JP4808718B2 - 増大したクチクラの水透過性を有する植物を作製するための単離されたポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は、特定のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関連し、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させるためのものである。より具体的には、本発明は、脱水した果実（例えば、トマトなど）を製造することができる遺伝子改変植物に関連する。

高等植物の地上部はクチクラの連続した細胞外層により覆われる。クチクラは、クチンモノマー（主に短鎖のヒドロキシル化脂肪酸）および様々な量のクチクラワックス（溶媒可溶性脂質）から大部分が構成されるポリマーマトリックスである。クチン成分およびワックス成分はともに、量および組成が種々の植物種および植物器官の間で異なる（Ｈｏｌｌｏｗａｙ、１９８２）。植物クチクラの成分および構造ならびにその生合成の生物学的調節および遺伝子的調節が広範囲に研究されている（Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ、１９８０；Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ他、１９８９；ＢｌｅｅおよびＳｃｈｕｂｅｒ、１９９３；Ａｒｔｓ他、１９９６；Ｎｅｇｒｕｋ他、１９９６；Ｍｉｌｌａｒ他、１９９７；Ｔｏｄｄ他、１９９９；Ｙａｐｈｒｅｍｏｖ他、１９９９；Ｆｌｅｂｉｇ他、２０００；Ｐｒｕｉｔｔ他、２０００；Ｗｅｌｌｅｓｅｎ他、２００１；Ｈｏｏｋｅｒ他、２００２；Ｃｈｅｎ他、２００３；ＫｕｎｓおよびＳａｍｕｅｌｓ、２００３；Ｋｕｒａｔａ他、２００３；Ａｈａｒｏｎｉ他、２００４；Ｓｃｈｎｕｒｒ他、２００４）が、クチクラの分化および／または機能を制御する機構は特徴づけされていないままである。

トマト果実のクチクラは、２つの特徴的な構造的性質を有する、４ミクロン〜１０ミクロンの厚さの薄い層である（ＷｉｌｓｏｎおよびＳｔｅｒｌｉｎｇ、１９７６）。第１に、クチン堆積物が層状構造で配置される。すなわち、層が表皮細胞に平行して組み立てられる。トマト果実のクチクラの第２の性質は、クチクラが、気孔、細孔または流路を何ら含有しないことである。結果として、トマトの皮の水透過性は非常に低く、完全に熟したトマトの果実はその水分含有量を保持する。気孔を有しない（気孔のない）数多くの他のクチクラの水透過性、および、クチクラを横断する水輸送の機構は、これまで無数の研究の対象であった（Ｓｃｈｏｅｎｈｅｒｒ、１９７６ａ；ＳｃｈｏｅｎｈｅｒｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ、１９７９；ＲｉｅｄｅｒｅｒおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、２００１）。明らかに、クチン成分およびワックス成分の両方が、器官からの水分喪失に対する統合された作用を有する。いくつかの場合において、クチクラ層の厚さが、クチクラ膜を横断する水の拡散に対して逆比例している（Ｌｏｗｎｄｓ他、１９９３）。しかしながら、しばしば、クチクラのワックス成分が、植物の水透過性に影響を及ぼすことにおいて主たる要因である。例えば、トマト果実のクチクラから有機溶媒によってクチクラ表面のワックス層を除くと、植物の急速な脱水によって明白になるように、クチクラの水透過性が３００倍から５００倍増大した（Ｓｃｈｏｅｎｈｅｒｒ、１９７６ｂ）。トマトの果実における蒸散バリアとしてのクチクラのワックスの役割についてのさらなる証拠が、酵素の超長鎖脂肪酸（ＶＬＦＡ）β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする近年報告された遺伝子である（ＬｅＣＥＲ６、Ｖｏｇｇ他、２００４）。この遺伝子は、果実のクチクラのワックスにおける主要成分であるＶＬＦＡの合成において重要な役割を果たしている。この遺伝子における機能喪失変異は、葉および果実の両方のワックスにおいて、鎖の長さがＣ_３０を超えるｎ−アルカンおよびアルデヒドの減少を生じさせた。そのようなＬｅＣＥＲ６変異を有するトマトの果実は、水透過性における４倍の増大を伴って特徴づけされた。トマト果実のクチクラの水透過性に影響を及ぼす別の要因は、クチクラ表面における亀裂形成の存在である。果実の亀裂形成が研究の関心を多く集めている（Ｃｏｔｎｅｒ他、１９６９；Ｖｏｉｓｅｙ他、１９７０；ｐｅｅｔ、１９９２；ｐｅｅｔおよびｗｉｌｌｉｔｓ、１９９５）。トマトの果実は３つの大きなタイプの亀裂形成によって影響を受ける：ｉ）同心状の亀裂形成（粗い亀裂形成）；ｉｉ）放射状の亀裂形成（分裂）；およびｉｉｉ）クチクラの亀裂形成（褐斑）（Ｂａｋｋｅｒ、１９８８）。最初の２つのタイプの亀裂形成は、果実の果皮を突き抜ける深い広範囲にわたる裂溝であり、水分喪失に加えて、病原体の侵入および果実の腐朽をも許す。

放射状または同心状の亀裂形成とは異なり、クチクラの亀裂は、クチクラに一般に限定され、かつ、果皮細胞に侵入しないクチクラの表面的な微細な裂溝である。トマトにおいてクチクラの亀裂形成を生じさせる原因および環境はほとんどが不明であり、クチクラ層の厚さ（ＥｍｍｏｎｓおよびＳｃｏｔｔ、１９９８）、下層の表皮細胞の形状（Ｃｏｎｔｅｒ他、１９６９；ＥｍｍｏｎｓおよびＳｃｏｔｔ、１９９８）、果実の形状（ＣｏｎｓｉｄｉｎｅおよびＢｒｏｗｎ、１９８１）、果実のサイズ（Ｋｏｓｋｅ他、１９８０；ＥｍｍｏｎｓおよびＳｃｏｔｔ、１９９７）、果実の周りの相対的湿度（Ｙｏｕｎｇ、１９４７；Ｔｕｋｅｙ、１９５９）、葉の強い刈り込み（Ｅｈｒｅｔ他、１９９３）、ならびに、表皮の引張り強度および伸長性（Ｂａｋｋｅｒ、１９８８）に関係づけられる場合がある。

トマトの果実における亀裂の発生はまた、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）の野生種からの遺伝子移動のときに主に発現する大きな遺伝的成分を有する。Ｆｕｌｔｏｎ他（２０００）は形質「表皮網状化」（Ｅｒ）を記載し、また、（野生型Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍとの）改良された戻し交配ＱＴＬ分析法を使用して、そのような形質に影響を及ぼす４つのＱＴＬを報告した。クチクラの亀裂はまた、トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）と他の野生種（例えば、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ＷＯ０１１３７０８）およびＬ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ（Ｍｏｎｆｏｒｔｅ他、２００１）など）との交配に由来するトマト属の果実でも報告されている。

裂溝に沿ったコルク質化した被膜の発達（Ｍｏｎｆｏｒｔｅ他、２００１）による果実のクチクラにおける亀裂（特に、表皮の網状化として視覚的に明白になる極端な亀裂）は、果実の水分含有量の喪失のためだけでなく、果実の価値を低下させる審美的損傷のために、負の現象であると一般に見なされている（Ｔｕｋｅｙ、１９５９）。しかしながら、丸ごとのまま、また、依然としてつるに付いたまま脱水する果実の経済的可能性は高い。脱水トマト製造物がトマト産業の重要な部分をなしている。トマトペースト、トマトケチャップおよび他の加工トマト製造物の製造は、脱水という、エネルギーを必要とする工程に依存している。加えて、「日干し」トマトの果実は、切ったトマトの果実を日光または乾燥オーブンのいずれかで脱水することからなる乾燥プロセスで調製される。日干しおよびオーブン乾燥はともに食品品質の低下を生じさせ得る。例えば、アスコルビン酸（ヒトの食事におけるトマトの主要な栄養学的寄与物の１つ）のレベルが、日干しまたはオーブン乾燥に応じて著しく低下する（Ｏｊｉｍｅｌｕｋｗｅ、１９９４）。さらに、トマトの果実を乾燥プロセスの前に半分にする必要があることにより、丸ごとの乾燥したトマト果実の製造ができない。

本発明者らは、古典的な遺伝学的育種技術を使用して水分含有量が低下している脱水トマトを以前に記載している（国際特許出願公開ＷＯ０１／１３７０８）。古典的な遺伝学的育種技術は、種内の遺伝子移動、または、同じ属の近縁種の間での遺伝子移動に限定されることが理解される。また、古典的育種は、目的とする遺伝子に密接に連鎖する他の望ましくない遺伝子を含む比較的大きな遺伝子移入によって特徴づけられる。

遺伝子移入された栽培トマト植物がＥｓｈｅｄおよびＺａｍｉｒ（１９８５）によって以前に記載されており、これは、望ましくない形質に関連し得る遺伝的背景（遺伝子移入系統ＩＬ４−４、すなわち、テロメアマーカーＴＧ４６４からセントロメアマーカーＣＴ５０にまで広がる遺伝子移入（約２０ｃＭ）から得られる）を有する。同様に、Ｍｏｎｆｏｒｔｅ他（２００１）は、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍに由来する類似した遺伝的背景［ほぼ近い遺伝子移入系統のＴＡ１４６８、ＴＡ１４６９、ＴＡ１４７６、これらはＴＧ４６４からＣＴ１７３（両者を含む）にまで及ぶ（約１０ｃＭ）］を有し、かつ、望ましくない作用を含めて数多くの作用を呈するトマト植物を記載している。

従って、上記の制限を有しない、増大したクチクラの水透過性を有する遺伝子改変植物が求められていることが広く認識されており、また、そのような遺伝子改変植物を有することは非常に好都合である。

本発明の１つの態様によれば、配列番号２２に対して少なくとも８８％相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、この場合、このポリペプチドは、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、核酸配列は配列番号２１または配列番号２３に示される通りである。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号２２に示される通りである。

本発明の別の態様によれば、単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、核酸構築物はさらに、核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。

本発明の別の態様によれば、核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。

本発明の別の態様によれば、単離されたポリヌクレオチド含む遺伝子改変植物が提供される。

本発明の別の態様によれば、単離されたポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドが提供される。

本発明の別の態様によれば、配列番号２２に対して少なくとも８８％相同的であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供され、この場合、このポリペプチドは、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる。

本発明のさらに別の態様によれば、単離されたポリペプチドを特異的に認識することができる抗体が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、野生のＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．に由来する遺伝子移入を含むゲノムを有する栽培トマト植物が提供され、この場合、遺伝子移入は、テロメアマーカーＴＧ４６４からセントロメアマーカーＣＴ１７３にまで広がる染色体部分よりも小さい、このＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．の第４染色体の一部を含み、かつ、栽培トマト植物のクチクラの水透過性を増大させることができる。

本発明のさらに別の態様によれば、作物植物の脱水した果実を製造する方法が提供され、この場合、この方法は、配列番号２２に対して少なくとも３０％相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド（このポリペプチドは、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる）を発現するように植物を遺伝子改変することを含む。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、この方法は、果実を植物につけたまま脱水させること、および、続いて、脱水した果実を集めることをさらに含む。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、この方法はさらに、作物植物からの果実をその脱水の前に取り除くこと、および、続いて、果実を脱水させることを含む。

本発明のさらなる態様によれば、配列番号２２に対して少なくとも３０％相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む遺伝子改変された種子が提供され、この場合、このポリペプチドは、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる。

本発明のさらにさらなる態様によれば、配列番号２２に対して少なくとも３０％相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む遺伝子改変された果実が提供され、この場合、このポリペプチドは、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、核酸配列は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４または配列番号５６に示される通りである。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５または配列番号５７に示される通りである。

本発明のなおさらにさらなる態様によれば、配列番号２２に対して少なくとも３０％相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する遺伝子改変された植物が提供され、この場合、このポリペプチドは、この植物のクチクラの水透過性を増大させることができる。

本発明は、植物中で発現されてその植物のクチクラの水透過性を増大させるためのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供することによって、また、脱水した果実を製造するための遺伝子改変植物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。

別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。

図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１ａ〜ｂは、集団２１４８（図１ａ）および集団２１４９（図１ｂ）における脱水速度に対するｃｗｐ（ＰＵＴ）遺伝子型の影響を示すグラフである。集団２１４８では、脱水形質は完全に優性な形質として挙動し、一方、２１４９では、脱水形質は部分的に優勢な形質として挙動する。果実を、赤く熟したときに摘み取り、周囲温度で脱水させ、ほぼ毎日の間隔で重量測定した。データがＬｏｇ％重量として表される。上付きのＨＨ、ＨＥおよびＥＥは分離植物の遺伝子型を示す。
図２ａ〜ｃは、ＣＷＰ遺伝子の詳細なマッピングを示す（図２ａ〜図２ｃ）。図２ａ−ＴＧ４６４分子マーカーのＣＡＰＳマーカー分析。ゲノムＤＮＡを、脱水速度について分離する２０個のＦ_２個体から抽出した。ＰＣＲ分析を、２つの親種の間で多型を示すＴＧ４６４マーカーについての適切なプライマーを使用して行った。ＰＣＲ生成物をＨｉｎＦ１エンドヌクレアーゼ制限部位酵素により切断し、２％アガロースゲルで電気泳動した。＋または−の記号は微細裂溝および脱水条件の存在または非存在を示す。Ｅ−Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ。Ｈ−Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ。Ｍ−ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏｒＩのラムダマーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、カタログＮｏ．ＳＭ０１９１）。図２ｂ−セントロメアの位置に対して向けられたＣＷＰの染色体領域の遺伝子連鎖マップ（ｃＭ単位）。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ遺伝子移入系統のＩＬ４．３およびＩＬ４．４（ＥｓｈｅｄおよびＺａｍｉｒ、１９９５）が示される。斜線付き棒は、この分析において脱水性のドナー親として使用された準同質遺伝子系統におけるＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍセグメントを表す。図２ｃ−Ｃｗｐ遺伝子に隣接する染色体セグメントの拡大。
図３ａ〜ｂは、ＣＷＰ遺伝子の物理的配置を示す（図３ａ〜図３ｂ）。図３ａ−ＣＴ６１およびＴＧ４６４のＣＡＰＳマーカーの間での橋渡しをもたらす遺伝子配列させた連続するＢＡＣ、ならびに、組換え体の表現型分析および配列決定されたＢＡＣ末端の多型による組換え体の特徴づけ。それぞれの組換え体の遺伝子型が、斜線部セグメント（Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ遺伝子型）および空白部セグメント（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ表現型）に分割された棒によって表される。図３ｂ−ＢＡＣ３７Ｂ８における３つの交差事象の拡大。これら３つの交差事象は、図３ａに示される最初の３つの組換え体の交差事象である。
図４は、Ｃｗｐ遺伝子を含むＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ由来の１５ｋｂの遺伝子移入を例示する。この配列を、ＮＣＢＩプログラムのＴＢＬＡＳＴを使用して相同的なオープンリーディングフレームについて分析した。３つの相同的な配列が特定され、それらのオープンリーディングフレームのそれぞれの方向が矢印によって示される。
図５ａ〜ｂは、トマトの発達中の子房および小果実におけるＰＵＴ遺伝子（図５ａ）およびＤＢＰ遺伝子（図５ｂ）の発現分析を示すグラフである。発現を、オンライン定量的ＰＣＲを使用して方法の節に記載されるように、抽出されたｃＤＮＡについて測定した。発現が各サンプルにおけるアクチン遺伝子の発現に対して表される。Ｏｖ、子房；開花後５日および１５日；ＩＧ、未成熟な緑色物；ＭＧ、成熟した緑色物；Ｂ、破砕段階。斜線付き棒はＣｗｐ^ＨＨ遺伝子型であり、黒塗り棒はＣｗｐ^ＥＥ遺伝子型である。
図６は、トマト遺伝子型の１５日目の小果実におけるＰＵＴ遺伝子の発現分析を示すグラフである。ＨＨ、Ｃｗｐ^ＨＨ遺伝子型；ＨＥ、ヘテロ接合のＣｗｐ^ＨＥ遺伝子型；ＥＥ、Ｃｗｐ^ＥＥ遺伝子型。これら３つの遺伝子型を、分離しているヘテロ接合集団から選択した。ＩＬ４．４は、ＰＵＴのＬ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉホモログを含有するＬ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ遺伝子移入系統ＩＬ４．４（ＥｓｈｅｄおよびＺａｍｉｒ、１９８５）を表す。Ｍ８２は、ＩＬ４．４の再び現れたＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ親である。
図７ａ〜ｂは、野生トマト種のＳｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ Ｓ．（以前は、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｍｉｌｌ．）に由来するＰＵＴ遺伝子を３５Ｓ構成的プロモーター下で発現するトランスジェニックトマト植物（Ｔ_０）を示す（図７ａ〜図７ｂ）。図７ａは、野生型ＭＰ１トマト系統（Ｗ．Ｔ．）果実の無傷の表面、および、微細裂溝を有するトランスジェニック体の果実（Ｍｐ１−４）を表す双眼写真を示す。図７ｂは、野生型ＭＰ１トマト系統（Ｗ．Ｔ．）と、別の独立したトランスジェニックＴ_０植物（ＭＰ１−１）との間での乾燥速度の比較を示す。果実を、成熟した赤い発達段階で摘み取り、室温（１５℃〜２５℃）で置いた。写真は、実験開始（Ｔ_０）から、乾燥の７日後（Ｔ_７）である。
図８ａ〜ｂは、果実の微細裂溝の重篤性（１〜５のスケール、図８ａ）および重量減少割合（室温で１４日後、図８ｂ）に対するＰＵＴ導入遺伝子コピー数の影響を示す。測定値を２つの独立したトランスジェニック（Ｔ_１）分離集団から集めた（各集団から１６個の個体）。それぞれのグラフは、平均（それぞれのひし形の中央における水平線）、９５％の信頼限界（ひし形の垂直端）、および、それぞれのコピー数群からの個体の散乱程度を示す。１つの群の三角形の底辺がそれ以外の群の三角形の底辺に一致しないとき、群間の差は有意である。統計学はＪＭＰプログラムによって行われた。
図９ａ〜ｂは、コピー体を発現しないトランスジェニックトマト個体（Ｔ_１世代）（これは野生型に類似する）と、野生トマト種のＳｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ Ｓ．に由来するＰＵＴ遺伝子の２コピーを発現するトランスジェニックトマト個体（Ｔ_１世代）との比較を示す（図９ａ〜図９ｂ）。図９ａ−ＰＵＴ遺伝子のコピー体を有しない個体（０コピー）に由来する果実の無傷の表面、および、２コピーの導入遺伝子を有する個体の非微細裂溝の果実を表す走査電子顕微鏡写真。図９ｂ−ＰＵＴ遺伝子のコピー体を有しない個体（０コピー）と、２コピーの導入遺伝子を有する個体（２コピー）との間での乾燥速度の比較。果実を、成熟した赤い発達段階で摘み取り、室温（１５℃〜２５℃）で置いた。写真は、実験開始（Ｔ_０）から、乾燥の７日後（Ｔ_７）である。
図１０ａ〜ｂは、ＣＷＰ１およびＣＷＰ２、ならびに、単子葉植物種および双子葉植物種に由来する関連した配列（配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４および配列番号５６）の保存を示す系統樹である（図１０ａ〜図１０ｂ）。これらの配列を、ＣＷＰ１に対する配列相同性に基づいて、ＥＳＴ ＴＩＧＲデータベースから検索した。ＣＷＰ１に対するパーセント相同性が上部に示される。図１０ａ−アミノ酸レベルでの保存。図１０ｂ−核酸レベルでの保存。
図１１は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷソフトウエアによって作製された本発明のＣＷＰ１ファミリーの種々のタンパク質メンバーの間での多重アラインメントを示す。

本発明は、植物のクチクラの水透過性を増大させるために使用することができる単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、脱水した果実果実（例えば、トマトの果実など）を製造するために使用することができる。

本発明の原理および作用は、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。

果実の劣化を生じさせる分解プロセスを伴うことなく、依然としてつるについたまま、自然に脱水することが可能なトマト品種の開発は、多くの果実産業（例えば、トマト産業など）にとって非常に有益である。

ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ０１／１３７０８（Ｓｃｈａｆｆｅｒ）は、クチクラの水分含有量が低下している脱水トマトを、古典的な遺伝学的育種技術を使用して作製することを教示する（ＷＯ０１／１３７０８）。古典的な遺伝学的育種技術は種内の遺伝子移動または同じ属の近縁種の間での遺伝子移動に制限されることが理解される。また、古典的育種は、目的とする遺伝子に密接に連鎖する他の望ましくない遺伝子を含む比較的大きい遺伝子移入によって特徴づけられる。

遺伝子移入された栽培トマト植物がＥｓｈｅｄおよびＺａｍｉｒ（１９８５）によって以前に記載されており、これは、望ましくない形質を伴い得る遺伝的背景（遺伝子移入系統ＩＬ４−４、すなわち、テロメアマーカーＴＧ４６４からセントロメアマーカーＣＴ５０にまで広がる遺伝子移入（約２０ｃＭ）から得られる）を有する。同様に、Ｍｏｎｆｏｒｔｅ他（２００１）は、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍに由来する類似した遺伝的背景を有するトマト植物（ＴＧ４６４からＣＴ１７３にまで及ぶ（１０ｃＭを超える）ほぼ近い遺伝子移入系統（ＮＩＬ））を記載している。その後の研究では、そのような比較的大きい遺伝子移入には、ブリックス収量、総収量および果実重量の形質を含めて、望ましくない園芸学的形質が付随する。

本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、植物中で発現されてその植物のクチクラの水透過性を増大させることができる単独遺伝子ｃｗｐ１（これはまたｐｕｔと呼ばれ、これらは本明細書中では交換可能に使用される）を発見した。

本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍに由来する果実脱水形質の遺伝パターンを単一の主要な遺伝子として特定した。マップに基づくポジショナルクローニング戦略を使用して、本発明者らは、成熟した赤いトマト果実のクチクラの水透過性（ＣＷＰ）を増大させ、かつ、無傷果実の脱水を生じさせる遺伝子を野生トマト種Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍからクローン化した。

本発明者らは、ｃｗｐについての野生種の対立遺伝子が発達中のトマトの果実におけるこの遺伝子の発現を可能にし、その一方で、標準的な栽培されているＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの対立遺伝子は発現されず、ヌル対立遺伝子であると見なされ得ることを示した。本発明者らはさらに、対立遺伝子の量的効果が発現レベルで存在し、かつ、ヘテロ接合のＨＥ遺伝子型が、野生種由来の２つの対立遺伝子を有するホモ接合遺伝子型のおよそ半分の発現によって特徴づけられることを示した。

バイオインフォマティクス分析では、ｃｗｐ１が、生物学的機能が不明であるタンパク質をコードすることが示された。この遺伝子は、クチクラを介した水分喪失を制御するので、新しいトマト産物のための育種プログラム、そして同様に、他の作物のための育種プログラムに寄与し得る。さらに、この遺伝子に関連する微細裂溝の構造的表現型は果実のクチクラ発達におけるｃｗｐについての役割を示している。栽培トマトにおける３５Ｓプロモーター下でのｃｗｐ１遺伝子の発現は拡大中の果実における微細裂溝の形成を誘導した。このことは、クチクラの水透過性の調節におけるこの遺伝子の示唆された役割を裏付けている。サザンブロット分析では、さらなるトマトホモログｃｗｐ２が発見された。興味深いことに、このホモログは、トマト果実の上皮網状化についての報告されたＱＴＬ（Ｆｒａｒｙ他、２００４）が存在するトマトの染色体２−１に位置づけられる。ナス科の栽培トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ）の発達中の果実もまた、Ｌｅｃｗｐ１遺伝子に対する大きな類似性（８７％）を有するｃｗｐホモログをその上皮組織において発現し、また、トウガラシの果実は、収穫後の水分喪失の園芸学的問題、ならびに、パプリカ栽培品種における果実の脱水という望ましい形質によって特徴づけられる。従って、ＣＷＰ遺伝子のホモログもまた、クチクラの改変および水透過性に寄与し得ることが考えられる。

これらの結果は、ｃｗｐ遺伝子の発現が、果実の拡大期間中における裂溝形成を弾性の低下のために受ける（重量およびＴＥＭに基づいて）構造的に変化したクチクラをもたらすことを示している。しかしながら、この現象は、非常に発達した果実クチクラを有する果実（例えば、無気孔性の厚い皮の栽培トマトなど）においてだけ観測され、その特徴的なより薄いクチクラを有する野生種の果実では明らかではない。栽培トマト果実の発達期間中におけるクチクラ成分の堆積は、未成熟な緑色段階から成熟した緑色段階への移行期間中に急激な変化を受け（Ｂａｋｅｒ、１９８２）、従って、これが微細裂溝表現型の観測と一致することは妥当である。

理論にとらわれることはないが、比較的不浸透性の果実クチクラの遺伝的形質は栽培トマトの進化過程および栽培化過程における正の発達であって、これにより、熟している収穫された果実の安定性が可能になったことが示唆される。脱水形質の遺伝的制御は、作物の進化および栽培化のある段階でのヌルＣｗｐのための選抜手法を示す。

系統発生学的分析（図１０ａ〜図１０ｂ）は、本発明のＣＷＰ遺伝子が、クチクラの水透過性を広範囲の作物植物において制御するために使用され得る遺伝子のより大きなファミリーに属することを示している。

従って、本発明の１つの態様によれば、配列番号２２に対する相同性が少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、この場合、このポリペプチドは、これを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる。

本明細書中で使用される表現「クチクラの水透過性」は、クチクラによって囲まれた植物組織（植物の地上部組織）（例えば、果実など）からの水の蒸発を阻害するクチクラの能力を示す。増大したクチクラの水透過性は、クチクラによって囲まれた組織の脱水を、高まった蒸発の結果としてもたらすことが理解される。

本明細書中で使用される表現「クチクラの水透過性を増大させる」は、類似する親栽培種の植物、または、これを発現しない遺伝子型の植物と比較して、クチクラの水透過性における少なくとも約５％の増大、少なくとも約１０％の増大、少なくとも約１５％の増大、少なくとも約２０％の増大、少なくとも約３０％の増大、少なくとも約４０％の増大、少なくとも約５０％の増大を示す。

クチクラの水透過性を明らかにする様々な方法がこの分野では広く知られており、下記の実施例の節において詳しく記載される（例えば、果実の裂溝の重篤性および重量減少割合）。下記の実施例の節の実施例５を参照のこと。加えて、クチクラの水透過性を測定するための方法には、単離された果皮を横断する水拡散の測定、極性細孔サイズおよび流体力学的透過性の測定（Ｓｃｈｏｎｈｅｒｒ、１９７６）が含まれるが、これらに限定されない。これらの機能的アッセイは、本明細書中に提供される構造的指針と一緒になって、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての機能的ホモログの特定を可能にする。

相同性（例えば、パーセント相同性）を、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアをはじめとする任意の相同性比較ソフトウエアを使用して、例えば、初期設定済みのパラメーターを使用することなどによって決定することができる。

同一性（例えば、パーセント同一性）を、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウエアをはじめとする任意の相同性比較ソフトウエアを使用して、例えば、初期設定済みのパラメーターを使用することなどによって決定することができる。

本明細書中で使用される表現「単離されたポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で単離および提供される一本鎖核酸配列または二本鎖核酸配列を示す。

本明細書中で使用される表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を示す。そのような配列は続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。

本明細書中で使用される表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（染色体から単離される）配列を示し、従って、染色体の隣接部分を表す。

本明細書中で使用される表現「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも一部が相補的であり、かつ、少なくとも一部がゲノム由来である配列を示す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために要求されるいくつかのエキソン配列、ならびに、エキソン間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、他の遺伝子のイントロン配列を含めて、任意の供給源のものであることが可能であり、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列はさらに、シス作用の発現調節エレメントを含むことができる。

本発明のこの態様の１つの好ましい実施形態によれば、本発明の上記の単離されたポリヌクレオチドの核酸配列は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４または配列番号５６に示される通りである。

本発明のこの態様の別の好ましい実施形態によれば、本発明のコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５または配列番号５７に示される通りである。

本発明のこの態様の単離されたポリヌクレオチドは、上記で記載される単離されたポリヌクレオチドを適度〜ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの存在下でインキュベーションすることによるハイブリダイゼーションアッセイを使用して定量することができる。

本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣体の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを示す。この用語は、天然に存在する塩基、糖および共有結合性ヌクレオチド間連結（例えば、骨格）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、天然に存在するそれぞれの部分と同様に機能する、天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。

本発明の教示に従って設計されるオリゴヌクレオチドは、この分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成法（例えば、酵素的合成または固相合成など）に従って作製することができる。固相合成を実行するための設備および試薬が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる：オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．他編（１９９４、１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８８）、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＧａｉｔ、Ｍ．Ｊ．編（１９８４）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”に詳しく記載されるような確立された方法論によって成し遂げることができ、例えば、固相化学（例えば、シアノエチルホスホルアミダイト）、それに続く脱保護、脱塩および精製（例えば、自動化されたトリチル−オン法またはＨＰＬＣによる精製）を利用して成し遂げることができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼーション可能な少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、少なくとも１９塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２２塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基または少なくとも４０塩基のものである。

適度〜ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄液および６５℃での最終洗浄を伴う、６５℃でのハイブリダイゼーション溶液、例えば、１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５ｘ１０^６ｃｐｍの^３２Ｐ標識プローブを含有する溶液などによって特徴づけられ、これに対して、適度なハイブリダイゼーションが、１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５ｘ１０^６ｃｐｍの^３２Ｐ標識プローブを含有するハイブリダイゼーション溶液を６５℃で使用し、１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄液および５０℃での最終洗浄を用いて行われる。

ハイブリダイゼーション方法論を使用して、本発明者らは、トマト果実の上皮網状化についての報告されたＱＴＬ（Ｆｒａｒｙ他、２００４）に位置づけられるｃｗｐ２（ｃｗｐ１の別のトマトホモログ）を単離することができた。

従って、本発明は、本明細書中上記に記載される核酸配列、そのフラグメント、それとハイブリダイゼーション可能な配列、それに対して相同的な配列、類似したポリペプチドを異なったコドン使用によりコードする配列、変異（例えば、天然に存在するか、または、人為的に導入されているかのいずれかであっても、また、ランダムまたは標的化された様式のいずれかであっても、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入または置換など）によって特徴づけられる変化した配列を包含する。

本発明のポリヌクレオチド配列は、以前には特定されていないポリペプチドをコードするので、本発明はまた、本明細書中上記に記載される単離されたポリヌクレオチドおよびそのそれぞれの核酸フラグメントによってコードされる新規なポリペプチドまたはその一部分を包含する。

従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを包含する。これらの新規なポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５または配列番号５７に示される。

本発明はまた、これらのポリペプチドのホモログを包含し、そのようなホモログは、配列番号２２に対する相同性が少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれ以上（例えば、１００％）であり得る。

本発明はまた、上記ポリペプチドのフラグメント、および、変異（例えば、天然に存在するか、または、人為的に導入されているかのいずれかであっても、また、ランダムまたは標的化された様式のいずれかであっても、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入または置換など）を有するポリペプチドを包含する。

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製するために使用することができる。例えば、そのような抗体は配列番号２２のアミノ酸座標５５〜１６０に向けることができる。配列座標５５〜１６０は多重比較分析の保存された配列およびモチーフの大部分を含む（図１１）。このアミノ酸配列領域における大きな配列相同性のために、そのような抗体は、本発明の様々なポリペプチド（例えば、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５および配列番号５７）に対して交差反応性であることが予想される。

本発明のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、増大したクチクラの水透過性を有する植物を作製するために使用することができる。

例えば、遺伝子改変された植物を、本発明の単離されたポリヌクレオチドを植物において発現させることによって作製することができる。

本明細書中で使用される用語「植物」は、増大したクチクラの水透過性が商業的に所望される、単子葉または双子葉の作物植物などの作物植物（植物全体またはその一部分、例えば、果実、種子）、ならびに、他の植物（針葉樹植物、コケまたは藻類）を示す。好ましくは、本発明の植物は、脱水が商業的に有益である果実をもたらす。そのような植物の例には、トマト、ブドウ、トウガラシ、リンゴ、モモ、アンズ、ナツメヤシ、イチジク、ナス、タマネギ、イチゴ、ウリ科植物、干し草用植物、飼料植物、香辛料植物およびハーブ植物などが含まれるが、これらに限定されない。

外因性ポリヌクレオチドを植物細胞において発現させるために、本発明のポリヌクレオチド配列は、好ましくは、植物細胞での発現のために好適な核酸構築物の中に連結される。そのような核酸構築物はシス作用の調節領域を含み、例えば、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的様式または誘導可能な様式で行わせるためのプロモーター配列などを含む。プロモーターは、形質転換された植物／細胞に対して同族または異種であってもよい。

本発明のこの態様に従って使用することができる好適なプロモーター配列は果実特異的または種子特異的なプロモーターである。

例えば、ｃｗｐ１遺伝子の新規なプロモーター配列（またはその機能的フラグメント）を、好ましくは、本発明の核酸構築物において使用することができる（配列番号５８）。

果実特異的なプロモーターの他の例が米国特許第４，９４３，６７４号に記載される。

本発明のこの態様に従って使用することができる他のプロモーターには、植物の指定された、空気にさらされる器官（例えば、葉、塊茎、種子、茎、花など）または指定された細胞タイプ（例えば、柔細胞、表皮細胞、毛状突起細胞または維管束細胞など）においてだけ発現を確実にするプロモーターがある。

種子における発現を高める好ましいプロモーターには、ｐｈａｓプロモーター（Ｇｅｅｓｔ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２：５７９〜５８８（１９９６））；ＧｌｕＢ−１プロモーター（Ｔａｋａｉｗａ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０：１２０７〜１２２１（１９９６））；ガンマ−ゼインプロモーター（Ｔｏｒｒｅｎｔ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４：１３９〜１４９（１９９７））およびオレオシンプロモーター（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ他、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、１１：７８３〜７９６（１９９７））が含まれる。

構成的、誘導可能、組織特異的または発達段階特異的な発現を媒介する他のプロモーター配列が国際特許出願公開ＷＯ２００４／０８１１７３に開示される。

核酸構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が可能である。好ましくは、本発明の核酸構築物はプラスミドベクターであり、より好ましくはバイナリーベクターである。

表現「バイナリーベクター」は、Ｔｉプラスミド由来の改変されたＴ領域を有し、大腸菌およびアグロバクテリウム細胞の両方で増殖することを可能にし、かつ、通常的には植物形質転換のためのレポーター遺伝子を２つの境界領域の間に含む発現ベクターを示す。本発明のために好適なバイナリーベクターには、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ、ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＰＩおよびｐＢＩＮ ＰＬＵＳ（下記の実施例の節の実施例５を参照のこと）、または、それらの改変体が含まれる。

本発明の核酸構築物は、宿主細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞）または植物を形質転換するために利用することができる。

本明細書中で使用される用語「トランスジェニック」または用語「形質転換された」は交換可能に使用され、クローン化された遺伝物質が移されている細胞または植物を示す。

安定的形質転換では、本発明の核酸分子は植物のゲノムに組み込まれ、そのため、本発明の核酸分子は、安定な受け継がれる形質を表す。一過性の形質転換では、核酸分子は、形質転換された細胞によって発現されるが、ゲノムには組み込まれず、そのため、一過性の形質を表す。

外来遺伝子を単子葉植物および双子葉植物の両方に導入する様々な方法が存在する（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．（１９９１）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、４２、２０５〜２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．他（１９８９）、形質転換プロトプラストから再生された稔性トランスジェニックイネ植物、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）、３３８、２７４〜２７６）。

外因性ＤＮＡを植物のゲノムＤＮＡに安定的に組み込む主要な方法では、下記の２つの大きな手法が含まれる：
（ｉ）アグロバクテリウム媒介の遺伝子移動。Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．他（１９８７）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、３８、４６７〜４８６；Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．およびＲｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９８９）、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、第６巻、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ、２頁〜２５頁、Ｊ．ＳｃｈｅｌｌおよびＬ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ．；および、Ｇａｔｅｎｂｙ，Ａ．Ａ．（１９８９）、微生物における植物遺伝子の調節および発現、９３頁〜１１２頁、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＫｕｎｇおよびＣ．Ｊ．Ａｒｎｔｚｅｎ編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）を参照のこと。
（ｉｉ）直接的なＤＮＡ取り込み。例えば、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．他（１９８９）、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、第６巻、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ、５２頁〜６８頁、Ｊ．ＳｃｈｅｌｌおよびＬ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ．；および、Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．他（１９８８）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ、６、１０７２〜１０７４（プロトプラスト内へのＤＮＡの直接的な取り込みのための方法）を参照のこと。Ｚｈａｎｇ他（１９８８）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ、７、３７９〜３８４；および、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．他（１９８６）、エレクトロポレーションによる遺伝子移動の後でのトウモロコシの安定的形質転換、Ｎａｔｕｒｅ、３１９、７９１〜７９３（植物細胞の短時間の電気的ショックにより誘導されたＤＮＡ取り込み）もまた参照のこと。Ｋｌｅｉｎ他（１９８８）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、５５９〜５６３；ＭｃＣａｂｅ，Ｄ．Ｅ．他（１９８８）、粒子加速によるダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）の安定的形質転換、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、９２３〜９２６；および、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．（１９９０）、植物のバイオリスティック形質転換、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ、７９、２０６〜２０９（粒子衝撃による植物細胞または植物組織へのＤＮＡ注入）もまた参照のこと。Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．他（１９８７）、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ、７５、３０〜３６；および、Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｃ．（１９９０）、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ、７９、２１３〜２１７（マイクロピペットシステムの使用）もまた参照のこと。米国特許第５４６４７６５号（細胞培養物、胚またはカルス組織のガラス繊維または炭化ケイ素ウィスカーによる形質転換）を参照のこと。ＤｅＷｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．他（１９８５）、“ＤＮＡ処理の花粉を使用するトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）における外因性遺伝子の移動”、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ、Ｇ．Ｐ．Ｃｈａｐｍａｎ他編、Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｌｏｎｄｏｎ、１９７頁〜２０９頁；および、Ｏｈｔａ，Ｙ．（１９８６）、花粉および外因性ＤＮＡの混合物によるトウモロコシの高効率な遺伝子形質転換、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８３、７１５〜７１９（ＤＮＡの、発芽中の花粉との直接的なインキュベーション）もまた参照のこと。

アグロバクテリウム媒介システムでは、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれる規定されたＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターの使用が含まれる。植物組織に接種する方法は、植物種およびアグロバクテリウム送達システムに依存して変化する。広く使用されている１つの方法がリーフディスク手法であり、これは、完全な植物への分化を開始させるための良好な供給源を提供する任意の組織外植片を用いて行うことができる（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．他（１９８８）、“リーフディスク形質転換”、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５、１〜９、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）。補助的な方法では、真空浸潤との組合せでのアグロバクテリウム送達システムが用いられる。アグロバクテリウムシステムは、トランスジェニック双子葉植物の作出のために、または、トランスジェニック双子葉植物の作出において特に有用である。

植物細胞内への直接的なＤＮＡ移動の様々な方法が存在する。エレクトロポレーションでは、プロトプラストが強い電場に短時間さらされ、これにより、ＤＮＡが進入することを可能にするようにミニ細孔が開けられる。マイクロインジェクションでは、ＤＮＡが、マイクロピペットを使用して細胞内に直接、機械的に注入される。マイクロ粒子衝撃では、ＤＮＡが微小弾丸（例えば、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子など）に吸着させられ、微小弾丸が物理的に加速されて、細胞内または植物組織内に入れられる。

安定的形質転換の後、植物の増殖が生じる。植物を増殖させる最も一般的な方法は種子による。しかしながら、種子増殖による再生の欠点は、種子は、メンデル則によって支配される遺伝分散に従って植物によって作製されるので、ヘテロ接合性のために作物において均一性がないことである。すなわち、それぞれの種子が遺伝子的に異なり、また、それぞれがそれ自身の特定の形質を伴って成長する。従って、再生された植物が親のトランスジェニック植物の形質および特徴と同一の形質および特徴を有するように、再生が行われることが好ましい。形質転換された植物を再生させる好ましい方法は、形質転換された植物の迅速かつ一貫した繁殖をもたらすマイクロプロパゲーションによる方法である。

マイクロプロパゲーションは、選抜された親植物または栽培品種から切り出された１つだけの組織サンプルから第二世代の植物を成長させるプロセスである。このプロセスは、好ましい組織を有し、かつ、融合タンパク質を発現する植物の大量繁殖を可能にする。新しく作製された植物は元の植物と遺伝子的に同一であり、かつ、元の植物の特徴のすべてを有する。マイクロプロパゲーションでは、短い期間での高品質の植物材料の大量生産が可能であり、かつ、元のトランスジェニック植物または形質転換された植物の特徴を保持する選抜された栽培品種の迅速な増殖が提供される。植物クローニングのこの方法の利点には、植物増殖の速度、ならびに、作製された植物の品質および均一性が含まれる。

マイクロプロパゲーションは、段階間での培養培地または成長条件を変化させることを必要とする多段階手法である。マイクロプロパゲーションプロセスでは、下記の４つの基本的な段階が伴う。第１段階、最初の組織培養；第２段階、組織培養増殖；第３段階、分化および植物形成；および第４段階、温室培養およびハードニング。第１段階の期間中に、組織培養物が確立され、混入物がないことが確認される。第２段階の期間中に、十分な数の組織サンプルが、製造目標を満たすために作製されるまで、最初の組織培養物が増殖させられる。第３段階の期間中に、新しく成長した組織サンプルが分割され、個々の幼植物体に成長させられる。第４段階において、形質転換された幼植物体がハードニングのために温室に移され、温室において、光に対する植物の寛容性が徐々に増大させられ、その結果、植物は天然の環境で成長し続けることができる。

一過性の形質転換を、上記で記載された直接的なＤＮＡ移動方法のいずれかによって、または、改変された植物ウイルスを使用するウイルス感染によって行うことができる。

植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびバキュロウイルス（ＢＶ）が含まれる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換が、例えば、米国特許第４８５５２３７号（ビーンゴールデンモザイクウイルス、ＢＧＭＶ）；欧州特許ＥＰＡ６７５５３（ＴＭＶ）；特開昭６３−１４６９３（ＴＭＶ）；欧州特許ＥＰＡ１９４８０９（ＢＶ）；欧州特許ＥＰＡ２７８６６７（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．他（１９８８）、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７２頁〜１８９頁）に記載される。外来ＤＮＡを、植物を含む多くの宿主において発現させることにおける偽ウイルス粒子の使用が国際特許出願公開ＷＯ８７／０６２６１に記載される。

非ウイルス性の外因性核酸配列の植物における導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築が上記の参考文献によって記載され、また同様に、Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．他（１９８９）、タバコモザイクウイルスハイブリッドは付加遺伝子を発現および喪失する、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７２、２８５〜２９２；Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．他（１９８６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３１、１２９４〜１２９７；および、Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．他（１９９０）、タバコモザイクウイルスＲＮＡベクターを使用するタバコプロトプラストにおけるエンケファリンの産生、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、２６９、７３〜７６によって記載される。

形質転換用ウイルスがＤＮＡウイルスであるならば、当業者は、ウイルス自体に対する好適な改変を行うことができる。あるいは、ウイルスを、外来ＤＮＡを伴う所望のウイルスベクターを構築することの容易さのために、最初に細菌プラスミドにクローン化することができる。その後、ウイルスをプラスミドから切り出すことができる。ウイルスがＤＮＡウイルスであるならば、細菌の複製起点をウイルスＤＮＡに付け加えることができ、その場合、ウイルスＤＮＡが細菌によって複製される。ＤＮＡの転写および翻訳により、ウイルスＤＮＡをカプシド形成によって包むコートタンパク質が産生される。ウイルスがＲＮＡウイルスであるならば、ウイルスは一般にはｃＤＮＡとしてクローン化され、プラスミドに挿入される。その後、このプラスミドを使用して、植物の遺伝子構築物のすべてが作製される。ＲＮＡウイルスは、その場合、プラスミドのウイルス配列から転写され、続いて、ウイルス遺伝子の翻訳により、ウイルスＲＮＡをカプシド形成によって包むコートタンパク質が産生される。

非ウイルス性の外因性核酸配列（例えば、本発明の構築物に含まれる核酸配列など）の植物における導入および翻訳のための植物ＲＮＡウイルスの構築が上記の参考文献ならびに米国特許第５３１６９３１号において明らかにされる。

１つの実施形態において、ウイルス核酸に由来する生来的なコートタンパク質をコードする配列の欠失（非生来的（外来）植物ウイルスコートタンパク質コード配列）と、非生来的なプロモーター（好ましくは、非生来的コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーター）とを含み、かつ、植物宿主における発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージング、および、組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身的感染を確実にすることを可能にする植物ウイルス核酸が挿入のために提供される。あるいは、生来的なコートタンパク質コード配列は、非生来的なタンパク質が産生されるように、非生来的な核酸配列をその中に挿入することによって非転写性にすることができる。組換え植物ウイルス核酸構築物は１つまたは複数のさらなる非生来的なサブゲノムプロモーターを含有することができる。それぞれの非生来的なサブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子または核酸配列を植物宿主において転写または発現させることができ、かつ、相互の組換え、および、生来的なサブゲノムプロモーターとの組換えができない。加えて、組換え植物ウイルス核酸構築物は、トランス作用する調節因子と結合し、その下流側に位置するコード配列の転写を調節する１つまたは複数のシス作用調節エレメント（例えば、エンハンサーなど）を含有することができる。２つ以上の核酸配列が含まれるならば、非生来的な核酸配列を、生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して、または、生来的および非生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入することができる。非生来的な核酸配列はサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写または発現されて、所望の生成物を産生する。

第２の実施形態では、生来的なコートタンパク質コード配列が、非生来的なコートタンパク質コード配列に隣接する代わりに、非生来的なコートタンパク質サブゲノムプロモーターの１つに隣接して設置されることを除いて、組換え植物ウイルス核酸構築物が第１の実施形態でのように提供される。

第３の実施形態では、そのサブゲノムプロモーターに隣接して設置された生来的なコートタンパク質遺伝子と、ウイルス核酸構築物に挿入された１つまたは複数の非生来的なサブゲノムプロモーターとを含む組換え植物ウイルス核酸構築物が提供される。挿入された非生来的なサブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子を植物宿主において転写または発現させることができ、かつ、相互の組換え、および、生来的なサブゲノムプロモーターとの組換えができない。非生来的な核酸配列を非生来的なサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入することができ、その結果、この配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写または翻訳されて、所望の生成物を産生させるようにすることができる。

第４の実施形態では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列によって置き換えられることを除いて、組換え植物ウイルス核酸構築物が第３の実施形態でのように提供される。

ウイルスベクターは、本明細書中上記で記載されるような組換え植物ウイルス核酸構築物によってコードされる発現したコートタンパク質によってカプシド形成して、組換え植物ウイルスを生じさせる。組換え植物ウイルス核酸構築物または組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物に感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸構築物は、宿主における複製、宿主内での全身的な拡大、および、所望のタンパク質を産生させるための宿主における１つまたは複数の外来遺伝子（単離された核酸）の転写または発現が可能である。

上記に加えて、本発明の核酸分子はまた、葉緑体ゲノムに導入することができ、それによって、葉緑体での発現を可能にすることができる。

外因性核酸配列を葉緑体のゲノムに導入するための技術が知られている。この技術は下記の手順を伴う。第１に、植物細胞を、細胞あたりの葉緑体の数を約１個に減らすように化学的に処理される。その後、外因性核酸が、少なくとも１つの外因性核酸分子を葉緑体に導入することを目指して、好ましくは粒子衝撃によって細胞に導入される。外因性核酸は、相同的組換え（これは葉緑体に固有の酵素によって容易に行われる）による葉緑体ゲノムへの組込みを可能にするように当業者によって選択される。この目的のために、外因性核酸は、目的とする遺伝子に加えて、葉緑体ゲノムに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。加えて、外因性核酸は選択マーカーを含み、そのような選択マーカーは、逐次的な選抜手法によって、そのような選抜の後の葉緑体ゲノムのすべてまたは実質的にすべてのコピー体が外因性核酸を含むことを確認することを当業者に可能にするために役立つ。この技術に関するさらなる詳細が、米国特許第４９４５０５０号および同第５６９３５０７号に見出される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。従って、ポリペプチドを葉緑体のタンパク質発現系によって産生させることができ、かつ、葉緑体の内膜に一体化させることができる。

数多くの方法が、作物と雑草との間での遺伝子拡散を最小限に抑えるためにこの分野では知られている。下記はそのような方法の非限定的な記載である［米国特許出願公開第２００４００９８７６０号、同第２００４０１７２６７８号、および、Ｄａｎｉｅｌｌ（２００２）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０：５８１もまた参照のこと］。他の方法には、雄性不稔および／または種子不稔（これらは、異系交雑、自発的な種子飛散を防止する）、閉花受精（この場合、受粉が開花前に起こり、それにより、異系交雑を防止する）、および単為生殖（種子が、有性交配ではなく、栄養起源に由来し、これにより、異系交雑および自発的な種子飛散が抑制される。米国特許第６８２５３９７号を参照のこと）が含まれる。

母系遺伝
細胞質オルガネラの母系遺伝が植物系（葉緑体）および動物系（ミトコンドリア）によって共に使用される。いくつかの説明が、この現象を説明するために提供されている。母系遺伝は、個体内で大きな比率を占める利己的な細胞質因子による集団への侵入を促進させる^１。加えて、細胞質因子の母系遺伝は、雄性に関連する障害または病原体の有性伝達を防止するための進化的機構である；（細胞質ではなく）核のみが受精時に胚珠に進入することが許される［Ｇｒｅｓｓｅｌ Ｊ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２００２）］。母系遺伝はまた、受精後の植物において起こる雄性の核遺伝子の一般的な抑制の延長であり得る［Ａｖｎｉ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２５、２７３〜２７７（１９９１）］。

導入遺伝子の母系遺伝を促進するための葉緑体遺伝子工学の使用は、遺伝子改変作物の間での異系交雑、または、遺伝子改変作物と雑草との間での異系交雑の潜在的可能性を伴うそのような場合には非常に望ましい。大部分の被子植物に見出される色素体遺伝の支配的なパターンが単親−母系であり、葉緑体ゲノムはほとんどの作物では母系遺伝する。

葉緑体ゲノムの母系遺伝は、精細胞（これはその後、受精時に雌性配偶子と融合する）を形成する雄原細胞の発達の期間中に植物において達成される。雄原細胞は花粉形成時における不等分裂の結果であり、どの葉緑体も受け入れない［Ｈａｇｅｍａｎｎ、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ、１５２、５７〜６４（１９８９）］。

葉緑体トランスジェニック植物における導入遺伝子の母系遺伝、および、花粉を介した遺伝子拡散の防止が、タバコおよびトマト［Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、３４５〜３４８；Ｒｕｆ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９、８７０〜８７５（２００１）］を含めて、いくつかの植物種において成功裏に明らかにされている。ジャガイモを含むいくつかの他の植物種の葉緑体ゲノムが形質転換されているが、母系遺伝はこれらの研究では明らかにされていない。しかしながら、３０を超える導入遺伝子が、所望する植物形質を付与するために、あるいは、機能的な生物医薬品または食用ワクチンまたはバイオポリマーを製造するための生物工場としてのトランスジェニック葉緑体の使用のために葉緑体ゲノムに安定的に組み込まれている［Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、７、８４〜９１（２００１）；Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、１３６〜１４１］。

多くの他の封じ込め策とは異なり、母系遺伝による取り組みは既に屋外で試験されている。ＳｃｏｔｔおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎ［Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、３９０〜３９２（１９９９）］は、英国においてテムズ川沿いの３４ｋｍ離れた、アブラナの隣で成長する２つの野生集団から集められた天然の雑種における色素体遺伝を研究し、１８の野生化したアブラナ集団の持続性を３年の期間にわたって評価した。彼らは、混合集団を形成することについての可能性、および、遺伝子移入のための農業範囲を超えた作物の持続性を定量化するために、色素体の遺伝様式および同所性の発生率（同じ領域における一緒になった種の出現）を含めて、作物から野生近縁種への葉緑体遺伝子の移動に影響するいくつかの変数を分析した。作物種と雑草種との間でのおよそ０．６％〜０．７％の同所性にもかかわらず、混合植物群は、植物数の急激な減少、種子の逆戻り、および、究極的には３年以内での消滅に向かう強い傾向を示した。従って、ＳｃｏｔｔおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎは、植物が葉緑体ゲノムを介して遺伝子改変されるならば、遺伝子拡散は希であるに違いないと結論した。

従って、葉緑体ゲノムの母系遺伝は、遺伝子封じ込めのための有望な選択肢の１つである。色素体の形質転換はいくつかの主要な作物種では未だ達成されないでいるが、葉緑体の遺伝子工学は現在、除草剤抵抗性［Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、３４５〜３４８（１９９８）］、昆虫抵抗性、耐病性［ＤｅＧｒａｙ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１２７、８５２〜８６２（２００１）］および日照り抵抗性を付与することが示されており、同様に、抗体［Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、７、８４〜９１（２００１）］、生物医薬品［Ｄａｎｉｅｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、７、８４〜９１（２００１）］および食用ワクチンを産生させることが示されている。欧州環境庁（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）からの近年の報告書は葉緑体遺伝子工学を遺伝子封じ込め法として推奨している［Ｅａｓｔｈａｍ遺伝子改変植物（ＧＭＯ）：花粉移動による遺伝子拡散の重要性、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｉｓｓｕｅ Ｒｅｐｏｒｔ２８（欧州環境庁、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ、２００２）］。

ゲノム不和合性。多くの栽培作物は多数のゲノムを有する。これらの作物ゲノムの１つのみが雑草との種間雑種形成について和合性を有するだけである。例えば、コムギのＤゲノムは、Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ（ヤギムギ（ｂｅａｒｄｅｄ ｇｏａｔｇｒａｓｓ）、これは合衆国における問題雑草である）のＤゲノムとの和合性を有する；対照的に、倍数性レベルが問題でないとすれば、この雑草と、ＡＡＢＢ四倍体のＢゲノムを有するデュラムコムギとの種間雑種形成を達成することの方がはるかに難しい［Ｇｒｅｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２００２）］。同様に、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ（カラシナ）のＢゲノムから多くのＢｒａｓｓｉｃａ属雑草への遺伝子移動についての可能性が野生種に関して存在する；しかしながら、これまでのほとんどの遺伝子工学はＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（セイヨウアブラナ）で行われており、しかし、これはＡＡＣＣ四倍体ゲノムを有しており、従って、和合性を有することは考えられない。雑草に拡大するトランスジェニック形質の危険性は、不和合性ゲノムを有するそのようなトランスジェニック系統のみを公開することによって劇的に低下させることができる。

ゲノム情報の入手が可能であることにより、雑草と異系交雑する低下した可能性を不和合性機構によって有する作物を操作することが可能になり得る。

時間的および組織特異的な制御。化学的に誘導可能なプロモーターを遺伝子封じ込め策のために使用することができる。例えば、化学物質を、圃場に除草剤が噴霧される前に、除草剤抵抗性を付与する遺伝子の一時的な発現を誘導するために使用することができる。明らかではあるが、遺伝子的隔離が、外来遺伝子の発現を、作物が開花していないそのような時期に制限することによって可能となる場合がある。現在、そのようなプロモーターが使用可能である（参考文献の国際特許出願公開ＷＯ９７／０６２６９を参照のこと）。

作物が開花状態でないときにだけ外来遺伝子のスイッチを入れるための代わりの方法が、開花が生じる前にその遺伝子を物理的に除くことである。ＫｅｅｎａｎおよびＳｔｅｍｍｅｒ［Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、２１５〜２１６（２００２）］は、これが、外来遺伝子を開花前に切り出す部位特異的なリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅなど）の発現を活性化するために化学誘導可能なプロモーターまたは果実特異的なプロモーターを使用することによって達成され得ることを示唆する。そのようなシステムでは、種子（種子特異的なプロモーターを使用する）または植物全体（化学誘導可能なプロモーターを使用する）のいずれかにおいてＣｒｅの発現を誘導し、かつ、２つのｌｏｘ部位によって挟まれた遺伝子の除去をもたらすことができる。

トランスジェニック緩和。遺伝子拡大を封じ込めるための別の方法が、作物遺伝子からの正の生存形質を遺伝子移入によって獲得している雑草の適応度を損なうことである［Ｇｒｅｓｓｅｌ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、３６１〜３６６（１９９９）］。この方法は、トランスジェニック緩和（ＴＭ）と呼ばれており、（１）タンデム構築物が、厳密に連鎖する遺伝子として作用し、かつ、それらの相互分離が極めて希であるという前提；（２）ＴＭ形質が作物については中立または正であり、しかし、雑草については有害であるという前提；および（３）そのような植物はそれら自身の間で強く競合し、大きな種子生産量を有するので、弱く有害なＴＭ形質でさえ雑草集団から排除されるという前提に基づいている。ＴＭによって標的化され得るプロセスの例には、種子休眠、種子の成熟化、および、果実が熟して落ちること、ならびに、成長が含まれる。

雑草の種子は典型的には二次的休眠を示し、この場合、収穫期から得られた種子は、翌年のシーズンを通して、また、翌年以降も発芽し、それにより、子孫の競合を低下させながら、適応度を最大にする（また、すべての雑草が１回だけの処置によって駆除されないようにする）。二次的休眠の途絶は作物には中立であるが、雑草には有害である。Ｓｔｅｂｅｒ他は、アブシジン酸に対して非感受性であり、かつ、二次的休眠を完全に有しないＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体を特定している。休眠に関連するそのような遺伝子（操作または変異されたとしても）はＴＭのために使用することができる［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４９、５０９〜５２１（１９９８）］。

雑草植物の別の特徴は、雑草植物がその種子をある期間にわたってまき散らし、また、その熟した種子のほとんどが地面に落ち、これにより連続性を確実にするということである。結果として、一様に熟し、かつ、落下防止性の遺伝子は雑草には有害であるが、種子が一様に熟し、かつ、容易に落下しない作物については中立である；実際、落下防止性の遺伝子は、落下性の自生する雑草問題を依然として有するナタネについては一層好都合である。雑草を含まない「認定された」種子のみがまかれ、それにより、トランスジェニック雑草の種子が排除される。種子の離層帯におけるホルモンバランスを変化させることは落下特性に影響を及ぼすことが考えられる。サイトカイニンの過剰産生は落下を遅らせることができる。最近、長角果における葯片の開放を遅らせることによって種子の落下を妨げるＳＨＡＴＴＥＲＰＲＯＯＦ遺伝子がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離されている。これは、近縁のナタネについては理想的な方策であり得る。

矮化は、イネおよびコムギの「緑の革命」品種を作製することにおいてこれまで特に有益であり、自給自足をインドおよび中国にもたらしている。しかしながら、矮化形質は雑草については不都合であり、これは、雑草がもはや光のために作物と競合することができないからである。遺伝子操作による高さの減少は、ジベレリン３３の生合成を妨げることによって可能である。加えて、生来的な受容体と競合し、それにより矮化を誘導することによってジベレリンの不安定性をもたらす不完全なジベレリン酸受容体遺伝子が単離されている。

プロモーターの配列情報（例えば、配列番号５８）は、栽培植物のプロモーター配列を改変することによって本発明のポリペプチドの増大した発現を有する植物の作製を可能にする。従って、例えば、「ノックイン」技術または変異誘発（例えば、化学的または放射線）を、本発明のポリペプチドのアップレギュレーションされた発現を有する植物を直接的または間接的に作製するために使用することができる。

本発明のｃｗｐ１遺伝子を野生Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．のトマトの第４染色体に突き止め、かつ、テロメアマーカーＴＧ４６４からセントロメアマーカーＣＴ１７３にまで広がる染色体部分よりも小さい遺伝子移入体へのより詳細なマッピングを行うことによって、増大したクチクラの水透過性を有する栽培トマト植物を、古典的育種技術を使用して作製することが可能である。

例えば、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物を野生Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．植物と雑種形成させることができる。その後、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物の果実を熟させ、雑種（Ｆ１）種子を集める。その後、集めたＦ１種子を植え、Ｆ１植物を成長させ、自家受粉させる。自植を少なくともさらにもう一世代にわたって続けることができ、または、Ｆ１植物をｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの親植物に対して交配することができる。自植世代または戻し交配世代から得られる果実は、果実の色の変化によって明らかにされるように、表面的に熟する時点を過ぎるまでつるにつけたままにされ、そして、（ｉ）自然脱水の存在；および（ｉｉ）上記遺伝子移入についてスクリーニングされる。例えば、野生種の対立遺伝子を含有する最小限の遺伝子移入は、下記のマーカー：ＣＴ１９９、ＴＧ１６３、ＣＴ６１を使用することによって１０ｃＭ未満に、５ｃＭ未満に、２ｃＭ未満に、および、１ｃＭ未満に、また、ＣＴ６１〜ＴＧ４６４にまたがる領域の内部に制限することができる。例えば、増大したクチクラの水透過性を依然として可能にする最小限の遺伝子移入体を作製するために使用することができるマーカーには、図３ａに示されるＢＡＣの両末端に由来する配列のいずれかが含まれる。

従って、本発明はまた、野生Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．に由来する遺伝子移入を含むゲノムを有する栽培トマト植物を提供し、この場合、この遺伝子移入は、テロメアマーカーＴＧ４６４からセントロメアマーカーＣＴ１７３にまで広がる染色体部分よりも小さいこのＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．の第４染色体の一部分を含み、かつ、栽培トマト植物のクチクラの水透過性を増大させることができる。

本発明の栽培植物および遺伝子改変植物が（上記で記載されたように）作製されると、脱水した果実を下記のように作製することができる。

果実を、熟する通常の時点が過ぎるまでつるにつけたままにすることができる。果皮のしわ形成によって明白になるような脱水の外見により、果実における低下した水分含有量が示される。脱水した果実が得られると、脱水した果実を集めることができる。あるいは、果実をつるから集め、続いて、（例えば、天日乾燥して）脱水させることができる（これは、背景の節で詳しく記載される）。

従って、本発明は、それを発現する植物におけるクチクラの水透過性を支配するポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに、商業的に有益な作物植物の脱水した果実を製造するためにこれらを使用する方法を提供する。

本明細書中で使用される用語「約」は±１０％を示す。

本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。

上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。

本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子学、生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。

材料および方法
植物材料および測定。Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｅ）および野生種Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ（Ｈ）の種間雑種形成に基づく戻し交配育種プログラムに由来する１組の、準同質遺伝子の遺伝子移入系統（これらは、果実が脱水する形質によって区別される）を、ここで要約されるような以前の記載（国際特許出願公開ＷＯ０１１３７０８）のように開発した。Ｅ育種系統１６３０の植物を野生種Ｈ（ＬＡ１７７４）と受粉させた。雑種Ｆ_１植物を自家受粉させ、これによりＦ_２種子を作製した。３つのＦ_２植物を、熟したときのそれらの大きな糖含有量に基づいて選抜した。Ｆ_３種子をまき、これら３つのＦ_２選抜体のＦ_３植物のそれぞれの１０個の植物を成長させ、果実を、熟する通常の段階が過ぎるまでつるにつけたままにし、収穫した。Ｆ_３植物の中で、１つの植物（Ｆ３−２０３−１０）は、果皮のしわ形成によって明白になる、果実が脱水する徴候の特徴を示した。系統育種プログラムを開発し、これは、このＦ_３個体をＦ_４世代まで自植し、その後、果実の脱水速度について厳しく選抜することからなった。その後、植物をＥ育種系統に対して戻し交配し、この交配の産物をさらに４世代にわって自植して、ＢＣ１Ｆ４集団を作製した。この集団からの脱水性の個体をＥに対するさらに１回の戻し交配に付して、その形質を備えた雑種植物を作製した。２つのＦ_２集団（２３９４および２３９５）をこれらのＦ_１個体から構築した。

最初に、選抜手順は果実の脱水の表現型および果実のクチクラにおける微細亀裂に基づいていた。この形質に連鎖する分子マーカーを開発した後、選抜を遺伝子型に従って行った。切断増幅多型（ＣＡＰＳ）マーカーを分子マーカーとして使用した。ＣＡＰＳを、エンドヌクレアーゼ酵素によって切断される特異的なＰＣＲ生成物を使用して開発した（さらには下記における「ＤＮＡ分析」を参照のこと）。

植物を、以前の記載（ＭｉｒｏｎおよびＳｃｈａｆｆｅｒ、１９９１）のように、標準的な方法に従って温室において１５−１ポットで成長させた。果実の平均重量および脱水速度を、５個の成熟した赤い果実をそれぞれの植物から摘み取り、その重量を測定し、果実を室温（約２５℃）で網テーブルに置き、２日〜３日毎にその重量を測定することによって求めた。果実のクチクラにおける微細裂溝（ＭＦ）の存在を、拡大鏡（２倍）または双眼顕微鏡（１０倍）のいずれかによって確認した。

ＤＮＡ分析。ゲノムＤＮＡをＦｕｌｔｏｎ他（１９９５）に従って抽出した。ＣＡＰＳ（切断増幅多型）マーカーを、下記のように、高密度トマトマップ（Ｔａｎｋｓｌｅｙ他、１９９２）から選択されたＲＦＬＰマーカーから開発した。選択されたＲＦＬＰマーカーを表すトマトＤＮＡインサートを含有するＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）がＴｏｍａｔｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）によって譲渡された。ゲノムＤＮＡ挿入セグメントを、Ｔ７プライマーおよびＳＰ６プライマー（それぞれ、配列番号１および配列番号２）を使用してＨｅｂｒｅｗ大学（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）のＤＮＡ分析部門において部分的に配列決定した。これらの配列分析結果に従って、配列特異的なＰＣＲプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（バージョン１．０）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計した。合計でおよそ２０個のマーカーを設計し、これらを、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍおよびＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍの親遺伝子型の間での多型、ならびに、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ由来形質において異なるトマト系統の間での多型の存在を明らかにするために調べた。

下記は、第４染色体上の位置を表す２つのマーカー（ＴＧ１６３およびＴＧ５８７）についてのＰＣＲプライマーである。

増幅反応を、熱安定なＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｕｐｅｒＮｏｖａ Ｔａｑポリメラーゼ、ＪＭＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｋｅｎｔ、英国）を使用して、自動化されたサーモサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）で行った。反応を、１０ｘ反応緩衝液、０．１２５ｍＭの各デオキシヌクレオチド、０．５μｌの各プライマー、２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼおよび５０ｎｇ〜１００ｎｇのトマトゲノムＤＮＡを含有する２５μｌの最終体積で行った。条件を、各プライマー組のためのアニーリング温度および生成物のフラグメントサイズについて最適化した。Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの対立遺伝子とＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍの対立遺伝子との間での多型を生じさせる制限エンドヌクレアーゼを特定するために、反応を、３．５μｌのＰＣＲ生成物、１μｌの１０ｘ高濃度制限酵素緩衝液および１ユニット〜３ユニットの適切な制限エンドヌクレアーゼを含有する１０μｌの最終体積で行った。消化生成物を１％ゲルで分析した。ＤｒａＩおよびＨｉｎＦ１がＴＧ１６３およびＴＧ５８７についてそれぞれ適切であることが見出され、これらを分離集団に対して使用した。類似した手順をそれ以外のＣＡＰＳマーカーの設計のために適用した。

本研究で使用されたすべてのＢＡＣＳ（細菌人工染色体）が、Ｔｏｍａｔｏ Ｈｅｉｎｚ １７０６ＢＡＣライブラリーフィルター（ＬＥ＿ＨＢａ）を使用してＣｌｅｍｓｏｎ大学Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃｌｅｍｓｏｎ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、米国）から提供された。トマトＢＡＣライブラリーフィルターを、ＮＥＢｌｏｔ（商標）キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ｉｎｃ．、＃ＮＩ５００Ｓ）を使用して、かつ、供給者の説明書に従って標識された下記に記載されるような放射性プローブによって特異的なＢＡＣクローンについてスクリーニングした。フィルター上の標識されたＢＡＣコロニーを、蛍光体画像化装置（ＦＬＡ−５０００；ＦｕｊｉＦｉｌｍ）を使用して検出した。ＢＡＣプラスミドを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍａｘｉプラスミド精製キット（＃１２２６３）を使用して、一致している大腸菌株から精製した。「染色体ウォーキング」手法のために、ＢＡＣの端部を、ＳＰ６プライマーおよびＴ７プライマーを使用して配列決定し、ＰＣＲ生成物をＢＡＣ末端配列に従って展開した。新しい精製されたＰＣＲ生成物を放射能標識し、トマトフィルターコロニーのもう一回の検出のために使用した。

ＬＥ＿ＨＢａ３７Ｂ８ ＢＡＣクローン（Ｃｌｅｍｓｏｎ大学Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｌｅｍｓｏｎ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、米国）をＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｋｓ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化し、配列決定した。１５ｋｂ部分を、上記で記載されたように、プライマーを開発し、ＰＣＲによってクローン化し、そして、関連した部分を配列決定することによって完全に配列決定した。ＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴソフトウエア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９０）を使用することによってＮＣＢＩの核酸データベースおよび翻訳タンパク質データベースを使用して分析した。

ＲＮＡ分析および定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。ｃＤＮＡの調製のために、総ＲＮＡを、以前の記載（Ｍｉｒｏｎ他、２００２）のように抽出した。総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒ−ｓｃｒｉｐｔＩＩ予備増幅システム逆転写酵素キット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）を供給者の説明書に従って４２℃で用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用した。

ＰＣＲプライマー。オンライン定量的ＰＣＲのための短いアンプリコンを伴う特異的なプライマーを、下記の３つのＯＲＦのＢＡＣ配列決定に由来する配列に基づいて、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（バージョン１．０）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した：１）ＺＩＮＣ遺伝子、フォワード、５’−ＡＡＴＡＡＴＧＣＧＡＡＴＣＧＡＡＴＣＡＣＴＡ−３’（配列番号７）、および、リバース、５’−ＡＡＧＧＣＴＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴ−３’［配列番号８、１４０ｂｐのアンプリコン（配列番号９）］、２）ＤＢＰ遺伝子、フォワード、５’−ＴＧＧＡＴＡＡＧＣＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＡＴＴＧ−３’（配列番号１０）、および、リバース、５’−ＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＴＣＴ−３’［配列番号１１、１１６ｂｐのアンプリコン（配列番号１２）］、３）ＰＵＴ遺伝子、フォワード、５’−ＣＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡ−３’（配列番号１３）、および、リバース、５’−ＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＡＴＣＡ−３’［配列番号１４、２０５ｂｐのアンプリコン（配列番号１５）］。アクチンを、Ｇｅｎｅバンクアクセション番号ＢＦ０９６２６２に基づく下記のプライマーにより、基準遺伝子として使用した：フォワード、５’−ＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＡＴ−３’（配列番号１６）、および、リバース、５’−ＧＧＧＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣ−３’［配列番号１７、２５１ｂｐのアンプリコン（配列番号１８）］。

ｃＤＮＡを、製造者の説明書（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを含有するＳＹＢＲグリーンマスターミックスを使用するＧｅｎｅＡｍｐ５７００配列検出システム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での定量的ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。サーモサイクラーを、９５℃で３０秒間の変性の最初の段階、１５秒間の６２℃のアニーリング温度、および、３０秒間の７２℃の伸張温度により、すべての反応のために４０サイクルについてプログラムした。データ取得を７７℃で３０秒間行った。ＰＣＲ生成物の予備的な解離分析により、７７℃を超えて残留する生成物は特異的なＰＣＲ生成物であることが示された。正規化のためのアクチンプライマーに加えて、対数的に増大する既知のｃＤＮＡレベルを含有する標準曲線をそれぞれのプライマー組を用いて作製した。すべてのリアルタイムＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルで調べ、同一性認定のための配列決定のために送付した。

全長ｐｕｔ遺伝子のクローニング。推定されるタンパク質遺伝子（ｐｕｔ）の全長配列を、下記のプライマーを使用して、ＨＨ系統の果実（開花後１０日）から得られたｃＤＮＡから増幅した：Ｐｕｔフォワード：５’−ＧＴＡＧＴＡＣＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧ−３’（配列番号１９）およびＰｕｔリバース：５’−ＣＡＴＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＡＴＣＴＡＡＴＧ−３’（配列番号２０）。全長遺伝子［（配列番号２０）、９３０ｂｐ］を、Ｔ−Ａクローニング手法を使用してｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化し、その後、ＥｃｏｒＩ（ＮＥＢ ＃Ｒ０１０１）エンドヌクレアーゼを使用してＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩｋｓ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化した。ｐｕｔ遺伝子（配列番号２１）を、ＸｈｏＩ（ＮＥＢ ＃Ｒ０１４６）エンドヌクレアーゼおよびＸｂａＩ（ＮＥＢ ＃Ｒ０１４５）エンドヌクレアーゼを使用して、ｐＢＩＮ ＰＬＵＳバイナリーベクター（Ｇｈｏｓｈ他、２００２）のカリフラワー３５Ｓプロモーター部位とｎ−ターミネーター部位との間に再びサブクローン化した。

トランスジェニック植物。ｐｕｔ遺伝子を３５Ｓプロモーター下に含む構築されたベクターを大腸菌（ＤＨ５α菌株、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、その後、ＷａｌｋｅｒｐｅａｃｈおよびＶｅｌｔｅｎ（１９９４）によって記載される方法を使用してＥＨＡ１０５アグロバクテリウムエレクトコンピテント細胞に再び形質転換した。プラスミドを、ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃１２１４３）を使用して調製し、欠失部および他のクローニング誤りがないことを確実にするための配列決定のためにｐＢＩＮ ＰＬＵＳに再び形質転換した。

トマト形質転換実験を、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ他（１９９７）によって記載されるようにｃｖ ＭｉｃｒｏＴｏｍを使用して、また、Ｂａｒｇ他（１９９７）によって記載されるようにｃｖ．ＭＰ１を使用して行った。トランスジェニックシュートを、１ｍｇＬ^−１のゼアチン（Ｄｕｃｈｅｆａ、＃Ｚ０９１７）、１００ｍｇＬ^−１のカナマイシンおよび１００ｍｇＬ^−１のクラフォランが補充されたＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎培地（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｈａａｒｌｅｍ、オランダ）において発根させた。形質転換された植物を成長させる標準的な操作を行う。

（実施例１）
脱水形質の遺伝分析
微細裂溝（ＭＦ）が果皮上に現れる形質の遺伝を、標準小果栽培種（系統１８１５）と、脱水の形質を示す改良された遺伝子移入系統（系統１８８１）との間での交配に基づく２つの独立した分離するＦ_５集団（系統２３９４および系統２３９５）において明らかにした。分離集団における微細裂溝の出現の分布パターンは、χ二乗確率値が集団２３９４および集団２３９５についてそれぞれ０．５４６および０．８６４で、微細裂溝クチクラ：標準クチクラについて３：１の比率に従っていた（表１、下記）。

この分布パターンは、優性／劣性の対立遺伝子関係による一遺伝子遺伝について特徴的である。

果実の脱水の形質（ＣＷＰ）は集団２３９４では３：１の比率に従って分離し、一方、集団２３９５では分離は１：２：１の比率に従っており、中間的な脱水速度ではあったが、集団のおよそ半分が脱水性であった。従って、対立遺伝子の関係は、集団の遺伝的背景に依存して完全優性または半優性のいずれかであることが結論される（図１ａ〜図１ｂ）。上記から、果実の形質ＣＷＰが、本明細書中ではＣｗｐと呼ばれる一遺伝子形質として遺伝することが結論され得る。

（実施例２）
ｃｗｐ遺伝子の詳細なマッピング
高密度トマトＲＦＬＰマップ（Ｔａｎｋｓｌｅｙ他、１９９２）に基づいて、１組のＣＡＰＳ（切断増幅多型）マーカーを設計した。網状化上皮についてのＱＴＬに連鎖するマーカー（Ｆｕｌｔｏｎ他、２０００、第４染色体、第６染色体、第８染色体および第１２染色体にそれぞれ突き止められたＴＧ４６４、ＴＧ４７７、ＣＴ６８およびＴＧ６８のマーカー）を含めて、様々なゲノム位置を表す遺伝子座を微細裂溝の形質との連鎖の分析のために調べた。ＰＣＲに基づく多型分子マーカーのそれぞれを、両方の親に対して、また、その形質について分離する４８個のＦ_２個体の１組に対して適用した。

最初の１組のマーカーに基づいて、Ｃｗｐ遺伝子の位置が、およそ３ｃＭの推定される距離によってＣＴ１９９マーカーに連鎖する第４染色体のテロメア部分に決定された（９６個の配偶子における２つの組換え事象、図２ａ）。第４染色体のテロメア領域のより詳細なマッピングのために、さらに一群のＣＡＰＳマーカーを、この染色体セグメントの全体にわたって位置する一連のマーカーのために設計した。Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ親からの染色体の遺伝子移入セグメントがＣＴ１６３マーカーとＴＧ４６４マーカーとの間に突き止められた（図２ｂ）。この遺伝子移入部は、この分析において脱水性のドナー親として使用された準同質遺伝子系統におけるＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍセグメントを表す。

遺伝子移入サイズをさらに狭くするために、より大きなＦ_２集団（２００を超える個体）を、ＣＴ１９９マーカーとＴＧ４６４マーカーとの間で、ＰＣＲに基づくマーカーを用いて調べた。密接に連鎖するクラスター（１．５ｃＭ未満）の分子マーカーが、Ｃｗｐ遺伝子に隣接するとして明らかにされ（図２ｃ）、また、この研究に基づいて、Ｃｗｐ遺伝子がＴＧ４６４とＣＴ６１との間に突き止められた（０．５ｃＭ）。

（実施例３）
ｃｗｐ遺伝子のポジショナルクローニング
この小さい遺伝子移入体への限定化により、Ｃｗｐのポジショナルクローニングが可能になった。この目的のために、準同質遺伝子系統に由来するヘテロ接合性個体のさらに３５００個の分離子孫（７０００個の配偶子）を、ＴＧ４６４マーカーおよびＣＴ６１マーカーを用いたＣＡＰＳマーカー分析に供し、これにより、１２個の組換え体（「１回目」の詳細なマッピングにおける同じマーカーの間での０．５ｃＭと比較して０．３４ｃＭ）が明らかにされた。連鎖するＴＧ４６４マーカーおよびＣＴ６１マーカーを橋渡しする５個の連続したＢＡＣの１組を特定し、染色体ウォーキング技術を使用して組み立てた。簡単に記載すると、これを、ＢＡＣ末端を配列決定し、ＢＡＣ末端を、連続したＢＡＣを特定するためのプローブとして使用することによって達成した。

新しいＢＡＣを遺伝子移入体に関して設置するために、また、より高分解能のマップを作製するために、これら２つの生物種についての多型ＣＡＰを開発し、組換え体をこれらの新しいマーカーについて調べた。

５個の連続したＢＡＣはＣＴ６１およびＴＧ４６４のＣＡＰＳマーカーの間での橋渡しをもたらした（図３ａ）。１２個の組換え植物のそれぞれについて、自殖した子孫を成長させ、適切な分離マーカーを用いて遺伝子型決定し、脱水と、微細裂溝の出現とについて分析した。最初に特定された１２個の組換え事象のうち、３つがさらに、ＢＡＣ３７Ｂ８の両端の間に突き止められた（図３ａ−２つの破線によって限定される領域）。このことは、Ｃｗｐが３７Ｂ８ ＢＡＣにおいて突き止められたことを示している。これらの組換え事象をさらに解明するために、ＢＡＣ３７Ｂ８をサブクローン化し、そのより小さいフラグメントを順序正しく組み立て、Ｃｗｐ遺伝子がその内部に位置するおよそ１５，０００ｂｐ（１５ｋｂ）のセグメントを特定した（図３ｂ、低分解能でのマッピングデータおよびサブクローン化されたコンティグデータは示されていない）。

（実施例４）
候補遺伝子のバイオインフォマティクス分析
実施例３で記載されたＢＡＣ３７Ｂ８における１５ｋｂのセグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化し、配列決定し、その後、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲソフトウエアパッケージ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して組み立てた。

ＢＬＡＳＴプログラム（ＢＬＡＳＴＰ、ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）による分析の後でのこの１５ｋｂの配列のバイオインフォマティクス分析により、３つの候補オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、図４）が明らかにされた。最初のＯＲＦは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来の機能不明のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿１８９３６９．１）に対する類似性を示した（タンパク質同一性、約４４％；相同性、約６１％）。このタンパク質は２つのドメインを有する。第１のドメインはＲＩＮＧフィンガードメイン（ｒｐｓＢＬＡＳＴ−ＮＣＢＩ保存ドメイン検索）（２原子の亜鉛と結合する４０残基〜６０残基の特殊化されたタイプのＺｎフィンガー）であり、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することにおそらくは関与する（Ｂｏｒｄｅｎ、１９９８）。このドメインは、広範囲の機能（例えば、ウイルス複製、シグナル伝達および発達など）を有するタンパク質において特定されていた。このドメインは、異なるシステイン／ヒスチジンパターンを有する２つの変化体（Ｃ３ＨＣ４タイプおよびＣ３Ｈ２Ｃ３タイプ（ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガー））を有する。もう一方のドメインはＤＵＦ２３であり、これは機能不明のドメインである。このドメインは、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびショウジョウバエのタンパク質に見出される、長さがおよそ３００残基の領域からなるファミリーの一部である。この領域は、触媒作用残基として機能し得る数個の保存されたシステイン残基および数個の荷電アミノ酸を含有する。このＯＲＦを「Ｚｉｎｃ」と名付けた。興味深いことに、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓホモログに対するトマトＺｉｎｃの相同性は、「Ｒｉｎｇフィンガー」の部位においてではなく、ＤＵＦ２３部位においてだけであり、「Ｒｉｎｇフィンガー」ドメイン領域はＺｉｎｃトマト遺伝子では失われている。

第２のＯＲＦは、ＤＮＡ結合性のブロモドメイン含有タンパク質に対する類似性を示した（シロイヌナズナＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿９７４１５３．１、タンパク質同一性、約３７％；相同性、５６％）。この遺伝子は、タンパク質、ＤＮＡおよびクロマチンのアセチル化調節に関連するＤＮＡ結合タンパク質ファミリーの一部であり、また、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ調節の一部である（Ｄｈａｌｌｕｉｎ他、２０００）。本発明者らはこの遺伝子を「ＤＢＰ」（ＤＮＡ結合タンパク質）と名付けた。

第３のＯＲＦは、単に「発現タンパク質」として記載されただけのタンパク質（シロイヌナズナＡｔ４ｇ３８２６０、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿５６８０３８．１）に対する類似性を有していた（タンパク質同一性、約４８％；相同性、６７％）。これは機能不明のドメイン（ＤＵＦ８３３）を含有する。これは、真核生物、原核生物およびウイルスに見出され、機能が不明であるファミリーの一部である。１つのメンバーが、マウスにおける初期胚発生の期間中に発現することが見出されている（Ｈａｌｆｏｒｄ他、１９９３）。この遺伝子を「ＰＵＴ」（推定される（ｐｕｔａｔｉｖｅ））と名付けた。これら３つの候補遺伝子はどれも、クチクラ生合成代謝の知られている段階において関係する遺伝子に対する何らかの類似性または相同性を示さなかった。

（実施例５）
候補遺伝子の発現分析
これら３つの遺伝子のうちのどれがトマト果実のクチクラ発達に関連するかを明らかにするために、それらのＣｗｐ対立遺伝子において異なる準同質遺伝子系統におけるこれら３つの遺伝子のそれぞれの発現レベルを測定した［Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍの脱水対立遺伝子（ＨＨ）およびＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの非脱水対立遺伝子（ＥＥ）、図５ａ〜図５ｂ］。下記の段階の子房および果実に由来するｍＲＮＡを抽出した：開花、開花後５日および１５日、ならびに、未成熟な緑色の発達段階、成熟した緑色の発達段階、および、損壊の発達段階（図５ａ〜図５ｂ）。果実の試料を、ポジショナルクローニング手法のために使用された同じ分離集団から取った。これらの遺伝子のそれぞれの発現をＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ＤＢＰは、子房段階でのみ、両方の遺伝子型（ＨＨおよびＥＥ）において等しく発現しており、従って、このことは、この遺伝子の発現は表現型形質に関連しないことを示していた（図５ｂ）。Ｚｉｎｃ遺伝子の発現は、いずれかの表現型において、果実のどの段階でも観測されず、このことは同様に、その発現は脱水の形質に関連しないことを示していた（データは示されず）。

ＰＵＴのみが発達中果実の若い段階で発現し、さらに、ＣｗｐについてのＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ対立遺伝子（ＨＨ）を伴う脱水表現型の果実だけにおいて示差的に発現していた（図５ａ）。この研究で観測された最も大きい発現は開花後１５日の小果実段階であった。

ＰＵＴ遺伝子の示差的な発現パターンを確認するために、Ｍ８２トマト産業用栽培種に由来するさらなる集団におけるこの遺伝子の発現を分析した。１つの集団は、脱水性系統（系統２１６８）とＭ８２限定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ）栽培種との雑種形成から生じたヘテロ接合の個体に由来するＦ_２集団であった。本発明者らは開花後５日〜１５日の段階（最初の発現分析において最大の発現レベルを伴う段階）で３つすべての分離表現型の発現（ＨＨ、ＨＥ、ＥＥ）を調べた。図６に示されるように、ＰＵＴ遺伝子の古典的なメンデル型の発現パターンが見出され、ＨＨ遺伝子型が最大の発現レベルを示し、ヘテロ接合のＨＥ個体はおよそ半分の発現レベルを示し、ＥＥ表現型は発現を有しなかった（図６における最初の３つの棒）。

加えて、ＰＵＴ遺伝子の発現を、別のＮＩＬ（準同質遺伝子系統）集団（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｍ８２）と、本明細書中に記載されるＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ由来の遺伝子型（ＥｓｈｅｄおよびＺａｍｉｒ、１９９４）と類似する遺伝子移入を含有するさらなる野生種（Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）との種間雑種形成に由来する遺伝子移入系統４．４）において調べた。この集団はＰＵＴ遺伝子の別の野生対立遺伝子を表し、ＩＬ４．４の果実もまた微細裂溝を示し、かつ、脱水する。Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ由来の集団と同様に、ＣｗｐについてのＬ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉの対立遺伝子を含有するＬ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ由来の遺伝子移入体（ＩＬ４．４）は、Ｍ８２と比較して、若い小果実におけるＰＵＴ遺伝子の発現を示した（図６、最後の２つの棒）。

ＰＵＴ遺伝子を発現するトランスジェニックトマト植物
Ｐｕｔ遺伝子の発現が特有のクチクラ発達形質に関連することを示すために、ＰＵＴ遺伝子が３５Ｓプロモーターの制御下にあるトランスジェニックトマト植物を（記載されたように、ｐＢＩＮ ＰＬＵＳバイナリーベクターを使用して）開発した。表現型形質がトランスジェニック植物において観測され、このことは、Ｐｕｔの発現がこの形質に関連することを示している。

最初のトランスジェニック植物の自植に由来する個々の分離Ｔ１植物の遺伝子量を明らかにするために、それぞれのＴ１植物から得られた５０個〜７０個の種子を、１００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１／２ＭＳ培地に播種した。発芽後、正常な根を有する実生の百分率を求めた。実生の１００％が正常な根の成長を示したとき、そのＴ１植物を導入遺伝子についてホモ接合性であると見なした。正常な根を有するおよそ７５％のＴ２実生は、Ｔ１植物が導入遺伝子についてヘテロ接合性であったことを示した。今回は観測されなかったが、他の比率は、導入遺伝子の連鎖しないコピー体が２つ以上存在することを示し得る。２つの独立したＴ１分離集団から得られた１６個のＴ１個体を、それらの対立遺伝子構成を明らかにするために分析した。その場合、３つの分類を、ＰＵＴ遺伝子の対立遺伝子量と、表現型形質との間での関係を明らかにするために使用した。

図７ａ〜図７ｂに示されるように、果実のクチクラにおける微細裂溝の表現型形質（ＭＦ−）がＴ_０世代において既に観測された。２０個の独立したＴ_０トランスジェニック個体から、４つの植物（ＭＦ１−１、ＭＦ１−４、ＭＦ１−８、ＭＦ１−１２）が果皮における様々なレベルのＭＦを示した。加えて、これらのトランスジェニック植物は野生型の果実よりも大きな脱水速度を示した（図７ｂ）。

２つの分離Ｔ_１集団を成長させ、ＭＦの存在および脱水速度について調べた。図８ａ〜図８ｂは、果実の微細裂溝の重篤性（１〜５の尺度、図８ａ）および重量減少割合（室温で１４日後、図８ｂ）に対するＰＵＴ導入遺伝子コピー数の影響を示す。ＰＵＴ遺伝子のコピー数を材料および方法の節でのように求めた。

図９ａ〜図９ｂは、野生トマト種（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ Ｓ．）由来のＰＵＴ遺伝子のコピー体を発現しないトランスジェニックトマト個体（Ｔ_１世代）（これは野生型と類似する）と、野生トマト種（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ Ｓ．）由来のＰＵＴ遺伝子の２コピーを発現するトランスジェニックトマト個体（Ｔ_１世代）との間での比較を示す。図９ａ−ＰＵＴ遺伝子のコピー体を有しない個体（０コピー）に由来する果実の無傷の表面、および、２コピーの導入遺伝子を有する個体の微細裂溝の果実を示す走査電子顕微鏡写真。図９ｂ−ＰＵＴ遺伝子のコピー体を有しない個体（０コピー）と、２コピーを有する個体（２コピー）との間での乾燥速度の比較。

これらの結果は、ＰＵＴ遺伝子の存在が微細列溝の表現型および果実の脱水に対する原因であることを明瞭に示している。

遺伝子配列に基づく系統生物学的分析は、ｃｗｐが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける３つのメンバーによって代表される遺伝子ファミリーの一部であることを示している（図１０ａ〜図１０ｂ）。Ｌｅｃｗｐ１遺伝子に対して３０％の相同性を示すさらなるトマトホモログ（ｃｗｐ２）が存在し、これは栽培トマトでは実際に発現している（ＥＳＴ Ｎｏ．ＡＷ６２１９２７）。

興味深いことに、このホモログは、トマト果実の上皮網状化についての報告されたＱＴＬ（Ｆｒａｒｙ他、２００４）が存在するトマトの染色体２−１に位置づけられる。ナス科の栽培トウガラシの発達中の果実もまた、Ｌｅｃｗｐ１遺伝子に対する大きな類似性（８７％）を有するｃｗｐホモログをその上皮組織において発現し、また、トウガラシの果実は、収穫後の水分喪失の園芸学的問題、ならびに、パプリカ栽培品種における果実の脱水という望ましい特質によって特徴づけられる。従って、ＣＷＰ遺伝子のホモログもまた、クチクラの改変および水透過性に寄与し得ることが考えられる。

これらの結果は、ｃｗｐ遺伝子の発現が、果実の拡大期間中における裂溝形成を弾性低下のためにおそらくは受ける（重量およびＴＥＭに基づいて）構造的に変化したクチクラをもたらすことを示している。しかしながら、この現象は、非常に発達した果実クチクラを有する果実（例えば、無気孔性の厚い皮の栽培トマトなど）においてだけ観測されており、その特徴的なより薄いクチクラを有する野生種の果実では明らかではない。栽培トマト果実の発達期間中におけるクチクラ成分の堆積は、未成熟な緑色段階から成熟した緑色段階への移行期間中に急激な変化を受け、従って、これが微細裂溝表現型の観測と一致することは妥当である。

明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。

本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許及び特許願、及びＧｅｎＢａｎｋアクセション番号はすべて、個々の刊行物、特許または特許願、またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。

集団２１４８（図１ａ）および集団２１４９（図１ｂ）における脱水速度に対するｃｗｐ（ＰＵＴ）遺伝子型の影響を示すグラフである。 ＣＷＰ遺伝子の詳細なマッピングを示す（図２ａ〜図２ｃ）。 ＣＷＰ遺伝子の物理的配置を示す（図３ａ〜図３ｂ）。 Ｃｗｐ遺伝子を含むＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ由来の１５ｋｂの遺伝子移入を例示する。 トマトの発達中の子房および小果実におけるＰＵＴ遺伝子（図５ａ）およびＤＢＰ遺伝子（図５ｂ）の発現分析を示すグラフである。 トマト遺伝子型の１５日目の小果実におけるＰＵＴ遺伝子の発現分析を示すグラフである。 野生トマト種のＳｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ Ｓ．（以前は、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｍｉｌｌ．）に由来するＰＵＴ遺伝子を３５Ｓ構成的プロモーター下で発現するトランスジェニックトマト植物（Ｔ_０）を示す（図７ａ〜図７ｂ）。 果実の微細裂溝の重篤性（１〜５のスケール、図８ａ）および重量減少割合（室温で１４日後、図８ｂ）に対するＰＵＴ導入遺伝子コピー数の影響を示す。 コピー体を発現しないトランスジェニックトマト個体（Ｔ_１世代）（これは野生型に類似する）と、野生トマト種のＳｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ Ｓ．に由来するＰＵＴ遺伝子の２コピーを発現するトランスジェニックトマト個体（Ｔ_１世代）との比較を示す（図９ａ〜図９ｂ）。 ＣＷＰ１およびＣＷＰ２、ならびに、単子葉植物種および双子葉植物種に由来する関連した配列（配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４および配列番号５６）の保存を示す系統樹である。 ＣＷＰ１およびＣＷＰ２、ならびに、単子葉植物種および双子葉植物種に由来する関連した配列（配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４および配列番号５６）の保存を示す系統樹である。 ＥＭＢＬ−ＥＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷソフトウエアによって作製された本発明のＣＷＰ１ファミリーの種々のタンパク質メンバーの間での多重アラインメントを示す。 ＥＭＢＬ−ＥＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷソフトウエアによって作製された本発明のＣＷＰ１ファミリーの種々のタンパク質メンバーの間での多重アラインメントを示す。 ＥＭＢＬ−ＥＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷソフトウエアによって作製された本発明のＣＷＰ１ファミリーの種々のタンパク質メンバーの間での多重アラインメントを示す。

配列番号１〜８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、および２０は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号９は、トマトＺＩＮＣ遺伝子アンプリコンの配列である。
配列番号１２は、トマトＤＢＰ遺伝子アンプリコンの配列である。
配列番号１５は、トマトＰＵＴ遺伝子アンプリコンの配列である。
配列番号１８は、トマトアクチンアンプリコンの配列である。
配列番号５８は、ｃｗｐ１遺伝子プロモーターの機能的フラグメントの配列である。

Claims (19)

1. 配列番号２２に対して少なくとも８８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる、単離されたポリヌクレオチド。
2. 前記核酸配列は、配列番号２１または配列番号２３に示される通りである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
3. 前記アミノ酸配列は、配列番号２２に示される通りである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
4. 請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
5. 前記核酸配列に機能的に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項４に記載の核酸構築物。
6. 請求項４に記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
7. 請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド含む遺伝子改変された植物。
8. 配列番号２２に対して少なくとも８８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる、単離されたポリペプチド。
9. 請求項８に記載の単離されたポリペプチドを特異的に認識することができる抗体。
10. 作物植物の脱水した果実を製造する方法であって、配列番号２２に対して少なくとも８８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように植物を遺伝子改変することを含み、前記ポリペプチドは、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる、方法。
11. 果実を植物につけたまま脱水させること、および、続いて、
    脱水した果実を集めること
    をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 作物植物からの果実をその脱水の前に取り除くこと、および、続いて、果実を脱水させること
    をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記核酸配列は、配列番号２１または配列番号２３に示される通りである、請求項１０に記載の方法。
14. 前記アミノ酸配列は、配列番号２２に示される通りである、請求項１０に記載の方法。
15. 配列番号２２に対して少なくとも８８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する遺伝子改変された植物であって、前記ポリペプチドは、植物のクチクラの水透過性を増大させることができる、遺伝子改変された植物。
16. 配列番号２２に対して少なくとも８８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む遺伝子改変された種子または果実であって、前記ポリペプチドは、このポリペプチドを発現する植物のクチクラの水透過性を増大させることができる、遺伝子改変された種子または果実。
17. 前記核酸配列は、配列番号２１または配列番号２３に示される通りである、請求項１６に記載の遺伝子改変された種子または果実。
18. 前記アミノ酸配列は、配列番号２２に示される通りである、請求項１６に記載の遺伝子改変された種子または果実。
19. 請求項１６に記載の遺伝子改変された果実を含むトマトペースト。