BR102016021788A2 - método de produção de planta com tolerância a estresse abiótico, planta com biomassa aumentada e/ou com pólen tolerante à dessecação, e moléculas para uso em transformação de plantas. - Google Patents
método de produção de planta com tolerância a estresse abiótico, planta com biomassa aumentada e/ou com pólen tolerante à dessecação, e moléculas para uso em transformação de plantas. Download PDFInfo
- Publication number
- BR102016021788A2 BR102016021788A2 BR102016021788-1A BR102016021788A BR102016021788A2 BR 102016021788 A2 BR102016021788 A2 BR 102016021788A2 BR 102016021788 A BR102016021788 A BR 102016021788A BR 102016021788 A2 BR102016021788 A2 BR 102016021788A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- plant
- nucleic acid
- seq
- plants
- sequence
- Prior art date
Links
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title description 14
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 title description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 67
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 198
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 33
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 28
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 11
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 7
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 5
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 claims description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 claims description 3
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 3
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 claims description 2
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000611157 Brachiaria Species 0.000 claims description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 claims description 2
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 claims description 2
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 claims description 2
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 claims description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 claims description 2
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 2
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 claims description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 claims description 2
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 claims 1
- 240000000905 Nymphoides indica Species 0.000 claims 1
- 235000017590 Nymphoides indica Nutrition 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 17
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 6
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 2
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 2-cis-abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\C1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 101100029891 Caenorhabditis elegans pkd-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101150008089 DREB1B gene Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102100025032 Dynein regulatory complex protein 1 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 101000908373 Homo sapiens Dynein regulatory complex protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004687 Malate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241001508381 Subterranean clover stunt virus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 235000010726 Vigna sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000042314 Vigna unguiculata Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003053 completely randomized design Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000023753 dehiscence Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002015 leaf growth Effects 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000025469 response to water deprivation Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 230000015378 stomatal closure Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
a presente invenção pertence ao campo da genética vegetal e descreve um novo e inventivo método de produção de plantas com tolerância aumentada a estresse hídrico que podem apresentar biomassa aumentada e/ou pólen resistente à dessecação. a invenção ainda provê moléculas, construções de ácido nucléico e outros elementos que se referem à introdução de gene modificado para obtenção da referida planta. também é provida planta que incorpora tais elementos, suas partes e plantas de sua progênie.
Description
Relatório Descritivo de Patente de Invenção
Método de produção de planta com tolerância a estresse abiótico, planta COM BIOMASSA AUMENTADA E/OU COM PÓLEN TOLERANTE À DESSECAÇÃO, E MOLÉCULAS PARA USO EM TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
Campo da Invenção [1] A presente invenção refere-se a plantas com maior tolerância a estresse hídrico, apresentando biomassa aumentada e que produzam pólen tolerante a dessecação. Em particular a moléculas de ácido nucléico, construções e outros agentes associados à manipulação de genes em plantas. A presente invenção também se refere a plantas que incorporam tais elementos, em especial, a plantas que incorporam as construções, em que plantas exibem polipeptídeo da invenção em questão.
Antecedentes da Invenção [2] Os estresses abióticos estão entre as maiores limitações para o cultivo de várias espécies como milho, soja, arroz, feijão, cana-de-açúcar e trigo. As plantas naturalmente respondem aos estresses em vários níveis, molecular, fisiológico, anatômico e morfológico; essas respostas variam de acordo com a espécie, o período do desenvolvimento ou crescimento da planta, e à intensidade do estresse. O estresse hídrico causado pela seca, que é um tipo de estresse abiótico, pode ser devastador para a agricultura, e atualmente, grande parte das terras cultivadas do mundo sofre com a baixa disponibilidade de água.
[3] O déficit hídrico ocorre quando há baixa disponibilidade de água para a planta, o que leva o conteúdo de água de um tecido a ficar abaixo do mais alto possível exibido durante o estado de maior hidratação. Um dos primeiros sintomas do déficit hídrico ocorre nas folhas, onde suas células perdem o turgor e as paredes celulares afrouxam. Em sequência a concentração dos solutos se eleva e a expansão foliar fica comprometida por depender do turgor celular. Em resposta rápida à desidratação, as
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 4/35
2/25 plantas fecham os estômatos, reduzindo a evaporação em suas folhas, ou seja, o fechamento dos estômatos e uma rápida resposta a queda de turgor nas folhas. O fechamento estomático também está relacionado a resposta química através do ácido abscísico (ABA) produzido nas raízes em condição de desidratação e acumulado nas folhas.
[4] Em estresse hídrico moderado, o crescimento das raízes não é inicialmente afetado pelo baixo crescimento das folhas, por depender dos produtos fotos sintéticos que são pouco afetados pela queda de turgor das folhas. Em decorrência da continuidade do crescimento radicular e a interrupção do crescimento da parte aérea, ocorre um desequilíbrio dessa proporção, ou seja, em condições de déficit hídrico moderado há maior crescimento de raiz visando à busca por solos mais úmidos. Em estresse hídrico severo há o fechamento completo dos estômatos e consequente diminuição da troca gasosa, o que acarreta na paralisação da fotossíntese. Com o a interrupção da fotossíntese a planta cessa o acúmulo biomassa, o que pode levar à sua morte.
[5] Com o intuito de obter plantas com maior tolerância à seca, várias estratégias vem sendo abordadas, incluindo o mapeamento gênico e transformação de plantas de interesse agronômico.
Sumário da Invenção [6] A invenção trata de um método para aumentar biomassa e/ou tolerância a estresse hídrico de uma planta expressando polinucleotídeo exógeno contendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol.
[7] A invenção também prevê uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°l, além de um polipeptídeo caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°2.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 5/35
3/25 [8] Adicionalmente, também é previsto um gene quimérico caracterizado por compreender um polinucleotídeo com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°2 ligado operacionalmente a um promotor ativo, além de um vetor compreendendo molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ IDN°1.
[9] Nesse contexto, o documento também trata de célula e/ou planta transformada compreendendo molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°l. Tal planta também pode conter vetor compreendendo molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°l.
[10] A presente invenção também se refere a um método de produzir uma planta com maior tolerância ao estresse hídrico, compreendendo as etapas de:
• Transformar explantes foliares com polinucleotídeos em que a referida sequência de ácido nucléico compreenda sequência SEQ ID °1 para obtenção de uma primeira linhagem de planta transgene T0;
• Regeneração dos explantes foliares transformados;
• Transferir plantas da linhagem T0 para solo e cultivar dadas plantas em casa de vegetação para obtenção de sementes de linhagem Tl.
[11] Nesse contexto também é prevista a planta produzida por um método definido na invenção, assim como partes desta planta, incluindo suas sementes e, adicionalmente, plantas de sua progênie.
Breve Descrição das Figuras [12] Figura 1: Vetor pC-DRCl utilizado para transformação de tabaco via Agrobacterium contendo SEQ ID N°1 dirigido pelo promotor CaMV35s e com o terminador nos3’, o gene bar que confere resistência ao glifosinato de amônio dirigido pelo promotor CaMV35S e com terminador CaMV35S poly A.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 6/35
4/25 [13] Figura 2: Gel de agarose 0,7% apresentando a amplificação de bandas de aproximadamente 586 pb correspondentes a SEQ ID N°1 em três colônias de A. tumefaciens transformadas com o plasmfdeo; 1, 2, 3: colônias diferentes de A. tumefaciens e M: marcador DNA Ladder Ikb.
[14] Figura 3: Teste comercial para detecção de fosfinotricina acetiltransferase (PAT), no qual 1 corresponde à planta transformada apresentando duas bandas indica a presença da proteína PAT e 2 corresponde à planta não transformada apresentando somente uma banda indica ausência da proteína PAT.
[15] Figura 4: Gel de agarose 0,7% apresentando a amplificação de bandas de aproximadamente 586 pb correspondentes a SEQ ID N°1 de plantas aclimatadas em casa de vegetação; 1 à 16: diferentes plantas aclimatadas; C-: planta controle negativo; C+ controle positivo da reação; Br: reação sem DNA; M: marcador DNA Ladder Ikb.
[16] Figura 5: Gel de agarose 0,7% apresentando a amplificação de bandas de aproximadamente 586 pb correspondentes a SEQ ID N°1 de plantas aclimatadas em casa de vegetação; 14 à 20: diferentes plantas aclimatadas; C-: planta controle negativo; C+ controle positivo da reação; Br: reação sem DNA; M: marcador DNA Ladder Ikb.
[17] Figura 6: A) Altura das linhagens WT e transformadas que não foram submetidas ao teste de seca; B) comprimento radicular das linhagens WT e transformadas que não foram submetidas ao teste de seca; C) Massa fresca das parte aérea das linhagens WT e transformadas que não foram submetidas ao teste de seca; D) Massa seca parte aérea das linhagens WT e transformadas que não foram submetidas ao teste de seca; E) Massa fresca da raiz das linhagens WT e transformadas que não foram submetidas ao teste de seca; F) Massa seca das raízes das linhagens WT e transformadas que não foram submetidas ao teste de seca; G) Relação entre a massa fresca da raiz e a parte aérea das linhagens WT e transformadas que não foram submetidas ao teste de seca; H) Relação da massa seca entre a raiz e a parte aérea das linhagens WT e transformadas que não foram submetidas ao teste de seca. Não foram observadas variações significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 7/35
5/25 [18] Figura 7: Taxa Fotossintética das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Os asteriscos representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[19] Figura 8: Taxa de transpiração das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Os asteriscos representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[20] Figura 9: condutância estomática das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Os asteriscos representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[21] Figura 10: Teor relativo de água das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Os asteriscos representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[22] Figura 11: Eficiência do uso da água instantânea das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Os asteriscos representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[23] Figura 12: Potencial hídrico das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Os asteriscos representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[24] Figura 13: Crescimento de parte aérea médio das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Os asteriscos representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[25] Figura 14: Comprimento radicular das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Não foram observadas diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[26] Figura 15: Massa fresca da parte aérea das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. As letras representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[27] Figura 16: Massa seca da parte aérea das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. As letras representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 8/35
6/25 [28] Figura 17: Massa fresca da raiz das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Não foram observadas diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[29] Figura 18: Massa seca das raízes das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. Não foram observadas diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[30] Figura 19: Relação de massa fresca entre raiz e parte aérea das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. As letras representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[31] Figura 20: Relação de massa seca entre a raiz e a parte aérea das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após período de estresse hídrico. As letras representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[32] Figura 21: Teor relativo de água no solo durante o período do estresse hídrico. Não houve diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[33] Figura 22: Viabilidade dos grãos de pólen das linhagens WT e transformadas de plantas de tabaco após estresse por calor e viabilidade sem estresse por calor. As letras representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
[34] Figura 23: Comparação entre plantas WT e plantas das linhagens T6, T16 e T17 submetidas ou não ao estresse hídrico. A) Comparação de três plantas da linhagem WT, a esquerda e três plantas da linhagem T6 a direita que foram submetidos ao estresse hídrico; B) plantas da linhagem WT que não foram submetidas ao estresse hídrico ao lado da planta que foi submetida ao estresse hídrico a esquerda e plantas da linhagem T6 que foram submetidas ao estresse hídrico ao lado da planta que foi não submetida ao estresse hídrico, a direita; C) Comparação de três plantas da linhagem WT a esquerda e três plantas da linhagem T16 a direita que foram submetidos ao estresse hídrico; D) plantas da linhagem WT que não foram submetidas ao estresse hídrico ao lado da planta que foi submetida ao estresse hídrico a esquerda, plantas da linhagem T16 que não foram submetidas ao estresse hídrico ao lado da planta que foi submetida ao estresse hídrico a direita; E) Comparação de três plantas da linhagem WT a esquerda e três plantas da linhagem T17 a direita que foram submetidos ao estresse hídrico; F) plantas
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 9/35
7/25 da linhagem WT que não foram submetidas ao estresse hídrico ao lado da planta que foi submetida ao estresse hídrico a esquerda, plantas da linhagem T17 que não foram submetidas ao estresse hídrico ao lado da planta que foi submetida ao estresse hídrico a direita; barra de escala 10 cm.
[35] Figura 24: Recuperação das plantas submetidas ao teste de estresse hídrico com intervalos de uma hora; plantas posicionadas da seguinte forma da esquerda para a direita: WT, T6, Til, T16, T17, T20, plantas das linhagens transformadas com recuperação ligeiramente mais rápida.
Descrição Detalhada da Invenção [36] A presente invenção descreve um novo e inventivo método de produção de planta com biomassa aumentada e tolerante a estresse hídrico. No contexto da referida descrição, inúmeros termos serão utilizados e, por isso, serão detalhados a seguir.
[37] O termo “ácido nucleico” refere-se a uma molécula a qual pode ser fita simples ou fita dupla, composta de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, um fosfato e uma base purina ou pirimidina. Um “fragmento de ácido nucleico” é uma fração de uma dada molécula de ácido nucleico. “Complementariedade” refere-se ao pareamento específico de bases purinas e pirimidinas que consistem de ácidos nucleicos: pares de adenina com timina e pares de guanina com citosina. Então, o “complemento” de um primeiro fragmento de ácido nucleico refere-se ao segundo fragmento de ácido nucleico cuja sequência de nucleotídeos é complementar à primeira sequência de nucleotídeos.
[38] Em organismos mais complexos, o ácido desoxirribonucleico (DNA) é um ácido nucléico que contém a informação do material genético de um dado organismo, enquanto o ácido ribonucleico (RNA) é um ácido nucléico que está envolvido na transferência da informação do DNA em proteínas. Um “genoma” é toda parte principal do material genético contida em cada célula de um organismo. O termo “sequência de nucleotídeo” refere-se às sequências de polímeros de nucleotídeos, formando uma fita de DNA ou RNA, as quais podem ser simples ou dupla-fita, opcionalmente sintéticas, não naturais ou com bases de nucleotídeos alteradas capazes de incorporação dentro de
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 10/35
8/25 polímeros de DNA ou RNA. O termo “oligômero” refere-se a sequências curtas de nucleotídeos, usualmente até 100 bases de comprimento. O termo “homólogo” faz referência à ligação ancestral entre as sequências de nucleotídeos de duas moléculas de ácido nucleico ou entre as sequências de aminoácidos de duas moléculas de proteínas. A estimativa de tal homologia é provida através da hibridização de DNA-DNA ou RNARNA sob condições de estringência como definido no estado da técnica (como mencionado no documento US20030074685, Hames and Higgins, Ed. (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.K); ou pela comparação de similaridade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico ou proteína (como mencionado no documento US20030074685, Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453).
[39] “Gene” refere-se ao fragmento de nucleotídeo que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias precedentes (região 5’ não traduzida) e posteriores (região 3’ não traduzida) à região codificadora. “Gene nativo” refere-se a um gene isolado com sua própria sequência reguladora encontrada na natureza. “Gene quimérico” refere-se ao gene que compreende sequências codificadoras, regulatórias e heterogêneas não encontradas na natureza. O gene quimérico da presente invenção compreende moléculas isoladas de ácido nucleicos ligadas operacionalmente a promotores ativos. Construções gênicas da presente invenção podem conter um ou mais genes quiméricos e podem ou não apresentar introns. “Gene endógeno” refere-se ao gene nativo normalmente encontrado em sua localização natural no genoma e não é isolado. Um “gene exógeno” refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido por transferência gênica. “Pseudogene” refere-se a uma sequência nucleotídica que não codifica uma enzima funcional.
[40] “Sequência codificadora” refere-se à sequência de DNA que codifica uma proteína específica e exclui a sequência não codificadora. Uma “sequência codificadora interrompida” significa a sequência que atua como separadora (por exemplo, um ou mais introns ligados através de junções). Um “intron” é uma sequência de nucleotídeo que é transcrita e está presente no pré mRNA, mas é removida através de divagem e a re-ligação do mRNA dentro da célula gerando um mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína. Exemplos de introns incluem, mas não são limitados a,
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 11/35
9/25 intron pdk, intron pdk2, intron catalase da mamona, intron Delta 12 desnaturase de algodão, Delta 12 desnaturase de Arabidopsis thaliana, intron ubiquitina de milho, intron de SV40, introns do gene da malato sintase.
[41] “Transcrito de RNA” refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia perfeita da sequência de DNA, ele é referido com transcrito primário ou ele pode ser uma sequência de RNA derivada de um processo pós-transcricional do transcrito primário e é então referido como transcrito maduro. “RNA mensageiro (mRNA)” refere-se ao RNA sem introns.
[42] O termo “vetor” diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (sejam eles de DNA ou RNA) podem ser ligados. Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores, mas não limitados, são os vetores pHANNIBAL (Wesley SV, Heliwell CA, Smith NA, Wang M, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green A G, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and highthroughput Gene silencing in plants. Plant J. 27:581590) pGLYP, pC33OO, pAC321, série pCambia (BioForge Co.), pBI121 (Chen, Ρο-Yen; Wang, Chen-Kuen; Soong, Shaw-Ching; To, Kin-Ying. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. .Molecular Breeding vol. 11 issue 4 May 2003. p. 287-293), pBSK (Addgene Co.), pGEM-T easy (Promega Corporation), pETIOl/ D-TOPO (Invitrogen). A obtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al. (Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).
[43] “Promotor” refere-se à sequência de DNA em um gene, usualmente localizada a montante da sequência codificadora, a qual controla a expressão da sequência
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 12/35
10/25 codificadora promovendo o reconhecimento pela RNA polimerase e outros fatores requeridos para a própria transcrição. Promotores podem também conter sequências de DNA que estão envolvidas na ligação de fatores de proteínas as quais controlam o efeito do início da transcrição em resposta a condições fisiológicas ou de desenvolvimento. “Promotores constitutivos” referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos do organismo e durante todo tempo. Promotores “tecido-específicos” ou “desenvolvimento-específicos” são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios do desenvolvimento específicos em um tecido, como no início ou final da embriogênese.
[44] O promotor pode conter elementos enhancers. Um enhancer é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecidoespecificidade de um promotor.
[45] O termo “expressão” refere-se à transcrição de uma dada sequência de DNA. Mais especificamente nessa invenção, refere-se à transcrição e acumulação estável do dsRNA derivado dos fragmentos de ácidos nucleicos da invenção.
[46] “Sequências regulatórias apropriadas” referem-se a sequências de nucleotídeos em genes nativos ou quiméricos que estão localizadas acima (região 5’ não traduzida), dentro, e/ou abaixo (região 3’ não traduzida) dos fragmentos de ácido nucleicos da invenção, as quais controlam a expressão dos fragmentos de ácido nucleicos da invenção.
[47] “Transformação” refere-se a transferência do gene exógeno para dentro do genoma de um organismo hospedeiro e sua consequente inclusão na herança geneticamente estável.
[48] “Plantas” referem-se a organismos eucariotos, autotróficos e fotos sintéticos, pertencentes ao Reino Plantae.
[49] O termo “promotor” refere-se a uma sequência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula. Isso inclui qualquer promotor de origem vegetal ou qualquer promotor de origem não vegetal o qual seja capaz de direcionar a
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 13/35
11/25 expressão em uma célula vegetal, por exemplo promotores de origem viral ou bacteriana tais como 35SCaMV (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hapster et al, 1988 Mol. Gen. Genet. 212, 182-190) e promotores do gene presentes no T-DNA de Agrobacterium\ promotores tecido-específicos ou órgãoespecíficos, incluindo mas não limitados a promotores semente-específicos (WO8903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionado no pedido de patente US20030175783, An et al., 1996 The Plant Cell 8, 15-30), promotores específicos de caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), promotores específicos de folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), promotores específicos de mesófilo, promotores específicos de raiz (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei. 3:1639-1646), promotores específicos de tubérculos (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), promotores específicos de tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369), promotores específicos de estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865); e semelhantes.
[50] O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefasciens, sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes.
[51] Construções gênicas ou genes quiméricos podem ser introduzidos dentro do genoma de uma planta através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA, como descrito em Rech EL, Vianna GR, Aragão FJL (2007) High transformation efficiency by biolistics of soybean, bean and cotton transgenic plants, Nature Protocols,
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 14/35
12/25 (3): 410-418. Também podem ser introduzidos diretamente dentro do DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plantas. Outra forma de introdução das construções gênicas é através de transfecção pela bactéria Agrobacterium tumefaciens.
[52] Células de plantas transformadas que são derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação descritas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e, consequentemente, o fenótipo esperado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a sequência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al., Ann. Ver. Of Plant Phys. 38:467-486, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501).
[53] A invenção trata de um método para aumentar biomassa e/ou tolerância a estresse hídrico de uma planta expressando polinucleotídeo exógeno contendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°l. Numa concretização preferencial, a sequência de ácido nucléico apresenta pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol. Em uma concretização mais preferencial, a sequência de ácido nucléico apresenta pelo menos 99% de similaridade com SEQ ID Nol. Em uma concretização mais preferencial ainda, a sequência de ácidos nucléicos expressa na planta corresponde à sequência descrita em SEQ ID N°l.
[54] A invenção ainda se refere a uma molécula de ácido nucléico caracterizada por compreender uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID Nol. Numa concretização preferencial, a molécula
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 15/35
13/25 de ácido nucleico apresenta pelo menos 95% de similaridade com a sequencia descrita em SEQ ID Nol. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico apresenta pelo menos 99% de similaridade com a sequencia descrita em SEQ ID Nol. Em uma concretização mais preferencial ainda, a molécula de ácido nucleico apresenta uma sequência de ácidos nucléicos conforme sequencia descrita em SEQ ID Nol.
[55] Em outra concretização, a molécula de ácido nucléico pode compreender uma substituição, deleção e/ou inserção de nucleotídeo em uma ou mais posições.
[56] A invenção também prevê molécula de polipeptídio com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID No2. Em uma concretização preferencial, a molécula de polipeptídio apresenta pelo menos 95% de similaridade com SEQ ID No2. Mais preferencialmente, a molécula de polipeptídio apresenta pelo menos 99% de similaridade com SEQ ID No2. Em uma concretização mais preferencial ainda, a molécula de polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácidos conforme a sequência descrita em SEQ ID No2.
[57] A invenção ainda se refere a um gene quimérico compreendendo:
a) um polinucleotídeo com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com SEQ ID N° 1;
b) e um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).
[58] Tal gene quimérico pode estar compreendido em um vetor. Em uma concretização preferencial, esse vetor é capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta. Em outra concretização, tal vetor compreende um fragmento de ácido nucleico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°3. Em uma concretização preferencial, o vetor compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°3. Já em uma concretização mais preferencial, o vetor possui em sua composição uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°3. Em uma concretização mais preferencial ainda, o vetor possui em sua composição uma sequência de ácidos nucléicos conforme descrita em SEQ ID N°3.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 16/35
14/25 [59] A presente invenção se refere também a uma célula transformada compreendendo uma molécula de nucleotídeo com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com SEQ ID N° 1. Em uma concretização preferencial, tal célula é bacteriana. Mais preferencialmente, a célula bacteriana é uma célula de Eschereria coli ou de Agrobacterium tumefaciens. Em outra concretização, a célula transformada é de origem vegetal.
[60] Outro objeto da presente invenção é uma planta transformada compreendendo uma molécula de nucleotídeo com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com SEQ ID N° 1. A invenção ainda prevê uma planta transformada contendo vetor com gene quimérico que compreende:
a) um polinucleotídeo com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com SEQ ID N° 1;
b) e um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).
[61] Em uma concretização preferencial, a planta transformada é uma dicotiledônea. Em uma concretização mais preferencial, a planta transformada é uma planta de soja, tabaco, feijão, tomate, algodão, laranja, girassol, canola, alface, feijão-caupi, mamão, abacaxi, uva, eucalipto, mandioca, café, banana.
[62] Em outra concretização preferencial, a planta transformada é uma monocotiledônea. Mais preferencialmente, a planta transformada é uma planta de milho, arroz, cana-de-açúcar, sorgo, trigo, braquiária.
[63] A invenção também se refere a um método de produzir uma planta com maior tolerância ao estresse hídrico, compreendendo as seguintes etapas:
I. Transformar explantes foliares com polinucleotídeos em que a referida sequência de ácido nucléico compreenda sequência SEQ ID °1 para obtenção de uma primeira linhagem de planta transgene TO;
II. Regeneração dos explantes foliares transformados;
III. Transferir plantas da linhagem TO para solo e cultivar dadas plantas em casa de vegetação para obtenção de sementes de linhagem Tl.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 17/35
15/25 [64] Após a obtenção, tanto de plantas TO na etapa I, quanto de sementes TI na etapa III, é realizada a identificação de plantas que apresentem pelo menos um fragmento correspondente ao polinucleotídeo utilizado na etapa I. Preferencialmente, são identificadas plantas com que apresentem pelo menos um fragmento correspondente a uma região interna da sequência apresentada em SEQ ID N°3. A referida identificação de plantas TO obtida na etapa I bem como sementes TI na etapa III é realizada submetendo uma pluralidade de plantas ou sementes a pelo menos uma técnica de análise de DNA. Preferencialmente, a referida técnica de análise de DNA é escolhida dentre as seguintes: análise de PCR, análise quantitativa de PCR, Southern blot, Northern blot e sequenciamento de nucleotfdeos.
[65] Outro objeto da invenção é uma planta produzida por um método descrito nesta invenção que apresenta tolerância ao estresse hídrico aumentada. Preferencialmente, tal planta apresenta biomassa aumentada. Mais preferencialmente ainda, tal planta também produz pólen tolerante a dessecação.
[66] A invenção também se refere à semente da planta produzida por um método descrito na invenção. Em uma concretização preferencial, a semente da planta possui em seu genoma uma sequencia de ácido nucleico com pelo menos 90, 95 ou 99% de similaridade com SEQ ID N° 1.
[67] Adicionalmente, a invenção trata de partes da planta produzida pelo método descrito na invenção. Preferencialmente, a parte da planta seria um pólen, um óvulo, um meristema, uma folha, um caule, uma raiz ou uma célula. Outro objeto da invenção é uma planta progênie da planta produzida pelo método descrito na invenção.
Experimentos realizados e resultados obtidos:
Construção do vetor:
[68] Para construção do vetor pC-DRCl, o fragmento de SEQ ID N°1 foi sintetizado e inserido no plasmídeo PBI 426 nos sítios Neo I e Sac I (substituindo o gus: npt II) para ser dirigido pelo promotor 35SCaMV do Cauliflower mosaic virus (CaMV). Em seguida, o cassete de transformação foi removido e inserido no plasmídeo pCAMBIA
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 18/35
16/25
3300 nos sítios Eco RI e Hind III que possui o gene bar, que codifica para a proteína fosfinotricina acetiltransferase e confere resistência ao herbicida glufosinato de amônio, gerando o vetor pC-DRCl (Figura 1) que foi inserido na linhagem EHA105 de A. tumefaciens por eletroporação como descrito por Lacorte, C. & Romano, E. Transferência De Vetores Para Agrobacterium. In: Brasileiro, A. C. M, Carneiro, V. T. C. Manual de Transformação Genética de Plantas. Embrapa, Brasília. 51-64 (1998), que posteriormente foi usada para a transformação genética de plantas de tabaco, seguindo as orientações de Aragão F.J.L. & Rech E.L.R. Isolamento de vetores para transformação direta In Manual de transformação genética de plantas, pp. 17-34. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-Cenargen (1998).
Preparo da cultura de Agrobacterium tumefaciens:
[69] O protocolo de transformação utilizado de acordo com Aragão et al. Metodologias para transformação genética de plantas-modelo. Circular técnica 15. (2002).
[70] Uma cultura da linhagem de A. tumefaciens EHA105 contendo o vetor pC-
DRC1 foi preparada usando 100 pL que foram inoculados em 10 mL de meio LB contendo os antibióticos canamicina (100 mg/L) e rifampicina (50 mg/L). A cultura foi crescida por 16 h a 28°C sob agitação a 100 rpm até a fase exponencial de crescimento (A600nm = 1,5). A presença do vetor foi confirmada nas colônias de A. tumefaciens através de análise por PCR usando os primers: Nco-DRCl (5’TCCATGGAAGGCGAAACG-3’) e Sac-DRCl (5’CGAGCTCTAATTCCTTTCCCATTC-3’) gerando uma banda de 586pb (figura 2). As culturas foram então diluídas para uma A600nm = 0,1 para posteriormente serem utilizadas na cocultura.
Cultura in vitro das plântulas de tabaco e cocultura:
[71] As sementes de plantas de tabaco foram desinfestadas com hipoclorito 1% por 15 minutos e enxaguadas seis vezes em água autoclavada. Foram germinadas em meio sólido de Murashige & Skoog (MS) com 7% de ágar e 3% de sacarose (Murashige, T.;
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 19/35
17/25
Skoog, E.A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant. 15: 473-497, 1962) e cresceram em condições controladas em câmara de crescimento a 25 ± 2°C e fotoperíodo de 16 h.
[72] Para a cocultura foram cortados explantes a partir das folhas jovens. Cada explante possuía aproximadamente 1 cm2, o corte e a preparação dos explantes foi feita com o auxilio de um bisturi e uma tesoura estéril sobre um papel filtro em uma placa de Petri previamente autoclavados. A nervura central e as bordas das folhas foram removidas sob filtro umedecido, em seguida, o mesófilo foi cortado em quadrados de aproximadamente 1 cm2 que foram adicionados imediatamente à cultura de A. tumefacies que foi preparada da seguinte forma: 1 mL da cultura de Agrobacterium diluída em 9 mL de LB líquido. A cocultura líquida foi mantida à temperatura ambiente por 30 minutos sob leve agitação.
[73] Após este período os explantes foram secados com filtro de papel estéril e, em seguida foram transferidos para placas contendo meio MS sólido suplementado com 10 mg/L de benzilaminopurina (BAP) com a face adaxial dos explantes em contato com o meio. Os explantes foram mantido neste meio por 48 horas a 25 ± 2°C no escuro.
Regeneração de plantas transformadas:
[74] Após a cocultura sólida, os explantes foram transferidos para placas contendo meio de regeneração MS suplementado com 2 mg/L de BAP, 100 mg/L de timetin, 200mg/L de cefotaxima e 5 mg/L do glifosinato de amônio (GA) como agente seletivo e mantidos em câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 h à temperatura de 25 ± 2°C.
[75] Os explantes foram cultivados por duas semanas e a gemas formadas nas folhas foram transferidas para novo meio de regeneração contendo agente seletivo. Os brotos regenerados com aproximadamente dois centímetros foram transferidos para frascos contendo meio de enraizamento (meio MS suplementado com 0,1 mg/L de Ácido Naftaleno Acético, ANA, e 5 mg/L de glifosinato de amônio).
[76] Após três semanas as plântulas enraizadas (com 8-10 cm de comprimento) foram transferidas para copos com terra adubada e estéril e foram cobertas com sacos plásticos transparentes para permitir a aclimatização em casa de vegetação com temperatura de
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 20/35
18/25
27-30°C e umidade controlada (70-80%). Após quatro dias foram removidos os sacos plásticos.
[77] A partir da transformação de plantas de tabaco foram obtidas 20 plantas e 11 plantas foram positivas para o teste de detecção da proteína fosfinotricina acetiltransferase (PAT - Figura 3) que demonstra que houve a inserção do gene exógeno bar na planta transformada. Entre as plantas obtidas não houve a ocorrência de fenótipo anão.
Extração de DNA e PCR:
[78] As plantas de tabaco em casa de vegetação foram testadas para a presença de SEQ ID N°1 com os mesmos primers que foram utilizados para a verificar a presença do vetor em Agrobacterium tumefaciens (Figura 4 e 5).Foram feitas extrações de DNA através do método de CTAB (Aragão, F. J. L.; Brasileiro, A. C. M. Positive, negative and marker-free strategies for transgenic plant selection. Brazilian Journal of Plant Physiology, v. 14, n. 1, p. 01-10, jan. 2002), um disco foliar foi retirado e macerado em nitrogênio liquido, ao qual foi adicionado CTAB (CTAB 2%, NaCl 1,4 M, Tris-HCl 100 mM, EDTA 20 mM) com 1% de PVP e incubado por 30mim em “Banho Maria” , em seguida foi adicionado 1 V de clorofórmio com álcool isoamílico (24:1) centrifugado por 5min, então foi coletada a fase aquosa superior para um novo tubo, ao qual foi adicionado 2/3 de álcool isopropílico e foi centrifugado novamente por 5 min; o sobrenadante foi descartado e os pellets foram lavados com etanol 70%, ao final os pellets foram secos e ressuspendidos em 20 pL de H2O. Para as reações de PCR foi utilizado o kit Taq DNA Polymerase, o protocolo ocorreu de acordo com o indicado pelo fabricante. Os primers: Nco-DRC (5’-TCCATGGAAGGCGAAACG-3’) e SacDRC (5’-CGAGCTCTAATTCCTTTCCCATTC-3’) foram usados para amplificar uma banda de 586 pb. Para a amplificação foi realizado um passo de desnaturação inicial a 95°C por 5 min, seguidos de 35 ciclos de 95°C por 1 min, 55°C por 1 min e 72°C por 1 min, com extensão final de 72°C por 5 min.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 21/35
19/25
Teste de tolerância ao estresse hídrico:
[79] Para os testes de tolerância à seca foram selecionadas cinco linhagens de plantas transgênicas RI escolhidas aleatoriamente e plantas de tabaco não transgênicas (WT). O teste de tolerância a seca foi realizado de acordo com Gutha LR, Reddy AR. Rice DREB1B promoter shows distinct stress-specific responses, and the overexpression of cDNA in tobacco confers improved abiotic and biotic stress tolerance. Plant Mol Biol 68: 533-55 (2008) com alterações. Para os experimentos foram utilizadas as plantas com 70 dias.
[80] Previamente plantas RI das cinco linhagens escolhidas T6, Til, T16, T17 e T20 foram selecionadas por meio do teste de tolerância ao glufosinato de amônia preparado a partir da diluição em água (1:100) de glufosinato de amônio 200g/L. As plantas que sobreviveram ao teste foram contadas como positivas e as plantas que morreram foram contadas como negativas. O qui-quadrado foi utilizado como teste estatístico para validar a segregação Mendeliana da progênie.
Tabela 1. Análise das frequências de segregação selecionadas através do gene bar das linhagens transformadas:
| Positivas | Negativas | (χ2) | P | |
| P6 | 25 | 5 | 1,11 | 0,29 |
| Pll | 21 | 7 | 0 | 1,00 |
| P16 | 18 | 11 | 2,58 | 0,10 |
| P17 | 25 | 4 | 2,28 | 0,16 |
| P20 | 21 | 8 | 0,10 | 0,74 |
[81] Para o teste de seca foram utilizadas 16 plantas de cada linhagem de tabaco transformada e 16 plantas não transformadas. As plantas foram separadas em dois grupos, tendo o cuidado de selecionar plantas similares em tamanho antes de iniciar o estresse. O primeiro grupo foi teste de seca por 9 dias e o outro grupo serviu de controle sendo mantido a irrigação. As análises foram realizadas de três em três dias com exceção das análises biométricas que foram realizadas no último dia de análise. Não foram observados fenótipos anômalos nas plantas como: fenótipo anão, ou variações
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 22/35
20/25 morfológicas observáveis a olho nu nas folhas, caule ou inflorescência das linhagens analisadas.
[82] O crescimento de plantas transformadas e o desenvolvimento radicular foram similares aquelas não transformadas (Figura 6A e Figura 6B). A massa fresca e massa seca de parte aérea das plantas transgênicas também foram semelhantes às plantas WT em condições sem estresse. As plantas WT mostraram uma pequena diferença, entretanto não distinguida estatística das linhagens transformadas (Figura 6C e Figura 6D). De forma geral a linhagem WT teve a maior média de peso fresco e seco de raiz quando comparadas as linhagens transgênicas, entretanto não apresentaram diferenças estatísticas (Figura 6E e Figura 6F). Apesar da linhagem WT (controle não transformada) apresentar a maior relação raiz/parte aérea da massa fresca não ouve diferença estatística quando comparada as linhagens transformadas (Figura 6G). A relação raiz/parte aérea da massa seca também não apresentou diferença estatística (Figura 6H). Portanto, não houve má formação ou alteração do crescimento pela expressão constitutiva deste gene nas plantas de tabaco.
Análise da taxa fotossintética líquida, condutância estomática, transpiração e do potencial hídrico:
[83] A taxa fotossintética líquida (An, pmol m-2 s-1), condutância estomática (gs,mol m-2 s-1), transpiração (Ea mmol-2 s-1) foram determinados usando o analisador de gases no infravermelho (IRGA), acoplado a um sistema portátil de medição das trocas gasosas, modelo LC-Pro SD. Também foram coletadas folhas de algumas plantas com a periodicidade de três dias para avaliar o potencial hídrico das plantas. Para essa medição foi utilizando a bomba de pressão tipo Scholander, SAPSII modelo 3115.
[84] Todas as linhagens transformadas apresentaram uma taxa de fotossíntese maior que a linhagem WT. No terceiro e sexto dia de estresse foi possível observar que a linhagem T6 apresentou a taxa de fotossíntese superior as demais linhagens se diferindo estatisticamente das plantas não transformadas. Já no sexto dia todas as linhagens se diferiram do controle mostrando taxa fotossintética maior que a encontrada nas plantas WT com exceção da linhagem T16 apresentou a menor taxa de fotossíntese dentre as
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 23/35
21/25 linhagens transformadas. No nono dia todas as linhagens tinham suas taxas de fotossíntese próxima à zero (Figura 7).
[85] Todas as linhagens transformadas apresentaram menor taxa de transpiração no terceiro dia de estresse se diferindo estatisticamente das plantas controle. Entretanto, no sexto dia de estresse as linhagens plantas T6, Til e T17 apresentaram taxas de transpiração maiores que as demais linhagens e que as plantas WT (Figura 8). Todas as plantas avaliadas apresentaram transpiração próxima à zero no ultimo dia avaliado.
[86] A condutância estomática das linhagens transformadas e da WT permaneceu muito próxima ao longo de todo o período do teste com uma única diferença da linhagem T6 ao sexto dia que apresentou diferença estatística das demais linhagens transformadas e da WT (Figura 9). No nono dia de estresse todas as linhagens apresentaram condutância estomática próxima à zero.
Teor relativo de água:
[87] Durante o período do teste de seca foram coletadas amostras de discos foliares a cada três dias para análise do teor relativo de água, para esta avaliação quatro discos com raio de 1 cm foram retirados por folha e foram utilizadas duas folhas por planta. Esses discos foram pesados frescos e em seguida hidratados em uma placa de Petri por dois dias, pesados novamente e secos em estufa a 60°C até o peso estabilizar, o que ocorreu em três dias.
[88] O teor relativo de água apresentou diferenças estatísticas na linhagem T6. A linhagem transformada T6 apresentou maior média de teor relativo de água, as linhagens Til e T16 ficaram muito próximas à linhagem T6, as linhagens T17 e T20 ficaram abaixo das linhagens anteriormente citadas; a linhagem WT apresentou o menor teor relativo de água (Figura 10).
[89] A eficiência do uso da água instantâneo não apresentou grandes variações ao longo dos dias do teste, contudo quase todas as linhagens transformadas apresentaram uma maior eficiência no uso da água no terceiro e sexto dia quando comparadas com a linhagem WT. A linhagem T6 no terceiro dia destaca se da outras linhagens
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 24/35
22/25 transformadas, porém somente no sexto dia apresenta diferença estatística quando comparada com as demais linhagens (Figura 11).
[90] O potencial hídrico das linhagens transformadas mostrou-se muito próximo. A linhagem T16 teve uma queda do potencial menos drástica quando comparada as outras linhagens analisadas sendo a linhagem que conservou o maior potencial hídrico, as linhagens T6, Til e T17 apresentaram valores medianos, dentre as linhagens transformadas a linhagem T20 apresentou o menor potencial hídrico, a linhagem WT teve o menor potencial hídrico diferenciando se estatisticamente nos dias 6 e 9 das linhagens transformadas (Figura 12).
Análises Biométricas e recuperação [91] As análises biométricas foram realizadas em duas etapas, a primeira foi medir a altura das plantas a cada três dias, essa medida foi realizada a partir do solo até o meristema apical, a segunda etapa foi realizada ao final do período de doze dias quando as plantas foram retiradas cuidadosamente do solo e realizadas medidas de massa seca e fresca de raiz e parte aérea. As raízes e parte aérea de plantas controle e sob estresse foram pesadas em balança de precisão para quantificar o peso fresco e depois foram secas em estufa a 60°C por 72 horas para análise do peso seco.
[92] Posteriormente ao estresse um grupo de plantas foi separado para analises de recuperação após restabelecer a irrigação. A recuperação foi observada com registros fotográficos com intervalos de Ih.
[93] As plantas de tabaco que foram submetidas ao estresse obtiveram altura máxima inferior a 30 cm de altura, as plantas da linhagem P6 e da linhagem P17 foram as plantas que atingiram a maior altura apesar do estresse hídrico, as plantas da linhagem P16 atingiram uma altura média entre as linhagens e as plantas das linhagens Pll e P20 atingiram as menores médias de altura, apesar de ainda ter uma altura média acima de 20 cm, a linhagem WT obteve um crescimento médio muito abaixo de 20 cm (Figura 13).
[94] As plantas transgênicas submetidas ao estresse apresentaram comprimento radicular semelhante às plantas WT. As plantas da linhagem T20 apresentaram as
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 25/35
23/25 maiores médias de comprimento de raiz com aproximadamente 36 cm em seguida as plantas da linhagem T16 com 34 cm, a linhagem T6 apresentou média de 32 cm sendo a terceiras maior, as plantas Til e T17 apresentaram médias iguais de 29 cm, a WT apresentou média de 30 cm (Figura 14).
[95] A massa fresca da parte aérea das linhagens transgênicas foi superior a encontrada em plantas WT, entretanto apenas as linhagens T6 e T17 se diferiram estatisticamente (Figura 15) das plantas da WT.
[96] A massa fresca da parte aérea das linhagens transgênicas foi superior a encontrada em plantas WT, entretanto apenas as linhagens T6 e T17 se diferiram estatisticamente (Figura 15) das plantas da WT.
[97] Após o período de secagem em estufa do material o peso seco obtido ficou entre 2g e 3g (Figura 16), a linhagem WT apresentou a menor massa seca de todas as plantas avaliada. As linhagens transformadas T6, T16 e T17 foram estatisticamente diferente das plantas WT.
[98] A massa fresca das raízes das linhagens analisadas durante o teste de seca não apresentou grandes diferenças estatísticas (Figura 17). As plantas WT tiveram as maiores médias de peso fresco, as plantas da linhagem T16 apresentaram as maiores médias de peso das raízes seguidas pelas linhagens T6 e T17, as plantas da linhagem T20 tiveram a menor média de peso de massa fresca dentre todas as linhagens analisadas.
[99] Assim como na massa fresca as plantas WT apresentaram maiores médias de peso seco, a linhagem T6 foi a que apresentou maior peso seco das linhagens transformadas, contudo não houve variação estatística entre as médias (Figura 18).
[100] A relação raiz/parte aérea da matéria fresca da parte aérea das plantas WT foi superior estatisticamente à relação encontrada em todas as linhagens de plantas transgênicas avaliadas (Figura 19).
[101] A relação raiz/parte aérea da massa seca foi bem similar à relação entre a raiz/parte aérea da massa fresca. A linhagem WT apresentou também a maior relação entre todas as linhagens transformadas (Figura 20). Podemos avaliar que com estes
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 26/35
24/25 resultados que houve maior crescimento e investimento energético nas raízes em plantas WT e na parte aérea em plantas transgênicas.
[102] Com um tensiômetro de solo foi medida a quantidade de água no solo durante o teste de seca e não foi observada variação estatística na quantidade de água entre as linhagens transformadas e a linhagem WT.
[103] As plantas transformadas foram visivelmente mais tolerantes ao estresse hídrico (Figura 23) tanto ao observar a murcha das folhas como o crescimento durante o período de estresse. Após o período de estresse hídrico as plantas foram irrigadas e fotografadas com intervalos de uma hora (Figura 24), as linhagens transformadas apresentaram uma recuperação levemente mais rápida.
Delineamento experimental e análises estatísticas:
[104] Para as analises estatísticas o delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado (DIC) com cinco repetições de cada linhagem por dia de análise nos tratamentos realizados, condições de estresse e sem estresse. Foi realizada a análise de variância (ANOVA) para a avaliação de todas as características. A diferença entre os tratamentos foi determinada pelo teste de média Tukey ou teste t (P < 0,05). As análises foram realizadas no programa Prisma 5.0d para Mac OS X.
Teste de viabilidade do pólen:
[105] O teste de viabilidade dos grãos de pólens foi realizado com as linhagens transformadas T6, Til, T17 e T20. Para a avaliação utilizou-se o corante diacetato de fluoresceína (FDA) por medir viabilidade celular ao ser hidrolisado por diversas enzimas no interior das células vivas. Cinco miligramas de diacetato de fluoresceína foram diluídas em 1 mL acetona, e novamente diluídos 1:100 em solução de sacarose 100 mg/L.
[106] Os grãos de pólen foram corados 5 minutos antes de serem observados em microscópio de fluorescência com os Filtros de 330 a 385nm. Para a contagem dos grãos de pólen foi utilizada uma câmara de Neubauer.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 27/35
25/25 [107] As linhagens transformadas Til e T20 apresentaram maior viabilidade do pólen mesmo em condições de estresse. As linhagens transformadas T6 e T17 não apresentaram divergências significativas da linhagem WT ao passarem pelo estresse de calor (Figura 22). A linhagem WT teve uma viabilidade próxima a 20% após o teste de tolerância a calor, as linhagens Til e T20 que foram estatisticamente diferentes tiveram viabilidades após o teste próximas a 50%.
[108] Os experimentos descritos neste documento foram realizados com apoio financeiro do CNPq.
Claims (44)
1. Método para aumentar biomassa e/ou tolerância a estresse hídrico de uma planta caracterizado por expressar na referida planta polinucleotídeo exógeno contendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°l.
2. Método da reivindicação 1 caracterizado por expressar na referida planta polinucleotídeo exógeno contendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°l.
3. Método da reivindicação 2 caracterizado por expressar na referida planta polinucleotídeo exógeno contendo uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°l.
4. Método da reivindicação 3 caracterizado por expressar na referida planta polinucleotídeo exógeno contendo uma sequência de ácido nucléico conforme sequência descrita em SEQ ID N°l.
5. Molécula de ácido nucléico caracterizada por compreender uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita emSEQIDN°l.
6. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 5 caracterizada por apresentar pelo menos 95% de similaridade com a sequencia descrita em SEQ IDN°1.
7. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 6 caracterizada por apresentar pelo menos 99% de similaridade com a sequencia descrita em SEQ IDN°1.
8. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 7 caracterizada por apresentar uma sequência de ácidos nucléicos conforme sequencia descrita em SEQIDN°1.
9. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 8 caracterizada por compreender uma substituição, deleção e/ou inserção de nucleotídeo em uma ou mais posições.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 29/35
2/5
10. Polipeptídeo caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N°2.
11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por apresentar pelo menos 95% de similaridade com a sequencia descrita em SEQ ID N°2.
12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por apresentar pelo menos 99% de similaridade com a sequencia descrita em SEQ ID N°2.
13. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por apresentar uma sequência de aminoácidos conforme a sequência descrita em SEQ ID N°2.
14. Gene quimérico caracterizado por compreender:
a) um polinucleotídeo definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8; e
b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).
15. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico descrita nas reivindicações 5 a 8.
16. Vetor de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido vetor ser capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta.
17. Vetor de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 90% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N° 3.
18. Vetor de acordo com a reivindicação 17 caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 95% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N° 3.
19. Vetor de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucléico com pelo menos 99% de similaridade com a sequência descrita em SEQ ID N° 3.
20. Vetor de acordo com a reivindicação 19 caracterizada por compreender uma sequência de ácidos nucléicos conforme sequencia descrita em SEQ ID N°3.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 30/35
3/5
21. Célula transformada caracterizada por compreender molécula de ácido nucleico definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.
22. Célula de acordo com a reivindicação 21 caracterizada por ser uma célula bacteriana.
23. Célula de acordo com a reivindicação 22 caracterizada por ser uma célula de Eschereria coli ou de Agrobacterium tumefaciens.
24. Célula de acordo com a reivindicação 23 caracterizada por ser uma célula vegetal.
25. Planta transformada caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.
26. Planta transformada caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 20.
27. Planta de acordo com a reivindicação 25 caracterizada por ser uma dicotiledônea.
28. Planta de acordo com a reivindicação 27 caracterizada por ser uma planta de soja, tabaco, feijão, tomate, algodão, laranja, girassol, canola, alface, feijãocaupi, mamão, abacaxi, uva, eucalipto, mandioca, café, banana.
29. Planta de acordo com a reivindicação 25 caracterizada por ser uma monocotiledônea.
30. Planta de acordo com a reivindicação 29 caracterizada por ser uma planta de milho, arroz, cana-de-açúcar, sorgo, trigo, braquiária.
31. Método de produzir uma planta com maior tolerância ao estresse hídrico, caracterizado por compreender as etapas de:
I. Transformar explantes foliares com polinucleotídeos em que a referida sequência de ácido nucléico compreenda sequência SEQ ID N°1 para obtenção de uma primeira linhagem de planta transgene TO;
II. Regeneração dos explantes foliares transformados;
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 31/35
4/5
III. Transferir plantas da linhagem TO para solo e cultivar dadas plantas em casa de vegetação para obtenção de sementes de linhagem Tl.
32. Método de acordo com a reivindicação 31 caracterizado por a referida planta TO obtida na etapa (I) ser submetida a pelo menos uma técnica de análise de DNA permitindo a identificação de uma planta TO que apresente pelo menos um fragmento correspondente a pelo menos uma região interna do vetor do cassete de expressão definido em SEQ ID N°3;
33. Método de acordo com a reivindicação 32 caracterizado por a referida técnica de análise de DNA compreender uma ou mais técnicas selecionadas do grupo consistindo em análise de PCR por eletroforese, análise quantitativa de PCR, Southern blot, Northern blot e sequenciamento de nucleotfdeos.
34. Método de acordo com a reivindicação 31 caracterizado por a referida planta Tl que seja heterozigota para o referido transgene ser obtida na etapa (III) e identificada submetendo uma pluralidade de plantas Tl a pelo menos uma técnica de análise de DNA permitindo a identificação de uma planta Tl que apresente pelo menos um fragmento correspondente a pelo menos uma região interna do vetor do cassete de expressão definido em SEQ ID N°3;
35. Método de acordo com a reivindicação 34 caracterizado por a referida técnica de análise de DNA compreender uma ou mais técnicas selecionadas do grupo consistindo em análise de PCR por eletroforese, análise quantitativa de PCR, Southern blot, Northern blot e sequenciamento de nucleotfdeos.
36. Planta caracterizada por ser produzida por um método descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
37. Planta caracterizada por ser produzida por um método definido na reivindicação 31.
38. Planta compreendendo a molécula de ácido nucleico definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9 caracterizada por possuir tolerância ao estresse hídrico aumentada.
39. Planta da reivindicação 38 caracterizada por possuir biomassa aumentada.
Petição 870190064894, de 10/07/2019, pág. 32/35
5/5
40. Planta a reivindicação 39 caracterizada por produzir pólen tolerante à dessecação.
41. A semente de planta definida em qualquer uma das reivindicações 36 a 40 caracterizada por a referida semente compreender um genoma com uma sequencia de ácido nucleico incluindo a molécula de acido nucleico definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9.
42. Parte de planta caracterizada por ser da planta definida em qualquer uma das reivindicações 36 a 40.
43. Parte da planta de acordo com a reivindicação 42 caracterizada por ser um pólen, um óvulo, um meristema, uma folha, um caule, uma raiz ou uma célula.
44. Planta caracterizada por ser progênie da planta definida em qualquer uma das reivindicações 36 a 40.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR102016021788-1A BR102016021788B1 (pt) | 2016-09-22 | 2016-09-22 | Método de produção de planta com tolerância a estresse abiótico,planta com biomassa aumentada e/ou com pólen tolerante à dessecação, e moléculas para uso em transformação de plantas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR102016021788-1A BR102016021788B1 (pt) | 2016-09-22 | 2016-09-22 | Método de produção de planta com tolerância a estresse abiótico,planta com biomassa aumentada e/ou com pólen tolerante à dessecação, e moléculas para uso em transformação de plantas |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR102016021788A2 true BR102016021788A2 (pt) | 2019-11-19 |
| BR102016021788B1 BR102016021788B1 (pt) | 2023-12-26 |
Family
ID=68530994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR102016021788-1A BR102016021788B1 (pt) | 2016-09-22 | 2016-09-22 | Método de produção de planta com tolerância a estresse abiótico,planta com biomassa aumentada e/ou com pólen tolerante à dessecação, e moléculas para uso em transformação de plantas |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BR (1) | BR102016021788B1 (pt) |
-
2016
- 2016-09-22 BR BR102016021788-1A patent/BR102016021788B1/pt active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR102016021788B1 (pt) | 2023-12-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200095600A1 (en) | Corn genes zmspl1 and zmspl2 and uses thereof | |
| JP4808718B2 (ja) | 増大したクチクラの水透過性を有する植物を作製するための単離されたポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド | |
| US20190136247A1 (en) | Flowering time-regulating genes and related constructs and applications thereof | |
| CN109797157B (zh) | 一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用 | |
| ES2750530T3 (es) | Medios y procedimientos para producir rendimiento en plantas | |
| CN107974459B (zh) | 提高植物非生物胁迫耐性的构建体和方法 | |
| US20190127755A1 (en) | Construct and vector for intragenic plant transformation | |
| CN106591324B (zh) | 谷子SiASR4基因及应用 | |
| ES2423209T3 (es) | Plantas que tienen un aumento de características relacionadas con el rendimiento y un método para elaboración de las mismas | |
| US10851382B2 (en) | Synthetic promotor induced by abiotic stress, genetic construct containing same and plant cells transformed therewith | |
| CN109628475B (zh) | 油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在调控植物分枝中的用途 | |
| CN107267525B (zh) | 三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因PnPGIP的应用 | |
| BR112019022369A2 (pt) | Controle da densidade estomática em plantas | |
| US10563219B2 (en) | Corn genes ZmSPL1 and ZmSPL2 and uses thereof | |
| CN109293758B (zh) | 抗黄萎病相关蛋白GbVIP1及其编码基因与应用 | |
| BR102016021788A2 (pt) | método de produção de planta com tolerância a estresse abiótico, planta com biomassa aumentada e/ou com pólen tolerante à dessecação, e moléculas para uso em transformação de plantas. | |
| CN111926023A (zh) | 一种桃休眠相关PpTCP20基因及其应用 | |
| Khan et al. | Genetic engineering of sugarcane with the rice tonoplast H+-ppase (OVP2) gene to improve sucrose content and salt tolerance | |
| AU2018253628B2 (en) | Construct and vector for intragenic plant transformation | |
| KR101219013B1 (ko) | Ａｂｆ3 유전자로 형질전환된 가뭄 저항성 조롱박 및 이의 제조 방법 | |
| WO2004092372A1 (ja) | 塩ストレス耐性を付与する遺伝子 | |
| BR102014012664A2 (pt) | método para melhorar uma ou mais características relacionadas ao rendimento em plantas, construção, célula hospedeira,planta, parte de planta ou célula vegetal, transgênica e método para sua produção, produto e método para sua fabricação, dna cromossômico recombinante e composição | |
| CN117721144A (zh) | 苹果MdAP2-like基因在同时调控果实软化和果实大小中的应用 | |
| CN116987163A (zh) | 抗逆相关蛋白MsWRKY2G及其编码基因与应用 | |
| CN118345087A (zh) | 棉花GhSST5基因及在提高植物耐盐性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06V | Preliminary requirement: patent application procedure suspended [chapter 6.22 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 22/09/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |