CN109337905A - 大豆孢囊线虫诱导型启动子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程应用技术领域，具体公开了大豆孢囊线虫诱导型启动子及应用，本发明提供的启动子的基因序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。申请人通过构建GmMYBp‑GUS报告基因的双元表达载体，观察到大豆根部GUS报告基因主要在大豆孢囊线虫侵染位点表达；又通过构建这个启动子连接抗性基因SHMT(丝氨酸羟甲基转移酶)的过表达和沉默的表达载体，并分别转入感病品种Williams 82以及抗病品种PI548402中，发现在线虫侵染位点特异表达抗病基因使大豆抗性增加、沉默抗病基因会增加敏感性。因而线虫诱导型启动子在提高大豆抗性利用方面具有新用途，从而为植物抗病抗逆研究提供新思路。

Description

大豆孢囊线虫诱导型启动子及应用

技术领域

本发明属于基因工程应用技术领域，具体涉及大豆孢囊线虫诱导型启动子及应用。

背景技术

大豆(Glycine max)作为世界上重要的粮油作物之一，为人类提供蛋白质和油料来源。据史料记载，大豆起源于中国，在我国已有五千多年的种植史，全国种植普遍，以东北地区和黄淮海地区种植面积最广、品质最优。大豆不仅可以为人体提供重要的蛋白质和不饱和脂肪酸来源，其产业链还涉及众多领域，与人类生活息息相关。所以在人口众多的我国，大豆在农业生产方面一直颇受关注。我国的大豆一直依赖于他国进口，其中美国是我国大豆主要的进口来源。现今，随着我国对大豆需求的日渐增多，如何改变本国大豆生产市场被进口大豆占据的局面以及提高本国大豆产量和品质是研究者亟待解决的问题。目前，常规的大豆育种手段对大豆的改良很有限，基于生物技术或基因工程的分子设计育种是目前提高作物产量和品质的有效手段之一。

大豆孢囊线虫(Soybean cyst nematode)属于土传性专性寄生线虫，主要危害以大豆为主的豆科植物，是危害大豆生产的最严重的病害之一，大豆受害症状表现为植株矮小黄化，结荚小而少，根系不发达且根瘤较少，造成大豆产量损失10-40％(张俊立，彭德良，曹克强.河北省大豆孢囊线虫分子鉴定及其分布.植物保护，2005，31(1)：40-43)。据2010年统计，美国每年因该病害造成的经济损失超过10亿美元(Koenning SR.Suppression ofsoybean yield potential in the continental United States by plant diseasesfrom 2006 to 20 09.Plant Health Progress,2010)。

相比于传统的组成型启动子，诱导型启动子能够有效控制下游基因的表达，最大限度地减少了因外源基因在转基因植物中的积累而造成的伤害，最大效率的保证植物应对外界刺激信号的干扰，维持植物的生长与发育，为在基因工程中实现对外源基因的精准调控提供了有效手段(王志新，赵琳，李文滨.植物诱导型启动子的研究进展.大豆科技，2011(3)：5-9)。针对植物内寄生性线虫，利用线虫诱导型启动子使抗性基因或毒性基因在线虫取食位点过量表达或使线虫生长发育必需基因沉默可大大减少线虫的危害。本发明通过受大豆孢囊线虫侵染3天后的大豆根部转录组数据筛选到一个大豆孢囊线虫诱导型启动子GmMYBp，并构建启动子-GUS报告基因表达载体转入大豆中探索其表达模式，又通过表型鉴定实验验证启动子的高表达效率：在感病品种中过表达抗性基因发现抗性增加、在抗病品种中沉默抗性基因表达发现抗性降低，这为大豆抗性机制研究以及抗病基因应用提供了新思路和新工具。

发明内容

本发明的目的是在于提供了大豆孢囊线虫诱导型启动子，所述启动子的序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了大豆孢囊线虫诱导型启动子的应用，该启动子受大豆孢囊线虫诱导，可用于大豆育种，大豆抗线虫基因等。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：

大豆孢囊线虫诱导型启动子，所述启动子的序列为SEQ ID NO.1所示或SEQ IDNO.2所示。

大豆孢囊线虫诱导型启动子的应用，包括利用本发明提供的启动子制备抗线虫或线虫敏感型大豆；或是利用本发明的启动子筛选线虫抗性基因；

以上所述的应用中，包括通过将SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.2所示基因连接目的基因后在大豆中进行过表达或沉默。

以上所述的应用中，是通过将大豆孢囊线虫诱导型启动子连接抗性基因SHMT在大豆中进行过表达或RNAi，以控制大豆孢囊线虫在大豆根上形成的孢囊数目，从而提高或降低大豆线虫抗性。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

大豆(Glycine max)作为油料和蛋白质的重要来源，对人类的生活十分重要。大豆孢囊线虫(Soybean cyst nematode)是危害大豆生产的最严重的病害之一，制约着大豆生产。利用抗病品种是最有效的防治措施之一。近年来，对大豆抗SCN种质资源的筛选以及抗SCN位点的鉴定方面取得了一些成果，但其调控分子机制以及如何高效的利用这些抗病基因仍需要更进一步的探索。线虫诱导型启动子能高效表达外源基因且不会在植物其他部位过多积累外源基因，对植物造成伤害，避免了抗病基因对植物产生的负效应。很多抗病基因在过表达或基因沉默的研究中出现致死表型，阻碍研究的继续开展以及抗病基因的应用。利用线虫诱导型启动子，能精确调控抗病基因的表达，为植物抗病抗逆研究以及抗病基因的应用提供新思路。

本发明通过构建大豆孢囊线虫诱导型启动子GmMYBp-GUS报告基因表达载体，发现GUS报告基因在大豆孢囊线虫侵染的取食细胞中被诱导表达；又分别构建GmMYBp连接已知的抗性基因(SHMT)的过量表达载体和RNAi载体，接种线虫后发现：在感病品种Will liams82中过量表达SHMT导致孢囊数减少，在抗病品种PI548402中沉默SHMT导致孢囊数增多，可知启动子GmMYBp在抗性基因精细调控方面具有高效率。

附图说明

图1为本发明涉及到的报告基因表达载体、过表达载体和RNAi载体示意图；

其中，图1中A为构建的GUS报告基因表达载体pSM101-GmMYBp-GUS质粒图谱，B为构建的过表达载体PSM101-GmMYBp-SHMT图谱，C为构建的pGRNAi1-GmMYBp-SHMT基因沉默载体图谱。

图2为RT-PCR检测GmMYB基因在大豆品种Williams 82、PI88788和PI548402受大豆孢囊线虫侵染3天和5天前后的转录水平。

图中Mock代表阴性对照，R3-3dpi和R3-5dpi代表三个品种接种大豆孢囊线虫3天和5天时的转录水平。

图3为启动子GmMYBp在转基因大豆根组织中的GUS染色示意图；

其中图中5dpi、8dpi分别代表接种大豆孢囊线虫5天和8天；图A、B、C中GmMYBp长度为2055bp，图D中GmMYBp为918bp；p代表启动子；Syn代表合胞体；N代表大豆孢囊线虫；标尺为200μm。

图4为启动子GmMYBp在大豆Williams 82中过表达抗性基因SHMT的抗性统计学分析及基因表达量分析示意图。

其中，图4的A、B中Control代表阴性对照(转化空载体的Williams 82)；B中1、2、3代表随机挑选的3条大豆Williams 82转基因阳性根。

图5为启动子GmMYBp在大豆PI548402中沉默抗性基因SHMT的抗性统计学分析及基因表达量分析示意图。

其中，图4的A、B中Control代表阴性对照(转化空载体的PI548402)；B中1、2、3代表随机挑选的3条大豆PI548402转基因阳性根。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特备说明，均来源于商业渠道。所用引物和序列测序均由北京奥科鼎盛生物技术有限公司完成。

实施例1：

启动子GmMYBp的分离和鉴定：

本发明通过受大豆孢囊线虫侵染3天后的大豆根部转录组数据筛选到一个大豆孢囊线虫诱导型启动子GmMYBp，该启动子的扩增步骤包括：

1)抽提来自大豆品种Williams 82(为公开应用的大豆品种)萌发5-7天的根组织的DNA，DNA抽提采用CTAB法；

2)以步骤1)中的DNA为模板，以GmMYBp-F和GmMYBp-R为引物进行扩增。

GmMYBp-F:GCGCAGCATAGTCAACCTTGG

GmMYBp-R:CGTCACTGCTCTGCAAAGCTC；

PCR用到的体系为20μl：DNA模板1μl，2×KOD FX buffer 10μl，2mM dNTP4μl，正向引物和反向引物各0.6μl，KOD FX酶0.5μl，加水至20μl；所用到的KOD FX buffer、dNTP、KODFX酶等均购自ToYoBo公司。

PCR反应条件如下：①98℃5分钟，②94℃30秒，③55℃30秒，④68℃2分钟，⑤从②－④循环30次，⑥68℃5分钟，⑦16℃保存。

3)将扩增出的基因全长连接到T/A克隆载体pMD18-T(购自TaKaRa公司)载体上，用M13F和M13R引物测序验证。

得到最终的启动子序列，序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2：

GmMYBp-GUS报告基因表达载体的构建

以GmMYBp启动子DNA(来自实施例1)为模板，PCR扩增包含酶切位点的GmMYBp启动子片段。扩增产物通过无缝克隆法(购自Vazyme公司的ClonExpressII重组克隆试剂盒，具体操作步骤参见试剂盒说明书)连入GUS表达载体中。

用来克隆包含酶切位点的启动子片段的引物如下所示：

GmMYBp-F:5'-ACGACGGCCAGTGCCctgcagGCGCAGCATAGTCAACCTTGG-3'

GmMYBp-R:5'-GGTGGACTCCTCCCgtcgacCGTCACTGCTCTGCAAAGCTC-3'

引物中ctgcag序列为PstI的酶切位点，引物中gtcgac序列为SalI的酶切位点，扩增得到2055bp启动子序列。

具体步骤如下：

1)将扩增得到的包含酶切位点的GmMYBp启动子片段经过无缝克隆法与载体连接，无缝克隆试剂盒采用ClonExpressII重组克隆试剂盒(购于Vazyme公司)，重组体系为5μl:5×CE II Buffer 1μl；线性化克隆载体0.5μl；插入片段扩增产物3μl；ExnaseII酶0.5μl。利用PstI和SalI酶切位点线性化过表达载体pSM101-GUS(该载体利用SalI和Bam HI将GUS报告基因插入到pSM101载体中获得)。同时对启动子GmMYBp进行了截短载体构建，通过元件分析网站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测到许多诱导相关元件集中在该启动子1kbp内，利用启动子上的HindIII酶切位点直接将GmMYBp截短为918bp(序列如SEQ ID NO：2所示)，并将其连入过表达载体pSM101-GUS。得到的载体分别命名为pSM101-GmMYBp-GUS和pSM101-GmMYBp918-GUS。

2)连接产物通过热激转化的方法(所用温度为42℃，时间为90秒)导入大肠杆菌DH5α中，在含有50mg/ml卡那霉素(购自BBI life sciences公司产品)的LA抗性培养基上涂皿培养；

3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入4ml含50mg/ml卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养14-16小时。质粒抽提后(购于Omega公司的质粒提取试剂盒，具体方法按试剂盒说明书)，用PstI和SalI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的GUS双元表达载体：pSM101-GmMYBp-GUS和pSM101-GmMYBp918-GUS(该质粒的图谱见图1中A)。

实施例3：

质粒载体的转化及转基因大豆GUS组织染色

1)pSM101-GmMYBp-GUS和pSM101-GmMYBp918-GUS通过电转化的方法(电转化仪为Thermo公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)分别导入发根农杆菌K599菌株中，。

2)利用发根农杆菌介导的毛状根发根体系转化大豆Williams 82，转化方法参照Cho等人报道的方法(Cho H J,Farrand S K,Noel G R,et al.High-efficiencyinduction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cystnematode.Planta,2000,210(2):195-204.)进行。经过一系列培养，得到转基因的GUS根组织。

3)将GUS根组织浸入GUS染色液中，GUS染色的采用真空泵压法。染色结束后，用70％酒精浸泡并在体式镜下观察拍照。GUS染色液的体系为：50mmol/L磷酸氢钠缓冲液(pH＝7.0)、10mmol/L EDTA、0.1％(V/V)Triton X-100、0.5mmol/L铁氢化钾和0.5mmol/L亚铁氢化钾，N，N-二甲基甲酰胺(DNF)溶解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)粉剂，配成20mmol/L的溶液。线虫接种后5天，将毛根浸没在GUS染色液中，于真空泵中真空抽取10min，分5min抽一次。置于保温箱37℃保温16-24h，转入70％乙醇脱色保存。

GUS染色结果如图2所示：在感病品种Williams82接种大豆孢囊线虫(Race 3)5天和8天后及抗病品种PI548402接种5天后，GUS基因在线虫侵染部位特异性诱导表达。且无论是全长还是截短的GmMYBp启动子，都能启动GUS基因在线虫侵染部位特异性表达。

实施例4：

GmMYBp表达的RT-PCR分析

为了进一步确定GmMYBp启动子是否受大豆孢囊线虫诱导表达，我们利用RT-PCR对启动子的表达进行分析，提取受大豆孢囊线虫Race 3侵染3天的三个大豆品种Williams82、PI88788和PI548402及对照组(未被线虫侵染的生长3天的大豆Williams 82、PI88788和PI548402)的根组织的RNA，反转录cDNA作为模板，以SKIP16基因作为内参照，分析GmMYBp启动子的表达情况，具体操作步骤如下：

1)收集受大豆孢囊线虫Race 3侵染3天的三个大豆品种Williams 82、PI88788和PI548402及对照组的根组织，RNA抽提采用RNA提取试剂盒(购于康为世纪的Ultrapure RNAKit(DNase I)试剂盒，具体操作步骤见该试剂盒的说明书)

2)利用反转录试剂盒对提取的RNA进行逆转录，体系如下：①配制混合液1：总RNA1μg，DNaseI 0.5U，10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置30分钟以除去DNA；②在混合液1加2μl DRR，室温孵育2分钟去除DNaseI，800rpm/min离心1分钟，取上清液至新管；③向上清液中加入2μl 500μg/ml的oligo(dT)(混合液2)，混匀后置于70℃水浴中温浴5分钟，立即置于冰上；⑤配制混合液3：混合液2 13μl，M-MLV 5xReaction buffer 5μl，RecombinantRNasin 0.75μl，2.5mM dNTP mixture 5μl，M-MLV反转录酶1μl，DEPC处理水加至25μl，混匀后将混合液3置于42℃水浴锅内温浴1小时；⑤反应结束后将混合液3置于90℃干浴3分钟；⑥-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Vazyme公司。

3)利用qRT-PCR检测GmMYBp的表达变化(qRT-PCR试剂购自Vazyme公司，反应体系参见说明书)。qRT-RCR仪为BIO-RAD CFX-96型，内参基因为：SKIP16(基因登录号为Glyma.12g051100)，PCR程序为：95℃预变性5分钟，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。qRT-RCR检测所用引物序列为：

GmMYBpRT-F：5'-GAATTGAGCTTTGCAGAGCAGTGAC-3'

GmMYBpRT-R：5'-GAAGGGCACGCCAGATTCCA-3'

结果如图3所示，在三个大豆品种中，未受线虫Race 3侵染的根组织中基因GmMYB表达水平低，而在线虫Race 3侵染3天和5天后，基因GmMYB的表达显著上调，结合GUS染色结果(图2)可知，基因GmMYB在大豆根部的本底表达量低，但在大豆孢囊线虫侵染时表达水平显著上调，且在线虫侵染位点特异性表达，说明该启动子GmMYBp受大豆孢囊线虫诱导表达。

实施例5：

抗性基因SHMT编码区CDS的扩增

1)抽提来自大豆品种PI548402萌发5天的根组织的RNA，RNA抽提采用RNA提取试剂盒(购于康为世纪的Ultrapure RNA Kit(DNase I)试剂盒，具体操作步骤见该试剂盒的说明书)。按照实施例4中步骤2)的方法将提取的RNA逆转录为cDNA。

2)然后根据Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)公布的SHMT(Glyma.08g108900，丝氨酸羟甲基转移酶)上游全长CDS序列，设计引物扩增基因SHMT序列：即用SHMT-F和SHMT-R扩增得到。

用来克隆基因SHMT的引物如下所示：

SHMT-F:5'-ATGGCACCAATGCCCAATG-3'

SHMT-R:5'-CTAATCCTTGTACTTCATTTCAGATACCA-3'

扩增得到1416bp的序列，引物设计参考Liu等的论文(Liu S,Kandoth PK,WarrenSD,Yeckel G,Heinz R,Alden J,Yang C,Jamai A,El-Mellouki T,Juvale PS,et al.Asoybean cyst nematode resistance gene points to a new mechanism of plantresistance to pathogens.Nature,2012.492:256–260)。

3)将扩增出的基因片段连接到T/A克隆载体pMD18-T(购自TaKaRa公司)载体上，用M13F和M13R引物测序验证。

实施例6：

过表达载体和RNAi载体的构建

对本发明所需要的DNA，通过PCR方法进行扩增得到启动子片段及抗性基因SHMT的CDS序列，具体步骤是：根据Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)公布的序列，设计包含酶切位点的引物，分别以大豆启动子(来自实施例1)和SHMT基因CDS(来自实施例5)为模板，通过PCR扩增获得目的片段。扩增截短的启动子产物通过无缝克隆法连接到过表达载体和沉默载体上；扩增的抗性基因CDS通过T/A克隆连接到pMD18T(购于TaKaRa公司)进行测序验证，再经过SalI和XbalI酶切连接后连入过表达载体和AscI、SwaI和BamHI、AvrII酶切连接后连入沉默载体中。

用来克隆包含酶切位点的启动子片段的引物如下所示：

过表达载体中使用的启动子和抗性基因的序列为：

OEGmMYBp-F：5'-ATGACGGCCAGTGCCctgcagCAAGAATTTACCAATTTAAGATGTACG-3'

OEGmMYBp-R：5'-GATGGTGATGATAAGgtcgacCGTCACTGCTCTGCAAAGCTC-3'；

OESHMT-F：5'-CTgtcgacATGGCACCAATGCCCAATG-3'

OESHMT-R：5'-GTtctagaCTAATCCTTGTACTTCATTTCAGATACCA-3'

RNAi载体中使用的启动子和抗性基因的序列为：

RiGmMYBp-F：5'-TAGCCAAAATCGATCactagtCAAGAATTTACCAATTTAAGATGTACG-3'

RiGmMYBp-R：5'-GATTACCATTTAAATggcgcgccCGTCACTGCTCTGCAAAGCTC-3'

RiSHMT-F：5'-GTcctaggggcgcgccTACGGCGGCAATGAATACATC-3'

RiSHMT-R：5'-TAggatccatttaaatGATGTAGCCGGTGGTGGAGTT-3'。

具体步骤如下：

1)将扩增得到的启动子片段的经过无缝克隆法与载体连接，无缝克隆试剂盒采用Clon Express II重组克隆试剂盒(购于Vazyme公司)，重组体系体积为5μl：5×CE IIBuffer1μl；线性化克隆载体0.5μl；插入片段扩增产物3μl；Exnase II酶0.5μl。利用PstI和SalI酶线性化过表达载体pSM101、SpeI和AscI酶线性化沉默表达载体pGRNAi1(Cook DE,Lee TG,Guo X,Melito S,Wang K,Bayless AM,Wang J,Hughes TJ,Willis DK andClemente TE,et al.Copy number variation of multiple genes at Rhg1mediatesnematode resistance in soybean.Science,2012.338(6111):1206-1209)。将连入启动子的载体重新命名为pSM101-GmMYBp、pGRNAi-GmMYBp。

2)将SHMT的CDS片段的T/A克隆用SalI和XbalI酶切，回收目标条带，与SalI和XbalI酶切的过表达载体质粒pSM101-GmMYBp连接；用AscI、SwaI和BamHI、AvrII分步酶切后连入沉默表达载体质粒pGRNAi-GmMYBp。

3)连接产物通过热激转化的方法导入大肠杆菌DH5α，在含有50mg/ml卡那霉素的LA抗性培养基上涂皿培养；

4)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入4ml含50mg/ml卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。抽提质粒，用对应的限制性内切酶酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的过表达载体pSM101-GmMYBp-SHMT(该质粒的图谱见图1中B)和沉默表达载体：pGRNAi1-GmMYBp-SHMT(该质粒的图谱见图1中C)；

实施例7：

质粒载体的转化及转基因大豆表型及阳性率检测

1)把新构建的超表达载体pSM101-GmMYBp-SHMT和沉默表达载体pGRNAi-GmMYBp-SHMT(来自实施例6)通过电转化的方法导入发根农杆菌K599菌株中。将转化后的菌株分别命名为OEGmMYBp-SHMT和GmMYBp-SHMTRi。

2)将上步得到的过表达载体OEGmMYBp-SHMT利用发根农杆菌K599转入感病品种Williams 82中；沉默表达载体GmMYBp-SHMTRi利用发根农杆菌K599转入大豆抗性品种PI548402中，获得阳性转基因大豆根。

3)在得到的阳性转基因大豆根部距离根尖1cm处接种大豆孢囊线虫二龄幼虫320条，无菌环境中培养基培养25-30天后，在体式镜下统计根部形成的孢囊数目，以转化空载质粒pSM101的相应大豆品种为对照。利用统计学方法计算每个转基因根的孢囊的平均数，利用STDEV公式计算方差、T.TEST公式计算显著性系数p值。如图4A和图5A所示，其中1、2、3代表转基因不同阳性根。“*”代表差异显著，P<0.05；“**”代表差异极显著，P<0.01。

结果如图4中A和图5中A所示：图4中A为感病品种Williams 82转入GmMYBp启动子的过表达质粒，接种大豆孢囊线虫25天后的孢囊统计柱状图。从图中可知，过表达根系相比对照根系所形成的孢囊数目显著减少，表明过表达根系抗性增强。图5中A为抗病品种Williams 82转入GmMYBp启动子的沉默质粒，接种大豆孢囊线虫25天后的孢囊统计柱状图。可知，沉默表达根系相比对照根系所形成的孢囊数目显著增加，沉默根系抗性明显下降。

4)为了检测过表达和RNAi转基因根的启动子调控抗性基因的表达量，申请人采用qRT-RCR的方法对转基因大豆根进行了表达分析。抽提来自接种大豆孢囊线虫Race 3二龄幼虫5天的大豆阳性根的总RNA，RNA抽提用的试剂是采用康为世纪公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；按照实施例4的方法进行反转录，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测抗性基因的表达量(试剂购自Vazyme公司，反应体系参见说明书)。按照实施例4步骤2进行qRT-RCR检测。qRT-RCR检测所用引物序列为：

SHMTRT-F：5'-TACGGCAATGAATACATCG-3'

SHMTRT-R：5'-GGAGCCGGAGTAGGGCTGGAC-3'

qRT-PCR结果如图4中B和图5中B所示：在转基因根系中，过表达根OEGmMYBp-SHMT：1-3中SHMT有不同程度的过表达，转基因根OEGmMYBp-SHMT：1-3的表达与转入空载的Williams 82相比，增加了1.81-6.69倍，说明启动子GmMYBp转基因根系的过表达效果好。图5中B中沉默根GmMYBp-SHMTR：1-3中SHMT表达均受抑制：转基因根GmMYBp-SHMTRi的表达与转入空载的PI548402相比，抑制了3.8-6.21倍，说明启动子GmMYBp沉默转基因根系的沉默效果好。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 大豆孢囊线虫诱导型启动子及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2055

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgcagcata gtcaaccttg gttacgatgg tttgagtagc aattgggcca agaccgaaaa 60

tatatatatg gagtcacgga gagatattag taggaaatct tgcagtgctc ttattttatt 120

ttattttcat tttggtttcg tgcatacaag aggattctca gccaacatgc attgggagat 180

taattctttt ttaaaacgta aaaattagta tagtgattat tttacctctc cacatccata 240

actaataaaa ttaaagttat aaatagtatt accaatgaga aacattaaaa taataagatt 300

atgattatgt aatgttaagg ataattttga aaaaataaat aatttaatag tattaaataa 360

atcaattaat ttatttttct taaaaaatta tataattaga tcttgatcgg tgagagtaat 420

gattatgtgg acctttgtta gtcacatttt ttcattagtt tgacatgccc gcacactgtt 480

aaattttatt ttttgggtga atcgaatcac tgttacatgt ttctttttct ttcttctttt 540

tttataaatc actgttacat gtttctaaaa tatggttatt tctcacgcta atattcaaac 600

acatgttttg gaaaaataat atactgtagt gtatacatga catcatgcac gagcttcttt 660

actatacttc gcctttcaga caaatggttt tgtttgggcc cgttttttcg tacacaattt 720

ctttccctat aattctatgg aatttttgtc tcgtttgaag atctttgcgg tagatgaata 780

ccccggatgt attttttcag ctacattgcg accaaaaaag tatgctactt tggactttta 840

cttctttaag tgttacttat tgcgaacaca cacacaattt taccaattat ttatgaaaca 900

tgtgtgaaca ttttgttcga taaatacaaa attaaactga aaaaaaaggt taagggattt 960

ggaatgaagg agtatatttg ctctatacag ttctcatatc aactcgtgca ctcacttttg 1020

gagttttggt tctgccaagc aattcttaaa aaaaatagaa caagttgtgt cttatttaaa 1080

ttttcatgtg atcaattata taaacaaaaa ggtaagcata aaacatataa aacaaagctt 1140

tatagattaa ttttatcaag aatttaccaa tttaagatgt acgtatgact tttatttctt 1200

ggcatgaagt tatcatttta gttttttttt ttttgacaaa aaaaactaat taatttgtat 1260

atatgtagcc tttcatgttc tttctaaatc aaatatacat cacgaaaatg gaagcaagcg 1320

aatataatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 1380

atatatatag agagagagag agagagagag agagattgag aaatgaaaat ataatgccaa 1440

aaaaatttac atgctaaatt ctgaattcat taatagagta tatggtttaa cctagaacca 1500

tataaaagac tgaacattct actattctag cacttcacgg caatgagtat aacggaagga 1560

gatgacataa cagtagtaag acatgcacga atccattttg ccccgtgtac tacttttgac 1620

taatggacca aaagaatgat ttatttaggc tatacagaag ccaaagtatt gaagagtcga 1680

agcaacctag aaggtgagtt atgttgatat ataaagtcgc ttttgttgca tataaaatta 1740

tgtctacaag ttaatttctt ttggtggccc atctctgttg tgaaattgtg atcagatcac 1800

cctatcttaa aattcaaatg cgcgtgcgtg ctttgaagag agaaaaacag gaataagaaa 1860

accaattaaa ggaatagtat caagtacctt tttgaaaacc acacagctta tttggaccgc 1920

atctacatta tattttcact actggcatag aggatattaa ttagaaccca atggctacat 1980

atcctgaaat taagagctag agctaccaat tggtttgtgc agagaaatag aattgagctt 2040

tgcagagcag tgacg 2055

<210> 2

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctttatagat taattttatc aagaatttac caatttaaga tgtacgtatg acttttattt 60

cttggcatga agttatcatt ttagtttttt tttttttgac aaaaaaaact aattaatttg 120

tatatatgta gcctttcatg ttctttctaa atcaaatata catcacgaaa atggaagcaa 180

gcgaatataa tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 240

tatatatata tagagagaga gagagagaga gagagagatt gagaaatgaa aatataatgc 300

caaaaaaatt tacatgctaa attctgaatt cattaataga gtatatggtt taacctagaa 360

ccatataaaa gactgaacat tctactattc tagcacttca cggcaatgag tataacggaa 420

ggagatgaca taacagtagt aagacatgca cgaatccatt ttgccccgtg tactactttt 480

gactaatgga ccaaaagaat gatttattta ggctatacag aagccaaagt attgaagagt 540

cgaagcaacc tagaaggtga gttatgttga tatataaagt cgcttttgtt gcatataaaa 600

ttatgtctac aagttaattt cttttggtgg cccatctctg ttgtgaaatt gtgatcagat 660

caccctatct taaaattcaa atgcgcgtgc gtgctttgaa gagagaaaaa caggaataag 720

aaaaccaatt aaaggaatag tatcaagtac ctttttgaaa accacacagc ttatttggac 780

cgcatctaca ttatattttc actactggca tagaggatat taattagaac ccaatggcta 840

catatcctga aattaagagc tagagctacc aattggtttg tgcagagaaa tagaattgag 900

ctttgcagag cagtgacg 918

Claims (5)

1.一种分离的大豆孢囊线虫诱导型启动子，所述启动子为SEQ ID NO.1所示的多核苷酸。

2.一种分离的大豆孢囊线虫诱导型启动子，所述启动子为SEQ ID NO.2所示的多核苷酸。

3.权利要求1或2所述的启动子在制备抗线虫大豆中的应用。

4.权利要求1或2所述的启动子在制备线虫敏感型大豆中的应用。

5.权利要求1或2所述的启动子在筛选抗线虫基因中的应用。