CN103667290A

CN103667290A - 玉米营养器官特异性启动子及其应用

Info

Publication number: CN103667290A
Application number: CN201310607845.2A
Authority: CN
Inventors: 程备久; 董庆; 项艳; 江海洋; 朱苏文; 李晓明; 徐倩倩; 杨建平
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-11-25
Also published as: CN103667290B

Abstract

本发明涉及一种玉米营养器官表达启动子，及其用于构建表达载体的用途。该启动子能在玉米营养器官中表达。本发明是从玉米B73自交系中克隆出的一段启动子序列，将改启动子替换双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，驱动下游GUS基因的表达，通过转化水稻（中花11）验证功能，确定133bp能驱动GUS基因只在营养器官中表达，不在种子中表达，将会在转基因抗虫、抗病等方面的玉米培育中有很好的应用前景。

Description

玉米营养器官特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物启动子分离鉴定与应用。本发明克隆133bp启动子序列能启动下游编码基因在水稻营养器官中表达，生殖器官中不表达。

背景技术

启动子是重要的顺式作用元件，调控基因的转录和表达，根据启动子的转录模式不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。选择何种启动子来驱动基因的表达，是当前基因工程研究的热点。

器官特异性启动子是启动子类型之一，能驱使外源基因在植物特有部位高效表达，减少能源浪费和对植物产生的不利影响，且能克服对基因转化植株重复使用同一启动子而导致的基因沉默现象，从而可以根据需要选择特定部位或特定空间表达的启动子调节基因转录与表达。从本质上说，这是由于受到各种组织细胞生理状态，发育阶段及其某种物理化学信号诱导等多种因素相互作用引起的结果。该类型启动子除了具备启动子一般结构特征外，还含有特殊的组织特异性序列、增强子、沉默区以及富含AT序列等。

已经从植物中分离得到了不同类型的器官组织特异性启动子，包括花粉、维管束、根、叶、茎、种子或果实、薄壁组织，分生组织，气孔等。Azria等（2011）从水稻中分离到了一种Orys1花粉特异性表达启动子；Kovalchuk等（2012）从小麦中获得了TaPR61种子特异性启动子，该基因是一个能编码含有疏水信号肽的脂转运蛋白基因，其启动子只在种子中表达；Cai等（2007）分离克隆了一个水稻来源的绿色组织特异性启动子PD540，他们将其与cry1AC基因相融合，得到的转基因水稻，有很好的抗虫性，而且在种子中检测不到蛋白的表达；刘昱辉等(2001)克隆到在-1677~1380bp这段序列能驱动基因在维管束中特异性表达。

玉米作为重要的粮食、油料及其饲料作物，对其基因工程的研究具有重要的意义。目前很少有报道玉米中，在营养器官（根、茎、叶）部位表达，而生殖器官（花、种子）不表达的启动子，将该基因与GUS报告基因融合，转化到水稻中，验证该段启动子的功能，该启动子为基因工程研究中获得抗虫抗病及营养高效型新品种的研发创造条件，具有重要的生产价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米营养器官特异性表达启动子及其表达载体，以及启动子和表达载体的用途。本发明所提供的玉米营养器官特异性表达启动子为PZmGL6，其来源于玉米属玉米（Zea mays L.）B73自交系，该启动子片段大小为133bp，能在转基因水稻的营养器官中特异性表达，在生殖器官等其他器官中不表达。

本发明所涉及的设计方案为一种玉米营养器官特异性表达启动子，具有序列表中SED ID NO:1项下的序列。PZmGL6启动子通过提取玉米B73自交系的总DNA克隆获得，经过测序其为133bp。

本发明还提供了一种营养器官特异性表达的载体，其特征在于转入了前述的营养器官特异性表达的启动子，并在水稻中进行验证。利用前述的玉米营养器官特异性表达启动子取代植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pCAM–PZmGL6。通过农杆菌介导法转化水稻，获得了六组独立转化事件，共53株转基因植株，PCR检测有36株阳性株。并对阳性植株的T₀和T₁代的不同组织部位都进行了GUS组织化学染色。GUS组织化学染色鉴定证实PZmGL6启动子为营养器官特异性表达启动子，pCAM–PZmGL6为一种营养器官特异性表达的载体。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种玉米营养器官特异性启动子，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述启动子用于在植物营养器官中特异性表达目的基因的用途。

在其他实施方案中，本发明提供了包含所述玉米营养器官特异性启动子的植物表达载体。在一个实施方案中，所述载体是用所述玉米营养器官特异性启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，从而构建得到的植物表达载体。在另一实施方案中，所述植物表达载体能调控目的基因在植物营养器官中特异性表达。

在其他实施方案中，本发明还提供了所述启动子用于构建在植物营养器官中特异性表达目的基因的植物表达载体的用途。

本发明提供的一个营养器官特异性启动子PZmGL6在水稻的营养器官中特异表达，该启动子可以控制筛选标记基因在正常水稻营养器官中特异表达，能指导外源基因在植物发育过程中特定时空的表达，用该方法筛选转基因水稻具有阶段性强、灵敏度高的优点。而且由于该启动子只能驱动下游基因在水稻的各种营养器官中表达，生殖器官中不表达的特点，可以将其连接有益的目的基因，转入植物中，提高植物的各种生理功能，比如抗虫害、抗病害，提高营养物质吸收能力，增强抗逆境胁迫能力等，且在种子中不表达，不影响种子品质与性状。该启动子将会在玉米或其他种子类作物育种中有很好的应用价值。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1：PZmGL6启动子分子检测结果。A为PCR结果；B为双酶切结果。

M：DL-2000 1：条带大小为133bp 2：HindIII和NcoI双酶切条带

图2：转基因植株PCR检测结果。A为PZmGL6启动子PCR结果；B为潮霉素基因PCR结果。

M：DL-2000 ck+：阳性对照 ck-：阴性对照 1~21：转基因株

图3：GUS基因的组织化学染色结果。A：幼叶；B：幼茎；C：幼根；D：成熟叶(横切面)；E：成熟茎(横切面)；F：成熟根；G：颖壳；H：穗茎；I：花药；J：花粉；K：乳熟期1；L：乳熟期2；M：乳熟期3；N：蜡黄期；O：完熟期(剖面)；P：萌发7d(剖面)。结果显示：PZmGL6启动子能驱动GUS基因在营养器官(A图的幼叶，B图的幼茎，C图的幼根，D图的成熟叶，E图的成熟茎，F图的成熟根，G图的颖壳，H图的穗茎，P图的幼芽)中表达，生殖器官（I图的花药，J图的花粉，K图的胚乳和胚，L图的胚乳和胚，M图的胚乳和胚，N图的胚乳和胚，O图的胚乳和胚）中不表达。

具体实施方式

所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上海生工公司测序；pTEAY-T1、Taq酶、Trans5α感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶HindⅢ和EcoI, T₄连接酶购自TaKaRa 公司；相应的抗生素来自上海生工和SIGMA公司；其余试剂均为国产分析纯。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1. 玉米营养器官特异性启动子PZmGL6的克隆

根据NCBI网站上公布的PZmGL6启动子全长序列，设计PCR扩增该片段的引物，上游加HindIII（AAGCTT）酶切位点，下游加NcoI（CCATGG）酶切位点

引物序列如下：

引物1（上游引物）：5’-CCCAAGCTT TGTCAGCACAAGCAACAAGTCCAAA -3’

引物2（下游引物）：5’-CATGCCATGGCTTTGCTTTGCCGTGATAGG-3’

以提取玉米B73基因组DNA（全式金公司植物基因组试剂盒提取）为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR反应体系为：

10×PCR buffer	5 μL
		dNTP(10mM)	4 μL
引物1	2 μL
		引物2	2 μL
DNA模板	1 μL
		Taq酶	0.2 μL
ddH₂O	至50 μL

PCR反应条件为：预变性：94℃ 6min；变性：94℃ 30s；退火：58℃ 30s；延伸：72℃ 30s，34个循环；总延伸：72℃ 10min。

反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，见图1A。回收并纯化133bp的目的片段；将回收片段与pEASY T1 Cloning Vector（全式金生物技术有限公司）连接，转化到大肠杆菌感受态Trans5α细胞(全式金生物技术有限公司)中；PCR和酶切检测筛选阳性克隆；对检测结果初步判断正确的连接片段，送去进行测序（上海生工公司），测序结果如:序列表中SEQ ID NO:1的DNA序列所示，由133bp个碱基组成，将其与NCBI上报道的序列比对，结果完全一致。

实施例2.PZmGL6基因启动子表达载体的建立

将已连接到pEASY T1 Cloning Vector上的PZmGL6片段（小片段）与农杆菌双元载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子（大片段）用HindIII和NcoI酶进行双酶切，于37℃水浴锅中，3h，酶切30μL体系如下：

大（小）片段	22μL
		BSA	3μL
10×buffer K	3μL
		HindIII	1μL
NcoI	1 μL
		总体积	30 μL

将上述大小片段用T4DNA连接酶连接，25℃连接2~12h ，连接体系如下：

大片段	1 μL
		小片段	7 μL
10×ligase buffer	1 μL
		T₄DNA ligase	1 μL

取3~5 μL的构建好的载体pCAM–pPZmGL6质粒轻轻打入到200μL EHA105农杆菌感受态细胞中，冰浴5 min，液氮速冻1min， 37℃水浴5 min后，加入200μL YEP液体培养基，28℃，220 rpm预表达4~5h；10000 rpm离心30s，弃上清，加入100μL YEP液体培养基，重新悬浮细胞，涂布于含100 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif的YEP固体平板上，28℃培养约24~48h；挑取平板上长出的微黄色的单菌落，接种于含100μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEP液体培养液中，摇菌24~48h；待菌液浑浊（橙黄色），提取质粒；分别用PCR和双酶切验证，见图1B。

实施例3. 农杆菌介导水稻转化

通过根癌农杆菌(Agrobacterum一mediated)农杆菌介导法将含pCAM–PZmGL6表达载体的农杆菌导入水稻中。

3.1 水稻成熟胚诱导愈伤的获得

在实验前，对实验所用的成熟种子在强太阳光下晒3~4h后对其去壳处理。先用灭菌水洗，水至清，再用75%乙醇浸泡5min，然后用灭菌水、次氯酸和吐温配制的杀菌水（具体比例：灭菌水：次氯酸=1：1，总体积：吐温=1mL:1ul）浸泡30min，期间不停的摇晃，从而进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗，直至水变澄清，再将成熟种子放在灭菌滤纸上吸干水分后，取其于愈伤于诱导培养基上，26±1℃培养；10~15d后，将诱导出的乳黄色愈伤转入继代培养基上继代培养。每两周继代培养一次，继代两次后挑选继代培养5~7d，将色泽淡黄的愈伤用于共培养。

3.2 用于转化水稻的农杆菌菌液的准备

将含有pCAM–pPZmGL6 表达载体的农杆菌接种于YEP液体培养基（含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL 利福平）中，28℃振荡培养至OD₆₀₀=0.6~1.0；室温下5000 rpm离心5min收集菌体，随后将其悬浮于液体共培养基中，调整菌体浓度至OD₆₀₀=0.4，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

3.3 农杆菌侵染水稻营养器官

挑选色泽鲜嫩、呈乳黄的愈伤，集中放入100 mL无菌三角瓶中，加入上述制备好的农杆菌悬浮液（悬浮液以淹没愈伤为好）；28℃，220 rpm摇床上培养20~30min；倒掉菌液，将侵染后的愈伤置于含无菌滤纸的培养皿上吸去多余菌液，随即转移到固体共培养基上，22℃暗培养2~3d。

3.4 选择培养

将共培的愈伤，先用灭菌水清洗直至水变澄清，弃去清洗液，转入含有羧苄青霉素（100mg/ml）的溶液中振荡清洗30min以上，用无菌滤纸吸干，置于含无菌滤纸的培养皿中干燥处理；再将愈伤挑选到含有羧苄青霉素（500mg/ml）和潮霉素（50mg/L）筛选培养基上，28℃光照培养30d左右，直至长出新的抗性愈伤。

3.5 抗性愈伤的分化

从筛选培养基上挑选长势较好呈乳黄色的新愈伤于含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先28℃暗培养3d，然后转移到30℃条件下进行全光照培养， 15~30d，有绿点出现；30~40d后会分化出幼苗。

3.6 生根、壮苗和移栽

待分化出的幼苗h≥3cm时，可转移至生根培养基上，培养2~3周；选择h≥15cm、根系发达的幼苗，加水室温下炼苗2~3d后，用温水洗去培养基，移入含水稻培养土的水桶中栽培。待苗生长健壮后移入水田中生长。

实施例4. 转基因水稻的的鉴定

4.1转基因水稻的PCR分子检测

为了检测转基因水稻，一般以提取的转基因水稻总DNA为模板，用目的基因PZmGL6启动子片段和表达载体上所含的潮霉素基因为检测对象，设计引物，扩增片段，用以初步鉴定转基因植株，图2为部分转基因株的PCR检测。

用目的基因检测的引物序列如下：

引物1（上游引物）：5’-CCCAAGCTT TGTCAGCACAAGCAACAAGTCCAAA -3’

引物2（下游引物）：5’-CATGCCATGGCTTTGCTTTGCCGTGATAGG-3’

PCR反应体系和反应条件如上（2.玉米营养器官特异性启动子PZmGL6的克隆）

用于检测潮霉素抗性基因的引物序列如下：

引物3（上游引物）：5’-TAGGAGGGCGTGGATATGGC-3’

引物4（下游引物）：5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’

PCR反应体系参照PZmGL6的克隆，反应条件如下：PCR反应条件为：预变性：94℃ 10min；变性：94℃ 30s；退火：55℃ 30s；延伸：72℃ 1min，34个循环；总延伸：72℃ 10min。

4.2 GUS基因的组织化学染色

分子检测结果，初步鉴定为转基因株后，分别对转PZmGL6启动子植株不同部位进行GUS组织化学染色。具体操作步骤如下：

(1)取转基因水稻不同的组织：将各部位移入试管中，加入适量的GUS固定液，室温下温和摇动30~60min, 用50nmol/L的磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗10~15min，重复几次，以除去组织中残留的固定液；(2) 对染色液进行1min中真空抽滤，将各组织置于GUS染色液中保温4~12h；结束后，将染色组织先置于75%乙醇漂洗脱色，再用50%和20%乙醇各侵泡20min以上，直到材料呈白色；肉眼或显微镜下观察，组织上有蓝色小点即为GUS表达部位。

如图3所示GUS基因的组织化学染色结果。A：幼叶；B：幼茎；C：幼根；D：成熟叶(横切面)；E：成熟茎(横切面)；F：成熟根；G：颖壳；H：穗茎；I：花药；J：花粉；K：乳熟期1；L：乳熟期2；M：乳熟期3；N：蜡黄期；O：完熟期(剖面)；P：萌发7d(剖面)。结果显示：PZmGL6启动子能驱动GUS基因在营养器官(A图的幼叶，B图的幼茎，C图的幼根，D图的成熟叶，E图的成熟茎，F图的成熟根，G图的颖壳，H图的穗茎，P图的幼芽)中表达，生殖器官（I图的花药，J图的花粉，K图的胚乳和胚，L图的胚乳和胚，M图的胚乳和胚，N图的胚乳和胚，O图的胚乳和胚）中不表达。

Claims

1.一种玉米营养器官特异性表达启动子，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的启动子用于在水稻营养器官中特异性表达目的基因的用途。

3.权利要求1所述的启动子用于在植物营养器官中特异性表达目的基因的用途。

4.包含如权利要求1所述玉米营养器官特异性表达启动子的植物表达载体。

5.根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于所述载体是用所述玉米营养器官特异性表达启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，从而构建得到的植物表达载体。

6.权利要求4或5所述的植物表达载体用于在水稻营养器官中特异性表达目的基因的用途。

7.权利要求4或5所述的植物表达载体用于在植物营养器官中特异性表达目的基因的用途。

8.根据权利要求4或5所述的植物表达载体，其特征在于能作为一种转化体。

9.根据权利要求4或5所述的植物表达载体，其特征在于能以根癌农杆菌作为宿主，导入水稻组织细胞中。

10.权利要求1所述的启动子用于构建在植物营养器官中特异性表达目的基因的植物表达载体的用途。