CN105647940A

CN105647940A - OsGRF6基因提高水稻产量的方法及其应用

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Publication number: CN105647940A
Application number: CN201410631922.2A
Authority: CN
Inventors: 李绍清; 高峰; 朱英国
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2014-11-11
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2034-11-11
Also published as: CN105647940B

Abstract

本发明公开了一种<i>OsGRF6</i>基因提高水稻产量的方法及其应用，属于作物基因工程技术领域。本发明通过将GRF6基因在水稻中过表达后，水稻二次枝梗数目和每穗粒数增加；而将GRF6基因在水稻中敲除、失活或者降低活性后，每穗二次枝梗数目和每穗粒数显著减少，说明该基因可控制水稻的产量。将GRF6基因通过表达载体导入到水稻体内使GRF6过表达则可以提高水稻的产量；GRF6基因还可以作为分子标记用于作物育种中。GRF6基因为利用分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育高产水稻新品种，提供了强有力的手段和工具，具有巨大的应用潜力。

Description

OsGRF6基因提高水稻产量的方法及其应用

技术领域

本发明涉及作物基因工程技术领域，特别涉及OsGRF6基因提高水稻产量的方法及其应用。

背景技术

水稻的产量包括有效穗、穗粒数、结实率和千粒重等性状。增加穗粒数是提高水稻产量的关键因素之一，穗粒数通常和二级枝梗数成正相关。因此，鉴定、克隆调控二级枝梗分化相关基因即可通过基因工程等方法提高水稻产量，促进水稻遗传改良，提高生产效率。

虽然农业科学工作者对水稻等农作物幼穗发育机理和相关基因克隆进行了大量研究，但目前克隆鉴定的调控水稻幼穗发育和穗粒数的基因非常有限，其中具有应用价值的基因更是少之又少。

生长调节因子(Growth-regulatingfactor,GRF)是水稻、玉米等开花植物中的一个保守基因家族，双子叶植物中大量研究表明该基因家族主要参与调控植物叶片、幼穗、花器官的发育以及抗逆等反应，具有广泛的生物学功能。而其在单子叶植物中的功能目前还处于探索阶段，未见其有关提高水稻产量的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供水稻生长调节因子基因6(GRF6)与作物产量的关系，进而提供GRF6在提高作物产量上的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明通过在水稻体内过表达水稻生长调节因子GRF6基因发现：在水稻体内过表达GRF6后，水稻的二次枝梗数目和每穗粒数得到增加，单株水稻平均产量增加71％；而干涉GRF6基因表达则有相反的效果。表明GRF6与水稻产量相关，增强水稻体内GRF6的表达可以大幅度提高水稻产量，所述的水稻包括籼稻和粳稻。水稻属于单子叶禾本科作物，同科的高粱、玉米、小麦等作物都是重要的粮食作物，GRF6的DNA序列与结构及其在幼穗中的表达模式非常保守，表明其对禾本科作物幼穗发育和产量调控方面有着相似的分子机制。因此，GRF6基因也可用于提高其他单子叶禾本科作物的产量。

一种提高作物产量的蛋白，为生长调节因子6(Growth-regulatingfactor6,GRF6)，来源于水稻(OryzasativaL.)，是如下(1)或(2)的蛋白质：

(1)由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQIDNO.1所示序列的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加与作物产量相关的由(1)衍生的蛋白质。

为了使(1)中的GRF6便于纯化，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签及其氨基酸序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(2)中的GRF6蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的GRF6的编码基因可通过将SEQIDNO.2所示序列自5’末端第84位到第2013位碱基的DNA序列中缺失或添加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错意突变，和/或在其5’端和/或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。

一种提高作物产量的GRF6基因，为如下(1)～(5)中任一所述的基因：

(1)其核苷酸序列为SEQIDNO.2所示基因组序列的自5’末端第84位到第2013位；

(2)其核苷酸序列为SEQIDNO.3所示cDNA序列的自5’端第84位到第1454位；

(3)其核苷酸序列为SEQIDNO.4所示cDNA编码序列；

(4)在严格条件下(1)或(2)或(3)的核苷酸经人工编辑、重组或突变后产生的编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列组成的蛋白的基因；

(5)与(1)或(2)或(3)的基因具有90％以上的同源性且编码GRF6蛋白的基因。

SEQIDNO.2所示核苷酸序列由2370个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5’端第84位到第2013位碱基。其中自5’端第268-413为内含子1，第777-1190为内含子2，第84-267位为外显子1，第414-778为为外显子2，第1191-2369为外显子3，编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的GRF6蛋白。

SEQIDNO.2所示核苷酸序列为cDNA序列，第1至第83位为5’UTR，第2014至第2368位为3’UTR。

SEQIDNO.3所示核苷酸序列为cDNA编码序列。

上述GRF6蛋白或GRF6基因在提高作物产量上的应用。所述的提高作物产量的应用包括增加二次枝梗数和每穗粒数。

扩增GRF6基因全长的引物在提高作物产量上的应用。

含有GRF6基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌在提高作物产量上的应用。

一种提高作物产量的方法为提高作物体内GRF6的表达量，具体为将GRF6基因通过表达载体导入到作物体内使GRF6过表达。

可用现有的作物表达载体构建含有GRF6基因的重组表达载体。所述作物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、Pcambia1300、Pbi121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pH7WG2D或其他衍生作物表达载体，如Gateway作物表达载体。

使用GRF6基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前添加任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其他启动子结合使用；此外，使用GRF6基因构建作物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻界区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以使天然的或者人工合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因作物细胞或作物进行鉴定及筛选，可对所用作物表达载体进行加工，如加入在作物中表达可产生颜色变化的酶或者发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等)、具有抗性作用的抗生素标记物(氨苄青霉素标记物、卡那霉素标记物等)、生化代谢标记物(木糖异构酶基因xylA)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。

所述重组表达载体具体可为在作物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点间插入或者通过Gateway方法重组上述GRF6基因的核苷酸序列得到的重组表达载体。

所述GRF6基因是通过上述重组表达载体导入目的作物中的。携带有GRF6基因的作物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、作物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到作物细胞或组织中。

GRF6基因还可以作为分子标记用于作物育种中。

本发明通过将GRF6基因在水稻中过表达后，水稻二次枝梗数目和每穗粒数增加；而将GRF6基因在水稻中敲除、失活或者降低活性后，每穗二次枝梗数目和每穗粒数显著减少，说明该基因可控制水稻的产量。因此GRF6基因为利用分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育高产水稻新品种，提供了强有力的手段和工具，具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1是GRF6基因结构图，箭头所示为QLQ结构域和WRC结构域的位置；

图2是GRF6基因在不同水稻中的表达水平结果图；

图3是不同水稻的植株表型图；

图4是不同水稻的稻穗表型图；

图5是不同水稻的二次枝梗数、穗长(单位cm)和每穗粒数统计柱状图；

图2-5中，GRF6OE：GRF6过表达的T₁代转基因植株；WT：粤泰B空载体对照植株；GRF6-RNAi：GRF6干涉的T₁代转基因植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中水稻按照如下方法栽培管理：水稻种子按照常规方法浸种催芽，种子露白后匀播在事先准备好的苗床上进行育秧，秧苗4叶一心期按5寸×6寸的密度移栽到大田。

实施例1

1、GRF6基因全长片段的获得

利用KOME全长cDNA克隆(AK073578)为模板(从日本GenomeResourceCenter，NationalInstituteofAgrobiologicalScience购买)，设计引物对G6F/G6R并在各自5’端添加attB重组位点(Invitrogen)，引物序列见表2，进行PCR扩增，获得的产物进行测序分析，扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，GRF6基因的结构示意图如图1所示。

表2.引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		G6F	ATGCAGGGTGCAATGGCCAGGGTGA
G6R	TCACACCAGGCGGATGCTCGGATG

2、GRF6基因过表达载体的构建

将用引物对G6F/G6R扩增得到的产物通过BP和LR两步反应(Invitrogen)插入表达载体pH7WG2D中，得到重组表达载体GRF6OE(即过表达载体GRF6OE)。

3、GRF6基因过表达转基因植株的获得

将过表达载体GRF6OE通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，筛选得到含有重组质粒GRF6OE的重组农杆菌菌株。

用含有重组质粒GRF6OE的重组农杆菌菌株侵染粤泰B愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上筛选抗性愈伤和阳性转基因植株。将根系发育良好的潮霉素抗性植株(T₀代)在阴凉处炼苗后，移栽到水田中，成熟时收获T₀代植株的种子，按照上述田间栽培的方法进行栽培，并通过常规分子检测，获得转GRF6OE的T₁代转基因植株。

按照获得转GRF6OE的T₁代转基因植株的方法，将空载体pH7WG2D转化粤泰B，得到空载体对照植株。

4、GRF6基因过表达转基因植株的产量检测

(1)通过RT-PCR检测GRF6基因的表达量：

利用TRIZOL(购自Invitrogen公司)提取转基因植株和对照粤泰植株的总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)进行反转录，得到cDNA。利用引物G6Q-F和G6Q-R进行PCR检测GRF6编码基因的表达；利用引物UbiRTF和UbiRTR引物PCR扩增Ubi基因作为内标；上述引物序列见表3。结果显示(图2)GRF6基因过表达转基因植株中GRF6编码基因的表达量明显增加。

表3.引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		G6Q-F	CTTCACGCCGTCTCAG
G6Q-R	GGATTGGCAGTGTTGG
		UbiRTF	CCCTCCACCTCGTCCTCAG
UbiRTR	AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC

(2)转基因植株的产量检测：

转基因水稻的植株表型见图3，进一步对转GRF6OE的T₁代转基因植株、粤泰B对照植株和空载体对照植株进行产量统计，每种材料统计10个单株。结果如图4、图5所示，转GRF6OE的T₁代转基因植株与粤泰B对照植株和空载体对照植株相比，二次枝梗数目平均从22.9个增加为49.5个，每穗粒数平均从118.3粒增加到203.2粒；单株平均产量增加71％。

实施例2

1、GRF6基因干涉片段的获得

利用KOME全长cDNA克隆(AK073578)为模板(从日本GenomeResourceCenter，NationalInstituteofAgrobiologicalScience购买)，设计引物对R6F/R6R并在各自5’端添加attB重组位点(Invitrogen)，引物序列见表4，进行PCR扩增，获得的产物进行测序分析，扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。

表4.引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		R6F	TCCATTAGCACGAGAAA
R6R	AAAGAATCACGGAACATAG

2、GRF6基因干涉载体的构建

将用引物对R6F/R6R扩增得到的产物通过BP和LR两步反应(Invitrogen)插入表达载体pANIC8A(http://plantsciences.utk.edu/stewart_panic.htm；MannDGJetal.,PlantBiotechJ10:226-236)中，得到重组表达载体GRF6-RNAi(即干涉载体GRF6-RNAi)。

3、GRF6基因干涉转基因植株的获得

将干涉载体GRF6-RNAi通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，筛选得到含有重组质粒GRF6-RNAi的重组农杆菌菌株。

用含有重组质粒GRF6-RNAi的重组农杆菌菌株侵染粤泰B愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上筛选抗性愈伤和阳性转基因植株。将根系发育良好的潮霉素抗性植株(T₀代)在阴凉处炼苗后，移栽到水田中，成熟时收获T₀代植株的种子，按照上述田间栽培的方法进行栽培，并通过常规分子检测，获得转GRF6-RNAi的T₁代转基因植株。

按照获得转GRF6-RNAi的T₁代转基因植株的方法，将空载体pANIC5A转化粤泰B，得到空载体对照植株。

4、GRF6基因干涉转基因植株的产量检测

(1)通过RT-PCR检测GRF6基因的表达量：

利用TRIZOL(购自Invitrogen公司)提取转基因植株和对照粤泰植株的总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)进行反转录，得到cDNA。利用引物G6Q-F和G6Q-R进行PCR检测GRF6编码基因的表达；利用引物UbiRTF和UbiRTR引物PCR扩增Ubi基因作为内标；上述引物序列见表3。结果显示(图2)GRF6基因干涉转基因植株中GRF6编码基因的表达量明显降低。

(2)转基因植株的产量检测：

转基因水稻的植株表型见图3，进一步对转GRF6-RNAi的T₁代转基因植株、粤泰B对照植株和空载体对照植株进行产量统计，每种材料统计10个单株。结果如图4、图5所示，转GRF6-RNAi的T₁代转基因植株与粤泰B对照植株和空载体对照植株相比，二次枝梗数目平均从22.9个降低为0个，每穗粒数平均从118.3粒降低到48.5粒；单株平均产量降低59.0％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种OsGRF6基因在提高水稻产量中的应用，其特征在于：所述的提高水稻产量包括增加二次枝梗数和每穗粒数。

2.根据权利要求1所述的OsGRF6基因在提高水稻产量中的应用，其特征在于：所述的水稻包括籼稻和粳稻。

3.根据权利要求1所述的OsGRF6基因在提高水稻产量中的应用，其特征在于：所述的OsGRF6基因编码的蛋白质为如下（1）或（2）的蛋白质：

（1）由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（2）将SEQIDNO.1所示序列的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加后由（1）所衍生的与水稻产量相关的蛋白质。

4.根据权利要求1所述的OsGRF6基因在提高水稻产量中的应用，其特征在于：所述的OsGRF6基因为以下（1）～（5）任一所述的基因：

（1）其核苷酸序列为SEQIDNO.2所示基因组序列的自5’末端第84位到第2013位；

（2）其核苷酸序列为SEQIDNO.3所示cDNA序列的自5’端第84位到第1454位；

（3）其核苷酸序列为SEQIDNO.4所示cDNA编码序列；

（4）在严格条件下（1）或（2）或（3）的核苷酸经人工编辑、重组或突变后产生的编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列组成的蛋白的基因；

（5）与（1）或（2）或（3）的基因具有90%以上的同源性且编码GRF6蛋白的基因。

5.扩增OsGRF6基因全长的引物在提高水稻产量上的应用。

6.含有OsGRF6基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌在提高水稻产量上的应用。

7.一种提高水稻产量的方法，其特征在于：提高水稻体内OsGRF6基因的表达量。

8.根据权利要求7所述的提高水稻产量的方法，其特征在于：为将OsGRF6基因通过表达载体导入到水稻体内使OsGRF6过表达。

9.OsGRF6基因作为分子标记在水稻育种中的应用。

10.GRF6基因在提高单子叶禾本科作物产量中的应用。