WO2013091049A2 - Polinucleotídeo de cana-de-açúcar que confere tolerância a estresses abióticos - Google Patents

Polinucleotídeo de cana-de-açúcar que confere tolerância a estresses abióticos Download PDF

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Cesar Bueno DE SOUZA
Andrea Akemi HOSHINO
Éder Bedani Ruis CHAGAS
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    • C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
    • C12Y306/03014—H+-transporting two-sector ATPase (3.6.3.14), i.e. F1 ATPase

Definitions

  • the present invention describes a method for producing transgenic stress-tolerant transgenic plants by introducing a vector containing a sugarcane polynucleotide sequence encoding a high identity ⁇ -subunit polypeptide of ATP synthases, besides vector construction and its uses.
  • microarrays DNA chips has allowed to associate function with hitherto unknown genes.
  • This technique allows to know the expression of DNA sequences of hundreds of thousands of distinct genes using fluorescent molecular tags that light up when a complementary strand derived from RNA molecules obtained from the plant tissues under study is attached.
  • chips have allowed to know and identify genes involved in different plant processes, such as response to abiotic stresses, gene regulation, sucrose accumulation, pest resistance, tolerance to water scarcity, plant-pathogen interaction and so on.
  • ATP synthases are important enzymes that provide energy to cells and have been very conserved during evolution. Bacterial enzymes have essentially the same structure as those found in animal, plant and fungal mitochondria and also in plant chloroplasts. In most systems ATP synthases are localized to the membranes and catalyze ATP synthesis from ADP and phosphate driven by the proton flux between the membrane and generated by the transfer of electrons. The flow starts from the positive photochemical (high electrochemical potential) side to the negative photochemical side. The reaction catalyzed by ATP synthase is completely reversible.
  • ATP " synthases is made up of two portions: a soluble portion F, which contains 5 subunits ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ). Three substrate binding sites are found in the ⁇ subunits. An additional binding site the adenine nucleotide is located in subunit. the Fi subunit catalyzes the hydrolysis of ATP. in the inner part of the cell is the F0 portion which is consisted of three subunits (a, b, c) (ccarty RE (1992) the plant biochemist s view of H + -ATPases and ATP SYNTHASE (Journal of Experimental Biology 172: 431-441).
  • cell membranes serve as a permeable barrier to the loss of water and some important molecules.
  • the availability of intercellular water is restricted, which alters extracellular solute concentrations, leading to osmotic imbalance. This causes water to flow out of the cells, causing a decrease in cell turgency and an increase in intracellular solute concentrations.
  • Reactive oxygen species and toxins generated during this process can also cause extensive damage to the cell.
  • US7368630 describes a method for using the DREB1A gene to produce a plant, tissue or plant cell line with this factor. as well as dehydration-induced genes from microarray studies.
  • US 7259297 describes transgenic plants created by introducing a gene encoding a DREB transcription factor that binds to the drought response element / crepeat (DRE) and activates the transcription of localized genes. in promoters with said DRE motif.
  • DRE drought response element / crepeat
  • overexpression of the DREB transcription factor activates the Rd29A, Rd29B, Rd17, Rd22, DREB1A, Cor6, Cor15a, Erd1 and Kin1 genes, inducing a rapid response in the plant under stress.
  • US7253000 comprises a nucleic acid sequence that utilizes one of the CBF group genes (C-repeat / dehydration-responsive element binding factor, which is another name given to DREB factors).
  • this invention relates to the direct manipulation of a DNA sequence encoding a sugarcane polypeptide similar to the ⁇ subunit of ATP synthases.
  • This invention also describes the construction of vectors containing the sugarcane polypeptide sequence, as well as a process of producing transgenic plants to produce a saline and water stress tolerance phenotype, larger biomass and higher photosynthesis, among others possible.
  • the present invention describes a plant production method which contains in its cells a sugarcane polynucleotide sequence and overexpression of that sequence leads to greater tolerance to abiotic stresses to the plant in question.
  • the sugarcane polynucleotide is expressed by a plant-promoting promoter and terminator. More specifically, the present invention provides a 5 'to 3' recombinant DNA polynucleotide comprising a plant-operating promoter operably linked to a second polynucleotide encoding a cane polypeptide operably linked to the terminator terminating transcription. of the DNA polynucleotide providing a polyadenylation site.
  • the invention also discloses a recombinant DNA sequence wherein the promoter is selected from the group consisting of inducible promoters, constitutive promoters, time-regulated promoters, tissue-preferred promoters, specific stress promoters, drought-inducible promoters, inducible deficit promoters. water, and tissue-specific promoters.
  • the promoter is selected from the group consisting of inducible promoters, constitutive promoters, time-regulated promoters, tissue-preferred promoters, specific stress promoters, drought-inducible promoters, inducible deficit promoters. water, and tissue-specific promoters.
  • Plants include, but are not limited to, monocotyledonous or dicotyledonous cultivated plants and may include sugar cane, soybean, corn, canola, rice, cotton, barley, oats, grass, wheat, jatropha, mango, guava, lemon, avocado, orange, plum, pitagueira, jabuticabeira, apple, peach, potato, pea, tomato, rose bush, sunflower, bean, eucalyptus, avocado, strawberry, pear, apple, guava, cocoa, lemon, passion fruit, fodder palm, castor, cassava, rubber, mate, rosewood, coffee, pumpkin, watermelon, peach, pitanga and cashew.
  • the invention also describes a method for producing abiotic stress-tolerant plants, thanks to genetic transformation with a recombinant DNA molecule expressing a cane polypeptide, as well as plants and their cells and propagules, such as seeds, containing molecules in their genome. of this recombinant DNA.
  • Such plants have one or more of the following properties: a higher growth rate under conditions where drought and / or salt stress would be limiting to the growth of an untransformed plant of the same species; higher growth rate under conditions where water would be limiting to the growth of an unprocessed plant of the same species, a higher growth rate under conditions where increased salts or ions in the soil and / or water would be limiting to growth. growth of an unprocessed plant of the same species, higher percentage of plants surviving after prolonged drought or under saline stress than an unprocessed plant of the same species, a higher yield when compared to an unprocessed plant of the same species species, or greater drought tolerance compared to an unprocessed plant of the same species.
  • the present invention comprises the propagation of genetically modified plants for the purpose of generating seeds, planting such seeds in the soil, or sprouting, as is the case with sugarcane tails, and which allows the plants to grow under stress conditions. More specifically, this invention provides a method for producing a plant which has as one of the characteristics, such as tolerance to abiotic stresses, increase or increase in root mass yield.
  • the invention comprises the steps of inserting into the genome of a plant cell the construction of a recombinant DNA molecule comprising a sugar cane polynucleotide, obtaining a transformed plant cell or transformed cells, regenerating transformed plants. plant cells and the selection of plants with the best agronomic characteristics. It is a feature of the invention that selected plants have higher abiotic stress tolerance selected from the group consisting of salt stress tolerance, drought tolerance, and survival after the combination of abiotic stresses. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES AND ATTACHMENTS
  • Figure 1 Polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced polypeptide sequence (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 2 Real-time PCR analysis of ATP synthase ⁇ subunit gene expression in samples of two varieties of sugarcane.
  • RB867515 is considered drought tolerant while RB855536 is considered sensitive.
  • the data show that the studied gene is drought induced in the variety RB855536.
  • the bars correspond to the relative expression of the gene using the irrigation condition as a control.
  • T1 tolerant variety RB867515 irrigated
  • TS RB867515 dry tolerant variety
  • SI RB855536 sensitive variety irrigated
  • SS RB855536 dry-sensitive variety.
  • Figure 3 Binary vector, pCambia2301 :: C10, used in agrotransformation of tobacco plants.
  • the selection, reporter and expression cassettes of the SEQ ID: 1 encoded polypeptide were cloned under the control of the CaViflower Cauliflower Mosaic Virus promoter and the Agrobacterium Nopaline Synthase (NOS) gene terminator.
  • NOS Nopaline Synthase
  • the npt11 gene that confers resistance to the kanamycin antibiotic was used and as a reporter the uidA gene encoding the ⁇ -glucuronidase protein (GUS).
  • Figure 4 Stages of tobacco genetic transformation.
  • A Production of explants to be used for tobacco processing. Wild tobacco seeds germinated in petri dishes containing Murashige-Skoog (MS) medium with 0.28% (w / v) phytagel. The plants were grown in a 16 / 8h light / dark (300-400 pmol photon m "2 s ⁇ 1 ) photoperiod at 25 ° C and 75-80% relative humidity.
  • Figure 5 PCR reaction product visualized on 0.8% agarose gel in TAE containing ethidium bromide under ultraviolet light illumination. Among the 9 plant samples that were blue stained for the GUS histochemical assay, the presence of the nptll gene was confirmed in all. The column identified with Br equals the absence of amplification in an unprocessed plant.
  • Figure 6 Phenotypic analysis of wild (non-genetically modified) and transgenic plants that have SEQ ID NO: 1 after water stress.
  • A Percentage of surviving plants after drought stress. Two-month-old plants were deprived of water for 15 days and rehydrated for 3 days. The experiment was carried out with 6 biological replicates and the number of surviving plants was counted.
  • B Surviving plant on the left and dead plant on the right. The plants were kept under normal conditions until flowering.
  • Figure 7 Effects of different NaCI concentrations on transgenic tobacco leaf discs containing SEQ ID NO.1 and wild.
  • Leaf disks of vector-transformed plants containing SEQ ID NO: 1 and wild were treated with 1 mL of half-strength liquid MS medium with 0 to 400 mM NaCl for 5 days.
  • A Leaf discs used as standard to evaluate the effects of saline stress. The visual phenotypes were scaled from 1 to 4 according to the intensity of the green color and the size.
  • C Total chlorophyll content of transgenic and wild lines after saline stress. The experiment was performed with 4 biological replicates.
  • the present invention describes a method for producing transgenic stress-tolerant transgenic plants by introducing a sugar cane polynucleotide encoding a polypeptide similar to the ⁇ -subunit of ATP synthase.
  • the polynucleotide sequence is described in sequence SEQ ID NO: 1 ( Figure 1A), and the polypeptide deduced from that DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 2 ( Figure 1B).
  • the invention described herein relates to a recombinant DNA vector comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 useful for producing transgenic plants and a method for producing genetically modified plants that overexpress a nucleic acid molecule of SEQ ID NO. : 1, involved in plant response to abiotic stresses, and whose overexpression produces a significant improvement in plant response to these stresses.
  • SEQ ID NO: 1 directly or indirectly controls the response of plants against such stresses.
  • applications of the invention include, but are not limited to, improving plant yields that are tolerant to such abiotic stresses.
  • the invention comprises sequences having an identity equal to or greater than 60% of SEQ ID NO: 1, but not limited to them alone.
  • the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1, from which the SEQ ID NO: 2 polypeptide is derived, is used as part of a chimeric DNA capable of producing high expression in plant cells.
  • the plant transformation vector used to introduce nucleic acid into the plant cell may be a plasmid, where DNA SEQ ID NO: 1 is inserted into restriction endonuclease cleavage sites or by mediation of recombination by other types of enzymes.
  • DNA is inserted into the cloning vector using widely known standard procedures. This usually involves the use of restriction enzymes and DNA ligases, as described, for example, by Sambrook et al. (Wood EJ (1983) Molecular Cloning - A Laboratory Manual - Maniatis, T, Fritsch, Ef, Sambrook, J. Biochemical Education 11: 82-82).
  • the resulting plasmid which includes SEQ ID NO: 1, can then be used to transform a plant cell, plant or plant part by conventional methods of transformation.
  • the preferred plasmid also includes a selection marker gene, although there are methods that do not require the use of such a marker gene.
  • Commonly used vegetable selection markers include the kanamycin resistance gene (neomycin phosphotransferase II or nptll), the hygromycin resistance gene (hygromycin phosphotransferase or HPT), the phosphinothricin acetyl transferase (bar) gene, the 5-enolpyruvylshiquimate gene 3-phosphate synthase (EPSPS), or acetolactate synthase (ALS) gene.
  • the selection marker is the Npt11 gene, which allows the selection of transformants with the kanamycin antibiotic.
  • the plasmid may also include a reporter gene that provides a clear indication that the genetic transformation was effected by detecting the activity of the protein encoded by the reporter gene.
  • the most commonly used reporter genes are those encoding beta-glucuronidase (GUS), luciferase and green fluorescent protein (GFP). Reporter genes are often placed in close proximity to the gene of interest to ensure that they are expressed together and not separated by crossing-over events.
  • the plasmid preferably also includes promoters suitable for expression of the nucleic acid indicated in SEQ ID NO: 1 and also for expression of the selection marker gene as well as the reporter gene.
  • the cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV 35S) is commonly used in plant transformation, as is the rice actin 1 gene (Act1), ubiquitin 1 (Ubi1), the alpha gene promoter. amylase, and stress-induced gene promoters.
  • the promoter used is the CaMV 35S promoter, but other promoters may also be used.
  • the DNA described in SEQ ID NO: 1 may be under the control of a constitutive promoter or may be under the control of its own native promoter or a different promoter.
  • the plasmid preferably also includes a nucleic acid molecule comprising the terminator, such as the 3 'untranslated region of the genes encoding an actin protease inhibitor, cauliflower mosaic virus, or of nopaline synthase (NOS).
  • the plasmid includes the nopaline synthase terminator (NOS).
  • the plasmid is preferably a binary plant transformation vector wherein the polynucleotides of interest are inserted within the edges of the T-DNA.
  • plant transformation vectors that may be used in the present invention are vectors obtained from commercial sources, such as the pCambia, pBI121 or pGreenll series containing a low replication RK2 origin, the neomycin phosphotransferase marker gene ( npt11), and the nopaline synthase terminator (NOS), constitutive promoter and a polyadenylation 3 'NOS signal.
  • commercial sources such as the pCambia, pBI121 or pGreenll series containing a low replication RK2 origin, the neomycin phosphotransferase marker gene ( npt11), and the nopaline synthase terminator (NOS), constitutive promoter and a polyadenylation 3 'NOS signal.
  • any suitable method for the transformation of monocotyledons or dicotyledons can be used, such as Agrobacterium-mediated transformation or particle bombardment (also known as biobalistic or biolistic transformation).
  • Agrobacterium-mediated transformation plant cells are contacted with an inoculum of bacteria transformed with the plasmid containing the DNA indicated in SEQ ID NO: 1 of the invention.
  • Bacteria of the genus Agrobacterium which can be used to transform plant cells include species of Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens, preferably strains of A. tumefaciens LBA4404, EHA105 or GV301.
  • Agrobacterium spp. are transformed with the plasmid by known conventional methods.
  • A. tumefaciens bacteria with the DNA indicated in binary vector-driven SEQ ID NO: 1 are grown in a growth medium in the presence of antibiotics, for example, kanamycin, to select the bacterial cells that have the binary plasmid.
  • antibiotics for example, kanamycin
  • wild tobacco leaves are sterilized superficially, cut into small discs and incubated in a suspension of A. tumefaciens for a suitable time. Different fabrics can be used for processing, such as leaves, stalk, flower among others.
  • the infected leaves are transferred to the culture medium in vitro for a certain period of time. Selection of transgenic plants is initiated by placing infected plants in the in vitro selection medium with antibiotic. After the development of rooted seedlings occurs the transfer to soil and growth in growth chamber.
  • the present invention relates to the production of plasmid transformed transgenic plants containing the sequence indicated in SEQ ID NO: 1, increasing their tolerance to abiotic stresses such as drought and high salinity.
  • SEQ ID NO: 1 Another approach to increasing expression levels of SEQ ID NO: 1 may be the production of genetically modified plants that overexpress genes that induce endogenous gene promoter activity, such as genes encoding transcription factors.
  • the invention describes the method for producing transgenic plants which contains in their cells a chimeric gene capable of expression in plant cells, as well as subsequent generations comprising a DNA sequence of SEQ ID NO: 1 and DNA sequences that allow expression of SEQ ID NO: 2 polypeptide in plant cells.
  • Transgenic plants according to the invention include, without limitation, cereals such as wheat, barley, maize, rice, oats, fodder grasses, peat, other monocotyledons such as sugar cane, miscanthus, or any species of other foods such as beans, soybeans, peas, tomatoes, rapeseed, as well as other species of economic interest, such as tobacco, oranges, etc.
  • cereals such as wheat, barley, maize, rice, oats, fodder grasses, peat, other monocotyledons such as sugar cane, miscanthus, or any species of other foods such as beans, soybeans, peas, tomatoes, rapeseed, as well as other species of economic interest, such as tobacco, oranges, etc.
  • Example 1 EVALUATION OF THE EXPRESSION LEVEL OF SUGAR CANE SEQ ID NO: 1
  • Dry expression was determined by the 2- ⁇ method (Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C (T)) Method Methods 25: 402-408) using non-stressed (irrigated) samples as a control.
  • Statistical significance of relative gene expression differences was determined by assuming a log-normal model that calculates the probability Pr (sample>reference>) and Pr (sample ⁇ reference) for induced and repressed genes, respectively. The expression profile was considered valid when P ⁇ 0.95. For each treatment leaves from three plants were used.
  • the result of real-time PCR analysis showed that induction of the gene encoding the ATP synthase ⁇ subunit is induced by water stress stress in the most drought sensitive variety (RB855536) and is shown in figure 2.
  • Example 2 CLONING OF SEQ ID NO: 1 SUGAR CANE AND PRODUCTION OF A RECOMBINANT CASSETTE.
  • a sugarcane polynucleotide sequence clone resembling genes encoding the ⁇ subunit of the ATP synthase protein was obtained from the Brazilian Clone Collection Center (BCCCENTER, Jaboticabal, Brazil). From this DNA the coding sequence, indicated in SEQ ID NO: 1 ( Figure 1), was amplified by PCR using specific 5 ' - CCATGGTGGCGCTGGACAAG-3- ' and 5 ' - GGTCACCTCAGGCGGATGGG -3 ' oligonucleotides, and cloned into pGEMT- Easy (Promega, USA).
  • Wild tobacco seeds (Nicotiana tabacum, var. SR1) were germinated in Petri dishes containing Murashige-Skoog (MS) medium with 0.28% (w / v) phytagel. The plants were grown in a 16 / 8h light / dark photoperiod growth chamber (300-400 pmol photons m "2 s " 1 ) at 25 ° C and a relative humidity of 75-80%. Tobacco leaves were cut into small discs and incubated with A. tumefaciens suspensions for 5 to 10 min.
  • MS Murashige-Skoog
  • the infected leaves were transferred to MS medium (supplemented with 1 mg / L benzylaminopurine, 0.1 mg / L naphthalenocetic acid and 0.0059g / L acetoseringone) for 3 days.
  • the infected discs were transferred to selective medium (MS salts, 1 mg / L benzylaminopurine and 100 mg / L kanamycin).
  • Plants that began to grow were transferred to MS medium with 200 mg / L kanamycin ( Figure 4).
  • the rooted plants were transferred to the Flowers and Foliage substrate (BIOMIX) and kept under greenhouse conditions until flowering and seed collection.
  • Example 4 ANALYSIS OF THE PRESENCE OF SEQ ID NO: 1 IN GENETICALLY MODIFIED PLANTS
  • the initial characterization of the plants rooted and transferred to soil was first made by the histochemical assay using X-GIuc as substrate for detection of beta-glucuronidase gene, also inserted in the expression cassette.
  • the tubes were then centrifuged in a 15,000 g microcentrifuge for 10 minutes. The supernatant was then transferred to a new 1.5 ml plastic tube containing 640 ⁇ l isopropyl alcohol and 60 ⁇ l 3M sodium acetate, mixed by inversion and incubated at -20 ° C for 10 minutes. In sequence, the tubes were centrifuged at 15,000 g for 10 minutes and the supernatant discarded. The precipitated DNA was washed in the tubes themselves with 70% alcohol three times and 100 ⁇ l of ultra pure water plus 100 mg / ml RN Ase A was added and then incubated at 37 ° C for 30 minutes. Genomic DNA was stored at 4 ° C.
  • SEQ ID NO: 1 The presence of SEQ ID NO: 1 in genomic DNA extracted from transgenic tobacco plants was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) for nptll gene amplification ( Figure 5). Initially 1.0 ⁇ _ DNA, 0.5 ⁇ _ dNTP (10mM), 1.0 ⁇ _ MgCl 2 (25mM), 0.75 ⁇ _ Direct Primer (10 ⁇ ), 0.75 ⁇ _ Reverse Primer (10 ⁇ ), 2.5 ⁇ Taq 10x Buffer, 0.3 pL Taq Polymerase were used.
  • Example 5 ANALYSIS OF THE EFFECTS OF WATER SUSPENSION ON GENETICALLY MODIFIED PLANTS CONTAINING SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 1 and wild plants were treated with 1 mL half strength liquid MS medium with 0, 200, 300 and 400 mM NaCl for 5 days. After the period in which the disks were subjected to saline stress, they were numbered, randomly arranged, and four people were asked to grade 1 to 4 for the phenotypic effects of stress based on 4 previously established patterns ( Figure 7A). No evaluator had prior knowledge of which discs corresponded to transgenic or wild lines as well as which replicates of the experiment. The average of the scores given by the 4 evaluators for each sample was calculated to infer the severity of stress (Figure 7B).

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Abstract

As plantas são influenciadas por um grande número de fatores ambientais bióticos e abióticos e recorrentemente estresses abióticos são mais graves, afetando todas as funções da planta, resultando em redução do crescimento e da produtividade. Nesse sentido, a identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância abióticos são fundamentais no desenvolvimento de novas cultivares tolerantes à seca. Dessa forma, a presente invenção descreve um método de produção de plantas que contém em suas células uma sequência de nucleotídeos de cana-de-açúcar. A expressão do vetor que contém a sequencia poderá levar a planta na qual ele é inserido à maior tolerância a estresses abióticos. De uma forma mais ampla, é descrito um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de cana-de-açúcar, o qual é expresso por um promotor e um terminador que funcionam em plantas e este polinucleotídeo confere tolerância a diferentes estresses abióticos.

Description

POLINUCLEOTÍDEO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE CONFERE TOLERÂNCIA A ESTRESSES ABIÓTICOS
CAMPO DA INVENÇÃO
As plantas são influenciadas por um grande número de fatores ambientais e recorrentemente estresses abióticos como seca, salinidade, temperatura, e radiação, são mais graves e afetam todas as funções da planta, resultando em redução do crescimento e da produtividade. Estima-se que esse tipo de estresse reduza a produtividade em 50% e em alguns casos até 70%. Isso tem levado a esforços para a identificação e a compreensão dos mecanismos de tolerância a estresses abióticos, visando o desenvolvimento de novas cultivares mais tolerantes. Dessa forma, a presente invenção descreve um método para produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses ambientais graças à introdução de um vetor que contém sequência de um polinucleotideo de cana-de-açúcar que codifica um polipeptídeo com alta identidade com subunidade β de ATP sintases, além da construção de vetor e seus usos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Um dos principais problemas na agricultura é a seca, que de longe é o estresse ambiental mais importante. Muitos esforços têm sido feitos para melhorar a produtividade das plantas sob condições limitantes de água. Nas ultimas décadas tem-se investido fortemente na produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses, dentre os quais se destacam a seca e o estresse salino. Isso tem permitido compreender melhor as respostas fisiológicas e moleculares das plantas aos estresses, abrindo perspectivas de aumentar o rendimento em condições de estresses. Dentre as tecnologias para produção de plantas tolerantes, a transformação por Agrobacterium (Hooykaas PJ, Schilperoort RA (1992) Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Mol Biol 19: 15-38; Bailon KA, Chilton MD (1983) Agrobacterium Ti plasmids as vectors for plant genetic engineering. Methods Enzymol 101: 527-539), a transferência direta de genes em protoplastos (Gharti-Chhetri GB, Cherdshewasart W, Dewulf J, Paszkowski J, Jacobs M, et al. (1990) Hybrid genes in the analysis of transformation conditions. 3. Temporal/spatial fate of NPTII gene integration, its inheritance and factors affecting these processes in Nicotiana plumbaginifolia. Plant Mol Biol 14: 687-696; Lyznik LA, Peng JY, Hodges TK (1991) Simplified procedure for transient transformation of plant protoplasts using polyethylene glycol treatment. Biotechniques 10: 294-300; Rodenburg KW, de Groot MJ, Schilperoort RA, Hooykaas PJ (1989) Single-stranded DNA used as an efficient new vehicle for transformation of plant protoplasts. Plant Mol Biol 13: 711-719 e Bailas N, Zakai N, Loyter A (1987) Transient expression of the plasmid pCaMVCAT in plant protoplasts following transformation with polyethyleneglycol. Exp Celi Res 170: 228-234) e o bombardeamento de partículas (Klein TM, Wolf ED, Sanford JC (1987) High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70-73) são as mais utilizadas.
Nos últimos anos tem-se obtido grande avanço nas tecnologias para a transformação de plantas e as pesquisas têm se voltado para a necessidade de desenvolver eficazes métodos de transformação genética das principais espécies de interesse experimental e económico. A agrotransformação tem ganhado grande aceitação pela facilidade do método de transformação e a alta taxa de plantas transgênicas geradas a partir desse método. Por outro lado, o tabaco tem sido utilizado amplamente como modelo para estudos envolvendo transformação gênica pela facilidade de transformação e rápida obtenção de gerações transformadas. Desta forma, genes de diferentes espécies podem ser avaliados inicialmente em tabaco, pela facilidade e rapidez na produção e análise das plantas transgênicas. Isso tem ocorrido com genes de cereais, produtos hortícolas, plantas ornamentais, medicinais, árvores frutíferas, pastagens, dentre outros. Assim, embora o tabaco seja uma planta dicotiledônea, ele oferece evidência clara que genes de monocotiledôneas, como cana-de-açúcar, milho, trigo e arroz, possam conferir tolerância a estresses abióticos tanto em plantas monocotiledôneas como dicotiledôneas.
Nos últimos anos, com a chegada de novas tecnologias como o sequenciamento genômico, microarrays e outras tecnologias (Mardis ER (2008) Next- generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402) têm aumentado as informações sobre os genes, até o ponto do patenteamento de genomas completos (Stix G (2006) Owning the stuff of life. Sei Am 294: 76-83 e Stott M, Valentine J (2003) Impact of gene patenting on R&D and commerce. Nat Biotechnol 21 : 729-731; author reply 731). A partir dessas novas abordagens, um grande número de genes vem sendo identificado. Dessa forma, tem-se buscado cada vez mais o patenteamento de plantas ricas em alguns nutrientes e vitaminas, que apresentem aumento na produção ou na tolerância a estresses, entre outros.
Dentro dos estresses, os de tipo abiótico têm tido um interesse particular para aplicação na agricultura devido ao efeito negativo sobre o desenvolvimento e a produtividade em geral, bem como pelo temor às mudanças climáticas. Um dos tipos de estresses mais estudados e consequentemente com alto número de patentes é a seca, que é a principal causa de déficit hídrico ou estresse osmótico nas plantas (Cattivelli L, izza F, Badeck FW, Mazzucotelli E, Mastrangelo AM, et al. (2008) Drought tolerance improvement in crop plants: An integrated view from breeding to genomics. Field Crops Research 105: 1-14).
Uma das mais recentes técnicas denominada microarrays ou chips de DNA tem permitido associar função a genes até então desconhecidos. Essa técnica permite conhecer a expressão de sequências de DNA de centenas de milhares de genes distintos usando tags moleculares fluorescentes que se acendem quando se liga uma fita complementar derivada de moléculas de RNA obtidas dos tecidos vegetais em estudo. Desta forma os chips têm permitido conhecer e identificar genes envolvidos em diferentes processos da planta, como resposta a estresses abióticos, regulação gênica, acúmulo de sacarose, além de resistência a pragas, tolerância à escassez de água, interação planta- patógeno e etc.
Dentre os diversos polinucleotídeos identificados por nosso grupo como diferencialmente expressos sob condições de seca, o que codifica um polipeptídeo com similaridade a polipeptídeos relacionados à subunidade β da ATP sintase foi selecionado e o seu papel na proteção contra estresses abióticos é revelado nesta invenção. As ATP sintases são importantes enzimas que fornecem energia para as células e foram muito conservadas durante a evolução. As enzimas bacterianas possuem essencialmente a mesma estrutura daquelas encontradas nas mitocôndrias de animais, plantas e fungos e também nos cloroplastos das plantas. Na maioria dos sistemas as ATP sintases são localizadas nas membranas e catalisam a síntese de ATP a partir de ADP e fosfato direcionado pelo fluxo de prótons entre a membrana e gerados pela transferência de elétrons. O fluxo parte do lado fotoquímico positivo (alto potencial eletroquímico) para o lado fotoquímico negativo. A reação catalizada pela ATP sintase é completamente reversível.
A estrutura das ATP "sintases é formada por duas porções: uma porção solúvel F, que contém 5 subunidades (α, β, γ, δ, ε). Três sítios de ligação a substratos são encontrados nas subunidades β. Um sítio adicional de ligação ao nucleotídeo adenina é localizado na subunidade a. A subunidade F-i cataliza a hidrolise do ATP. Na parte interna da célula encontra-se a porção F0 que é consistida de 3 subunidades (a, b, c) ( ccarty RE (1992) A plant biochemist s view of H+-ATPases and ATP SYNTHASE. Journal of Experimental Biology 172: 431 - 441).
Os mecanismos de tolerância à seca em plantas têm semelhanças com outros tipos de estresses (Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006) Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annual Review of Plant Biology 57: 781-803), uma vez que as mesmas proteínas e osmoprotetores estão envolvidos em respostas moleculares para diferentes tipos de estresse. Adicionalmente, a maioria dos estresses abióticos começa com um tipo de estresse, por exemplo, osmótico que logo desencadeia os outros. Isto implica que um gene ou via de transdução de sinais identificados como resposta a um estresse especifico pode estar envolvido nas respostas de vários outros tipos de estresses (Yamaguchi- Shinozaki K, Shinozaki K (2006) e Zhu JK (2002) Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol 53: 247-273).
Ao nível celular, as membranas celulares servem como uma barreira permeável para a perda de água e de algumas moléculas importantes. Porém, durante o estresse osmótico, a disponibilidade de água intercelular é restrita, o que altera as concentrações extracelulares de solutos, levando a um desequilíbrio osmótico. Desta forma ocorre um fluxo de água para fora das células, causando uma diminuição na turgência da célula e um aumento nas concentrações intracelulares de solutos. As espécies reativas de oxigénio e toxinas geradas durante esse processo também podem causar um dano extensivo para a célula.
Muitas são as patentes que descrevem diferentes proteínas capazes de conferir tolerância a fatores abióticos como seca e estresse salino, tais como os elementos de ligação a DNA ativados em resposta a desidratação (DREB/CBF), os quais compõem uma importante família com um papel chave na regulação de transdução de sinal induzida pelo estresse (Oh S, Song S, Kim Y, Jang H, Kim S, Kim M, Kim Y, Nahm B, Kim J. (2005). Arabidopsis CBF3/DREB1A and abf3 in transgenic Rrice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant Physiology. 138:341-351; Stockinger E, Gilmour S, Thomashow M. (1997). Arabidopsis Thaliana CBF1 Encodes An AP2 Domain-Containing Transcription Activator That Binds To The C-Repeat/DRE, A Cis-Acting DNA Regulatory Element That Stimulates Transcription In Response To Low Temperature And Water Deficit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94:1035-1040). Proteínas CBF/DREB possuem diferentes domínios e foram identificadas em diferentes espécies. Os documentos US7368630, US7259297 e US7253000 utilizam estes importantes reguladores da transcrição para a produção de plantas transgênicas tolerantes ao estresse hídrico.
A patente US7368630 descreve um método para usar o gene DREB1A para produzir uma linha de células vegetais, tecidos ou plantas com este fator de transcrição, assim como os genes induzidos por desidratação a partir de estudos de microarrays. Por sua vez, o documento US7259297, descreve plantas transgênicas criadas pela introdução de um gene que codifica um fator de transcrição DREB que se liga ao elemento de resposta a seca DRE/CRT (Drought Response Element/Crepeat) e ativa a transcrição de genes localizados em promotores com o referido motivo DRE. Segundo essa patente, a superexpressão do fator de transcrição DREB ativa os genes Rd29A, Rd29B, Rd17, Rd22, DREB1A, Cor6, Cor15a, Erd1 e Kin1, induzindo uma resposta rápida na planta quando esta submetida ao estresse.
Da mesma forma, a patente US7253000 compreende uma sequência de ácido nucléico que utiliza um dos genes pertencentes ao grupo CBF (C- repeat/dehydration-responsive element binding factor, que é outro nome dado aos fatores DREB).
Outras patentes descrevem o uso de vários fatores de transcrição envolvidos na tolerância ao estresse em plantas como, por exemplo, a WO2005024028 e JP2006158402, que empregam fatores de transcrição tipo dedo de zinco (Zinc finger) para conferir tolerância a estresse hídrico nas plantas. Por sua vez, o documento US2008163397, utilizou o fator de transcrição CAAT-binding, conferindo tolerância a seca e ao estresse por frio, utilizando o domínio B do fator de transcrição. Da mesma forma, na patente US2009265813 utiliza-se o fator de transcrição AP2, para obtenção de plantas transgênicas relacionadas com múltiplas características, incluindo o crescimento reforçado da raiz e obtendo tolerância à seca como resultado final.
As patentes aqui mencionadas são reflexo do potencial biotecnológico dos genes que codificam fatores de transcrição, proteínas quinases e outras proteínas envolvidas nas respostas das plantas à seca. Essas proteínas atuam protegendo diretamente componentes celulares durante a desidratação, bem como amplificando o sinal molecular da percepção do estresse hídrico, permitindo a planta antecipar e acelerar os mecanismos de defesa. Nenhum documento apresenta proteção sobre sequências de polinucleotídeos que codifiquem sequências de polipetídeos com alta similaridade à proteínas correspondentes à subunidade β da ATP sintase, como é o caso da presente invenção.
Apesar do crescimento em pesquisas com cana-de-açúcar, são poucos os exemplos de invenções que utilizam genes de cana para produção de plantas com maior tolerância a estresses abióticos (Affenzeller MJ, Darehshouri A, Andosch A, Lutz C, Lutz-Meindl U (2009) Salt stress-induced cell death in the unicellular green alga Micrasterias denticulata. J Exp Bot 60: 939-954 e Molinari HBC, Marur CJ, Daros E, de Campos MKF, de Carvalho JFRP, et al. (2007) Evaluation of the stress-inducible production of proline in transgenic sugarcane (Saccharum spp.): osmotic adjustment, chlorophyll fluorescence and oxidative stress. Physiologia Plantarum 130: 218-229). Além dos trabalhos acima citados recentemente dois pedidos de patente foram solicitados pelo nosso grupo (documentos PCT/BR2011/000201 e PCT/BR2011/000202) onde reivindica-se a proteção do uso de dois genes de cana-de- açúcar (Scdrl e Scdr2) que codificam proteínas de funções desconhecidas que conferem tolerância a seca e sal em plantas transgênicas de tabaco. O uso de genes de cana que dão tolerância a estresses abióticos, em contraponto a genes de outras espécies, permite a produção de plantas transgênicas da cana contendo genes da própria cana, os quais têm maior aceitação pelos consumidores. De fato, 70% dos consumidores dão suporte a modificações genéticas envolvendo genes da própria espécie, em contraste com o suporte de 26% quando se tratam de genes de outras espécies (Rommens CM (2010) Barriers and paths to market for genetically engineered crops. Plant Biotechnology Journal 8: 101-111).
Portanto, esta invenção relaciona-se com a direta manipulação de uma sequência de DNA que codifica um poiipetídeo de cana-de-açúcar com similaridade à subunidade β de ATP sintases. Esta invenção descreve também a construção de vetores que contém a sequência do poiipetídeo de cana-de-açúcar, bem como um processo de produção de plantas transgênicas de forma a produzir um fenótipo de tolerância a estresse hídrico e salino, maior biomassa e maior fotossíntese, dentre outros possíveis.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve um método de produção de plantas que contém em suas células uma sequência de polinucleotídeos de cana-de-açúcar e a superexpressão dessa sequência leva â maior tolerância a estresses abióticos à planta em questão.
Em uma forma mais ampla, o polinucleotídeo de cana-de-açúcar é expresso por um promotor e um terminador que funcionam em plantas. Mais especificamente, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo de DNA recombinante no sentido 5' para 3', que compreende um promotor que funciona em plantas, operacionalmente ligado a um segundo polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de cana, operavelmente ligado ao terminador que finaliza a transcrição do polinucleotídeo de DNA fornecendo um sítio de poliadenilação. A invenção também descreve uma sequência de DNA recombinante em que o promotor é selecionado do grupo constituído por promotores induzíveis, promotores constitutivos, promotores regulados temporalmente, promotores com preferência por tecidos, promotores de estresses específicos, promotores induzíveis por seca, promotores induzíveis pelo déficit de água, e os promotores tecido-específicos.
Também são descritas células vegetais e plantas que contêm em seu genoma moléculas de DNA recombinante, tal como descrito e os propágulos e descendentes delas produzidas. As plantas incluem, mas não estão limitadas a plantas de cultivo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas e dentre elas podem-se incluir cana-de- açúcar, soja, milho, canola, arroz, algodão, cevada, aveia, grama, trigo, pinhão manso, mangueira, goiabeira, limoeiro, abacateiro, laranjeira, ameixeira, pitagueira, jabuticabeira, macieira, pessegueira, batateira, ervilheira, tomateiro, roseira, girassol, feijão, eucalipto, abacate, morango, pêra, maçã, goiaba, cacau, limão, maracujá, palma forrageira, mamona, mandioca, seringueira, mate, jacarandá, café, abóbora, melancia, pêssego, pitanga e caju.
A invenção também descreve um método para produção de plantas tolerantes aos estresses abióticos, graças à transformação genética com uma molécula de DNA recombinante que expressa um polipeptídeo de cana, bem como as plantas e suas células e propágulos, como sementes, contiverem em seu genoma moléculas desse DNA recombinante.
Tais plantas apresentam uma ou mais das seguintes propriedades: uma maior taxa de crescimento em condições onde a seca e/ou o estresse salino seriam limitantes para o crescimento de uma planta não-transformada da mesma espécie, uma maior taxa de crescimento em condições onde a água seria limitante para o crescimento de uma planta não-transformada da mesma espécie, uma maior taxa de crescimento, sob condições em que o aumento de sais ou ions no solo e / ou água seria limitante para o crescimento de uma planta não-transformada da mesma espécie, maior porcentagem de plantas sobreviventes após um período prolongado de seca ou sob estresse salino do que uma planta não-transformada da mesma espécie, um rendimento maior quando comparado a uma planta não-transformada da mesma espécie, ou maior tolerância à seca em comparação com uma planta não-transformada da mesma espécie.
A presente invenção compreende a propagação das plantas genéticamente modificadas, com a finalidade de gerar sementes, plantar tais sementes no solo, ou brotação, como é o caso de uso de toletes em cana-de-açúcar, e que permite o crescimento das plantas sob condições de estresse. Mais especificamente, esta invenção fornece um método para produzir uma planta que tem como uma das características, tais como tolerância a estresses abióticos, aumento ou incremento no rendimento da massa de raízes. A invenção compreende as etapas de inserir no genoma de uma célula de planta, a construção de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo de cana-de-açúcar, a obtenção de uma célula de planta transformada ou células transformadas, a regeneração de plantas transformadas de células vegetais e a seleção de plantas que apresentam melhores características agronómicas. Uma das características da invenção é o fato das plantas selecionadas apresentarem maior tolerância a estresses abióticos selecionado do grupo consistindo de tolerância ao estresse salino, tolerância à seca e sobrevivência após o a combinação de estresses abióticos. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E ANEXOS
Figura 1 : Sequência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 1 ) e sequência do polipeptídeo deduzido (SEQ ID NO: 2).
Figura 2: Análise por PCR em tempo real da expressão do gene que codifica a subunidade β da ATP sintase em amostras de duas variedades de cana-de-açúcar. Entre as variedades utilizadas a RB867515 é considerada tolerante a seca enquanto a RB855536 é considerada sensível. Os dados mostram que gene estudado é induzido por seca na variedade RB855536. As barras correspondem a expressão relativa do gene utilizando a condição de irrigação como controle. Tl: variedade tolerante RB867515 irrigada; TS: variedade tolerante RB867515 sequeiro; SI: variedade sensível RB855536 irrigada; SS: variedade sensível RB855536 sequeiro.
Figura 3: Vetor binário, pCambia2301 ::C10, utilizado na agrotransformação de plantas de tabaco. Os cassetes de seleção, repórter e de expressão do polipeptídeo codificado pela SEQ ID:1 foram clonados sob controle do promotor do vírus do mosaico da couve-flor CamV35S e o terminador do gene da Nopalina sintase (NOS)de agrobactéria. Para a seleção foi utilizado o gene nptll que confere resistência ao antibiótico canamicina e como repórter o gene uidA que codifica a proteína β-glucuronidase (GUS).
Figura 4: Fases da transformação genética de tabaco. (A) Produção de explantes que serão utilizados na transformação de tabaco. Sementes de tabaco selvagem germinadas em placas de petri contendo meio Murashige-Skoog (MS) com 0,28% (w/v) de phytagel. As plantas foram crescidas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 16/8h luz/escuro (300-400 pmol fótons m"2 s~1) a 25°C e umidade relativa de 75-80%. (B) Discos foliares de tabaco após a infecção com agrobactérias e mantidas em placa contendo meio MS (suplementado com 1 mg/L de benzilaminopurina, 0.1 mg/L de ácido naftalenocetico e 0,0059g/L de acetoseringona) por 3 dias. (C) Os discos infectados em meio seletivo (sais MS, 1 mg/L de benzilaminopurina e 100 mg/L de canamicina). (D) Regeneração de plantas tolerantes ao antibiótico canamicina em placas contendo meio MS com 200 mg/L de canamicina. (E) Transferencia das plantulas para fracos contendo meio MS para o alongamento e enraizamento.
Figura 5: O produto da reação de PCR visualizado em gel de agarose 0,8% em TAE contendo brometo de etídeo, sob iluminação de luz ultra-violeta. Dentre as 9 amostras de plantas que apresentaram a coloração azul para o ensaio histoquímico de GUS, a presença do gene nptll foi confirmada em todas. A coluna identificada com Br equivale a ausência de amplificação em uma planta não transformada.
Figura 6: Análise fenotípica de plantas selvagens (não modificadas geneticamente) e transgênicas que possuem a SEQ ID NO: 1 após estresse hídrico. (A) Porcentagem de plantas sobreviventes após o estresse por seca. Plantas de dois meses de idade foram privadas de água por 15 dias e rehidratadas por 3 dias. O experimento foi realizado com 6 réplicas biológicas e o número de plantas sobreviventes foi contado. (B) Planta sobrevivente na esquerda e planta morta na direita. As plantas foram mantidas em condições normais até o florescimento.
Figura 7: Efeitos de diferentes concentrações de NaCI em discos foliares de tabaco transgênico contendo a SEQ ID NO.1 e selvagem. Discos foliares de plantas transformadas com vetor contendo a SEQ ID NO:1 e selvagens foram tratados com 1 mL de meio MS líquido meia força com 0 a 400 mM de NaCI por 5 dias. (A) Discos foliares utilizados como padrão para avaliar os efeitos do estresse salino. Os fenótipos visuais foram escalonados de 1 a 4 de acordo com a intensidade da cor verde e o tamanho. (B) 6 discos de cada planta foram coletados e inoculados em meio MS contendo NaCI e após 5 dias os efeitos do estresse salinos oram avaliados e escalonados de acordo com os padrões mostrados em (A). (C) Conteúdo total de clorofila das linhagens transgênicas e selvagem após estresse salino. O experimento foi realizado com 4 réplicas biológicas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve um método para produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses ambientais graças à introdução de um polinucleotídeo de cana-de-açúcar que codifica um polipetídeo com similiridade à subunidade β de ATP sintase. A sequência do polinucleotídeo é descrita na sequência SEQ ID NO: 1 (Figura 1A), e o polipeptídeo deduzido a partir dessa sequência de DNA está indicado na SEQ ID NO: 2 (Figura 1B).
O invento descrito neste documento refere-se a um vetor de DNA recombinante compreendendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1 , útil para produzir plantas transgênicas e um método para produção de plantas geneticamente modificadas que superexpressam uma molécula de ácido nucléico da SEQ ID NO: 1 , envolvida na resposta das plantas a estresses abióticos, e cuja superexpressão produz uma melhora significativa na resposta da planta a esses estresses. Assim, determina-se que o polinucleotídeo indicado na SEQ ID NO:1 controla direta ou indiretamente a resposta de plantas contra esses estresses.
Como tal, as aplicações da invenção incluem, mas não estão limitadas, à melhoria da produção de plantas que sejam tolerantes a esses estresses abióticos. Da mesma forma, a invenção compreende as sequências com identidade igual ou superior a 60% à SEQ ID NO: 1 , mas não limitantes a somente elas.
A sequência de DNA descrita em SEQ ID NO: 1 , da qual se deduz o polipeptídeo SEQ ID NO: 2, é usada como parte de um DNA quimérico capaz de produzir uma elevada expressão em células vegetais.
O vetor de transformação de plantas usado para introduzir o ácido nucléico na célula vegetal pode ser um plasmídeo, em que o DNA SEQ ID NO: 1 é inserido em sítios de clivagem de endonucleases de restrição ou por recombinação mediada por outros tipos de enzimas. O DNA é inserido no vetor de clonagem utilizando procedimentos padrão amplamente conhecidos. Isso geralmente envolve o uso de enzimas de restrição e ligases do DNA, conforme descrito, por exemplo, por Sambrook et al. (Wood EJ (1983) Molecular-Cloning - a Laboratory Manual - Maniatis,T, Fritsch,Ef, Sambrook.J. Biochemical Education 11 : 82-82). O plasmídio resultante, que inclui a SEQ ID NO:1 pode então ser usado para transformar uma célula vegetal, plantas ou partes de plantas por métodos convencionais de transformação.
Para a transformação de plantas, o plasmídeo de preferência também inclui um gene marcador de seleção, embora existam métodos que prescindam do uso desse tipo de gene marcador. Marcadores seleção de vegetais comumente usados incluem o gene de resistência a canamicina, (neomicina fosfotransferase II ou nptll), o gene de resistência a higromicina (higromicina fosfotransferase ou HPT), o gene de fosfinotricina acetil transferase {bar), o gene 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), ou gene da acetolactato sintase (ALS). Na presente invenção, o marcador de seleção é o gene Nptll, que permite a seleção dos transformantes com o antibiótico canamicina. O plasmídeo também pode incluir um gene repórter que fornece uma indicação clara de que a transformação genética foi efetuada através da detecção da atividade da proteína codificada pelo gene repórter. Os genes repórteres mais comumente utilizados são os que codificam a beta-glucuronidase (GUS), a luciferase e a proteína verde fluorescente (GFP). Genes repórter são muitas vezes colocados nas proximidades do gene de interesse para assegurar que elas são expressas em conjunto e não separadas por eventos do crossing-over.
O plasmídeo, de preferência também inclui os promotores adequados para a expressão do ácido nucléico indicado na SEQ ID NO: 1 e também para a expressão do gene marcador de seleção, assim como o gene repórter. O promotor do vírus do mosaico couve-flor 35S (CaMV 35S) é comumente utilizado na transformação de plantas, bem como o do gene da actina 1 de arroz (Act1 ), da ubiquitina 1 (Ubi1 ), o promotor do gene da alfa-amilase, e promotores de genes induzidos por estresse. Na presente invenção, o promotor utilizado é o promotor CaMV 35S, mas outros promotores também podem ser utilizados.
No plasmídeo, o DNA descrito em SEQ ID NO:1 pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou pode estar sob o controle do seu próprio promotor nativo ou de um promotor diferente. Para a transformação de plantas, o plasmídeo de preferência inclui também uma molécula de ácido nucléico que compreende o terminador, como a região 3' não traduzida dos genes que codificam um inibidor de protease de actina, do vírus do mosaico da couve-flor, ou da nopalina sintase (NOS). Na presente invenção, o plasmídeo inclui o terminador da nopalina sintase (NOS). O plasmídeo é de preferência um vetor de transformação de plantas binário em que os polinucleotídeos de interesse são inseridos dentro das bordas do T- DNA. Exemplos de tais vetores de transformação de plantas que podem ser usados na presente invenção são vetores obtidos a partir de fontes comerciais, tais como a serie pCambia, pBI121 ou pGreenll que contém uma origem RK2 de baixa replicação, o gene marcador da neomicina-fosfotransferase (nptll), e o terminador da nopalina sintase (NOS), promotor constitutivo e um sinal 3' NOS de poliadenilação.
Para a produção de plantas transgênicas, qualquer método adequado para a transformação de monocotiledôneas ou dicotiledôneas pode ser usado, como, por exemplo, a transformação mediada por Agrobacterium ou bombardeamento de partículas (também conhecida como transformação de biobalística ou biolística). Na transformação mediada por Agrobacterium, as células vegetais são colocadas em contato com um inoculo de bactérias transformadas com o plasmídeo contendo o DNA indicado na SEQ ID NO: 1 da invenção. Bactérias do género Agrobacterium que podem ser utilizados para transformar células vegetais incluem espécies de Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens de preferência cepas de A. tumefaciens LBA4404, EHA105 ou GV301. Agrobacterium spp. são transformadas com o plasmídeo por métodos convencionais conhecidos.
Por sua vez, utilizando-se um protocolo de transformação de discos foliares, bactérias de A. tumefaciens com o DNA indicado na SEQ ID NO:1 cionado em vetor binário são cultivadas em um meio de crescimento na presença de antibióticos, como por exemplo, canamicina, para selecionar as células bacterianas que possuem o plasmídeo binário. Em seguida, folhas de tabaco selvagem são esterilizadas superficialmente, cortadas em pequenos discos e incubadas numa suspensão de A. tumefaciens por um tempo adequado. Diferentes tecidos podem ser utilizados para a transformação, tais como folhas, talo, flor dentre outros. Após a incubação com A. tumefaciens as folhas infetadas são transferidas ao meio de cultura in vitro por determinado período de tempo. A seleção das plantas transgênicas é iniciada colocando- se as plantas infetadas no meio de seleção in vitro com antibiótico. Após o desenvolvimento de plântulas com raízes ocorre a transferência para solo e o crescimento em câmara de crescimento.
Adicionalmente, a presente invenção refere-se à produção de plantas transgênicas transformadas com plasmídeos contendo a sequência indicada em SEQ ID NO:1 , aumentando sua tolerância a estresses abióticos, como seca e alta salinidade.
Outra abordagem para se aumentar os níveis de expressão de SEQ ID NO: 1 pode ser a produção de plantas geneticamente modificadas que superexpressem genes que induzam a atividade do promotor do gene endógeno, como é o caso de genes que codificam fatores de transcrição.
Assim, a invenção descreve o método para produção de plantas transgênicas que contém em suas células um gene quimérico com capacidade de expressão em células vegetais, assim como as subsequentes gerações compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 1 e sequências de DNA que permitam a expressão do polipetídeo SEQ ID NO:2 em células vegetais.
Plantas transgênicas, de acordo com a invenção, incluem, sem limitação, os cereais, como trigo, cevada, milho, arroz, aveia, gramíneas forrageiras, turfa, outras monocotiledôneas como cana-de-açúcar, miscanthus, ou qualquer espécie de cultura de outros alimentos como o feijão, a soja, ervilha, tomate, colza, bem como outras espécies de interesse económico, como o tabaco, a laranja, etc.
EXEMPLOS
Exemplo 1 : AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE EXPRESSÃO DA SEQ ID NO: 1 DE CANA-DE- AÇÚCAR
Para avaliar o padrão de expressão do polinucleotídeo SEQ ID NO: 1 sob seca foi feito um Real time-PCR quantitativo conforme descrito por Rocha et al (Rocha FR, Papini-Terzi FS, Nishiyama MY, Vencio RZN, Vicentini R, et al. (2007) Signal transduction-related responses to phytohormones and environmental challenges in sugarcane. Bmc Genomics 8) utilizando folhas de uma variedade de cana com maior tolerância à seca (RB867515) e de outra com maior sensibilidade à seca (RB855536) mantidas sob irrigação ou em sequeiro (com suspensão de rega, equivalente à estresse por seca). Como gene de referência foi utilizado o gene da poliubiquitina de cana.
A expressão sob seca (sequeiro) foi determinada a partir do método 2- ΔΔΟΤ (Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25: 402-408), utilizando amostras não submetidas ao estresse (irrigadas) como controle. A significância estatística das diferenças de expressão gênica relativas foi determinada assumindo-se um modelo log-normal que calcula a probabilidade Pr (amostra > referência>) e Pr (amostra < referência) para genes induzidos e reprimidos, respectivamente. O Perfil de expressão foi considerado válido quando P≥0,95. Para cada tratamento foram usadas folhas de três plantas. O resultado da análise por PCR em tempo real mostrou a indução do gene que codifica a subunidade β da ATP sintase é induzido por estresse por déficit hídrico na variedade mais sensível a seca (RB855536) e é mostrado na figura 2.
Exemplo2: CLONAGEM DA SEQ ID NO: 1 DE CANA-DE-AÇÚCAR E PRODUÇÃO DE UM CASSETE RECOMBINANTE.
Um clone com sequência de polinucleotídeos de cana-de-açúcar com similaridade a genes que codificam a subunidade β da proteína ATP sintase foi obtido do Brazilian Clone Collection Center (BCCCENTER, Jaboticabal, Brasil). A partir desse DNA a sequência codificante, indicada na SEQ ID NO: 1 (Figura 1), foi amplificada por PCR utilizando oligonucleotideos específicos 5'- CCATGGTGGCGCTGGACAAG-3-' e 5'- GGTCACCTCAGGCGGATGGG -3', e clonada no vetor pGEMT-Easy (Promega, EUA). Posteriormente, um fragmento contendo a SEQ ID NO: 1 foi retirada do vetor pGEMT- Easy com a enzima EcoRI e inserido no vetor pRT104 digerido com a mesma enzima. O cassete de expressão foi liberado pela digestão com Hindlll e clonado no vetor de expressão pCAMBIA 2301 (Cambia, Austrália), também digerido com a mesma enzima. A construção recombinante final resultante, pCAMBIA2301 ::C10 (Figura 3) foi introduzida em Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 .
Exemplo 3: PRODUÇÃO DE PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
Sementes selvagens de tabaco (Nicotiana tabacum, var. SR1) foram germinadas em placas de Petri contendo meio Murashige-Skoog (MS) com 0,28% (w/v) de phytagel. As plantas foram crescidas em câmara de crescimento com fotoperiodo de 16/8h luz/escuro (300-400 pmol fótons m"2s"1) a 25°C e umídade relativa de 75-80%. Folhas de tabaco foram cortadas em discos pequenos e incubadas com suspensões de A. tumefaciens por 5 a 10 min. Após isto, as folhas infetadas foram transferidas ao meio MS (suplementado com 1 mg/L de benzilaminopurina, 0.1 mg/L de ácido naftalenocetico e 0,0059g/L de acetoseringona) por 3 dias. Os discos infectados foram transferidos para meio seletivo (sais MS, 1 mg/L de benzilaminopurina e 100 mg/L de canamicina). As plantas que começaram a se desenvolver foram transferidas para meio MS com 200 mg/L de canamicina (Figura 4). As plantas enraizadas foram transferidas para o substrato Flores e Folhagens (BIOMIX) e mantidas em casa-de- vegetação sob condições normais até o florescimento e coleta de sementes.
Exemplo 4: ANÁLISES DA PRESENÇA DA SEQ ID NO: 1 EM PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
A caracterização inicial das plantas enraizadas e transferidas para solo foi feita primeiramente pelo ensaio histoquímico utilizando-se o X-GIuc como substrato para a detecção do gene beta-glucuronidase, também inserido no cassette de expressão.
Observou-se que um grande número de plantas apresentou forte coloração azul, as quais foram utilizadas para confirmar a integração do transgene contendo a SEQ ID NO:1 por PCR, utilizando-se DNA genômico como molde.
Em seguida foi extraído DNA total de amostras de folha de plantas selvagens e plantas transgênicas. Para tal, coletaram-se cerca de 50 - 150 mg de folha, que foram macerados em microtubos de centrífuga com nitrogénio líquido até a obtenção de um pó bastante fino, ao qual acrescentaram-se 500 pL de tampão de extração (Tris 100 mM pH=8.0, EDTA 50 mM pH=8.0, NaCI 500 mM, β-mercaptoetanol 10mM) seguidos das da adição de 35 pL de SDS 20%.. As amostras foram, então, mantidas em banho- maria a 65°C, por 10 minutos e 130 pL de Acetato de Potássio 5M foram adicionados e, então, os tubos foram mantidos em gelo por 5 minutos.
Em seguida, os tubos foram centrifugados numa microcentrífuga a 15.000 g durante 10 minutos. O sobrenadante foi então transferido para um novo tubo plástico de 1 ,5 mL contendo 640 pL de álcool isopropílico e 60 pL de acetato de sódio 3M, misturado por inversão e incubado a -20°C por 10 minutos. Em sequência, os tubos foram centrifugados numa a 15.000 g durante 10 minutos e o sobrenadante foi descartado. O DNA precipitado foi lavado nos próprios tubos com álcool 70%, por três vezes e foram adicionados 100 pl_ de água ultra pura acrescida de RN Ase A 100 mg/mL e então incubada a 37°C por 30 minutos. O DNA genômico foi armazenado a 4°C.
A presença de SEQ ID NO: 1 no DNA genômico extraído de plantas transgênicas de tabaco foi confirmada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para a amplificação do gene nptll (Figura 5). Inicialmente foram utilizados 1.0 μΙ_ de DNA, 0.5 μΙ_ dNTP (10mM), 1.0 μΙ_ MgCI2 (25mM), 0.75 μΐ_ de Primer direto (10μΜ), 0.75 μΙ_ Primer reverso (10μΜ), 2.5 iL Tampão Taq 10x, 0.3 pL Taq Polimerase (Fermentas), 18.2 μΙ_ de água Milli-Q e essa reação foi submetida ao seguinte programa de amplificação: 10 minutos à 95°C, mais 35 ciclos de 1 minuto à 94°C, 1 minuto à 65°C, 1 minuto à 72°C e uma extensão final de 7 minutos a 72°C.
O produto dessa reação foi visualizado em gel de agarose 0,8% em TAE contendo brometo de etídeo, sob iluminação de luz ultra-violeta. Dentre as 9 amostras de plantas que apresentaram a coloração azul para o ensaio histoquímico de GUS, a presença do gene nptll foi confirmada em todas. Essas plantas foram utilizadas nos ensaios posteriores para observar os efeitos da SEQ ID NO:1 nas características das plantas de tabaco transgênicas.
Exemplo 5: ANÁLISE DOS EFEITOS DA SUSPENSÃO DE REGA NAS PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS CONTENDO A SEQ ID NO: 1
Para verificar a resposta à suspensão de rega das plantas transgênicas em comparação com as plantas selvagens foram utilizadas plantas de tabaco (T2) em que a homozigose do transgene foi verificada. Para isso sementes das linhagens homozigotas foram germinadas e as plantas foram transferidas para potes com 300 g de substrato Flores e Folhagens (BIOMIX) e mantidas sob condições normais de rega até atingirem 2 meses de idade. Esse procedimento foi realizado com plantas do tipo selvagem e com plantas transgênicas identificadas no Exemplo 4.
Plantas de dois meses de idade de três eventos independentes (27.3, 21.1 e 20.5) e selvagens foram expostas a suspensão de rega por 15 dias e foram posteriormente reidratadas por 3 dias. O experimento foi realizado com 6 réplicas biológicas de cada linhagem (transgênicas e selvagem) e o número de plantas sobreviventes foi contado (Figura 6A). A diferença entre o número de plantas que tiveram a capacidade de se recuperarem após o período de seca foi significativamente diferente entre as linhagens transgênicas e as plantas selvagens. As linhagens transgênicas 27.3, 21.1 e 20.5 que contém a SEQ ID NO: 1 apresentaram as taxas de sobrevivência ao período de seca de 88,3%, 66,6% e 66,6% respectivamente, enquanto a linhagem não transformada apresenta uma taxa de sobrevivência de 16,6%. O Figura 6B mostra uma planta sobrevivente (transgênica) e uma planta não sobrevivente (selvagem). Estes dados mostram que a presença de vetor contendo a SEQ ID NO: 1 aumenta a tolerância â seca.
Exemplo 6: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ESTRESSE SALINO EM DISCOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS CONTENDO A SEQ ID NO: 1
Discos foliares de 3 eventos transgênicos independentes que possuem a
SEQ ID NO: 1 e de plantas selvagens foram tratados com 1 mL de meio MS líquido meia força com 0, 200, 300 e 400 mM de NaCI por 5 dias. Após o período ao qual os discos foram submetidos ao estresse salino, estes foram numerados, dispostos aleatoriamente e quatro pessoas foram solicitadas para atribuir notas de 1 a 4 para os efeitos fenotípicos do estresse baseando-se em 4 padrões previamente estabelecidos (Figura 7A). Nenhum avaliador teve conhecimento prévio de quais discos correspondiam a linhagens transgênicas ou selvagens bem como quais eram as réplicas do experimento. A média entre as notas atribuídas pelos 4 avaliadores para cada uma das amostras foi calculada para inferir a severidade do estresse (Figura 7B). Dados mostram que as linhagens transgênicas são mais tolerantes ao tratamento com 200 mM de NaCI do que as plantas não transformadas e que não existe diferença significativa entre transgênicos e selvagens nos outros tratamentos testados. Após a avaliação do fenótipo visual, o conteúdo de clorofila foi quantificado como descrito por Arnon (1949) (Arnon, D.l. (1949). Plant Physiology 24: 1-15) O NaCI causou uma redução no teor de clorofila em todas as plantas. No entento, os dados confirmam que a retenção da clorofila nos eventos transformados com a SEQ ID NO: 1 é maior do que nas plantas não transformadas no tratamento com 200 mM de NaCI (Figura 7C). Os dados acima descritos permitem concluir que a presença de vetor contendo a SEQ ID NO: 1 proporciona uma melhoria na tolerância ao estresse salino.

Claims

1/6 REIVINDICAÇÕES
1. Método para produção de plantas geneticamente modificadas, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) Produção de um vetor que compreenda a sequência polinucleotídica de interesse descrita em SEQ ID NO:1 ;
b) Produção de um vetor em que a sequência descrita em SEQ ID NO:1 esteja operacionalmente ligada a um promotor funcional em plantas;
c) Produção de um vetor em que a sequência descrita em SEQ ID NO:1 esteja operacionalmente ligado a um terminador funcional em plantas;
d) Inserção do dito vetor compreendendo a sequência descrita em SEQ ID NO:1 , o promotor e o terminador no genoma de célula vegetal, planta ou partes de plantas.
2. Método para produção de plantas geneticamente modificadas, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) Produção de um vetor que compreenda pelo menos 60% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:1 ;
b) Produção de um vetor em que a sequência com pelo menos 60% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:1 esteja operacionalmente ligada a um promotor funcional em plantas;
c) Produção de um vetor em que a sequência com pelo menos 60% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:1 esteja operacionalmente ligado a um terminador funcional em plantas; 2/6
d) Inserção do dito vetor compreendendo a sequência com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO:1 , o promotor e o terminador no genoma de célula vegetal, planta ou partes de plantas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelas plantas geneticamente modificadas apresentarem no seu genoma a sequência gênica SEQ ID NO:1.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado peias plantas geneticamente modificadas apresentarem no seu genoma sequência gênica com pelo menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 1.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pela sequência gênica SEQ ID NO:1 ser obtida de cana-de-açúcar.
6. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por poder ser aplicado em monocotiledônias.
7. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por poder ser aplicado em dicotiledônias.
8. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser aplicado em tabaco.
9. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser aplicado em cana-de-açúcar, soja, milho, arroz e trigo.
10. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por permitir a integração do vetor no genoma da célula vegetal.
1 1. Método, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por modular a tolerância da planta a estresses ambientais. 3/6
12. Método, de acordo com a reivindicação 11 , caracterizado pelo estresse ambiental ser preferencialmente seca.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pelo estresse ambiental ser preferencialmente salinidade.
14. Vetor de DNA recombinante, caracterizado por compreender a sequência polinucleotídica descrita em SEQ ID NO:1.
15. Vetor, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender uma sequência de polinucleotídeos responsável pela produção de um polipeptídeo descrito na SEQ ID NO: 2.
16. Vetor de DNA recombinante, caracterizado por compreender uma sequência polinucleotídica com pelo menos 60% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO:1.
17. Vetor, de acordo a reivindicação 16, caracterizado por compreender uma sequência de polinucleotídeos responsável pela produção de um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
18. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por ser vetor de expressão ou vetor de clonagem.
19. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por poder ser um plasmídeo.
20. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado pelas sequências polinucleotídicas de interesse serem inseridos entre as bordas do T-DNA de um vetor binário. 4/6
21. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por conter um promotor operacionalmente ligado à sequência polinucleotídica de interesse.
22. Vetor, de acordo com a reivindicação 21 , caracterizado pelo promotor ser preferencialmente o promotor CaMV 35 S do vírus do mosaico do couve-flor.
23. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por conter um terminador operacionalmente ligado à sequência polinucleotídica de interesse.
24. Vetor, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo ácido nuciéico que codifica o terminador ser, preferencialmente, o da nopalina sintase (NOS).
25. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por poder conter um gene marcador.
26. Vetor, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo gene marcador ser preferencialmente o gene Nptll.
27. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por poder conter um gene repórter.
28. Vetor, de acordo com as reivindicações 14 e 16, caracterizado por ser capaz de permitir a transferência de DNA para célula vegetal, planta ou partes de plantas.
29. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de célula vegetal, planta ou partes de planta.
30. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de sementes a partir de plantas que contém a sequência de interesse descrita em SEQ ID NO:1. 5/6
31. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de sementes a partir de plantas que contém sequência de interesse com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID N0.1.
32. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de partes de plantas usadas com a finalidade de reprodução assexuada a partir de plantas que contém a sequência descrita em SEQ ID NO:1.
33. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de partes de plantas usadas com a finalidade de reprodução assexuada a partir de plantas que contém sequência polinucleotídica com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO:1.
34. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de progénie de plantas que contém a sequência descrita em SEQ ID NO:1.
35. Uso do método descrito nas reivindicações de 1 a 13 caracterizado por ser aplicado para produção de progénie de plantas que contém sequência polinucleotídica com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO:1.
36. Uso do vetor descrito nas reivindicações de 14 a 28 caracterizado por conter a sequência polinucleotídica de interesse descrita em SEQ ID NO:1.
37. Uso do vetor descrito nas reivindicações de 14 a 28 caracterizado por conter sequência polinucleotídica com pelo menos 60% de identidade com a descrita em SEQ ID NO:1.
38. Uso da sequência descrita em SEQ ID NO: 1 caracterizado por poder ser aplicado em monocotiledônias ou dicotiledônias. 6/6
39. Uso das sequências gênicas que apresentam pelo menos 60% de identidade com a sequência descrita em SEQ ID NO: 1 , caracterizado por poder ser aplicado em monocotiiedônias ou dicotiiedônias.
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