚质的温度和相对成熟度组)。籽粒在此时达到其最大干物质积累，且籽粒水分是大约35％。

通过如下标准定义大豆发育阶段：

充分发育的三叶节点：当在刚超出其的节点处的叶片已经充分展开使得每个小叶的两个边缘不再接触时，叶片被认为是完全发育的。在主茎的末端节点处，当小叶是平坦的且在外观上类似于植物的较老叶片时，叶片被认为是完全发育的；

VC：子叶和单小叶是完全展开的；

R1：开始开花–即，在主茎的任何节点处的一个开放的花。

表6描述了性状分析。TraitRefID是各性状分析的参考ID。性状名称是分析的描述性名称。性状描述说明了所述分析测量的内容，且所述测量进行的方式。阳性呼叫方向(Direction For Positive Call)表示在分析结果中对应于“阳性”呼叫的测量数量的增加或减少。

表6.性状分析的说明。

设置这些性状分析以便将所测试的转基因株系与对照株系比较。相对于对照分析收集的数据，并且如果存在0.2或更小的p值，那么指定为阳性。表7、8和9分别是包含所公开的重组DNA构建体的转基因植物关于玉米物候学和形态测定分析、玉米产量/性状构成分析、以及大豆根分析的概况。

测试结果是由三个数量表示：在字母“p”之前的第一个数字表示具有如表6所定义的“阳性”变化的测试事件数量；在字母“n”之前的第二个数字表示具有“阴性”变化的测试事件数量，所述“阴性”变化与如表6所定义的“阳性”呈相反的方向；字母“t”之前的第三个数字表示在特定的分析中对于给定基因的转基因事件的测试总数。“阳性”或“阴性”变化是与非转基因对照植物相比来测量。符号“-”表示其尚未被测试。例如，2p1n5t表示测试5个转基因植物事件，其中2个事件显示所测量参数的“阳性”变化，且1个显示所测量参数的“阴性”变化。所述分析在表6中用它的TraitRefID表示。注意，在一些分析中测试基因T5MON21的两个构建体，并且结果列为T5MON21和T5MON21x。

表7.玉米物候学和形态测定分析的分析结果概况

表8.玉米性状构成分析的分析结果概况

基因ID

EAR6

EDR6

ELR6

ETVR6

EVR6

KPER6

SKWTR6

EDWR1

T5MON02

1p0n3t

0p0n3t

2p0n3t

1p0n3t

2p0n6t

0p0n6t

1p0n3t

T5MON03

-

1p0n4t

0p1n4t

-

T5MON08

1p0n6t

0p1n6t

1p1n6t

1p2n6t

-

T5MON16

2p0n3t

0p0n3t

2p0n3t

0p1n3t

0p0n7t

2p0n7t

4p0n7t

T5MON17

-

0p1n4t

0p0n4t

-

T5MON19

-

0p0n4t

-

T5MON20

0p1n2t

0p2n2t

0p1n2t

1p0n2t

0p0n4t

0p1n4t

0p0n2t

T5MON21

1p0n3t

0p1n3t

0p0n3t

1p1n3t

1p0n3t

-

T5MON21x

0p0n3t

1p1n3t

0p0n3t

0p3n3t

0p0n3t

-

T5MON26

2p0n3t

0p0n3t

1p0n6t

0p1n6t

0p0n3t

T5MON27

0p0n2t

1p0n2t

0p0n2t

0p1n2t

0p0n2t

-

T5MON28

0p2n3t

0p1n3t

0p2n3t

0p0n3t

0p5n4t

5p0n7t

0p1n7t

T5MON29

-

0p0n4t

0p2n4t

-

表9.大豆根分析的分析结果概况

基因_ID	RBPN	RTL
			T5MON12	0p0n4t	1p0n4t
T5MON13	3p0n4t	3p0n4t

实施例5.在大田试验中关于提高的氮利用率、提高的水分利用率和提高的产量对转基因植物的表型评估

进行玉米大田试验以鉴别可在氮限制条件下改善氮使用效率(NUE)的基因，由此得到与非转基因对照相比提高的产量表现。对于表10中所示的氮大田试验结果来说，将各田地在氮限制条件(60磅/英亩)下种植，并且将玉米穗重量或产量与非转基因对照植物比较。

进行玉米大田试验以鉴别可在在水限制条件下改善水分利用率(WUE)的基因，由此得到与非转基因对照相比提高的产量表现。在管理的水限制条件下进行的水分利用率试验的结果示于表10中，并且将玉米穗重量或产量与非转基因对照植物比较。

进行玉米和大豆大田试验以鉴别可在标准农艺实践下改善广亩产量(BAY)的基因。在标准农艺实践下进行的广亩产量试验的结果示于表10中，并且将玉米或大豆产量与非转基因对照植物比较。

表10提供了产生与对照植物相比具有提高的氮利用率(NUE)、提高的水分利用率(WUE)和/或提高的广亩产量(BAY)的转基因植物的基因的列表。包括在具有至少一个事件的构建体中的多核苷酸序列，所述至少一个事件显示在p≤0.2下的多个位置处显著的产量或穗重量增加。除非另外指出，否则用在“特异性表达模式”栏的组成型启动子表达基因。基于对基因功能的理解或基于当用组成型启动子表达基因时观察到的显著产量提高的缺乏，在组成型启动子中选择特异性表达模式的启动子。表10的元件描述如下：“作物”是指试验中的作物，其为玉米或大豆；“条件”是指大田试验的类型，其为针对在标准农艺实践(SAP)下广亩产量试验的BAY、针对水分利用率试验的WUE、及针对氮使用率试验的NUE；“特异性表达模式”是指预期表达模式或启动子类型，代替组成型；“基因ID”是指如表1中所定义的基因标识符；“产量结果”是指在显示在p≤0.2下多个位置处显著的产量增加的至少一个事件的构建体中的重组DNA。第一个数字是指具有显著的产量或穗重量增加的测试事件的数量，而第二个数字是指对于构建体中的每个重组DNA的测试事件的总数。通常，每个构建体测试4至8个截然不同的事件。

表10.具有针对提高的氮利用率、提高的水分利用率和提高的产量的蛋白质编码基因的重组DNA

作物	条件	特异性表达模式	基因ID	产量结果
					玉米	BAY		T5MON01	1/7
玉米	BAY		T5MON04	3/8
					玉米	BAY	根特异性	T5MON05	4/28
玉米	BAY	根特异性	T5MON06	7/44
					玉米	WUE	根特异性	T5MON06	1/6
玉米	BAY	种子特异性	T5MON08	1/18
					玉米	WUE	种子特异性	T5MON08	3/5
玉米	BAY		T5MON14	1/15
					玉米	WUE		T5MON14	2/6
玉米	BAY	根特异性	T5MON15	2/8
					玉米	BAY		T5MON16	2/20
玉米	NUE		T5MON16	5/11
					玉米	BAY		T5MON17	4/16
玉米	BAY		T5MON19	8/19
					玉米	WUE	分生组织和穗轴强化	T5MON21	1/7
玉米	BAY	种子优选	T5MON23	3/27
					玉米	NUE	种子优选	T5MON23	1/14
玉米	BAY	分生组织和胚乳优选	T5MON27	2/24
					玉米	BAY		T5MON28	1/14
大豆	BAY		T5MON09	3/12
					大豆	BAY		T5MON10	3/13
大豆	BAY		T5MON11	6/23
					大豆	BAY		T5MON18	2/28
大豆	BAY	种子优选	T5MON24	3/14

表11提供了具有特定表达模式的启动子的多核苷酸序列的列表。为了传达特定的表达模式，启动子的选择不限于表11中所列的那些。

表11.启动子序列和表达模式

核苷酸SEQ ID No.	启动子表达模式
		93	种子优选
94	根优选
		95	分生组织和胚乳优选
96	根特异性
		97	胚乳特异性
98	胚乳特异性
		99	种子特异性
100	种子优选
		101	分生组织和穗轴强化

实施例6.同源物鉴别

此实施例说明了由表1中鉴别的DNA序列所编码的蛋白质的同源物的鉴别，其被用于提供具有增强的农艺性状的转基因种子和植物。可从同源物蛋白质的序列中鉴别相应的同源DNA序列，以用于制备具有增强的农艺性状的额外的转基因种子和植物。

使用专有序列数据库和国家生物技术信息中心(NCBI)非冗余氨基酸数据库(nr.aa)，由已知的蛋白质序列构建“所有蛋白质数据库”。对于本文所提供的多核苷酸序列由此获得的每个生物体，“生物体蛋白质数据库”是由生物体的已知蛋白质序列构建；其为基于生物体的NCBI分类ID的所有蛋白质数据库的子集。

使用具有1e-8的E值截止的NCBI“blastp”程序，使用表1中提供的氨基酸序列查询所有蛋白质数据库。保留高达1000个顶级命中，并由生物体名称分隔。对于除了查询序列以外的每个生物体，保留来自查询生物体自身的命中的列表，其具有比生物体的最佳命中更显著的E值。所述列表含有本文所提供的多核苷酸的可能重复的基因，且被称为核心列表。为来自每个生物体的命中保留另一列表，通过E值来分选，并且成为命中列表。

使用具有1e-4的E值截止的NCBI“blastp”程序，使用表1中提供的多肽序列查询生物体蛋白质数据库。保留高达1000个顶级命中。BLAST可搜索数据库是基于这些命中来构建，并且称为“SubDB”。使用具有1e-8的E值截止的NCBI“blastp”程序，用命中列表中的每个序列查询SubDB。将具有最佳E值的命中与来自相应生物体的核心列表比较。如果命中属于核心列表，那么其被认为是可能的直向同源物，否则其不被认为是可能的直向同源物，并且不再进一步搜索同一生物体的命中列表中的序列。在表1所提供的多肽序列超过95％的长度上具有至少95％同一性的同源物报告于下文的表12和13中。

表12提供同源物基因的列表，其中元件描述如下：“PEP SEQ ID NO.”识别氨基酸序列。“同源物ID”是指字母数字标识符，其数字部分是NCBI Genbank GI编号；且“基因名称和描述”是基因的通用名称和功能描述。表13描述了表1中的蛋白质编码基因与它们的同源物之间的一致性，以及基因与它的同源物之间的蛋白质序列比对水平。

表12.同源基因信息

表13.基因与同源物的一致性

实施例7.使用定点整合在植物中引入转基因或调节内源基因的表达。

如上所引入，可将包含转基因、表达盒等(如表1和12中所鉴别的基因的一个或多个编码序列或其同源物)的DNA序列经由定点整合插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特异性位点或基因座中。包含表1和12中所鉴别的基因的一个或多个编码序列或其同源物的DNA序列可与启动子和/或其它调控元件如5’和/或3’非翻译区(UTR)、增强子、内含子和/或终止子区可操作地连接，它们各自可为原生的、非原生的、合成的和/或与编码序列或植物宿主细胞的异源的。本公开的重组DNA构建体和分子可因此包括具有插入序列的供体模板，所述插入序列包含至少一个转基因、表达盒或用于插入植物或植物细胞的基因组中的其它DNA序列。用于定点整合的所述供体模板可进一步包含侧接插入序列的一个或两个同源臂以促进插入序列插入所需位点或基因座处。可以选出植物基因组内的任何位点或基因座用于插入序列的定点整合。

用于定点整合的若干方法是本领域中已知的，其涉及切割基因组DNA以在所需基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同蛋白质(或蛋白质和/或指导RNA的复合物)。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化或原生的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导到植物基因组内的所需位点的序列。本公开的重组DNA分子或构建体可进一步包含编码位点特异性核酸酶的表达盒、指导RNA和/或进行所需定点整合事件的任何相关蛋白质。

可选出对应于表1和12中鉴别的基因或其同源物的植物或植物细胞的内源性基因组基因座，用于能够调节相应内源基因的表达的重组DNA分子或序列的位点特异性插入。如上所述，重组DNA分子或序列充当用于插入序列整合到植物基因组中的供体模板。所述供体模板还可具有一个或两个侧接插入序列的同源臂以促进靶向插入事件。虽然转基因、表达盒或其它DNA序列可经由定点整合插入植物基因组的所需基因座或位点中，但供体模板则可用于替代、插入或修饰内源基因的5’非翻译区(UTR)、启动子、增强子、内含子、3’UTR和/或终止子区或其任何部分，以便调节内源基因的表达水平。用于修饰内源基因的表达的另一种方法是通过内源基因的基因座的基因组编辑。例如，靶向基因组编辑事件可能会破坏或消除用于内源基因的转录阻遏物的调控结合位点以增加或修饰内源基因的表达。

对于供体模板的插入序列的基因组编辑或位点特异性整合，在所选的基因组基因座中制造双链断裂(DSB)或切口。DSB或切口可用以下制得：位点特异性核酸酶，例如，锌指核酸酶、工程化或原生大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶或RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。在供体模板存在下，DSB或切口可通过供体模板的同源臂与植物基因组之间的同源重组修复，实现插入序列的定点整合，以便在DSB或切口的位点处进行靶向基因组修饰或插入。对于本文中示出在植物中带来或产生所需表型或性状的基因，包含基因的编码序列的表达构建体或转基因可经由如上所论述的定点整合插入植物基因组内的所需或所选位点处。或者，相应的内源基因的序列可经由定点整合被修饰以提高或改变内源基因的表达水平，如通过添加启动子或内含子序列，或通过修饰或替代内源基因的5’UTR序列、启动子、增强子、内含子、3’UTR序列和/或终止子区或其任何部分。

在用重组分子或构建体转化植物细胞之后，筛选所得到的事件，以用于供体模板插入序列的定点插入或基因组修饰。然后可关于内源基因的调节、整合转基因的表达和/或产量性状或其它表型的改变对含有这些证实的事件或修饰的植物进行测试。

Claims

1.一种重组DNA构建体，其包含：

a)与选自由SEQ ID NO:1-29组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多核苷酸序列；或

b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:30-92组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其包含在植物细胞中有功能并且与所述多核苷酸序列可操作地连接的启动子。

3.一种载体或质粒，其包含权利要求1所述的重组DNA构建体。

4.一种植物，其包含权利要求1所述的重组DNA构建体。

5.如权利要求4所述的植物，其中所述植物为大田作物。

6.如权利要求4所述的植物，其中所述植物为选自由以下组成的组的大田作物植物：玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、奎奴亚藜和甘蔗。

7.如权利要求4所述的植物，其中所述植物与对照植物相比具有改变的表型或增强的性状。

8.如权利要求7所述的植物，其中与对照植物相比所述增强的性状选自由以下组成的组：从种植到成熟的天数减少、减小的茎尺寸、增加的叶片数、在营养体阶段中提高的植物高度生长速率、增大的穗尺寸、增加的每株的穗干重、增加的每穗的籽粒数、增加的每籽粒的重量、增加的每株的籽粒数、减小的穗空隙、延长的谷类饱满期、降低的植物高度、增加的根分支数、增加的总根长度、提高的产量、提高的氮利用率及提高的水分利用率。

9.如权利要求7所述的植物，其中所述改变的表型选自由以下组成的组：植物高度、生物量、冠层面积、花青素含量、叶绿素含量、水用量、水含量和水分利用率。

10.一种繁殖体，其包含权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述繁殖体选自由以下组成的组：细胞、花粉、胚珠、花、胚芽、叶、根、茎、嫩枝、分生组织、谷粒和种子。

11.一种用于在植物中改变表型、增强性状、提高产量、提高氮利用率或提高水分利用率的方法，所述方法包括产生包含重组DNA构建体的转基因植物，其中所述重组DNA构建体包含：

12.如权利要求11所述的方法，其中所述重组DNA构建体包含启动子，所述启动子在植物细胞中有功能并且与所述多核苷酸序列可操作地连接。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述植物是通过用所述重组DNA构建体转化植物细胞或组织并且由包含所述重组DNA构建体的所述植物细胞或组织再生或发育成所述转基因植物而产生。

14.如权利要求11所述的方法，其包括：

产生包含所述重组DNA构建体的子代植物，通过使所述转基因植物与下列各物杂交：

a)自身；

b)来自相同植物株系的第二植物；

c)野生型植物；或

d)来自不同植物株系的第二植物，

以产生种子，使所述种子生长以产生子代植物而实现；以及

选择与对照植物相比具有提高的产量、提高的氮利用率或提高的水分利用率的子代植物。

15.如权利要求11所述的方法，其中所述转基因植物通过以下步骤产生：使用包含所述重组DNA构建体的供体模板将所述重组DNA构建体定点整合到植物细胞或组织的基因组中，以及由包含所述重组DNA构建体的植物细胞或组织再生或发育成所述转基因植物。

16.一种植物，其通过权利要求11所述的方法产生。

17.一种重组DNA分子，其用作定点整合中的供体模板，其中所述重组DNA分子包含含有以下的插入序列：

18.如权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述插入序列进一步包含启动子，所述启动子在植物细胞中有功能并且与所述多核苷酸序列可操作地连接。

19.如权利要求17所述的重组DNA分子，其进一步包含至少一个侧接所述插入序列的同源臂。

20.如权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子进一步包含至少一个编码位点特异性核酸酶的盒，其中所述位点特异性核酸酶选自包括以下的组：锌指核酸酶、工程化或原生的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶或RNA指导的核酸内切酶。

21.如权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子进一步包含至少一个编码一个或多个指导RNA的盒。

22.一种重组DNA分子，其用作定点整合中的供体模板，其中所述重组DNA分子包含用于调节内源基因的表达的插入序列，其中所述内源基因包含：

a)与选自由SEQ ID NO:1-29组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多核苷酸序列或其一部分；或

23.如权利要求22所述的重组DNA构建体，其中所述插入序列包含启动子、增强子、内含子或终止子区。

24.如权利要求22所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA分子进一步包含至少一个编码位点特异性核酸酶的盒，其中所述位点特异性核酸酶选自包括以下的组：锌指核酸酶、工程化或原生的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶或RNA指导的核酸内切酶。

25.如权利要求22所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA分子进一步包含至少一个编码一个或多个指导RNA的盒。

26.一种用于在植物中改变表型、增强性状、提高产量、提高氮利用率或提高水分利用率的方法，所述方法包括：

a)通过以下步骤修饰植物细胞的基因组：

i)鉴别对应于选自表1和12中的基因列表的基因的所述植物的内源基因及其同源物，及

ii)经由定点整合修饰所述植物细胞中的内源基因序列以改变所述内源基因的表达水平；以及

b)由所述植物细胞再生或发育成植物。