CN103819549B - 一种水稻蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明所提供的应用为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：a1）调控植物抗旱性；a2）选育抗旱性提高的植物品种。本发明利用可以引导外源基因在植物中表达的载体，将所述蛋白子的编码基因（OsFLP基因）导入水稻细胞进行过量表达，或将OsFLP基因表达进行干扰，可改变转基因植株对干旱的耐受能力。本发明对于植物耐旱的分子机制的研究，植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义。

Description

一种水稻蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种水稻蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。
背景技术
随着全球气候变化，非生物胁迫对植物生长的影响已经成为人类面临的重大挑战之一，严重制约着植物的生长和发育，在农业生产中直接造成作物减产。非生物胁迫是指在特定环境下，任何非生物因素对植物所造成的不利影响，包括干旱、低温、盐碱等因素，其中干旱是制约植物生长的一个最主要的胁迫因素。而水稻是目前全世界最重要的粮食作物之一，是全世界56%人口的主食。据统计非生物胁迫中的干旱胁迫对水稻造成的减产已经是其他因素造成减产的总和，因此提高水稻的耐干旱能力已经是现代社会解决的关键问题。研究水稻在干旱胁迫下的功能基因调节及胁迫应答的分子机理已成为当今最热点的课题之一，通过基因工程技术与突变体筛选培育手段获得非生物胁迫耐受性相关的基因品种对提高农业生产具有十分重要的实践意义。
水稻（OryzasativaL.）成为继拟南芥（Arabidopsisthaliana）之后的另外一类重要的模式植物，它比其他作物如玉米、小麦等的基因组小，基因组长度大约为420万碱基对，估计约有2-4万个表达基因。到目前为止参与非生物胁迫应答响应的很多基因已经被研究报道，根据功能将其分为以下几类：（1）渗透保护大分子，包括氨基酸类物质、胺类物质、糖和糖醇类物质。与这些大分子合成相关的基因被认为对植物非生物胁迫响应有作用。（2）胚胎发育后期丰富蛋白（LateEmbryogenesisAbundantProteins，LEA），过量表达该类基因可以有效的提高植物对干旱和高盐的耐受性。（3）抗氧化基因，植物受到非生物胁迫后，体内的活性氧化物（ReactiveOxygenSpecies，ROS）含量上升，从而对植物细胞造成伤害。清除ROS的系统可有效清除细胞内ROS，已有研究与ROS清除相关的基因编码蛋白包括，超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽硫转运蛋白或谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶（GR）、单脱氢抗坏血酸还原酶等。（4）膜转运蛋白，调控膜离子转运蛋白的表达是提高盐胁迫的重要手段。如拟南芥中的Na+/H+转运蛋白的AtNHX1基因及SOS信号途径中的SOS1（SaltOverly-Sensitive1）同样编码质膜Na+/H+转运蛋白。（5）转录因子，是在逆境胁迫信号途径中发挥关键作用的调节蛋白。与胁迫响应基因表达有关的转录因子家族bZIP、MYC/MYB、HD-Zip、Znfinger和ABI3/VP1家族。（6）蛋白激酶，蛋白磷酸化是一种重要的蛋白翻译后修饰，这种作用在植物应答非生物胁迫中起着重要作用。如MPK3和MPK6以及SOS2（SaltOverlySensitive2）。（7）激素信号，激素合成及信号途径是传递胁迫信号的到胞内的重要过程。包括ABA，生长素，茉莉酸和水杨酸。（8）miRNA，是一类具有20个左右核苷酸长度的RNA分子，它们能为RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）提供底物特异性，从而调节靶基因的表达，在非生物胁迫中起到重要作用。如此众多类型的调控非生物胁迫响应的途径已经被揭示，由于多数是在拟南芥中进行研究，而在大田作物中的研究还较为匮乏，因此进一步在水稻中挖掘和探索与非生物胁迫响应相关的新基因是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。
本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质（命名为OsFLP蛋白）或其编码基因（命名为OsFLP基因）在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控植物抗旱性；
a2）选育抗旱性提高的植物品种。
在上述a1）中，所述调控植物的抗旱性，具体体现在：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的OsFLP蛋白在所述植物中的表达量越低，所述植物的抗旱性越弱；所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的OsFLP蛋白在所述植物中的表达量越高，所述植物的抗旱性越强。
在上述a2）中，在实际应用中，当所选育的植物品种为抗旱性强的植物品种时，需将所述OsFLP蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交。当所选育的植物品种为抗旱性低的植物品种时，需将所述OsFLP蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交。
所述OsFLP蛋白或其编码基因在调控植物体内干旱胁迫响应基因表达量中的应用也属于本发明的保护范围。
所述调控植物体内干旱胁迫响应基因表达量，具体体现在：当所述植物体内的所述OsFLP蛋白或其编码基因表达量增高时，所述干旱胁迫响应基因的表达量会相应增高。
所述干旱胁迫响应基因可为如下中的至少一种：OsLEA3基因、OsDREB2A基因和OsNAC6基因。
本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为如下（A）或（B）：
（A）培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：
a）向目的植物中导入由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗旱性提高的转基因植物；
所述抗旱性提高的转基因植物中所述OsFLP蛋白的表达量高于所述目的植物。
（B）培育抗旱性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：
c）在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；
d）从步骤c）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗旱性降低的转基因植物；
所述抗旱性降低的转基因植物中所述OsFLP蛋白的表达量低于所述目的植物。
在上述应用或方法中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质（OsFLP蛋白）的编码基因（OsFLP基因）是如下1）至3）中任一所述的核苷酸序列：
1）序列表中序列1所示的核苷酸序列；
2）在严格条件下与1）所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列；
3）与1）或2）所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列1由1617个脱氧核苷酸组成，为所述OsFLP基因的cDNA序列，整个序列即为编码序列（ORF）；编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质（OsFLP蛋白），序列2由538个氨基酸残基组成。
在上述方法（A）中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因具体可通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中。
在上述方法（B）中，所述在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，可为任何可降低所述目的植物中所述OsFLP基因的表达的方法。
在本发明中，所述在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，具体是通过将如下式（I）所示的DNA片段转入所述目的植物中实现的：
SEQ正向-X-SEQ反向（I）
所述SEQ正向是序列表中序列3的第13-241位核苷酸；
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
在本发明中，所述式（I）所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列3的第13-800位。
序列3由1044个核苷酸组成。其中，第13-241位为所述OsFLP基因的一个片段的正向序列（对应上述式（1）中的SEQ正向，与序列表中序列1的第117-345位一致），第269-555位为内含子核苷酸序列，对应上述式（1）中的X，第572-800位为所述OsFLP基因的一个片段的反向序列（对应上述式（1）中的SEQ反向，为序列表中序列1的第117-345位的反向互补序列）。
在上述方法（A）中，所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子RD29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
进一步，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子。在本发明的实施例中，所述重组过表达载体具体为在pH7WG2D.1载体的attR1和attR2之间插入所述OsFLP基因后得到的重组质粒。
在上述方法（B）中，所述式（I）所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体的形式转入所述目的植物中的；所述RNA干扰表达载体上启动所述式（I）所示的DNA片段转录的启动子单子叶植物玉米的泛素基因Ubiquitin启动子。在本发明的一个实施例中，所述RNA干扰表达载体具体为在pCAMBIA1301-Ubi的多克隆位点处插入所述OsFLP基因的RNA干扰序列（序列3的第7-1038位）后得到的重组质粒。
在上述培育转基因植物的方法（A）和方法（B）中，将携带有所述OsFLP基因的所述重组过表达载体或所述OsFLP基因片段的所述RNA干扰表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
在上述各应用或各方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为单子叶植物水稻，如水稻品种中花11。
如下式（I）所示的DNA片段也属于本发明的保护范围：
SEQ正向-X-SEQ反向（I）
所述SEQ正向是序列表中序列3的第13-241位核苷酸；
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补；
所述DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3的第13-800位。
含有所述DNA片段的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述重组载体既可以为重组表达载体，也可以为重组克隆载体。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述RNA干扰序列转录的启动子为单子叶植物玉米的泛素基因Ubiquitin启动子。具体的，所述重组表达载体为在pCAMBIA1301-Ubi载体的多克隆位点处插入所述OsFLP基因的RNA干扰序列（序列3的第7-1038位）后得到的重组质粒；更为具体的，所述RNA干扰表达载体是按照包括如下步骤的方法制备：用KpnⅠ和SacⅠ酶切序列表中序列3所示DNA片段，回收酶切片段后与经过同样双酶切的pCAMBIA1301-Ubi载体的骨架大片段相连，得到所述重组表达载体。
本发明利用可以引导外源基因在植物中表达的载体，将OsFLP基因导入水稻细胞进行过量表达，或将OsFLP基因表达进行干扰，可改变转基因植株对干旱的耐受能力。本发明对于植物耐旱的分子机制的研究，植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义。
附图说明
图1为水稻OsFLP基因表达模式分析。
图2为水稻OsFLP基因受到干旱胁迫的诱导表达情况。
图3为水稻OsFLP基因全长cDNA的扩增结果。其中，M：DNA分子量标准；1：水稻OsFLP基因全长cDNA的扩增条带。
图4为T1代OsFLP转基因水稻的表达量分析结果。
图5为T1代OsFLP转基因水稻的抗旱性分析结果。其中，A为植株表型；B为植株存活率统计结果。
图6为T1代OsFLP转基因水稻干旱胁迫相关基因表达情况。
图7为水稻OsFLP基因RNAi序列的扩增结果。其中，M：DNA分子量标准；1：水稻OsFLP基因RNAi序列的扩增条带。
图8为OsFLP基因RNAi水稻株系中OsFLP基因的相对表达量检测结果。其中，#5、#6、#7、#12、#15、#23和#24分别表示T1代OsFLP基因RNAi水稻株系OsFLP-RNAi#5、OsFLP-RNAi#6、OsFLP-RNAi#7、OsFLP-RNAi#12、OsFLP-RNAi#15、OsFLP-RNAi#23和OsFLP-RNAi#24。
图9为OsFLP基因RNAi水稻株系生长5天和25天的植株表型。其中，A为生长5天；B为生长25天。
图10为OsFLP基因RNAi水稻株系的抗旱性分析结果。A为植株表型；B为植株存活率统计结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
水稻（Oryza.sativaL.）品种中花11：商业途径可购买，由中国农业科学院作物科学研究所选育，在“谢道昕,范云六,倪丕冲等.苏云金芽孢杆菌杀虫基因导入中国栽培水稻品种中花11号获得转基因植株.中国科学(B辑化学生命科学地学)，1991年08期”一文中有记载。
pH7WG2D.1质粒：记载于“GATEWAYvectorsforAgrobacterium-mediatedplanttransformation,TrendsinPlantScience;7(5):193-5”一文,公众可从中国科学院植物研究所获得。
pCR8/GW/TOPO载体：Invitrogen公司产品，其产品目录号为K2500-20。
pBIntron载体：在LiuY,CuiS,WuF,YanS,LinX,DuX,ChongK,SchillingS,TheissenG,MengZ(2013)FunctionalconservationofMIKC*-TypeMADSboxgenesinArabidopsisandricepollenmaturation.PlantCell25:1288-1303一文中有记载，公众可从中国科学院植物研究所获得。
pCAMBIA1301-Ubi载体：在CuiR,HanJ,ZhaoS,SuK,WuF,DuX,XuQ,ChongK,TheissenG,MengZ(2010)FunctionalconservationanddiversificationofclassEfloralhomeoticgenesinrice(Oryzasativa).PlantJ61:767-781一文中有记载，公众可从中国科学院植物研究所获得。
根癌农杆菌EH105：记载于“秦永华,张上隆.影响根癌农杆菌介导的丰香草莓遗传转化因素分析.核农学报,2007年05期”一文中，公众可从中国科学院植物研究所获得。
实施例1、水稻OsFLP表达模式分析
本实施例中所涉及的水稻OsFLP基因的cDNA序列如序列表中序列1所示，序列1由1617个核苷酸组成，其中第1-1617位为编码序列（ORF）；序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质（OsFLP蛋白），序列2由538个氨基酸残基组成。
1、水稻OsFLP基因表达模式分析
收集水稻（OryzasativaL.）品种中花11的不同组织材料，包括幼苗叶片、成熟叶片、根和花。将以上材料用TRizol（Invitrogen公司产品）提取其总RNA，经甲醛变性RNA琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。将鉴定合格的RNA反转录为cDNA，按照ReverseTranscriptionSystem（Promega公司产品）的使用说明操作。以所得cDNA为模板，用引物1和引物2对OsFLP基因的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，以OsACTIN为内参，所用引物为引物3和引物4。
引物1：5’-AGTTCTTGGGAACAAATGGAC-3’（序列1的第294-314位）；
引物2：5’-TGTACCAATGCCCTCTTTGA-3’（序列1的第445-464位的反向互补序列）；
引物3：5’-GGATCCATCTTGGCATCTCTCA-3’；
引物4：5’-GGGCCAGACTCGTCGTACTC-3’。
实时荧光定量PCR反应体系：正向引物（10μM）0.5μL，反向引物（10μM）0.5μL，2×SYBRPremixExtaq7.5μL，cDNA模板1μL，补充灭菌超纯水至15μL。其中，2×SYBRPremixExtaq为TaKaRa公司产品，其产品目录号为RR820A。
实时荧光定量PCR反应程序：三步法：预变性95℃30s；变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃20s，循环数40次。
数据处理：获得不同样品的Ct值（对数期设定的荧光阈值所经过的扩增循环次数），根据公式计算X40=X0×2n计算出40个循环后扩增产物数量，起始模板数量X0设定为1，n为内参基因与目标基因Ct差值。
实验重复三次，结果取平均值。
结果如图1所示，可见OsFLP基因在幼苗叶片、成熟叶片，根和花中均有表达，并且在成熟叶片中表达量最高，幼苗叶片和花中次之，根中表达量最少。
2、水稻OsFLP基因在干旱处理后表达模式分析
将生长2周的水稻（OryzasativaL.）品种中花11的幼苗置于20%（20g/100mL）PEG4000溶液中处理0h、2h、6h、12h后提取植物总RNA，反转录为cDNA，然后针对OsFLP基因进行qRT-PCR检测。具体操作参照步骤1进行。
结果如图2所示，OsFLP基因受到干旱胁迫后瞬时诱导表达，诱导6小时OsFLP基因表达量得到最高值。
实施例2、OsFLP转基因水稻的获得及功能鉴定
本实施例中所涉及的水稻OsFLP基因的cDNA序列如序列表中序列1所示，序列1由1617个核苷酸组成，其中第1-1617位为编码序列（ORF）；序列1编码序列表中序列2所示的蛋白质（OsFLP蛋白），序列2由538个氨基酸残基组成。
1、重组表达载体Super-pH7WG2D.1-OsFLP的构建
以pH7WG2D.1质粒为骨架载体，采取Gateway方法构建重组表达载体Super-pH7WG2D.1-OsFLP，具体如下：
（1）OsFLP-TOPO载体的构建
以水稻（Oryza.sativaL.）品种中花11的幼苗为材料，取100-200mg，用TRizol（Invitrogen公司产品）提取其总RNA，经甲醛变性RNA琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。将鉴定合格的RNA反转录为cDNA，按照ReverseTranscriptionSystem（Promega公司产品）的使用说明操作。
OsFLP基因扩增条件如下，将合成的cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板：采用TOYOBO公司的高保真DNA聚合酶KOD-Plus，以引物5和引物6对OsFLP基因cDNA全长进行扩增。
引物5：5’-ATGGCGACCGGACCCGATCTG-3’（序列1的第1-21位）；
引物6：5’-TCATAGGCTATTAAGGAGAGC-3’（序列1的第1597-1617位的反向互补序列）。
扩增体系（50μL）：10×KODbuffer5μL，2mMdNTPmix5μL，10μM引物5和引物6各1.5μL，KOD-PlusDNA聚合酶0.5μL，cDNA模板1-5μL，补充灭菌超纯水至50μL。反应体系在冰上进行操作。
BIO-RADPCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃30s，68℃2min，循环数32个；68℃延伸10min。
将扩增片段用1％的琼脂糖凝胶进行电泳（图3），回收扩增片段，连接到pCR8/GW/TOPO捐献载体上，得到重组载体。送样测序，将经测序正确且在pCR8/GW/TOPO质粒的aatL1和aatL2之间正向插入序列表中序列1所示DNA片段的重组质粒命名为OsFLP-TOPO。
（2）重组表达载体Super-pH7WG2D.1-OsFLP的构建
将步骤（1）中构建好的OsFLP-TOPO捐献载体，用限制性内切酶PvuⅠ在37℃条件下，酶切3小时，把酶产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收。取回收产物1.5μL，pH7WG2D.1质粒0.5μL及GatewayLRClonaseⅡenzymemix（invitron公司产品，其产品目录号为11791-020）0.5μL混合，于25℃反应4小时。终止反应后，将混合物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到单菌落克隆，对单菌落进行繁殖并提取质粒。采用引物5和引物6对所得重组质粒进行PCR扩增，进一步将经PCR鉴定初步判定正确的重组质粒（PCR产物大小约为1617bp），送样测序，将经测序正确表明在pH7WG2D.1质粒的aatL1和aatL2之间正向插入序列表中序列1所示DNA片段的重组质粒命名为Super-pH7WG2D.1-OsFLP。
在重组表达载体Super-pH7WG2D.1-OsFLP中，启动序列1所示DNA片段转录的启动子为花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子。
2、含有OsFLP基因的重组表达载体异源转化水稻品种中花11
将步骤1获得的重组质粒Super-pH7WG2D.1-OsFLP采用电击转化法转化根癌农杆菌EHA105，即将1μL质粒加入100μLEHA105感受态细胞中混匀，冰上放置5min后转入预冷无菌的电转杯中，利用基因导入仪进行转化，条件为电压1.8kV，脉冲5ms，然后迅速加入1mLLB培养基，28℃，200rpm摇菌1.5h，取100μL菌液涂布含有50μg/mL利福平和壮观霉素的LB平板，28℃生长2天。对转化后的重组农杆菌用由引物5和引物6组成的引物对进行PCR鉴定，将经鉴定表明含有OsFLP基因（PCR目的条带大小为1617bp）的重组农杆菌命名为EH105/Super-pH7WG2D.1-OsFLP。同时设置向根癌农杆菌EH105中转入pH7WG2D.1空载体的对照，将转入pH7WG2D.1空载体的重组农杆菌命名为EH105/pH7WG2D.1。
将以上所得两种重组农杆菌（EH105/Super-pH7WG2D.1-OsFLP或EH105/pH7WG2D.1）侵染水稻品种中花11愈伤组织（参考文献：HieiY,OhtaS,KomariT,KumashiroT(1994)Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.ThePlantJournal6:271-282），经过共培养、除菌、抗生素筛选和分化，收获T1代种子。将T1代种子在含有25μg/μL潮霉素（AMRESCO公司产品，产品目录号为K547-20，规格25mg/mL）的1/2MS培养基上进行筛选，得到根和叶均能生长的抗性T1代转化植株。
3、OsFLP转基因水稻的分子鉴定
从步骤2获得的T1代OsFLP转基因水稻，以及转入pH7WG2D.1空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。
对于T1代OsFLP转基因水稻和转入pH7WG2D.1空载体的对照植株，均采用针对GFP基因的引物7和引物8进行PCR扩增，经鉴定得到大小约为580bp的目的条带的植株为阳性水稻植株。
引物7：5’-CGACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’；
引物8：5’-CTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCA-3’。
将经上述鉴定阳性的T1代OsFLP转基因阳性水稻植株中随机选取4个株系，分别记为OsFLP-OE#1，OsFLP-OE#2，OsFLP-OE#2和OsFLP-OE#4。以上植株在含25μg/μL潮霉素溶液中生长2周后，取能正常生长的水稻幼苗提取植物总RNA，反转录为cDNA，然后针对OsFLP基因利用引物1和引物2进行qRT-PCR检测，具体操作参照实施例1步骤1进行。
结果如图4所示，OsFLP-OE#1和OsFLP-OE#4转基因阳性水稻株系OsFLP基因表达量与空载体的对照植株相比增高，而OsFLP-OE#4株系表达量增高值最大，因此后续实验将采用OsFLP-OE#1和OsFLP-OE#4两个转基因阳性水稻株系。
4、T1代OsFLP转基因水稻的抗旱性分析
获得的T1代OsFLP转基因水稻株系OsFLP-OE#1和OsFLP-OE#4、未转基因的水稻（OryzasativaL.）品种中花11和向水稻（OryzasativaL.）品种中花11中转入pH7WG2D.1空载体的对照植株为实验材料。用于实验的每种材料的植株数为60株。
将各实验材料的种子播种成苗后，将其栽培至土壤中正常生长25天，然后停止浇水15天，复水一周后观察各植株的表型并照相。同时设置未经干旱处理的对照组。
实验重复三次，定量数据结果取平均值。
结果显示：
干旱处理组中，未转基因的水稻（OryzasativaL.）品种中花11大部分发黄并萎焉死亡，而步骤3获得的T1代OsFLP转基因水稻株系OsFLP-OE#4多数存活（图5中A）。进一步，对存活的水稻植株进行统计，结果如图5中B所示，未转基因的水稻（OryzasativaL.）品种中花11存活率达到40%左右，而步骤3获得的T1代OsFLP转基因水稻株系OsFLP-OE#4存活率均在70%左右，显著高于中花11（P<0.05）。而向水稻（OryzasativaL.）品种中花11中转入pH7WG2D.1空载体的对照植株，其植株表型及存活率与未转基因的水稻（OryzasativaL.）品种中花11基本一致，无统计学差异。
未经干旱处理的对照组，所有植株均正常生长。
以上结果表明OsFLP基因能明显增强水稻对干旱的耐受性。
5、T1代OsFLP转基因水稻中干旱胁迫相关基因的表达分析
以步骤2获得的T1代OsFLP转基因水稻株系OsFLP-OE#4、未转基因的水稻（OryzasativaL.）品种中花11和向水稻（OryzasativaL.）品种中花11中转入pH7WG2D.1空载体的对照植株为实验材料。以上植株在含25μg/μL潮霉素溶液中生长2周后，取能正常生长的水稻幼苗提取植物总RNA，反转录为cDNA，然后针对OsFLP、OsLEA3、OsDREB2A和OsNAC6基因分别利用引物1和引物2、引物9和引物10、引物11和引物12和引物13和引物14，进行qRT-PCR检测，以OsACTIN为内参，所用引物为引物3和引物4。具体操作参照实施例1步骤1进行。
引物9：5’-CGGCAGCGTCCTCCAAC-3’；
引物10：5’-CGGTCATCCCCAGCGTG-3’。
引物11：5’-GCTGCACATCAGCACCTTCA-3’；
引物12：5’-TCCTGCACCTCAGGGACTAC-3’。
引物13：5’-CTGTACGGAGAGAAGGAGTGG-3’；
引物14：5’-GTGCATGATCCAGTTGGTCT-3’。
实验重复三次，定量数据结果取平均值。
结果显示：与中花11和向水稻（OryzasativaL.）品种中花11中转入pH7WG2D.1空载体的对照植株相比，在OsFLP-OE#4转基因水稻（OryzasativaL.）品种中，干旱胁迫响应基因OsLEA3、OsDREB2A和OsNAC6基因表达量均增加，结果如图6所示。以上结果表明过表达OsFLP基因明显增强水稻抗旱性与增加胁迫相关基因的表达相关。
实施例3、OsFLP基因RNAi水稻植株的获得及功能鉴定
本实施例中所涉及的水稻OsFLP基因的cDNA序列如序列表中序列1所示，序列1由1617个核苷酸组成，其中第1-1617位为编码序列（ORF）；序列1编码序列表中序列2所示的蛋白质（OsFLP蛋白），序列2由538个氨基酸残基组成。
1、RNAi表达载体OsFLP-pCAMBIA1301-Ubi-RNAi的构建
根据序列表中序列1设计如下RNAi引物序列：
引物15：5’-GGGGTACCTCTAGATGTGCTTCGTACTCAAATTGC-3’（下划线处依次为酶切位点KpnI和XbaI的识别序列，其后为序列1的第117-137位）；
引物16：5’-GGGTCGACCCCGGGAGTTCTGCCTGAGACAACCTT-3’（下划线处依次为酶切位点SalI和SmaI的识别序列，其后为序列1的第325-345位的反向互补）。
以序列表中的序列1为模板，用引物15和引物16在BIO-RADPCR扩增仪上进行扩增。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃30s，68℃30s，循环数32个；68℃延伸10min。将扩增片段用2％的琼脂糖凝胶进行电泳（图7），回收扩增片段，为OsFLP-RNAi片段。
用限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ双酶切OsFLP-RNAi片段，回收酶切片段后将其与经过XbaⅠ和SmaⅠ双酶切的pBIntron载体骨架大片段相连，得到中间质粒1。再用限制性内切酶KpnⅠ和SalⅠ双酶切OsFLP-RNAi片段，回收酶切片段，将其与经过KpnⅠ和SalⅠ双酶切的中间质粒1的骨架大片段相连，得到中间质粒2。最后利用KpnⅠ和SacⅠ酶切中间质粒2，回收目的片段1000bp左右，与经过KpnⅠ和SacⅠ双酶切的pCAMBIA1301-Ubi载体的骨架大片段相连，得到重组质粒，送样测序。测序正确结果表明在pCAMBIA1301-Ubi载体的酶切位点KpnⅠ和SacⅠ之间插入序列表中序列3的第7-1038位所示的DNA片段的重组质粒命名为OsFLP-pCAMBIA1301-Ubi-RNAi。
在RNAi表达载体OsFLP-pCAMBIA1301-Ubi-RNAi中，启动序列表中序列3所示的DNA片段转录的启动子为单子叶植物玉米Ubi-1启动子。
序列3由1044个核苷酸组成。其中，第13-241位为所述OsFLP基因的一个片段的正向序列（与序列表中序列1的第117-345位一致），第269-555位为来自于pBIntron载体上的X内含子（intron）核苷酸序列，第572-800位为所述OsFLP基因的一个片段的反向序列（为序列表中序列1的第117-345位的反向互补序列）。正向序列和反向序列之间由一段内含子（intron）序列隔开以维持载体的稳定性；该系统在植物细胞中转录产生带发夹结构（hairpin）的dsRNA，引发RNAi，从而抑制目的基因的表达。
2、RNAi表达载体OsFLP-pCAMBIA1301-Ubi-RNAi转化水稻
将步骤1获得的RNAi表达载体OsFLP-pCAMBIA1301-Ubi-RNAi采用电击转化法转化根癌农杆菌EH105，对转化后的重组农杆菌用由引物15和引物16组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有PCR目的条带大小为229bp的重组农杆菌命名为EH105/OsFLP-pUN1301-RNAi。
同时设置向根癌农杆菌EH105中转入pCAMBIA1301-Ubi空载体的对照。将转入pCAMBIA1301-Ubi空载体的重组农杆菌命名为EH105/pCAMBIA1301-Ubi。
将以上所得两种重组农杆菌（EH105/OsFLP-pCAMBIA1301-Ubi-RNAi或EH105/pCAMBIA1301-Ubi）通过侵染水稻品种中花11愈伤组织（参考文献：HieiY,OhtaS,KomariT,KumashiroT(1994)Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.ThePlantJournal6:271-282），经过共培养、除菌、抗生素筛选和分化，收获T1代种子。将T1代种子在含有25μg/μL潮霉素（AMRESCO公司产品，产品目录号为K547-20，规格50mg/mL）的1/2MS培养基上进行筛选，得到根和叶均能生长的抗性T1代转化植株。
3、OsFLP基因RNAi水稻中OsFLP基因转录水平分析
从步骤2获得的抗性T1代OsFLP基因RNAi水稻阳性植株中随机选取八个株系，分别记为OsFLP-RNAi#1、OsFLP-RNAi#5、OsFLP-RNAi#6、OsFLP-RNAi#7、OsFLP-RNAi#12、OsFLP-RNAi#15、OsFLP-RNAi#23和OsFLP-RNAi#24。以上株系在含25μg/μL潮霉素溶液中生长2周后，取能正常生长的水稻幼苗提取植物总RNA，反转录为cDNA，然后针对OsFLP基因进行qRT-PCR检测。具体操作参照实施例1步骤1进行。
实验同时设置未转基因的水稻（Oryza.sativaL.）品种中花11和向水稻（Oryza.sativaL.）品种中花11中转入pCAMBIA1301-Ubi空载体的植株作为对照。
结果显示，相比未转基因的水稻（OryzasativaL.）品种中花11，步骤2获得的T1代OsFLP基因RNAi水稻株系OsFLP-RNAi#1、OsFLP-RNAi#5、OsFLP-RNAi#6、OsFLP-RNAi#7、OsFLP-RNAi#12、OsFLP-RNAi#15、OsFLP-RNAi#23和OsFLP-RNAi#24中OsFLP基因的表达量显著降低（P<0.05），部分植株鉴定结果如图8所示。而向水稻（OryzasativaL.）品种中花11中转入pCAMBIA1301-Ubi空载体的对照植株中OsFLP基因的表达量与未转基因的水稻（OryzasativaL.）品种中花11相比，基本一致，在统计学上无显著差异。
4、OsFLP基因RNAi水稻的抗旱性分析
以步骤2获得的T1代OsFLP基因RNAi水稻株系OsFLP-RNAi#5、OsFLP-RNAi#23和OsFLP-RNAi#24，未转基因的水稻（Oryza.sativaL.）品种中花11和向水稻（Oryza.sativaL.）品种中花11中转入pCAMBIA1301-Ubi空载体的对照植株为实验材料。用于实验的每种材料的植株数为60株。
将各实验材料的种子播种成苗后，观察生长5天和25天的植株表型，如图9所示，步骤2获得的T1代OsFLP基因RNAi水稻株系与未转基因的水稻（Oryza.sativaL.）品种中花11相比株高降低。将各水稻植株转移至96孔水培板，生长25天的植株浇灌浓度为10%（10g/100mL）的PEG4000水溶液模拟干旱实验，每株一次性浇灌100mL。处理3天后浇水恢复生长2天，观察表型并照相。同时设置未经PEG4000处理的对照组。
实验重复三次。
结果如图10所示，经PEG4000处理组，步骤2获得的T1代OsFLP基因RNAi水稻株系与未转基因的水稻（Oryza.sativaL.）品种中花11相比大部分发黄并萎焉死亡，中花11经PEG4000处理后存活率为75%左右，OsFLP-RNAi#5存活率仅为40%左右，表现出对干旱胁迫的超敏感性。而向水稻（OryzasativaL.）品种中花11中转入pCAMBIA1301-Ubi空载体的对照植株的表型与未转基因的水稻（OryzasativaL.）品种中花11相比，基本一致，在统计学上无显著差异。而未经PEG4000处理的对照组，所有植株均正常生长。

Claims (8)

1.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控水稻抗旱性；
a2）选育抗旱性提高的水稻品种。
2.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控水稻抗旱性；
a2）选育抗旱性提高的水稻品种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
4.培育抗旱性改变的转基因水稻的方法，为如下（A）或（B）：
（A）培育抗旱性提高的转基因水稻的方法，包括如下步骤：
a）向目的水稻中导入由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因水稻；
b）从步骤a）所得转基因水稻中得到与所述目的水稻相比，抗旱性提高的转基因水稻；
（B）培育抗旱性降低的转基因水稻的方法，包括如下步骤：
c）在目的水稻中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因水稻；
d）从步骤c）所得转基因水稻中得到与所述目的水稻相比，抗旱性降低的转基因水稻。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述（A）中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的水稻中的；
所述（B）中，所述在目的水稻中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，是通过将如下式（I）所示的DNA片段转入所述目的水稻中实现的：
SEQ正向-X-SEQ反向（I）
所述SEQ正向是序列表中序列3的第13-241位核苷酸；
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述（B）中，所述式（I）所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列3的第13-800位。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述（A）中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动子；
所述（B）中，所述式（I）所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体的形式转入所述目的水稻中的；所述RNA干扰表达载体上启动所述式（I）所示的DNA片段转录的启动子是单子叶植物玉米的泛素基因Ubiquitin启动子。
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